JP2013503351A - 小型自動セルカウンター - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年8月31日付で出願された米国仮特許出願第61/238,534号の優先権の恩典を主張し、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は概して、液体中に懸濁した生体細胞の計測のための血球計算法およびシステムの分野に属する。本発明の関心は、自動細胞計測システムにある。
白血球および赤血球の計測を含む細胞計測は、多岐の臨床および研究手順における関心の的であり、それは様々な疾患または異常状態の診断において有益であり、またそのような疾患または状態に対する治療を受けている患者のモニタリングにおいても有益である。細胞は以下の工程より手動で計測される:サンプルの既知の希釈液を、互いに対して十分に近い(典型的にはおよそ100ミクロンの間隔を有する)光学的に透明なプレートの間に配置し、細胞を単一層に成形する工程;指定された寸法の層の一領域を既知の倍率に拡大する工程;および、拡大された領域中の細胞を、顕微鏡を通じて計測する工程。手動の細胞計測は、ユーザーの負担を減らすため、計測領域中に刻まれた格子をしばしば含む。そのような格子およびその使用手順に関する記載は、2008年2月12日に発行された、Qiu, J.による米国特許第7,329,537 B2号の「Micro-Pattern Embedded Plastic Optical Film Device for Cell-Based Assays.」(特許文献1)に見られる。それがどのように為されようとも、手動の細胞計測は、退屈であり、ユーザーのエラーを非常に受けやすい。計測には通常、計測領域中の細胞数を減らすため、サンプルを高度に希釈した液を利用することにより促進されるが、計測の正確性は、計測される細胞の割合の減少に伴い、低下する。
上側および下側の光学ウインドウは、それらウインドウ間で細胞懸濁液がサンプル容器中に保持されるものであり、十分に近接しているため、保持された懸濁液は薄いフィルムであり、その横向き寸法、すなわち露出される長さと幅は厚さよりも少なくとも一桁大きい。サンプルチャンバーの全露出領域(すなわち、横向き寸法)またはその横向きに寸法付けられた(laterally dimensioned)部分は、少なくとも約4,000,000 (400万)画素またはある態様において約4,000,000〜約10,000,000画素を含むデジタルイメージングセンサー上に投影される視野としての機能を果たす。各画素のサイズは、約2 x 2 μm (4 μm2)以下、またはある態様において約0.5 x 0.5 μm (0.25 μm2)から約2 x 2 μm (4 μm2)、および後者の一態様において、約1 x 1 μm (l μm2)から約2 x 2 μm (4 μm2)である。センサーにより撮像された視野は、少なくとも約3平方ミリメートル、しばしば約3 mm2から約10 mm2である。相補型金属酸化膜半導体(CMOS)は、この目的に有益なデジタルイメージングセンサーの一例である。これらパラメーターを満たすCMOSセンサーの例は、OmniVision Santa Clara, California, USAから入手可能なOV5620およびOV5632カラー撮像装置である。他の例も、Aptina Imaging, a division of Micron Technology, Inc., of San Jose, California, USAから入手可能である。カラーデジタルイメージングセンサーもまた使用できる。CMOSセンサーにより生成されたイメージ中の細胞を計測するためのイメージ処理は、上述したような既知のデジタル計測方法により達成できる。
Claims (26)
- 光学部品と、サンプルスライドを受け入れるためのサンプルマウントと、該光学部品および該サンプルマウントを保持するハウジングとを備える自動セルカウンターであって、
該光学部品が、光源と、デジタルイメージングセンサーと、光を該光源から該サンプルマウントを通って該デジタルイメージングセンサーへ向けるように位置づけられたレンズとを備え、
該光学部品が、直線状の光路に配置され、かつ細胞懸濁液を含むサンプルスライドが該サンプルマウント中に取り付けられた時に該細胞懸濁液のイメージが該デジタルイメージングセンサーに投影されるように配置され、
該デジタルイメージングセンサーが、少なくとも約4,000,000画素を含み、かつサンプルマウントにおける少なくとも3 mm2の視野を撮像し、各画素が2 x 2 μm以下の面積である、
自動セルカウンター。 - デジタルセンサーが約4,000,000から約10,000,000画素を含み、各画素が約0.5 x 0.5 μmから約2 x 2 μmの面積であり、かつイメージングフィールドが約3 mm2から約10 mm2である、請求項1記載の自動セルカウンター。
- 光路が垂直に方向付けられており、ハウジングが少なくとも該ハウジングと同じ幅の支持基盤に取り付けられており、ハウジングおよび支持基盤がそれぞれ最大で300 cm2までの横向き領域を占め、かつ光路が最大で20 cmまでの全高を有する、請求項1記載の自動セルカウンター。
- デジタルイメージングセンサーが、イメージの隣接領域間のコントラスト値を生成する手段を含み、サンプルマウントが、光路に沿って調節可能な高さであり、セルカウンターが、イメージに焦点が合うまで、前記コントラスト値に応じて高さを自動調節するための手段をさらに備える、請求項1記載の自動セルカウンター。
- 視野内の細胞を計測するデジタル撮像装置をさらに備える、請求項4記載の自動セルカウンター。
- サンプルマウントの高さの自動調節およびデジタル撮像装置が、サンプルスライドを該サンプルマウントに挿入した際に自動で起動される、請求項5記載の自動セルカウンター。
- デジタルイメージングセンサーが平坦であり、レンズが、該デジタルイメージングセンサーにおいて焦点フィールドを有するアクロマートレンズ対を含み、かつ自動セルカウンターが該焦点フィールドの湾曲を補正するための手段をさらに備える、請求項1記載の自動セルカウンター。
- 焦点フィールドの湾曲を補正するための手段が、デジタルイメージングセンサーに隣接した負レンズである、請求項7記載の自動セルカウンター。
- 光源が、生存細胞と死滅細胞とを判別するイメージングセンサー中にイメージを生成するためにスペクトル的に限定されている、請求項1記載の自動セルカウンター。
- デジタルイメージングセンサーがカラーデジタルセンサーである、請求項1記載の自動セルカウンター。
- 支持基盤が表面にあり、ハウジングが30 cm以下の高さであり、かつサンプルマウントが前記表面より少なくとも6 cm上方にある、請求項3記載の自動セルカウンター。
- サンプルマウントに取り付けられる寸法であり、かつ生存細胞および死滅細胞をシミュレーションするよう表面にイメージがプリントされた、品質管理スライドをさらに備える、請求項1記載の自動セルカウンター。
- 以下を備える、細胞懸濁液中の細胞を計測するためのサンプルスライド:
光学的に透明である上側および下側のウインドウにより境された内部チャンバーを有する平坦プレート;および
該平坦プレートを細胞計測機器内へ、上側ウインドウが該機器内で選択された方向に向くような配向性で導くための、該平坦プレート中のオリエンテーションノッチ。 - 上側ウインドウが下側ウインドウよりも実質的に薄い、請求項13記載のサンプルスライド。
- 第一および第二の内部チャンバーを有する単一の平坦プレートを内部に備えるサンプルスライドであって、
該内部チャンバーが、該平坦プレートにおいて互いに対して横向きに位置し、かつそれぞれが光学的に透明な上側および下側のウインドウを有し、
該単一の平坦プレートが、該平坦プレートを該細胞計測機器内へ、光学的に透明な上側ウインドウが機器内で選択された方向に向くような配向性で導くための第一および第二のオリエンテーションノッチを備える、
請求項13記載のサンプルスライド。 - 以下の工程を含む、細胞懸濁液中の細胞を計測するための方法:
(a)細胞懸濁液のアリコートをサンプルスライドの内部チャンバー中に設置して、該チャンバー中に該懸濁液のフィルムを形成する工程;
(b)該フィルム内にある少なくとも3 mm2の視野のデジタルイメージを、少なくとも4,000,000画素を含むデジタルイメージングセンサー上に作成する工程であって、
各画素が、2 x 2 μm以下の面積であり、
前記作成する工程が、
該サンプルスライドをサンプルマウント上に挿入すること、および
該サンプルマウントを、光源と、デジタルイメージングセンサーと、光を該光源から該サンプルマウントを通って該デジタルイメージングセンサーへ向けるように位置づけられたレンズとを備える光学部品から形成される直線状の光路中に位置づけること
により為される、工程;ならびに
(c)該デジタルイメージ中の細胞をデジタル方式で計測する工程。 - デジタルセンサーが約4,000,000から約10,000,000画素を含み、各画素が約0.5 x 0.5 μmから約2 x 2 μmの面積であり、かつイメージングフィールドが約3 mm2から約10 mm2である、請求項16記載の方法。
- 工程(b)が、サンプルマウントを動かすことによるデジタルイメージの自動焦点調節を含む複数の機能により実行され、
アリコート中に生体染色が存在しているかどうか検出すること、生体染色が検出された場合にサンプルスライドの内部チャンバー内の複数の焦点面のデジタルイメージを作成すること、およびデジタルイメージングセンサー上に形成されたイメージを処理して該アリコート中の細胞計測を決定することが全て、ハウジングの内部で実行される、
請求項16記載の方法。 - 光路が垂直に方向付けられており、サンプルマウントおよび光学部品が支持基盤に取り付けられたハウジング中に保持され、該支持基盤が少なくとも該ハウジングと同じ幅であり、該ハウジングおよび支持基盤がそれぞれ最大で300 cm2までの横向き領域を占め、かつ該光路が最大で20 cmまでの全高を有する、請求項16記載の方法。
- (a')イメージの隣接領域間のコントラスト値を自動で生成する工程、および該イメージに焦点を合わせるために該コントラスト値に応じて光路に沿った高さにサンプルマウントを自動で調節する工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
- 工程(a')および(b)が、サンプルスライドをサンプルマウントに挿入した際に自動で起動される、請求項16記載の方法。
- デジタルイメージングセンサーが平坦であり、かつレンズが、該デジタルイメージングセンサーにおいて焦点フィールドを有するアクロマートレンズ対および該焦点フィールドの湾曲を補正するために位置づけられた負レンズを含む、請求項16記載の方法。
- 光源が、生存細胞と死滅細胞とを判別するイメージングセンサー中にイメージを生成するためにスペクトル的に限定されている、請求項16記載の方法。
- 細胞懸濁液を生体染色で処理し、それにより、生存細胞と死滅細胞とを判別するイメージングセンサー中にイメージを生成することをさらに含む、
請求項16記載の方法。 - デジタルイメージングセンサーがカラーデジタルセンサーである、請求項16記載の方法。
- 工程(c)が、光学部品の焦点を内部チャンバー内にある複数の平面上に合わせることを含む、請求項16記載の方法。
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