JPS63132664A - コラーゲン／鉱質混合物のγ線照射 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、コラーゲンと鉱質物とを含む硬質組織修復の
ための移植物および補綴物の調製に関する。特に、アテ
ロペプチド細繊維再生コラーゲンの混合物をリン酸カル
シウム鉱質物と混合し、その混合物にγ線照射を行うこ
とにより、生物学的特性が改善され、かつ取り扱い性の
向上が達成される。

（従来の技術） 硬質組織修復に使用する目的で広範囲の材料が提案され
ている。重量に耐える必要のある場所については、応力
に耐えうる補綴物は、金属棒状物から再生動物骨にまで
およんでいる。また、歯槽隆線増強のため、架橋コラー
ゲンを使用するように、骨構造増強のため３種々の閉塞
材が用いられてきた。種々のタイプの骨格修復に適した
種々の材料が利用できるのは望ましい。なぜなら、それ
ぞれの適用について、最適の移植組織片を決定するため
の唯一の１組のパラメーターを有するためである。さら
に、開業医によって取り扱われる場合に、該開業医が成
功裏の結果を収めるためには。

材料の物理的な取り扱いやすさの特性が重要である。な
ぜなら１部分的には、取り扱いの容易さが成功を決定す
るからである。

骨の主要な有機成分および無機成分の適当な物質（すな
わちコラーゲンおよびリン酸カルシウム鉱質物）を組成
物とする試みがなされている。コラーゲン／鉱質の組み
合わせを使用する試みの報告が多い。例えば、　Ｌｅｍ
ｏｎｓ、　Ｊ、らが５ｅｃｏｎｄ　ＷｏｒｌｄＣｏｎｇ
ｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　　（Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ、　　Ｄ、Ｃ，）で１９８４年４月２
７日〜５月１日に開催）にて９次のような試みを報告し
た。その試みは、市販のヒドロキシアパタイトおよびリ
ン酸カルシウムとともにコラーゲンを利用し２人工的に
つくり出されたウサギの傷を修復する試みである。これ
らの混合物を使用しても傷の再癒合はおきなかった。し
かし、新鮮自原骨を使った対照実験においては癒着に成
功した。同様に、　Ｌｅｖｙ、　Ｐ、ら（Ｊ、Ｐｅｒｉ
ｏｄｏｎｔａｌ（１９８１）則：　３０３−３０６）は
、イヌまたはサルの歯根における骨内欠損の修復にコラ
ーゲン／鉱質ゲル移植物を利用しようとして失敗′して
いる。Ｇｒｏｓｓ＋Ｂ、Ｃ，ら、　（射ａｌカＬＬ（１
９８０）、弧：　２ｌ−２６）は。

次の混合物を使用し、制限付きではあるが、サルの骨膜
上移植によって骨の生長を誘発することに成功したと報
告した。その混合物とは、凍結乾燥した子牛の皮の再生
コラーゲンをヒドロキシアパタイトに混合した調製物で
ある。他の多（の者は。

明らかにテロペプチド（コラーゲンの抗原性の主な源と
なっている）を含むコラーゲンが鉱質物と結合した形態
のものを骨修復に使用することについて報告している。

例えば、　Ｉ（ａｙａｓｈｉ、　Ｋ、　ら、紅並０ｒｔ
ｈｏ　　Ｔｒａｕｍａｔ　Ｓｕｒ　　（１９８２）９９
　：　２６５−２６９；Ｂａｔｔｉｓｔａ。

米国特許第４．３４９．４９０号（水和ゼラチン使用）
；Ｃｒｕｚ＋　Ｊｒ、＋米国特許第３，７６７．４３７
号（カルシウムによる沈降形態のコラーゲンを使用）；
およびＢａｔｔｉｓｔａら、米国特許第３，４４３，２
６１号（リン酸カルシウムに加えて、凝集したトロポコ
ラーゲン単位の微細結晶を含む°“新形態”のコラーゲ
ンを使用）を参照されたい。

Ｍｉｙａｔａら（米国特許第４．３１４，３８０号）は
、動物の骨を処理してすべての有機物質を除去し、アテ
ロペプチドコラーゲンで被覆する方法によって直接調製
した鉱質を椎を利用した。日本国特開間第５８−０５８
０４１号公報（１９８３年４月６日公開）には。

アテロペプチドコラーゲンで処理された細孔を有する海
綿状多孔質リン酸カルシウムの材質が開示されている。

このコラーゲンは濃度が２重量％を超えないコラーゲン
溶液から誘導される。上記日本国出願においては、上記
材料の細孔中に骨芽細胞が進出し、新しい骨が生長する
ことが報告されている。ヨーロッパ特許出願（第０３０
５８３号、　１９８１年６月２４日公開）には、コラー
ゲンフリース［Ｆ］（Ｃｏｌｌａｇｅｎｆｌｅｅｃｅ■
）をヒドロキシアパタイトと混合して骨の修復に使用す
ることが開示されている。

このコラーゲン物質は市販品であり、動物の皮をタンパ
ク分解し、凍結乾燥し、そしてγ線照射で滅菌すること
により得られる。このコラーゲン調製物は軟質膜様物質
を形成するが、テロペプチドを含んでおり、処理操作に
より部分的にそれが減じられる。

ＥＰＯ出願、公開第１６４，４８３号（１９８５年１２
月１８日公開）には、鉱質／コラーゲン混合物に生物適
合性を確実に与える方法が開示されている。この混合物
において、可溶化コラーゲンは、リン酸カルシウム鉱質
成分が存在するとき、またはそれが添加される前に架橋
する。これはリン酸カルシウム鉱質成分が、架橋を完成
させるよりもむしろ体液についての再吸収性および吸着
能を保持するということを示す。Ｍｉｔｔｅｌｍｅｉｅ
ｒの米国特許第４，５１６．２７６号には、非線繊維、
非再生コラーゲンおよびヒドロキシアパタイトの組み合
わせが示されている。

米国特許出願第８４８，４４３号（１９８６年４月４日
に提出）およびその特許、米国特許出願第７１７．０７
２号（１９８５年３月２８日提出）、（両者とも、この
出願と同じ出願人）の内容は、参照としてここに示され
ている。そこには、リン酸カルシウム鉱質物と混合され
た再生細繊維アテロペプチドコラーゲンを含む新規な組
成物が開示されている。組成物を強固にするための種々
の方法がまた。開示されている。その方法は、規定され
た温度と時間における混合物のインキュベート、および
乾燥した混合物の熱による処理を包含する。上記参照し
た出願の調製物は、処理した対象物に感染しないように
無菌的条件下で調製されるにちがいない。なぜなら直接
滅菌開示された方法においては滅菌の設備がないからで
ある。典型的には、無菌的操作工程により、　１０−３
〜１０−４の無菌的に保証されるレベル（すなわち、非
無菌生成物単位の確率）を有する生成物が得られる。

上記に示した出願で開示された種々の硬化処理を行った
後、得られる物質は、１ｃＪ当り約６ニユートン（約６
Ｎ／ｃｆｌＴ）の圧縮率を有する。この強度および圧縮
率指数をさらに改善することは１両者ともそのなかに開
示された硬化工程により達成され得る。

どの手法においても、容易かつ能率的に滅菌し得、移植
物を効果的に挿入するのに充分な操作性を保持する骨欠
損修復に適した組成物が提供されていない。その物質は
圧縮に耐える必要があり。

しかもある場所に形成され得るように充分弾力がある必
要がある。あるいは１重量に耐える必要のある場所で使
用される場合には、それに適したように整いことが必要
である。本発明の方法およびそれにより得られる生成物
により、この分野の欠落部分は改善される。

本発明は照射工程を採用している。゛その照射工程につ
いては、コラーゲンだけを含む調製物の場合にのみ物理
的特性に影響を与えることを前に記載した。例えばコラ
ーゲン縫合におけるγ線照射効果の要約は、＾ｒｔａｎ
ｄｉ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｆｌ１４
９＋Ｉｎｔｌ、八ｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ａｇｅｎ
ｃｙ、　Ｖｉｅｎｎａ、　　ｒ医学的および生物学的材
料の放射線滅菌の操作便覧１５章」（１９７３）に見ら
れる。そして組織組成物としてのコラーゲンにおける放
射線効果の総論は、　Ｂａ１ｌｅｙ。

Ａ、Ｊ、により発行されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔ　Ｒ
ｅｖ　ＣｏｎｎｅｃｔＴｉｓ　（１９６８）　ｐ、２３
３−２８１）　、さらに、　ＰＣＴ出願ＷＯ３１１００
９６３には、熱処理により、およびガス状のハロゲン化
水素で処理することによりコラーゲン物質の物理的強度
が向上することが開示されている。

ＥＰＯ公開第１６４，４８３号（前出）では、凍結乾燥
した調製物を滅菌するためにγ線照射を使用している（
この公報には性質または使用については所見がない）。

しかし２本出願人は、この公報においては、コラーゲン
／鉱質混合物の物理的特性および操作特性に対するγ線
照射効果の開示がないことに気付く。

（発明の要旨） 生体和合性を有し９体積弾性係数が少な（とも１ＯＮ／
ＣＴＩＩであり、無菌保証係数が少なくとも１０−６程
度に低い骨移植調製物を調製する本発明の方法は、コラ
ーゲン／鉱質組成物に０．５〜４　Ｍｒａｄのγ線を照
射することを包含し、該照射中に該組成物には、１〜６
％の水分が含有される。上記コラーゲン／鉱質組成物は
水分を除いて、２〜４０重量％の再生細繊維アテロペプ
チドコラーゲンと６０〜９８重量％のリン酸カルシウム
鉱質との混合物である。

生体和合性を有し１体積弾性係数が少なくとも１ＯＮ／
ｄであり、無菌保証係数が少な（とも１０−６程度に低
い骨移植調製物を調製する本発明の方法は。

コラーゲン／鉱質組成物に０．５〜４　Ｍｒａｄのγ線
を照射をすることを包含し、該組成物は、０．５〜１％
の水分を含有する場合には、予め加熱処理され。

体積弾性係数ｌＯ〜４５Ｎ／ｃｆｆｌに相当する架橋が
行われる。上記コラーゲン／鉱質組成物は、水分を除い
て、２〜４０！！ｔ％の再生細繊維アテロペプチドコラ
ーゲンと６０〜９８重量％のリン酸カルシウム鉱質との
混合物である。

本発明の骨移植材料は上記の方法により調製される。

所望の水分含量を有するコラーゲン／１２．質組成物を
得る本発明の方法は、該混合物を水分含量が１％より少
なくなるまで乾燥すること、および該乾燥した混合物を
相対湿度５０〜８０％、温度３５〜４５℃にてインキュ
ベートすることにより再水和すること、を包含する。

本発明は、コラーゲン／鉱質調製物が効果的に滅菌され
得、そして同時に次のような特性をそれらに与える方法
を提供する。その特性とは欠損修復の際に材料の取り扱
いが容易であること、および移植物としての性質が好適
であることをいう。

その方法の中心は、所望のレベルにまで滅菌するのに充
分な全エネルギーにより調製物を照射することである。

ここでコラーゲン／鉱質調製物は。

充分な体積弾性係数と、所望の弾性および剛性の組み合
わせとが、照射により得られるような形態で提供される
。照射期間中のコラーゲン／鉱質試料の関連するパラメ
ーターに関する条件または状態の調整に依存して、所望
の特性範囲が得られる。

それゆえに、ある面では１本発明は、所望の物理的特性
および滅菌レベルをコラーゲン／鉱質混合物に与える方
法に関する。その方法は、前記混合物を滅菌し得る量の
γ線照射（典型的には０．５〜４Ｍｒａｄ）を行うこと
を包含する。ここで、上記混合物は約６０〜９８％のリ
ン酸カルシウム鉱質物と２〜４０％のアテロペプチド細
繊維再生コラーゲンを含む（水分を除く）。照射の間は
、調整物のコラーゲン部分は、物理的特性を安定化する
ために。

充分な架橋が行われるか行われたことが重要である。こ
れは次のような種々の方法によって達成され得る。例え
ば１部分的な架橋が行われるように試料をあらかじめ加
熱しておくこと、または照射それ自体により必要なレベ
ルの架橋が行われるように照射を行う湿度を調整するこ
とにより達成され得る。このようにして、これらの条件
下において、少なくとも１０−６という低い無菌保証レ
ベルにまで滅菌するだけでなく、照射による架橋と分解
とのバランスが達成されることにより物理的特性の調整
が行われる。

（発明の構成） 本発明の方法は、特定の組成物を有するコラーゲン／鉱
質混合物に適用し得る。以下では、まず個々の成分の性
質、およびこれらの成分を混合物とする方法について考
察する。

蓋ｉ底豆 本発明の組成物には２種々のリン酸カルシウム鉱質成分
材料を使用し得る。ここで用いられているように、′リ
ン酸カルシウム鉱質”材料は、　Ｃａ”およびリン酸イ
オンから成る物質を意味し、この場合、微細構造、該リ
ン酸イオンのプロトン化伏態、または水和の程度には関
係しない。リン酸カルシウム鉱質材料には１次のような
種々の形態（例えば、市販品として利用し得る形Ｂ）が
あるニリン酸三カルシウム（例えば、　Ｓｙｎｔｈｏｇ
ｒａｆｔ＠リン酸三カルシウム）、あるいはヒドロキシ
アパタイト（例えば、　Ｐｅｒｉｏｇｒａｆ　＠　、　
Ａｌｖｅｏｇｒａｆ　＠　、　Ｉｎｔｅｒ−ｐｏｒｅ＠
、　ＯｒｔｈｏＭａｔｒｉｘ”　Ｈ＾−１０００”、ま
たはＯｒｔｈｏ−ＭａｔｒｉｘＴＭＨＡ−５００”ヒド
ロキシアパタイト微粒子状調製品）。ヒドロキシアパタ
イトまたはリン酸三カルシウムは、以下のような既知の
方法でも調製し得る：例えば、　Ｔｅｒｍｉｎｅ　ら、
　Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ影響復ｖ−（１９７０）　
１４０　：　３０７−３２５．またはＨａｙａｓｈｉ　
＋に、ら、　Ａｒｃｈ　０ｒｔｈｏ　　Ｔｒａｕｍａ　
Ｓｕｒ　　（１９８２＋前出）によって開示された方法
。いずれにしても、鉱質は。

−ｉに非生物起源のものが好ましく、適当な細かさの粉
末として供給される。好ましい粒子サイズは、１００〜
２０００μｍの範囲内である。この目的のためには、骨
の鉱質内容物を採集し、精製し得るが、より経済的に調
製し、ｔＮ整した組成物が１価格および品質の両面から
好ましい。ブロック状の固体が必要な場合には、以下に
述べるように、微粒子状の形態の物からこれらを°調製
する。

−ジ立：セ４Ｚ 本発明の組成物におけるコラーゲン成分は、その効能が
重要である。本発明に用いるのに適当なコラーゲンは、
精製されたアテロペプチドの細繊維状再生コラーゲンで
あり、典型的には皮膚から調製される。

多数の形態のコラーゲンが調製されているが。

これらのコラーゲンは、生体和合性だけでなく物性につ
いても異なっている。混合物が溶液、コロイド、または
懸濁液のいずれかであるかに依存する直径範囲内に粒子
サイズを特定することが意図されない場合には、単一の
一般名“コラーゲン分散体”を用いる。この用語は、コ
ラーゲンの粒子サイズが特定されないような、水性媒体
中のいかなるコラーゲン調製物をも意味する。すなわち
。

この調製物は、溶液、懸濁液、あるいはゲルであり得る
。

天然のコラーゲンは、主として三重らせん構造からなる
。この三重らせん構造は、２つの付加的なアミノ酸（通
常、プロリンおよびヒドロキシプロリン）に結合したグ
リシンからなるトリブレット配列の繰り返しを有する。

天然のコラーゲンは。

トリブレットグリシン配列を有さす、従ってらせんを形
成しない、各末端領域を含む。これらの領域は、はとん
どのコラーゲン調製物に関係した免疫原性の原因と考え
られる。この免疫原性は、これらの領域を除去し、′ア
テロペプチド”コラーゲンを生産させることによって軽
減し得る。これは、トリプシンおよびペプシンのような
タンパク分解酵素による分解で達成し得る。また、非ら
せんテロペプチド領域は、天然で生じる架橋の原因であ
る。アテロペプチドコラーゲンは、架橋が必要な場合に
は９人工的に架橋しなければならない。

天然に存在するコラーゲンは９個々の鎖のアミノ酸配列
、炭水化物含量、およびジスルフィド架橋の有無に従っ
て、約１０タイプのサブクラスに分類されている。最も
一般的なサブタイプは、■型と■型である。■型は皮膚
、股、および骨に存在し、繊維芽細胞によって生産され
る。■型は主として皮膚に見い出される。他のタイプは
特殊化した膜または軟骨、あるいは細胞表面に存在する
。

Ｉ型および■型は、これらのらせん中に同程度の数のア
ミノ酸を含み、高い相同性を有する；しかしながら、■
型は三重らせんのＣ末端に２つの隣接したシスティンを
含んでおり、鎖間で架橋を形成し得るが、■型はこのよ
うなシスティンを含んでいないため架橋を形成できない
。

それゆえ、コラーゲン調製物は、最初の組成物（これは
、その起源に依存する）によって、あるいは調製方法に
よって互いに異なり得る。腎由来のコラーゲンは９例え
ば■型コラーゲンだけを含んでいる；ところが皮膚由来
のコラーゲンは■型も含んでいる。また、調製工程にお
いて、テロペプチドは除去しても、しなくてもよい。こ
のように、変化していないコラーゲンおよび“アテロペ
プチドコラーゲンの両方が調製され得る。架橋は故意に
または偶然に行われ得る。γ線照射または高温加熱によ
って滅菌することにより架橋し得るが、架橋の程度また
は性質は調節されない。また、この場合、三重らせんの
部分分解が起こる。

種々の方法（グルタルアルデヒドを用いた処理を含む）
によって、故意に架橋を実施し得る。おそらくもっと微
細な原因から生じる相違は、おそらく調製方法の細部の
変更の結果である。例えば。

コラーゲンは、可溶化され、そして再沈澱されるか、あ
るいは単に細かく粉砕され、そして懸濁状態に保たれ得
る。この可溶化された物質が再凝集する場合には、この
凝集が、非特異的に結合した固体を形成するように行わ
れるか、あるいはコラーゲンが、天然の形態を擬領した
繊維に再生され得る。また、もちろん純度は変化し得る
。

ここで用いられるように、コラーゲン調製物に関して“
不純物を含まない”または“精製した“′というのは１
通常、天然の状態でコラーゲンに結合している不純物に
関して述べたものである。従って、子ウシの皮から調製
したコラーゲンは、子ウシの皮の他の成分が除去される
場合には、不純物を含まない；骨から調製したコラーゲ
ンは、骨の他の成分が除去される場合には、不純物を含
まない。

“再生”コラーゲン、とは、テロペプチドの伸展を伴°
うか、あるいは伴わずに１個々の三重らせん分子に分解
され、溶液とされ１次いで°“細繊維状パの形態に再構
成されたコラーゲンを意味する。この形態では、原繊維
は、長くて薄いコラーゲン分子から成り、その長さの約
１７４の倍数だけ互いにずれている。このようにして、
帯状構造が生じ。

該帯状構造がさらに凝集して繊維となり得る。

“°実質的に架橋していない”コラーゲンとは。

アテロペプチドが除去され、従って天然の架橋形成能力
を欠くコラーゲンを意味する。例えば、グルタルアルデ
ヒドで処理するか、あるいはそれ自身が架橋を生じる処
理（例えば、滅菌を目的としてしばしば用いられる。高
温処理およびγ線照射）を受けることによって、故意に
架橋されない場合、　には、これらの調製物は実質的に
架橋していない状態を保つ。高温処理およびγ線照射は
、適当な条件下で行う場合について、ここに述べられて
いる。

本発明の混合物に適する１つのコラーゲン調製物は、ア
テロペプチドコラーゲンである。このアテロペプチドコ
ラーゲンは、細繊維状の形態に再生され、５〜１００■
／ｄ、好ましくは約５０〜７０■／ｄの分散体として与
えられる。Ｚｙｄｅｒｍ　＠コラーゲン移植体（ＺＣＩ
）のような分散体が適当である。このＺＣＩは、生理食
塩水中に３５■／−または６５■／−のコラーゲンを含
有する調製物として市販されている（製造元：コラーゲ
ンコーポレーション。

パロアルト、カリフォルニア）。本発明の組成物に用い
る場合、　ＺＣＩまたは他ｄコラーゲン分散体は、リド
カインまたは他の鎮静剤、を使用せずに用いられる。こ
こで用いられるように、　“ＺＣＩ”とは。

コラーゲン成分それ自身よりむしろコラーゲンの水性分
散体を意味する。

コラーゲン　ム　°人 本発明の組成物は、最終には照射を受けるが。

一般に、まず５０〜８５重量％のリン酸カルシウム鉱質
成分、好ましくは６５〜７５重量％の鉱質成分を混合す
ることによって調製される。この際、該組成物は、水性
媒体中におけるコラーゲン分散体（例えば、　ＺＣＩ）
としてのバランスを保って調製される。

鉱質／コラーゲンの割合（コラーゲン分散体の水分含量
を除く）で表現すると、これらの混合物は。

６０〜９８％、好ましくは７５〜９８％が鉱質であって
。

残りはコラーゲンである０組成物は、二成分を完全に混
合して、凝集した固まりにすることによって容易に調製
し得る。また、混合物は所望の形（例えば、ブロック、
方形物、薄板）に成形し得る。

乾燥生成物または湿潤生成物のいずれかに対し。

例えば０．００１−０．１％程度のグルタルアルデヒド
を用いて、架橋を反復することができる。これについて
は以下でさらに述べる。

次いで、この混合物は、水分含量が１％より少なくなる
まで乾燥させ、以下に述べる本発明の滅菌照射法を行う
前に、再び水和させるか、あるいは加熱処理を行う。コ
ラーゲン／鉱質の組成割合。

および水分含量は、以下のように計算される：コラーゲ
ンおよびミネラルの割合は、水を含まない。

これら二成分だけの全重量に対する乾燥重量として与え
られる。水分の割合は、全重量（すなわち。

水＋コラーゲン＋ミネラルの！Ｉｆ）で水の重量を割っ
て１００倍したものである。

照射工程から得られた滅菌物質は、鉱質／コラーゲンそ
れ自体として用いるか、あるいは付加的な成分と混合し
得る。これらの付加的な成分は。

患者に投与するのに適当なものであって、やはり滅菌さ
れる。これらの調製物は、コラーゲンおよび鉱質に関し
て記述されているが、常に湿潤した状態で患者に供給さ
れるものであり２元々の混合物における固有の水分を含
有するか、あるいは投与前に滅菌水または生理的食塩水
で再び湿潤化されるかのいずれかである。さらに、化合
物の効能を向上させるように意図された成分（例えば、
血液または骨髄）が添加され得る。上述のように。

コラーゲンおよび鉱質の割合は、これらの相対量を表し
ている。コラーゲン／鉱質混合物は、場合によっては、
適用された全調製物の１０％程度しか形成し得ない。い
かなる添加剤も滅菌されるか。

あるいは例えば血液の場合のように、滅菌が不適切であ
るような起源から誘導されなければならない。

°人　に　まれる量 コラーゲン／硬質混合物は、それ自体が用途に応じた特
定の物理的性質を示す必要がある。特に。

ある形をとるのに充分な弾性が必要である。しかし、同
時に圧力が加わった時に全体の形がくずれないような充
分な剛性が必要である。圧縮に対する抵抗力は２体積弾
性係数として測定することができる。これは、アメリカ
ン　ソサイアテイ　フォー　テスティング　マテリアル
ズ（ＡＳＴＭ）から出ている体積弾性係数測定指針に従
い、インストロン　ユニバーサル　テスティング　イン
ストロンｌ−４２０２型のような市販の装置を用いて測
定できる。

この測定を行うには、上記混合物をまず生理食塩水中に
５〜２４時間浸漬する。この物質は移植される場合湿潤
状態となるので、この浸漬処理はより適切なデータを従
供する。この浸漬処理は、完全な湿潤状態を与えるよう
に充分な時間実施され；次いでその混合物か試験装置に
かけられる。物質に弾力性がある場合、それ以上圧縮す
るためには微視的レベルでその物質固有の構造を破壊す
る必要があるような点に達するまでは、容易に圧縮され
る。物質が剛性であれば１弾力性のある物質よりもより
少ない変形でこの点に達する。コラーゲン／鉱質混合物
については、微視的構造は第１に三重らせんそれ自身に
より維持される。しかしまた、小繊維の個々の構成成分
のコラーゲン三重らせん部分間の相互作用および小繊維
どうしの結合によっても維持される。これらのレベルの
構造のいずれをも破壊するような圧縮は、一般に中空空
間の体積を減少させるような圧縮よりも困難である。も
ちろん９組成物中のコラーゲン鎖がより高度に組織化さ
れ、架橋されている程、この微視的な圧縮はより困難で
ある。

このように、高い体積弾性係数（Ｎ／ｃ１ａで測定）は
、微視的レベルでの高レベルの組織化、特に高レベルの
架橋を示す。低い体積弾性係数は、架橋度が低い５とを
示す。適当な物理的取扱い特性。

および移植体としての完全な状愈維持については。

適度に体積弾性係数が高い事が重要である。つまり、少
なくともｌ０Ｎ１０１ｔかそれ以上、そして３５〜４５
Ｎ／ｃ−程度の高さであり得る。体積弾性係数の上限レ
ベルは、物質の性質によるのであって、このタイプの混
合物は、実際にいかなる架橋度においても１００Ｎ／ｃ
ｄを大きく越えた係数値に達することはできないと考え
られている。いずれにせよ１本発明の組成物について適
度な物理的特性を維持するのに１体積弾性係数が１０Ｎ
／ｃｍ２１以上であり、好ましくは範囲が１０〜６ＯＮ
／ｃｗｔであり、最も好ましくは２５〜４５Ｎ／ｃｆｆ
ｌであることが重要である。本発明の方法に従って処理
をして得られた組成物は、適当な圧縮抵抗強度が得られ
ていることを実証するためのこの測定により評価される
。

この混合物は微視的レベルでの完全状態を維持すること
が必要であるが、一方では９周辺の硬い組織が移植体の
内部へ成長するのを可能にする生物学的特性を有するた
めに、充分多孔質であり。

侵入を受は易いことも必要である。そして、この混合物
は被検体内に置かれた場合、いくつかのケースにおいて
再吸収能を示す必要がある。しかし。

この性質は至適には適度に備わっている程度で良く、最
大限備わる必要はない。このことは、コラーゲン細繊維
の適度な分解として考えらえており。

これにより被検体内に置かれた時に生物学的作用を受は
易くなる。

この特性のインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での測定の
１つとして、トリプシンによる加水分解の受は易さ、ま
たは「トリプシン感受性」がある。この測定をするには
、試料をタンパク質分解酵素であるトリプシンで処理す
る。トリプシンは、コラーゲンタンパク質の断片化され
た部分のみを攻撃し得る能力を有する。加水分解の程度
は、可溶化されたペプチドをフルオレサミン分析する事
により測定される。そしてその結果は、非らせんコラー
ゲンの百分率で表される。例えば、比較すると、コラー
ゲンのゼラチン調製物は１００％非らせん、溶液中のコ
ラーゲンは約１０％非らせん、およびｚＣ■は１０％非
らせんである。望ましい範囲は、この物質の使用目的に
よる。

微視的レベルでの切断状態の他の測定法としては、示差
走査熱量測定（ＯＳＣ）で測定される転移温度がある。

転移温度が低くなるということは、トリプシン感受性測
定によるのと同様、微視的レベルでの切断が増加してい
る事を示している。

本発明の方法は、前述のパラメーターを調整し。

至適の物理的および生物学的適合特性を達成する。

また、この方法によれば、少なくともｌｏ−６程度の滅
菌レベルを保証するように物質が効果的に殺菌される。

発１１と引決 滅菌および物理的性質の至適化は９組成物をγ線照射源
を用いて０．５〜４　Ｍｒａｄ、好ましくは１〜３　Ｍ
ｒａｄ、および最も好ましくは２．５〜３　Ｍｒａｄの
範囲で照射することにより達成される。これらの照射量
は、コラーゲンのみを含有する調製物を効果的に滅菌す
ることが知られている。（Ａｒｔａｎｄ　；前出を参照
のこと）。放射線照射工程それ自体は。

食品、化粧品などの滅菌処理として当業者に公知の標準
法を用いて実施される。放射線照射は　１３１１゜１３
７ｃｓまたは最も一般的には６６　ＣＯのようなγ線照
射源を用いて実施される。これらの材料は標準的な形態
で供給され、そして、制定された指針に従い、　ＡＢＣ
許可を受けた者によって標準装置を用いて試料に適用さ
れる。参考文献としては、アソシエーション　フォー　
アドバンスメント　オプメディカル　インスツルメンテ
ーション（ＡＡＭＩ）の推薦法として発行されている「
医療装置のガンマ線照射滅菌についての工程制御ガイド
ライン」（１９８４）がある。また、′技術報告シリー
ズ第１４９；“医療材料および生物学的材料の放射線滅
菌の手引き”　、　Ｉｎｔｌ　Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅｒ
ｇｙ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ、　Ｖｉｅｎｎａ１９７３
も挙げられる。

試料への放射線照射を行うときの重要な因子は。

照射線総量（Ｍｒａｄ）および放射線照射中の試料の状
態である。他の因子１例えばエネルギ：が供給される割
合、放射線照射の延べ時間、照射線源か。

らの試料の距離などは、全照射線量に対するそれらの組
合せの効果を除いては、一般に無関係である。

放射線照射をされる試料の状態は最も重要であり、本発
明の基礎をなすものである。試料は、放射線照射を受け
る前に所望のレベルに架橋しておくことが必要であり、
またはこの試料を、放射線照射中に放射線照射それ自体
によりこの架橋が生じるような状態に置くことが必要で
あり、もしくはこれらの因子の組み合わせを採用するこ
とが必要である。

本発明を実施する好ましい方法の１つでは、γ線照射を
している間、この混合物が１〜６％、好ましくは、１〜
２％で水分を含有するように設定される。これを最も簡
便に行うには、まず３５〜４５℃３好ましくは３５〜３
７゛Ｃでの加熱乾燥により試料の水分を１％以下にして
２次いで５０〜９５％相対湿度（Ｒ１１）で３５〜４５
℃、好ましくは５０〜８０％ＲＨで３５〜３７℃３にお
いて６〜２４時間処理することにより混合物を再水和し
、所望の平衡水分量とする。所望の範囲の水分量が得ら
れているかどうかを確認するためには、ハ■Ｌ匹的ｍ、
　（１９３５）移：３９４でＦｉｓｃｈｅｒ、　Ｋ、が
記述しているような標準的方法により水分量の測定がで
きる。所望のレベルの水分量とするための他のプロトコ
ルも用いることができ、上述と同様に水分量が確認され
る。混合物が所望のレベルの水分量を有するならば、上
述の放射照射線量を照射する。放射線照射すると、その
間に所望のレベルの架橋結合が生じる。

他の実施態様においては、放射線照射前に加熱処理する
ことにより架橋結合が誘導される。１つの好ましいプロ
トコルでは、まず試料を乾燥して。

上記のように水分含量を１％を下まわるように。

または好ましくは０．５〜１％とす、る。次いで、２０
〜８０％相対湿度、好ましくは５０〜６０％相対湿度で
。

約６０〜９０℃好ましくは７０〜８０″Ｃにおいて、４
〜２４時間加熱し１体積弾性係数で測定される所望の量
の架橋結合を生じさせる。適当な体積弾性係数の値は、
　１０〜４５Ｎ／ｃｉｌ！である。このレベルの架橋結
合を達成させる他の方法も利用できる。この方法は。

グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドのような架
橋側による処理を包含する。いずれにせよ。

試料は適当な架橋測定値（体積弾性係数で規定される）
が得られるまで、これらの架橋処理を受ける。次に、そ
の試料の放射線照射を実施する。

このように、最初の実施態様では、試料中の水分の存在
の故に放射線照射の間に架橋結合が生じると考えられる
。第２の方法では、放射線照射処理前に架橋結合を形成
しておくと滅菌中に架橋はそれほど増加しない。しかし
、上述の２つの処理の組み合わせも明らかに採用され得
る。つまり。

放射線照射前の処理において架橋の度合を減少させ、所
望の工程を完全にするように照射中の試料の水分含有量
を調節することにより、採用されうる。以上のような好
ましい方法の概略を第１図に示す。

放射線照射処理においては、上述のように照射処理に適
した組成物を、含有される試料の滅菌状態を保つため、
試料をγ線照射に適した材料で包装する。次いで標準方
法に従い、０．５〜４　Ｍｒａｄの放射線照射を行う。

このとき包装された試料は。

滅菌状態で適当な形に再形成され、被検体に利用される
。このように使用するには、まず試料を滅菌条件下で包
装から取り出し、滅菌食塩水に浸漬するか、または必要
なら血液や骨髄と混合し、所望の目的に使用する。

則羞Ｊ１ゴ九里 得られた組成物は、骨を増強したり欠損した骨の埋め合
わせに使用される。例えば、歯周前、抜歯窩、顎嚢に使
われる。重要な例であるアンシー法には歯槽隆線の増強
術が包含される。外科の移植の方法は当該分野で公知で
ある。歯槽隆線増強では、増強が必要な骨膜下にこの組
成物を挿入する。整形外科法や再構成法に適用する場合
には。

特に移植片に応力がかかる場合には、多孔質ブロックの
形の鉱質も用いられる。コラーゲンをしみ込ませたブロ
ックの移植はまた。標準的な外科的技術で実施される。

（実施例） 以下の実施例は２本発明を例示するためのものであり２
本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

鉱質／コラーゲン調製物は、リドカインを用いずに、６
５重量部のＯｒｔｈｏＭａｔｒｉｘ”　）ＩＡ−１００
０”ヒドロキシアパタイトと、３５重量部のＺｙｄｅｒ
ｍ”コラーゲン移植体（ＺＣＩ　；　６５■／−）を混
合して得た。

（ＺＣＩは生理食塩水中に６．５％のコラーゲンを含む
調製物であるので、最終的な組成ハ、■へ６５重置部、
コラーゲン２．３重量部（０，０６５Ｘ３５）および生
理食塩水３２．７　（３５−２，３）重量部である）。

この混合物を完全に混合し、その内の０．５５ｄを押し
出してブロックとし９層流フード下、３６〜３７℃で約
４８時間乾燥した。得られた調製物の水分含量は０．８
７％であり、これはＦｉｓｃｈｅｒ、　Ｋ、＋　ハ銭Ｌ
０憇ユ（１９３５）４８　：　３９４の方法により測定
した。この組成は、　０．８７重量％の水、　３．３７
重量％のコラーゲン、および９５．７６重量％の鉱質で
ある。

実施例１に従って調製したブロックをガラスびんに入れ
、再水和を行った。２０個のガラスびんを。

相対湿度７５％、３５℃で約２４時間インキュベートす
ることにより、ブロックを得た。該ブロックの水分含量
は１．８６％と測定された。これらブロックのうち１０
個を、相対湿度９５％、３６〜４３℃にてさらに１５時
時間数置し、水分含量５．９％を得た。

乾燥試料および再水和した試料を、０．５〜３　Ｍｒａ
ｄにわたって総照射線量のレベルを変えた照射に供した
。体積弾性係数に対する照射の結果を第２図ａに示す。

同じ＜、トリプシン感受性に対する照射の効果を第２図
すに示す。これらの結果は、　１．８６％の水分含量を
有する試料は、照射によって２体積弾性係数の点で強化
されたが、それらのトリプシン感受性はそれ程増加しな
いことを示している。

対照的に、再水和を行わなかった試料は、照射によって
、かなりの断片化を示し、圧縮強度は大きくは改善され
ていなかった。（転移温度をＤＳＣにより測定したとこ
ろ、全ての試料は適度の減少を示した。） 上述の操作を繰り返し、今回は水分含量が１．２８％お
よび１．６２％になるように試料を再水和したところ、
それぞれ第３図ａおよび第３図すに示すように比較すべ
き結果を得た。さらに、より高い水分含量を有する試料
は、トリプシン感受性分析によれば、照射中にほとんど
断片化を示さなかった（第３図ｂ）が、第３図ａに示す
ように、照射中の体積弾性係数は著しく増加した。

尖旌拠主 によるτ八　〇を 実施例１と同様にして調製した試料をガラスびんに入れ
、そのうち１６個のガラスびんの栓をし。

相対湿度５０〜７０％、８０℃にて４８時間処理した。

これらの加熱処理された試料に対する照射の効果を。

加熱処理をしていないが初めに０．８７％の水分含量を
有する試料と比較した。加熱処理をした試料のトリプシ
ン感受性は、未照射の試料に対する１０％の非らせんコ
ラーゲンを示す値から、　　３Ｍｒａｄを照射した試料
に対する６０％の非らせん含量まで増加した。これは、
加熱処理をしていない試料については、非らせん性が照
射前の３％から３　Ｍｒａｄ照射後には約２５％となり
、かなり低い断片化を示すことと対照的である。熱処理
により試料の圧縮強度は著しく増加した。即ち、照射前
は約３５Ｎ／ｃｄｌと測定され、全照射線量の範囲にわ
たってこの値を維持した。

別の実験では、相対湿度５０〜７０％、８０℃にてわず
か６時間半加熱した。　０．８７％の水分を含む試料は
、また体積弾圧係数３５Ｎ／ａｌｌを示した。

このように、加熱処理をした試料は、照射後も圧縮に耐
える能力を保持するが、トリプシン感受性が増大するよ
うである。

押し出した混合物を、乾燥前に、相対湿度９０〜９５％
、２６〜３４℃にて７２時間インキュベートすること以
外は、実施例１と同様にして調製し、水分含量が０．４
８〜０．４９％の試料を得た。このブレインキュベート
した混合物を、相対湿度５０〜７０％、８０℃にて９時
間の長さを変えて処理したところ９体積弾性係数の着実
な増加を示し、加熱処理を行わない場合の１５Ｎ／ｃｆ
ｆｌから、８０℃にて４時間加熱後は２５Ｎ／ｃｊ、　
　８時間加熱後は３ＯＮ／ａｉｌ　、そして１２時間加
熱後は４ＯＮ／ｃｄに増加した。従って、加熱処理は、
照射を行う場合と同様に、乾燥試料の圧縮率を高、める
のに有効である；しかじ、必ずしも滅菌がもたらされる
わけではない。

（発明の要約） γ線照射を用いた本発明のコラーゲン／鉱質組成物滅菌
法は、所望の取り扱い性と生体和合性を有する生成物を
製造し得る条件下で実施される。

４　　′　　の　　　な苦′日 第１図は１本発明を行うための選択的方法を示すダイア
グラム；第２図ａは１種々レベルの照射においてコラー
ゲン／鉱質混合物の水分含量が体積弾性係数に及ぼす影
響を示すグラフ；第２図すは、該水分含量がトリプシン
惑受性に及ぼす影響を示すグラフ；そして、第３図ａお
よび第３図すは、第２図ａおよび第２図すのそれと同様
に独立して定量した結果を示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生体和合性を有し、体積弾性係数が少なくとも１０
   Ｎ／ｃｍ＾２であり、無菌保証係数が少なくとも１０＾
   −＾６程度に低い骨移植調製物を調製する方法であって
   、該調製物は、水分を除いて、２〜４０重量％の再生細
   繊維アテロペプチドコラーゲンと６０〜９８重量％のリ
   ン酸カルシウム鉱質との混合物であるコラーゲン／鉱質
   組成物を含み、 該方法は、該組成物に０．５〜４Ｍｒａｄのγ線を照射
   することを包含し、 該組成物は、該照射中に１〜６％の水分を含有する、 方法。 ２、前記組成物が、前記照射中に、１〜２％の水分を含
   有する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、照射前に、コラーゲン／鉱質組成物を、水分含量が
   １％より少なくなるまで乾燥し、次いで該組成物を、水
   分含量が１〜６％になるように再水和させる工程をさら
   に含む、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、前記再水和が、コラーゲン／鉱質組成物を、相対湿
   度５０〜９５％、３５〜４５℃にて６〜２４時間インキ
   ュベートすることによって行われる、特許請求の範囲第
   ３項に記載の方法。 ５、生体和合性を有し、体積弾性係数が少なくとも１０
   Ｎ／ｃｍ＾２であり、無菌保証係数が少なくとも１０＾
   −＾６程度に低い骨移植調製物を調製する方法であって
   、該調製物は、水分を除いて、２〜４０重量％の再生細
   繊維アテロペプチドコラーゲンと６０〜９８重量％のリ
   ン酸カルシウム鉱質との混合物であるコラーゲン／鉱質
   組成物を含み、 該方法は、該組成物に０．５〜４Ｍｒａｄのγ線を照射
   をすることを包含し、 該組成物は、０．５〜１％の水分を含有する場合には、
   予め加熱処理され、体積弾性係数１０〜４５Ｎ／ｃｍ＾
   ２に相当する架橋が行われている、方法。 ６、前記加熱処理が、相対湿度２０〜８０％、６０〜９
   ０℃にて４〜２４時間行われる、特許請求の範囲第５項
   に記載の方法。 ７、前記照射線量が１〜３Ｍｒａｄである、特許請求の
   範囲第１項または第５項に記載の方法。 ８、前記混合物のコラーゲン含量が２〜５％である、特
   許請求の範囲第１項または第５項に記載の方法。 ９、特許請求の範囲第１項または第５項に記載の方法に
   より調製される骨移植材料。 １０、体積弾性係数が２５〜４５Ｎ／ｃｍ＾２である、
   特許請求の範囲第９項に記載の生成物。 １１、生体和合性を有するコラーゲン／鉱質組成物であ
   って、 水分を除いて、２〜４０重量％の再生細繊維アテロペプ
   チドコラーゲンと６０〜９８重量％のリン酸カルシウム
   鉱質とを有する混合物を含み、 体積弾性係数が少なくとも１０Ｎ／ｃｍ＾２であり、無
   菌保証係数が少なくとも１０＾−＾６程度に低いような
   組成物。 １２、水分含量が０．５〜６％であり、体積弾性係数が
   ２５〜４５Ｎ／ｃｍ＾２である、特許請求の範囲第１１
   項に記載の組成物。 １３、所望の水分含量を有するコラーゲン／鉱質組成物
   を得る方法であって、 前記混合物を水分含量が１％より少なくなるまで乾燥す
   ること、および 該乾燥した混合物を相対湿度５０〜８０％、温度３５〜
   ４５℃にてインキュベートすることにより再水和するこ
   と、 を包含する方法。