CN110354310A - 后巩膜加固术用生物补片及其制备方法 - Google Patents

后巩膜加固术用生物补片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种眼后巩膜加固术用生物补片及其制备方法，取异种动物牛、马、猪的心包经去杂质、脱脂、脱细胞、梳整纤维、减薄、增厚、交联、成型、包装、灭菌工艺处理后，最大程度的使心包厚度趋于一致，并可控制材料抗拉延伸率、改善其生物力学、提高生物相容性、增强材料的抗降解能力，成为眼后巩膜加固术用生物补片；本发明可极大的提供心包材料的可利用面积，提高补片合格率，降低生产成本。生物补片呈紫蓝色、梭形或条带状，定荷拉伸率≤3%，含水率＞300%，厚度0.2～0.80mmm，长度30～50mm，宽度10～20mm，用于治疗高度近视及其引发的视网膜脱落和黄斑劈裂，终止其发展、恢复视力是可靠和有效的。

Description

后巩膜加固术用生物补片及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种眼科用医疗器械，具体是治疗高度近视的眼后巩膜加固术用生物补片及其制作方法。
背景技术
患者因遗传和环境因素致眼后巩膜厚度变薄、强度减弱而发生持续性扩张，眼轴不断延长表现为负屈光度数不断增加使高度近视呈进行性加重；后巩膜的持续扩张还可导致视网膜脱离，随着病程的不断进展，患者多在成年后因发生眼底病变而致盲。据统计，中国学生在小学、中学、大学的不同阶段近视眼发生率分别是30%、50%、70%，其中又有5—20%发生高度近视。
目前对高度近视的矫正手段有：佩戴眼镜、激光切削角膜、前房带晶体植入人工晶体；但也仅可矫正视力，无法防止高度近视的进行性加重；另外激光手术对角膜切削不适用于超过600°(-6D）的高度近视，有造成圆锥角膜和在角膜疾患时发生穿孔而致盲的风险。
目前学界广泛认可后巩膜加固术是控制高度近视病程进展的唯一手术，其原理是：将加固补片移植固定在后巩膜外表，使后巩膜细胞迁徙到生物补片的网架中生长，补片与后巩膜融合形成厚度增加的新巩膜，后巩膜强度增加，扩张被限制，终止眼轴延长和近视屈光度数增加，保护脉络膜和视网膜，阻止眼底病变的发生和加重。
近年来实验研究发现，后巩膜加固术在术中固定补片时加压缝合，使后巩膜受到前后方向半环状带扣压使眼轴缩短，可用于高度近视性黄斑劈裂和黄斑区视网膜脱落的治疗。
后巩膜加固术用材料分两类：生物材料和非生物材料。生物材料来源于生物体，包括自体材料，异体材料和异种材料；自身材料来源于自身如阔筋膜，取材繁琐且造成患者新的创伤；异体材料和异种材料包括异体动物的巩膜、硬脑膜等。
同种异体材料来源稀缺且法规禁止其作为商品交易；非生物材料有硅胶，涤纶布，某些高分子材料的凝胶等，这些材料来源广泛，植入人体后不易降解，张力和韧性可靠，不易被拉伸延长，但组织相容性差，会发生慢性无菌性炎症-免疫反应。
中国专利CN 102525729 B 公开了一种用牛、马、猪的心包或硬脑膜制备人眼后巩膜加固术用生物补片的技术方案。
所述动物的硬脑膜凸凹不平如同核桃皮，血管呈脉络样分布，厚薄不均，难寻合适的表面积用于手术，补片成材率极低。
所述动物的心包组织结构是由胶原纤维与弹性纤维组成，胶原纤维的原纤维平行排列成较粗大的束，其三股螺旋由二条α1链及一条α2链构成，每条α链约含1050个氨基酸残基，有重复的Gly-X-Y序列构成。X-脯氨酸，Y-羟脯氨酸或羟赖氨酸残基； 该序列使α链卷曲为左手螺旋，每圈含3个氨基酸残基。三股这样的螺旋再相互盘绕成右手超螺旋，即原胶原；原胶原分子间通过侧向共价交联，相互呈阶梯式有序排列聚合成直径50—200nm，长150nm至数微米的原纤维，在电镜下可见间隔67nm的横纹。
随着植入时间的持续，宿主组织内胶原酶作用使得补片表面层的胶原纤维降解，补片内层胶原纤维的残基处于游离状态，诱发宿主内皮细胞浸入对其覆盖遮掩，引起宿主组织无菌性炎性反应和免疫反应，进一步加快对补片的降解速度；造成宿主后巩膜无法与补片形成有效的融合，无法形成新的加固后的新巩膜，导致后巩膜在补片被完全降解后继续扩张、术后远期疗效下降、高度近视复发呈进行性加重，最后使手术失败。
天然的胶原纤维和弹力纤维呈整齐的弯曲状排列，可被外力作用延伸扩张，即使在交联后，其拉伸延长率仍在30%左右，用于眼后巩膜加固术后容易被扩张的宿主后巩膜拉伸延长，眼轴继续延长、降低手术的远期疗效。
所述动物（牛、马、猪）的心包材料是一种亲水性生物材料，具有纤维定向性，可控制交联度，经过目前公开的生物工程技术处理、呈现弱抗原性，生物相容性好，植入体内无排异反应，与细胞亲和力高，可刺激细胞增殖、分化和生物降解等优良特性；在植入人体后，可被降解为氨基酸、短肽成为组建细胞的源材料或通过代谢途径排出体外。（亲水材料对细胞的贴服、生长和营养物质的传递至关重要。）
目前：牛心包在心血管外科用于先心及心血管的修补——（心脏瓣膜、新血管替代）；用于脑膜的修补——（外伤、脑内手术，修补防止皮下与脑组织粘连，防止手术癫痫的发生）；用于眼科整形——（支撑、加固、修复、睑下垂的吊带）； 用于普外手术——（腹壁缺损，如腹股沟疝）。作为外科植入物，须保障生物相容性、生物功能性。
以目前公开的技术方案以动物心包制备生物补片，通过脱细胞洗涤和交联去除了抗原性，增强了材料的韧性、强度；但并未修正材料的弹性，拉伸率。虽然有优良的生物相容性，但不能满足后巩膜对补片的生物功能性要求，无法保障手术疗效，
眼后巩膜加固术用生物补片的生物力学要求是：补片在许用强度下的弹性伸长率＜3%。
对眼后巩膜加固材料的生物力学要求，必须要优于天然巩膜。
有必要提出新的制备方法，克服上述技术方案中的不足，为后巩膜加固手术提供不弱于天然巩膜属性的眼后巩膜加固术用生物补片，以满足众多患者诊疗高度近视的需要。
京尼平是一种环烯醚萜类杂环化合物，具有羟基、羧基等多个活性官能团，是一种优良的天然交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料用于临床医学诊疗过程，如人造骨骼、组织修复、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛（其毒性是戊二醛的万分之一）和其他常用化学交联剂。也具有除抗原作用，可以与胶原分子中的赖氨酸、羟赖氨酸、精氨酸等残基的游离氨基反应。细胞毒性低，是因为京尼平形成的环形交联比其他的网状交联及线状交联更加稳定。京尼平与氨基酸反应生成蓝色色素，蓝色物质可能由京尼平和甲胺反应产生，由40—44个单体组成，这提示，它可在胶原分子内部形成环状结构的分子交联； 京尼平交联胶原较其他交联方法有最大的热收缩温度（TS）、弹性模量、拉伸强度；且植入人体后，不易发生钙化。交联后的生物膜材料韧性、机械强度及抗降解能力等性能与交联度有关，随着交联度的提高，韧性增加，机械强度提高，抗降解能力提高，但随着材料硬度增大其顺应性下降。交联度与交联反应的条件，如温度、PH值、交联剂浓度和交联时间等有关。
发明内容
本发明的目的是为眼后巩膜加固术提供一种不弱于人眼后巩膜生物力学及功能要求的异种异体生物补片；同时提出实现上述要求的异种异体生物补片的制备方法。
本发明包括如下步骤：①取材制备毛坯：a.取新鲜检疫无疾病的成熟牛、猪、马的心包，去除杂质、脂肪、系带，消毒清洗；b.使用洗涤剂去除脂肪，以生理盐水冲洗3次；c.将有破损的、心脏大血管出入口处明显增厚不适合应用的部分剪除；d.将上述制备的心包毛坯材料置入消毒液内保存备用。②脱细胞制备基材：a.将心包毛坯材料浸入脱细胞溶液内，2～8h，使心包内细胞结构被破坏、溶解，b.将上述脱细胞处理后的毛坯材料使用PBS溶液洗涤3次，每次5min；上述步骤a.和步骤b.重复三次，得到脱细胞后的细胞膜基材；③掩膜梳整：a. 取上述脱细胞心包基材适中部分，制作测试标准样，测得其断裂强度并记录；b.将待处理的心包基材平铺在交联支架上，在毛坯材料的外周以支架为支撑施加外向作用力，该作用力是心包断裂强度的40～60%；使心包整体被拉伸呈完全平整状态，手触之可有弹性扩张；c.以连续数字厚度尺或电子厚度扫描仪，得出心包基材的厚度地形图；d.取平均厚度，标示出超厚区域（＞20%平均厚度）和超薄区域（＜20%平均厚度）边缘；e.先对超薄区域施加局部热变性处理：使材料发生热皱缩变性，厚度增加60%以上；f.对其他区域进行局部热蒸汽变性处理、全层轻度热挛缩变性，使其胶原纤维内外层的原胶原残基完全裸露；g.在材料四周施加外向作用力，力值是上述断裂强度的90%～95%，拉伸材料使所有区域的厚度趋于一致，误差＜±10%；h.保持外向拉力下，在交联支架上固定基材。所说的热皱缩处理温度在85～100℃；处理时间在3Sec～3min；蒸汽处理的时间在3～10Sec；④交联制备精材：a.将上述交联支架及心包基材完全浸入交联剂溶液内处理；b.交联（设备）参数是：温度4～ 35℃；时间24～168h；晃动角度＞±1°；摆动频率1～50次/min； 交联剂溶液PH值5.0～14.0范围内；c. 交联剂：所述的交联剂是浓度为0.25～2.0%京尼平溶液，溶剂可以是下列液体的一种：1～20%的酒精、生理盐水、无菌去离子水或蒸馏水；d.心包基材与交联剂溶液之比为10～30%（W/V）；e.观察交联过程，心包基材逐渐与交联剂发生化学反应，胶原纤维和弹力纤维之间发生分子间交联和分子内的交联，交联过程中，京尼平的活性官能团及心包胶原纤维的氨基酸残基发生交联后可形成一种多聚体深色（紫蓝色）无毒色素；观察颜色均一、稳定、基材质地增加、强度增加，韧性增加；基材内 外颜色一致时，交联基本完成；f.交联结束后，将心包由交联支架上取下，大体观察：基材应继续保持与支架上的平整、光滑、柔顺状态，且不再会发生如未进行梳整工序时的回缩、挛缩、形变现象。如此得到交联后心包精材，该精材在耐受许用强度及工作强度时的拉伸延长率＜3%。
所述的PH值调节、可用碳酸氢钠缓冲液对交联剂溶液PH值在5.0～14.0之间进行调整，PH值＜8时反应后心包呈蓝色，PH值＞8时反应后心包呈紫色。
⑤交联后处理：a.取交联后完整无裂口、厚薄基本一致的心包精材由交联器内取出，使用蒸馏水水反复清洗3次，每次3～5min；b.使用5～30%甘氨酸溶液对心包精材进行中反应，以消除残留的交联剂。c.再对心包精材使用蒸馏水进行漂洗3-5次，每次3—5min；
d.按规定制备测试样，测试交联后心包精材的生物力学特性：其断裂强度较未交联时提高（28～68MPa），不低于许用强度20MPa，远大于工作强度8～12MPa；心包精材的断裂拉伸率≤5%；定荷拉伸率≤3%；含水率＞600%。
⑥包装灭菌：a. 成型：选取完好、厚薄基本一致的经测试合格的精材裁剪成梭形或条带状的眼后巩膜加固术用生物补片；b.包装：将裁剪后的补片放入含有无菌生理盐水的泡罩容器内进行热合密封包装，包装机参数和密封性能需要工艺验证和确认，包装标识和编码要符合相关法规要求；c.灭菌，将包装完好的生物补片进行灭菌处理；灭菌方式可以是伽马射线、直线加速器、化学剂或环氧乙烷；灭菌设备和工艺参数及最终灭菌效果需经过验证和确认，保证灭菌质量的无菌水平符合法规要求；灭菌后成为眼后巩膜加固术用生物补片。
所述的步骤①取材中，牛心包来源是有3—5岁龄的非疫区饲养经过检疫检验定点屠宰的新鲜牛心包；猪心包是饲养一年以上的非疫区饲养经过检疫检验定点屠宰的新鲜猪心包。
所述的步骤②脱细胞溶液是指：TritonX-100、洗涤剂可以是PBS溶液；脱细胞方法还可以的以超临界CO2流体真空设备溶解脱细胞、反复冻融方式。
所述的步骤③梳整方法是：用万能电子材料试验仪，按照规范方法取得待处理牛心包测试样本，测得其断裂强度及延伸率；交联支架是可以夹持且可调节张力的环形或多边形紧固支架，材料是稳定的不与交联剂发生作用（反应）的材料制成；张力的调节可以使用拉力传感器或拉力机测得，也可通过断裂拉伸率比对获得。
所述的交联仪器是包含有：基本箱体、内有温度传感器、温度设定的测控电路及加热元件的基本结构，还具有定时器，搅拌或晃动装置且其速率和幅度可设定和调节。
所述的交联剂PH值范围在 5～14之间，可以通过缓冲液进行调整；缓冲液可以是下列额一种或几种：磷酸氢二钠/氢氧化钠；氯化钠/氢氧化钠；碳酸二氢钠/磷酸二氢钾；碳酸钠/碳酸氢钠。
通过改变交联剂溶液PH值，范围在5.0-14.0之间，可对应控制心包被交联后的颜色由紫色向蓝色转变。
本发明与前述技术方案比较，具有以下进步：将心包基材处于平整的状态下，以热源对较薄材料进行热皱缩变性对剩余材料进行蒸汽处理使其适度变性，全层的残基裸露；然后对其进行柔性交联使材料内外全层被交联，游离的氨基酸残基被全部交联链接，最大限度的提升生物相容性、提高抗降解率、利于材料植入后与宿主巩膜的融合，保持术后疗效的持久性。
本发明采取了测试脱细胞后心包的断裂强度，据此计算出心包接近塑形状态时的最大拉伸力，然后以此最大拉伸力值对心包外周施加（该拉力），以实现对心包的胶原纤维和弹性纤维的梳整拉伸，即可使其处于伸展平直状态；又避免拉力不适造成心包被过大的拉力损坏（进入塑性区，纤维破坏）；在此状态下予以交联处理，可重新构成顺直的胶原纤维状态下的交联结构网，消除心包纤维的自然回弹、挛缩、变性现象，使得交联后的心包更加平整、顺滑、舒适质地感更好，关键是满足了的后巩膜的弹性要求，拉伸率小于3%。
本发明的纤维梳整/交联方法还可控制交联后生物材料（心包）的弹性度、拉伸率，以满足不同的生物力学要求。
由于本发明采用了以PH值调节，可以控制反应物（交联反应后心包）的颜色，根据需要更加醒目，手术时与周边组织更易分辨，便于操作。
附图说明：
附图1是本发明的心包在自然状态下组织切片的组织结构图：
附图2是本发明的心包脱细胞后组织切片在光镜下的组织结构图：
附图3是本发明的心包结果掩膜梳整交联后在光学显微镜下的组织结构图。
具体实施例说明
一种眼后巩膜加固术用生物补片呈紫蓝色、梭形或条带状的片状体，长度30～50mm；最宽处10～20mm；最窄处3～5mm,厚度0.2～0.80mm；一面光滑平整、另一面稍粗糙；断裂强度＞30MPa；延伸率≤5%；许用强度＞20MPa,延伸率≤3%；工作强度＞12MPa，延伸率≤3%；含水率＞300%；无菌；所述生物补片的基材来源于动物的心包，通过选择、脱细胞、热皱缩变性、纤维梳整、交联处理过程获得。
参照附图、典型的本发明实施例包括如下步骤：
①取材制备毛坯
a. 取材：鲜检疫无疾病的健康成熟牛、猪、马或羊的心包，去除杂质、脂肪、系带，消毒清洗；
b. 选材：将心包破损处、明显增厚的心脏大血管出入口边缘处不适合应用的部分剪除；
c. 去脂： 使用洗涤剂去除心包内的脂肪，然后以生理盐水冲洗3次；此时触摸心包有涩涩感，无滑脱感，成为心包毛坯。
d. 消毒：将上述制备的心包毛坯材料置入消毒液内保存备用。
所述的洗涤剂可以是下列的一种 或几种的混合应用：去污剂、清水、洗洁精稀释液
所述的消毒剂可以是：化学或生物制剂的一种或多种配伍：如0.5%过氧乙酸、庆大霉素生理盐水溶液、青霉素/链霉素生理盐水溶液、新洁尔灭溶液等；
附图1是经过上述步骤处理后的心包毛坯材料的组织切片图：可见胶原纤维中有大量成纤维细胞核结构存在。
②脱细胞制备基材
a.将心包毛坯浸入脱细胞溶液内，2～8h，使心包内细胞结构被完全破坏、溶解；
b.将上述脱细胞处理后的毛坯使用PBS溶液洗涤3次，每次5min；洗脱细胞残留碎片；
c.上述脱细胞步骤a. 洗涤步骤b.重复三次。得到脱细胞后的心包基材。
由附图2可见，心包组织切片中大量胶原纤维束呈自然弯曲状态，胶原纤维束间隙扩张，未见到完整的细胞核组织。
③梳整基材纤维
③掩膜梳整：a. 取上述脱细胞心包基材适中部分，制作测试标准样，测得其断裂强度并记录；
b.将待处理的心包基材平铺在交联支架上，在毛坯材料的外周以支架为支撑施加外向作用力，该作用力是心包断裂强度的40～60%；使心包整体被拉伸呈完全平整状态，手触之可有弹性扩张；c.以连续数字厚度尺或电子厚度扫描仪，得出心包基材的厚度地形图；d.取平均厚度，标示出超厚区域（＞20%平均厚度）和超薄区域（＜20%平均厚度）边缘；e.先对超薄区域施加局部热变性处理：使材料发生热皱缩变性，厚度增加60%以上；f.对其他区域进行局部热蒸汽变性处理，使其胶原纤维内外层的原胶原残基完全裸露；g.在材料四周施加外向作用力，力值是上述断裂强度的90%～95%，拉伸材料使所有区域的厚度趋于一致，误差＜±10%；h.保持外向拉力下，在交联支架上固定基材。
所说的热皱缩处理温度在85～100℃；处理时间在3Sec～3min；蒸汽处理的时间在3～10Sec。
所述的交联支架是采用与交联剂不发生化学反应的材料制成的圆形或多边形的中空支架，可将基材固定、并可对基材施加向外作用力，该作用力可以被拉力传感器或拉力计监测。通过调节该作用力，可控制基材的弹性拉伸率。
④交联制备精材
a.将上述交联支架及固定后基材完全浸入脱细胞热溶液内，晃动条件下交联；
b.交联（设备运行）参数是：温度 4～35℃，时间24～168h；交联支架或交联剂晃动角度＞±1°；晃动频率1～50次/min; 交联剂溶液PH值5.0～14.0；
c. 交联剂：所述的交联剂是浓度为0.25～2.0%京尼平溶液，溶解京尼平的溶液可以是以下液体的一种：1～20%的酒精溶液、生理盐水、无菌去离子水或蒸馏水；交联剂的PH值可在6～14.0范围内使用缓冲液进行调整；
d.被交联物质（心包基材）与交联剂溶液之比为10～30%（W/V）；
e.观察交联过程：心包基材与交联剂发生化学反应，胶原纤维和弹力纤维之间发生分子间交联和分子内的交联，交联过程中，京尼平的活性官能团及心包胶原纤维的氨基酸残基发生交联后可形成一种多聚体深色（紫蓝色）无毒色素；观察基材的颜色均一、稳定、基材质地增加、强度增加，韧性增加；当基材内、外、全层颜色一致时，交联基本完成；
f.交联结束后，将心包由交联支架上取下，大体观察：基材应继续保持与支架上的平整、光滑、柔顺状态，且不再发生如未进行梳整工序时的回缩、挛缩、形变现象。如此得到交联后心包精材，该精材在耐受许用强度20MPa时拉伸延长率≤3%，及工作强度12MPa时的拉伸延长率≤3%；
所述的PH值调节，可以使用碳酸氢二钠/氢氧化钠缓冲液对交联剂溶液进行；将交联剂溶液的PH值控制在5.0～14.0之间，PH值＜8时交联后心包精材呈蓝色，PH值＞8时交联后心包精材呈紫色。
⑤交联后处理：
a.漂洗：将交联后心包精材由交联机内取出，用蒸馏水水反复漂洗3次，每次3～5min；
b.中和：使用5～30%甘氨酸溶液对心包精材进行中和反应，以消除残留的交联剂。
c.清洗：再对心包精材使用蒸馏水进行漂洗3-5次，每次3—5min；
d.测试：取规定测试样，测试交联后心包精材的生物力学指标：其断裂强度较未交联时明显提高（28～68MPa），不小于许可强度20MPa，远大于工作强度12MPa；定荷拉伸率≤3%；含水率＞600%。
⑥成型包装灭菌
a.成型：选取完好、厚薄基本一致的经测试合格的精材裁剪成梭形或条带状的眼后巩膜加固术用生物补片；
b.包装：生物补片放入含有无菌生理盐水的泡罩容器内进行热合密封包装，包装机参数和密封性能需工艺验证和确认，包装材料外部标识和编码应符合相关法规要求；
c.灭菌：将包装完好的生物补片进行灭菌处理；灭菌方式可以是伽马射线、直线加速器、化学剂或环氧乙烷；灭菌设备和工艺参数及最终灭菌效果需经过验证和确认，保证灭菌质量的无菌水平符合法规要求；灭菌后成为眼后巩膜加固术用生物补片。
所述的步骤①取材中，牛、马心包来源是有3—5岁龄的非疫区饲养经过检疫检验合格在定点屠宰的新鲜牛心包；猪心包是非疫区饲养一年以上经过检疫检验合格并在定点屠宰的新鲜猪心包；
所述的步骤②脱细胞溶液是指：以下溶液的一种或几种；TritonX-100，超临界CO2流体；
所述的交联设备是包含有温度设定、温度传感器及测控电路及加热元件的基本结构，还具有定时器，搅拌或晃动装置且其速率和幅度可设定调节；
所述的交联剂是：药用级京尼平呈白色结晶粉末，纯度98%；
所述的交联剂PH值范围在 5～14之间，可以通过缓冲液进行调整；缓冲液可以是下列的一种或几种：磷酸氢二钠/氢氧化钠；氯化钠/氢氧化钠；碳酸二氢钠/磷酸二氢钾；碳酸钠/碳酸氢钠；
通过改变交联剂溶液PH值，范围在5.0～14.0之间，可对应控制心包被交联后的颜色由紫色向蓝色转变。

Claims (4)

1.一种眼后巩膜加固术用生物补片，其特征在于：所述生物补片呈梭形或条带形的片状体，其长度在30～50mm；宽度在10～20mm；厚度在0.2～0.80mm；外观深蓝色、一面光滑平整、了一面较粗糙；断裂强度＞30±8.5MPa；延伸率≤5%；许用强度＞20MPa,延伸率≤3%；工作强度＞12MPa，工作强度下拉伸延长率≤3%；含水率＞600%；无菌；所述生物补片的基材来源于动物的心包，是通过脱细胞、纤维梳整、交联处理过程获得。
2.如权利要求1所述的一种眼后巩膜加固术用生物补片及其制备方法，其特征在于：所述动物为牛、马、猪。
3.根据权利要求1所述的一种眼后巩膜加固术用生物补片及其制备方法，其特征在于，所述基材是通过纤维梳整/交联处理的，其交联度为70～90%。
4.根据权利要求1所述的一种眼后巩膜加固术用生物补片及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）取材制备毛坯
a. 取材：选取经过检疫的健康成熟动物的心包；
b. 选材：去除心包外周杂质、脂肪、系带；将破损处、明显增厚的心脏大血管出入口边缘不适合应用的部分减除；
c. 去脂：使用洗涤剂去除心包内的脂肪，然后以生理盐水冲洗3次；此时触摸心包有涩涩感，无滑脱感为好，成为心包毛坯；
d. 消毒：将上述制备的心包毛坯材料置入消毒液内保存备用；
2）脱细胞制备基材
a.将心包毛坯浸入脱细胞溶液内，2～8h，使心包内细胞结构被完全破坏、溶解；
b.将脱细胞处理的毛坯使用PBS溶液洗涤3次，每次5min；洗脱细胞残留碎片；
c.将脱细胞步骤a. 洗涤步骤b.重复三次，得到脱细胞后的心包基材；
3）梳整基材纤维
③掩膜梳整
a. 取上述脱细胞心包基材适中部分，制作测试标准样，测得其断裂强度并记录；
b.将待处理的心包基材平铺在交联支架上，在毛坯材料的外周以支架为支撑施加外向作用力，该作用力是心包断裂强度的40～60%；使心包整体被拉伸呈完全平整状态，手触之可有弹性扩张；
c.以连续数字厚度尺或电子厚度扫描仪，得出心包基材的厚度地形图；
d.取平均厚度，标示出超厚区域（＞20%平均厚度）和超薄区域（＜20%平均厚度）边缘；
e.先对超薄区域施加局部热变性处理：使材料发生热皱缩变性，厚度增加60%以上；
f.对其他区域进行局部热蒸汽变性处理，使其胶原纤维内外层的原胶原残基完全裸露；g.在材料四周施加外向作用力，力值是上述断裂强度的90%～95%，拉伸材料使所有区域的厚度趋于一致，误差＜±10%；
h.保持外向拉力下，在交联支架上固定基材；
所说的热皱缩处理温度在85～100℃；处理时间在3Sec～3min；蒸汽处理的时间在3～10Sec；
g.在交联支架上固定基材、以保持外向拉力；
所述的交联支架是采用与交联剂不发生化学反应的材料制成的圆形或多边形的中空支架，可将基材固定、并可对基材施加向外作用力，该作用力可以被拉力传感器或拉力计监测；通过调节该作用力，可控制基材的弹性拉伸率；
4）交联制备精材
a.将上述交联支架及固定后基材完全浸入脱细胞热溶液内，晃动条件下交联；
b.交联（设备运行）参数是：温度 4～35℃，时间24～168h；交联支架或交联剂晃动角度＞±1°；晃动频率1～50次/min；交联剂溶液PH值5.0～14.0；
c. 交联剂：所述的交联剂是浓度为0.25～2.0%京尼平溶液，溶解京尼平的溶液可以是以下液体的一种：1～20%的酒精溶液、无菌去离子水或蒸馏水；交联剂的PH值可在5.0～14.0范围内使用缓冲液进行调整；
d.心包基材与交联剂溶液之比为10～30%（W/V）；
e.交联结果：京尼平的活性官能团及心包胶原纤维的氨基酸残基发生交联反应，使心包基材胶原纤维和弹力纤维之间发生分子间交联和分子内的交联；交联后可形成一种多聚体深色（紫蓝色）无毒色素；观察基材的颜色均一稳定，当基材内、外、全层颜色一致时，交联过程基本完成；
f.交联结束后，将心包由交联支架上取下，大体观察：基材应继续保持与支架上的平整、光滑、柔顺状态，且不再发生如未进行梳整工序时的回缩、挛缩、形变现象；
如此得到交联后心包精材，该精材在耐受许用强度20MPa及工作强度12MPa时的拉伸延长率≤3%；
所述的PH值调节，可以使用碳酸氢钠缓冲液对交联剂溶液进行；将交联剂溶液的PH值控制在8～12之间，PH值＜8时交联后心包精材呈蓝色，PH值＞8时交联后心包精材呈紫色；
5）交联后处理
a.漂洗：将交联后心包精材由交联机内取出，用蒸馏水水反复漂洗3次，每次3～5min；
b.中和：使用5～30%甘氨酸溶液对心包精材进行中和反应，以消除残留的交联剂；
c.清洗：使用蒸馏水对心包精材漂洗3-5次，每次3—5min；
d.测试：取规定测试样，测试交联后心包精材的生物力学指标：其断裂强度较未交联时明显提高（28～68MPa），不低于许可强度20 MPa，远大于工作强12 MPa；心包精材的断裂拉伸率≤3%；在工作强度下定荷拉伸率≤3%；含水率＞600%；
6）成型包装灭菌
a.成型：选取完好、厚薄基本一致的经测试合格的精材裁剪成梭形或条带状的眼后巩膜加固术用生物补片；
b.包装：生物补片放入含有无菌生理盐水的泡罩容器内进行热合密封包装，包装机参数和密封性能需工艺验证和确认，包装材料外部标识和编码应符合相关法规要求；
c.灭菌：将包装完好的生物补片进行灭菌处理；灭菌方式可以是伽马射线、直线加速器、化学剂或环氧乙烷；灭菌设备和工艺参数及最终灭菌效果需经过验证和确认，保证灭菌质量的无菌水平符合法规要求；灭菌后成为眼后巩膜加固术用生物补片；
所述的步骤①取材中，牛、马心包来源是有3—5岁龄的非疫区饲养经过检疫检验合格在定点屠宰的新鲜牛心包；猪心包是非疫区饲养一年以上经过检疫检验合格并在定点屠宰的新鲜猪心包；
所述的步骤②脱细胞溶液是指：以下溶液的一种或几种；TritonX-100，超临界CO2流体；
所述的交联设备是包含有温度设定、温度传感器及测控电路及加热元件的基本结构，还具有定时器，搅拌或晃动装置且其速率和幅度可设定调节；
所述的交联剂是：药用级京尼平，纯度98%；
所述的交联剂PH值范围可在 5.0～14.0之间，通过缓冲液进行调整，可以对应控制心包被交联后的颜色由蓝色向紫色转变；缓冲液可以是下列的一种或几种：碳酸氢钠、磷酸二氢钠。
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