CN102576406B - 小型自动化细胞计数器 - Google Patents

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Abstract

在自动细胞计数器中对液体悬浮液中的生物细胞进行计数，该计数器将该悬浮液的图像聚焦到数字成像传感器上，该传感器包含至少4,000,000像素，每个像素的面积是2×2μm或更小些，并且该传感器对至少3mm2的视场进行成像。该传感器能使该计数器将光学部件压缩到垂直排布时高度小于20cm的光路中，该光路整体的方向没有变化，整个仪器的覆盖区小于300cm2。通过简单地将样品支架插入该仪器中，就启动了光源的激活、传感器图像的自动聚焦和数字细胞计数的所有功能。将悬浮液置于载玻片形式的样品腔室中，该载波片被定形为确保载玻片在细胞计数器中有恰当的取向。

Description

小型自动化细胞计数器
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年8月31日提交的美国临时专利申请No.61/238,534的优先权，其内容通过引用结合于此。
技术领域
本发明涉及血液凝固以及一般用于对流体中悬浮的生物细胞进行计数的系统的领域。本发明的重点在于自动化细胞计数系统。
背景技术
在各种临床和研究过程中，细胞计数是令人感兴趣的，其中包括白细胞和红血球的计数，而这在各种疾病或异常状况的诊断过程中以及在监控经历这种疾病或状况的治疗的病人的过程中是很有价值的。可以通过下列过程对细胞进行人工计数：将已知的样品稀释物放置在光学清晰的板之间，这些板彼此充分地靠近(通常，间隔是在100微米的量级)以使这些细胞形成单一的层；将该层的一区域在指定维度上放大到已知的倍数；以及通过显微镜对被放大的区域中的细胞进行计数。人工细胞计数器通常包括刻在计数区域中的栅格以减小使用者的负担。Qiu，J的美国专利US 7,329,537B2(2008年2月12日授权，题为“Micro-Pattern Embedded Plastic Optical Film Device for Cell-BasedAssays”)描述了这种栅格及其使用过程。不管这是如何实现的，人工细胞计数都是乏味的，且使用者很容易出错。通过使用该样品的高度稀释物以减小计数区域中的细胞数目，常常有助于计数，但是，被计数的那部分细胞每每有所减少，该计数的准确度就会下降。
通过使用数字成像系统，已使细胞计数过程的自动化变为可能。这种系统的示例是ImageJ，一种在国家卫生学院开发的基于Java的图像处理程序，Collins，T.J.的文章“ImageJ for microscopy”(BioTechniques 43(1Suppl.)：25-30，2007年7月)对此进行过报道。Gering，T.E.和C.Atkinson在文章“A rapidmethod for counting nucleated erythrocytes on stained blood smears by digitalimage analysis”(J.Parasitol.90(4)：879-81，2004年)中报道了在血液系统中使用ImageJ的情况。下列文献进一步描述了自动化细胞计数：Chang，J.K.等人的美国专利US 7,411,680B2，2008年，8月12日授权，题为“Device for CountingMicro Particles”；以及Chang，J.K等人的美国专利申请公报US 2006/0223165A1，2006年10月5日公布，题为“Device for Counting Cells and Method forManufacturing the Same”。
自动化细胞计数系统自身包含固有的统计不确定性，这是由通常所谓的“采样误差”所导致的，这种“采样误差”是指在选择执行自动化计数的区域时固有的误差。目前可买到的自动化细胞计数器的诸多局限之一是：因为仪器中的光学部件的限制，对细胞进行计数的区域与样品所占据的整个区域相比具有有限的大小。因为这相应地限制了细胞的数目，并且被计数的细胞的数目每每有所减小，误差就会增大，所以现有技术的典型仪器被构造成具有很长的光路或很大的覆盖区(该仪器在试验台上所占据的表面积)或两者皆有以实现可接受的准确度。这给使用者带来了不便，特别是当该仪器要被用在细胞培养盖中的时候。
发明内容
本文揭示了一种用于高度准确的细胞计数的完全独立的仪器，用户干预最少，覆盖区相对很小，且高度也有限。将细胞悬浮液放在可消耗的样品容器中，该容器的尺寸和维度可以宽泛地变化，该容器的一个方便的示例是其外部尺寸与显微镜载玻片相似的容器。该容器由此可以在构造与尺寸方面相似于上述US 2006/0223165A1中所描述的容器，该容器具有至少一个平且浅的内部腔室，该内部腔室的顶部和底部以平的、光学清晰的窗口为界，这些窗口可以是塑料片且间隔得足够近以使得大部分样品细胞构成一个层即一个细胞那么深。在该容器中可以包括合适的入口和出口，以允许用样品轻易且完全地填满该腔室。然后，将该容器放到该仪器中，在该仪器中该容器与线性光路相交。在本文中所使用的术语“线性”表示一条在光束方向上除了透镜所导致的转弯或变化以外没有转弯或其它变化的路径。该容器通过该光路中的指定高度处的狭缝而进入该仪器，并且如下文所更详细地描述的那样，本发明的某些实施例中的仪器包括多个特征项，用于自动地调节样品的高度以便聚焦样品图像。某些实施例包括多个特征项，用于使所有的仪器功能在将样品容器插入该仪器中时就开始工作。
附图说明
图1是代表本文所揭示的概念的实现示例的细胞计数仪器的透视图。
图2是图1的仪器的光学部件的图。
图3是图1的仪器的内部中的光学部件的透视图。
图4是在图1的仪器中所使用的用于构成样品载玻片的两个板的分解透视图。
图5A是图4的样品载玻片的顶板的上表面的图。图5B是图4的样品载玻片的顶板的下表面的图。
具体实施方式
在顶部光学窗口和底部光学窗口之间，使细胞悬浮液保持在样品容器之内，该顶部光学窗口和底部光学窗口靠得足够近，使得所保持的悬浮液是一个薄膜，该薄膜的横向维度即它露出的长度和宽度至少比它的厚度大一个数量级。样品腔室的整个露出的区域(即横向维度)或其横向维度部分用作一个视场，该视场被投射到数字成像传感器上，该传感器包含至少约4,000,000
(四百万)个像素或者在某些实施例中包含约4,000,000到10,000,000个像素，每个像素的尺寸不大于约2×2μm(4μm2)或者在某些实施例中约为0.5×0.5μm(0.25μm2)到2×2μm(4μm2)并且在后者的某些实施例中约为1×1μm(1μm2)到2×2μm(4μm2)。被传感器成像的视场至少约为3平方毫米，通常约为3-10平方毫米。互补金属氧化物半导体(CMOS)是用于此目的的数字成像传感器的一个示例。符合这些参数的CMOS传感器的示例是可从美国加利福尼亚州SantaClara市的OmniVision公司买到的OV5620和OV5632彩色成像器。其它示例则可以从美国加利福尼亚州San Jose市的Micron Technology公司的AptinaImaging部门购买到。也可以使用彩色数字成像传感器。通过已知的数字计数方法，比如上文提到的那些，可以实现图像处理以对CMOS传感器所产生的图像中的细胞进行计数。
沿着光路，可以按一个放大倍数放大样品腔室的图像，该放大倍数通常是在约1.5到6的范围中或者是在约1.5到3的范围中，作为一个示例，该放大倍数约为2。这可以通过一种双透镜式消色差透镜组件来实现。这种透镜组件的示例是：最靠近样品的35mm焦距的透镜，最靠近传感器的60mm焦距的透镜，以及在这两个透镜之间的孔径。由此，在本示例中，最靠近样品的透镜与样品自身之间的距离是35mm，并且最靠近传感器的透镜与成像器自身之间的距离是60mm。系统的放大倍数是这两个透镜的焦距之比，在这种情况下就是60mm/35mm＝1.7。例如，这两个透镜的直径可以是12.5mm，上述孔径的直径可以是6mm。会产生相同或大致相同的结果的其它直径和焦距的透镜对于本领域技术人员而言是显然的。该仪器的覆盖区被定义为该仪器及其支撑基座中较大的那个在垂直于光路的平面上所投射的区域。如上所述，该仪器可以被构造成具有很小的覆盖区，特别是其面积小于300平方厘米的覆盖区。
当使用平的数字成像传感器时，负透镜可以位于该传感器下方以立刻截断光信号并校正该消色差透镜对的聚焦场曲率。这种场曲率在多种光学系统中是普遍的，也被称为Petzval曲率。在示例的实施例中，使用了具有负18mm焦距的6mm直径透镜。透镜厚度可以有所改变，但最好被选择成能校正上述曲率而不显著减小视场。
通过使用在仪器基座处的常规光源以及在该光源与样品之间的准直透镜，可以实现该样品的照明。使用这些部件，就可通过透射照明来照射该样品，而无需漫射器。较佳的光源是单个具有荧光涂层的白色发光二极管(LED)。这种部件的示例是：LUXEONRebel White，部件号码为LXML-PWN1-0050，可从美国加利福尼亚州San Jose市的Philips LumiledsLighting公司购买到。准直透镜的示例是直径为9mm且焦距为18mm的透镜。使用这些尺寸和上文所提到的尺寸，可以构造出一种仪器，该仪器的消色差透镜对大约在样品上方35mm，该仪器的传感器大约在该消色差透镜对上方60mm。在消色差透镜对具有大约13mm的厚度的情况下，样品与传感器之间的总距离可以小到108mm。通常，该仪器的光路(即，在本文中被定义为从光源延伸到CMOS或其它数字成像传感器的多个部件的排布)的高度可以是20cm或更小点。在本发明的范围之内的较佳仪器中，使用顺从性的计数按一种浮置的方式将多个光学部件安装到外壳内部，以避免在震到该仪器时光学系统被破坏或失调，比如当仪器发生衰落或使用不当或与另一个仪器或转变相撞时可能出现这种破坏或失调。
如上所述，通过一狭缝，将样品容器(考虑到其尺寸与形状相似于显微镜载玻片，在下文中将被称为样品载玻片)收纳到上述仪器中，该狭缝位于沿着上述光路的一位置，该位置离上述消色差透镜对的最接近的透镜的距离等于该透镜的焦距。在其较佳实施例中，该仪器整体的高度是30cm或更小些，并且按上文所述使用数字成像传感器(该传感器使用大量的小尺寸像素)能允许该仪器被构造成具有足够高的狭缝以允许用户舒适地用手插入该狭缝(即让用户的手不会碰到该仪器所在的桌子)。由此，该狭缝可以离该仪器的底座有60mm或更大，最好离该底座有70-80mm。
在本发明的较佳实施例中，通过在插入载玻片之后自动地调节该载玻片的高度，上述仪器提供了样品图像的自动聚焦。一种自动聚焦手段包括使用图像处理器芯片，该芯片提供了在来自传感器的图像上的多个区域的阵列之内的图像对比的输出。这种芯片的示例是可从美国得克萨斯州Plano市ARM公司KeilTM买到的的“Freescale Semiconductor MC9328MX21”；其它示例对于本领域技术人员而言是很明显的。在传感器阵列的特定区域中相邻的绿色像素的绝对差异之和可以被用作图像对比值，并且当该图像对比值达到最大时就实现了最佳聚焦。通过连接到上述收纳狭缝内的载玻片托板的齿轮马达，可以调节上述聚焦，即，马达在转动时将使载玻片托板向上或向下移动以改变图像的聚焦情况。在马达的各个位置处检测该对比值，然后，返回到产生最高对比值的位置。在该仪器的许多实施例中，这种自动聚焦可以发生在15秒或更少的时间内。
可为该仪器提供的附件是标准载玻片，用于质量控制，比如用于验证对活细胞和死细胞进行计数的准确度以及该仪器进行恰当聚焦的能力。该标准载玻片可以具有与样品载玻片相同的外部尺寸，但是和样品腔室不一样，该标准载玻片可以具有印刻在其上的暗色斑点和环，这些斑点模拟死细胞并且在数字成像传感器中被当作死细胞来检测，而这些环则模拟活细胞并且在数字成像传感器中被当作活细胞来检测。
在本文所描述的诸多概念的某些实施例中，通过简单地插入样品载玻片，就启动了该仪器所执行的功能(包括自动聚焦和细胞计数)。通过在上述狭缝内或上述狭缝内的载玻片托板上放置一个非接触的光学反射传感器，就可以实现这种启动。合适的传感器的示例是这样一种传感器，它能发射红外光束并通过检测该光束的反射信号而检测到传感器孔径的约1毫米内的物体。当载玻片被插入时，该反射信号将达到最大，并且高信号将启动自动聚焦和细胞计数机制。可用于该目的的传感器的一个示例是“QRE1113反射式物体传感器”，这可以从美国加利福尼亚州San Jose市的仙童半导体公司买到。其它示例对于本领域技术人员而言是很明显的。
在具体实施本文所描述的诸多特征的仪器中，可包括的另一个特征是：自动检测被活体染色剂沾染的样品中的细胞。活体染色剂是用于优先沾染死细胞的染色剂，并且被这种染色剂沾染的细胞与未被沾染的细胞之间的差异是通过使用不同颜色的像素来实现的。锥虫蓝是活体染色剂的一个示例，曙红和亚丙基是其它示例。锥虫蓝使蓝光透射并使红光衰减，并且通过比较图像传感器中的蓝色像素和红色像素的强度，该仪器就可以确定是否存在被活体染色剂沾染的细胞。其它染料将提供相似的颜色区分，只要对染料自身合适就行。包括这种自动检测特征的图像处理芯片包括上文所提及的那些且很容易买到。可以对该仪器进行编程，以通过在两个或更多个平面上进行聚焦来消除任何可能的活细胞漏记，由此活细胞检测可达到特别高的准确度。通过使用滤光片来控制照明带宽，或者通过选择光谱很窄的光源(比如特定颜色的LED而非白光)，就可以进一步增大活细胞与死细胞之间的对比。例如，可以使用具有约20nm带宽的585nm滤光片，以使上述照明匹配于锥虫蓝染料的峰值吸收波长(其峰值吸收是586nm)。当通过这种滤光片照射该样品时，死细胞将看起来更暗一些。
在本发明的范围内的较佳仪器中，对样品中的细胞计数的获得有贡献的所有功能都被包含在该仪器外壳内，由此，可以实现该仪器的完全操作而无需使用外部机器或计算机。在这些功能中，包括了下列：通过改变样品载玻片的高度来自动聚焦，以找到最佳焦平面，从而将细胞与背景区分开来；确定该样品是否已被锥虫蓝或其它活体染色剂沾染；当检测到活体染色剂时，进行多焦平面分析，使得在多个焦平面上记下每一个细胞，以防止活细胞的漏记；集成的稀释计数器，用于确定要使用的细胞悬浮液的体积；在用户选择时，能在显示器上产生这些细胞的可视化图像并且能放大以便仔细查看这些细胞；以及在用户选择时，能将这些结果输出到USB闪存驱动器或热打印机或其它外部打印机。通过上文所描述的非接触的光学反射传感器，简单地插入样品载玻片就可以启动所有这些功能，并且在许多情况下，这些功能的执行是在30秒或更少的时间内完成的。
附图所描绘的仪器包含了许多上述的特征，并用作本文所描述的诸多功能的实现示例。
图1描绘了一种处于其直立位置中的自动细胞计数器仪器11，它在试验台上使用时就是这样子。该仪器的可见部分是：外壳12，支撑底座13，显示屏幕14，控制面板15，以及用于插入样品载玻片17的狭缝16。显示屏幕示出了细胞计数分析的过程，标识了该仪器的正被执行的各种功能，并且向用户提供多种选项，用于多种功能，和用于示出在样品载玻片中的细胞的图像。
图2描绘了图1的仪器内部的光路的各种部件，样品载玻片17已经被放置到该光路中了。样品载玻片17是水平的，并且位于用作光源的LED板22的上方。准直透镜23使来自该LED的光线在接近该样品载玻片时变为平行。消色差透镜对24位于样品载玻片17和传感器25之间。消色差透镜对的这两个透镜26、27被一孔径28分开。场平整透镜29紧挨在传感器25下方。
图3描绘了主要的光学组件，示出了：载玻片托板31，样品载玻片17被部分地插入其中；LED板22；照明(准直)透镜23；齿轮马达32，用于调节载玻片高度以聚焦该图像；以及成像透镜管33，端接于装配件34以收纳CMOS传感器板。图中还示出了主要的印刷电路板35，用于控制该仪器的各种功能并且包括马达驱动芯片以控制马达32。板35位于外壳之内，该板在图中的位置反映了其相对于光学组件的位置。
图4、5A和5B示出了之前的图中的仪器中所使用的样品载玻片。图4是透视图，并且载玻片17是由两个接合到一起的平板42、43(但是图中显示成分开了)构成的。该载玻片包含两个样品腔室，被分别标记为“A”和“B”，这两个样品腔室沿着该载玻片纵向地彼此分开且横向地彼此偏离。构成样品腔室底面的下平板43的区域44、45是由光学透明材料制成的，正如上平板42的相应区域那样，这些相应区域直接位于下平板上的这些区域上方并构成样品腔室的顶面。在本实施例中，下平板43比上平板42厚以向载玻片提供刚性，并且上平板42相对较薄就能允许每个样品腔室的顶部窗口比底部窗口要薄一些且事实上尽可能薄从而在CMOS传感器中实现高度聚焦的图像。由此，每个样品腔室离载玻片的中心平面有所偏离，并且与下平板43相比更靠近上平板42。
图5A和5B分别是上平板42的顶面51和底面52的平面图，底面52是接合到下平板43的那个表面。每个样品腔室是由上平板的底面中的凹陷53(图5B)所定义的，这进一步减小了在每个样品腔室顶部形成光学清晰窗口的区域的厚度。在载玻片的尺寸的一个示例中，上平板中除了凹陷53以外的区域的厚度是0.65mm，下平板的厚度是1.00mm，总的载玻片厚度是1.65mm。凹陷53的深度是0.100mm，由此形成了深度为0.100mm的样品腔室，这是人工血细胞计数器的标准样品腔室深度。每个样品腔室具有两个入口或出口54、55，细长的腔室的两个相对的纵向末端处各有一个。在载玻片顶部敞开的溢出区域56、57、58、59位于每个样品腔室的四个角落处以容纳多余的样品，由此确保样品腔室被样品恰当地填满。
因为每个样品腔室更靠近上平板42而非下平板43，所以当载玻片被恰当地插入到细胞计数器中且上平板42位于顶部且因此最薄的光学窗口也位于顶部的时候，该载玻片就发挥最佳的功能。为了确保按这种取向来插入该载玻片，在载玻片的两个对角线相对的角处形成凹口61、62。细胞计数器中的狭缝(载玻片就被插入该狭缝中以启动该细胞计数器的多种功能)的内表面包含与这些凹口互补的轮廓特征。由此，这些凹口与狭缝中的互补的轮廓能防止用户插入载玻片时上下颠倒了，即上平板42在底部了(应该在顶部)。这些凹口的对称排布也与两个样品腔室的对称排布互补，并且在插入载玻片时允许任一末端先插入，同时防止以倒逆的位置插入载玻片(上下颠倒)。因为载玻片最好是可消耗物品，所以它可以被用于在不同的时刻对两个独立的样品进行细胞计数测量，并且一旦两个腔室都已被使用则该载玻片可以被丢弃且不再被使用。
对于本领域技术人员而言，很明显，在确保恰当的取向的情况下，样品载玻片的构造可以有所改变。由此，可以改变凹口的排布、数目和形状，正如样品腔室的数目及其在载玻片中彼此的相对位置也可以改变那样。构造的材料也可以宽泛地改变，并且可以是能形成光学清晰窗口的任何材料即不与样品发生反应且足够刚硬以便插入细胞计数器中的任何材料。聚(甲基丙烯酸脂)和聚碳酸酯是可使用的材料的示例。其它材料对于本领域技术人员而言是显而易见的。同样地，上述的板的接合可以是通过常规手段来实现的。激光焊接和超声焊接是示例。
在本文所附的权利要求书中，术语“一”或“一个”旨在表示“一个或多个”。当描述步骤或元素时，术语“包括”以及诸如“所包括”以及“所包含”等其变体旨在表示另外的步骤或元素的添加是可选的且不是排它性的。本说明书所引用的全部专利、专利申请、以及其它公开的参考材料通过引用整体结合于此。本文所引用的任何参考材料或任何一般的现有技术与本说明书的明确教示之间的任何差异旨在有利地包含在本说明书教示中。其包括词或短语的该领域所认同的定义以及相同词或短语的在本说明书所明确提供的定义之间的任何不一致。

Claims (23)

1.一种自动细胞计数器，包括：
光学部件；
用于收纳样品载玻片的样品托板；以及
用于保持所述光学部件和样品托板的外壳，
所述光学部件包括：
光源；
数字成像传感器；以及
透镜，所述透镜被放置成引导来自所述光源的光穿过所述样品托板到达所述数字成像传感器，
所述光学部件排列在线性光路中，并且被安排成使得当包含细胞悬浮液的样品载玻片被安装到所述样品托板中时，所述细胞悬浮液的图像被投影到所述数字成像传感器上，所述数字成像传感器包括至少约4,000,000个像素并且对样品托板处的至少3mm2的视场进行成像，每个像素的面积是2×2μm或更小些，其中，所述光路是垂直取向的，并且，所述外壳被安装到一支撑基座，所述支撑基座至少与所述外壳一样宽，所述外壳和支撑基座各自占据的横向面积不大于300cm2，所述光路的总高度不大于20cm。
2.如权利要求1所述的自动细胞计数器，其中，
所述数字成像传感器包含约4,000,000到10,000,000个像素，每个像素的面积约为0.5×0.5μm到2×2μm，成像的场约为3mm2到10mm2。
3.如权利要求1所述的自动细胞计数器，其中，
所述数字成像传感器包括用于产生所述图像的相邻区域之间的对比值的装置，所述样品托板具有沿着所述光路的可调节的高度，所述细胞计数器还包括用于响应于所述对比值而自动调节所述高度直到所述图像被聚焦的装置。
4.如权利要求3所述的自动细胞计数器，还包括：
数字成像器，用于对所述视场中的细胞进行计数。
5.如权利要求4所述的自动细胞计数器，其中，
当把样品载玻片插入到所述样品托板中时，就自动地启动所述样品托板的所述高度的自动调节以及数字成像器。
6.如权利要求1所述的自动细胞计数器，其中，
所述数字成像传感器是平的，所述透镜包括消色差透镜对，所述消色差透镜对具有在所述数字成像传感器处的聚焦场，所述自动细胞计数器还包括用于校正所述聚焦场的曲率的装置。
7.如权利要求6所述的自动细胞计数器，其中，
所述用于校正所述聚焦场的曲率的装置是与所述数字成像传感器相邻的负透镜。
8.如权利要求1所述的自动细胞计数器，其中，
所述光源是光谱受限的，以在所述成像传感器中产生一图像，所述图像在活细胞和死细胞之间作出区分。
9.如权利要求1所述的自动细胞计数器，其中，
所述数字成像传感器是彩色数字传感器。
10.如权利要求1所述的自动细胞计数器，其中，
当所述支撑基座位于一表面上时，所述外壳的高度是30cm或更小并且所述样品托板是在所述表面上方至少6cm。
11.如权利要求1所述的自动细胞计数器，还包括：
质量控制载玻片，所述质量控制载玻片具有用于被安装到所述样品托板上的尺寸，并且其上印有图案以模拟活细胞和死细胞。
12.一种用于对细胞悬浮液中的细胞进行计数的样品载玻片，所述样品载玻片包括：
具有第一和第二内部腔室的平板，每个内部腔室以光学清晰的顶部窗口和底部窗口为界；以及
在所述平板中的第一和第二取向凹口，用于引导所述平板按多种取向进入细胞计数仪器由此使所述顶部窗口在所述仪器内面朝着一选定的方向，
其中，所述第一和第二内部腔室沿着所述平板纵向地彼此分开，并且
其中，所述第一和第二取向凹口形成于所述平板的两个对角线相对的角处，
使得所述样品载玻片是对称的并且可以用任一末端先插入所述细胞计数仪器。
13.如权利要求12所述的样品载玻片，其中，
所述顶部窗口比所述底部窗口薄很多。
14.一种用于对细胞悬浮液中的细胞进行计数的方法，所述方法包括：
(a)将所述细胞悬浮液的等分部分放置在样品载玻片的内部腔室中，以在所述腔室中形成所述悬浮液的薄膜；
(b)在权利要求1所述的自动细胞计数器上产生所述薄膜内的至少3mm2的视场的数字图像；以及
(c)对所述数字图像中的细胞进行数字计数。
15.如权利要求14所述的方法，其中，
所述数字成像传感器包含约4,000,000到10,000,000个像素，每个像素的面积约为0.5×0.5μm到2×2μm，成像的场约为3mm2到10mm2。
16.如权利要求14所述的方法，其中，步骤(b)是通过包括下列的多种功能来执行的：
通过移动所述样品托板，自动地聚焦所述数字图像；
检测所述等分部分中是否有活性染色剂；
当检测到活性染色剂时，产生所述样品载玻片的内部腔室中的多个焦平面的数字图像；以及
处理在所述数字成像传感器上所形成的图像以确定所述等分部分中的细胞计数，
上述多种功能都是在上述外壳内执行的。
17.如权利要求14所述的方法，还包括：(a’)自动地产生所述图像的相邻区域之间的对比值，并且，响应于对比值，沿着所述光路将所述样品托板自动地调节至一高度以聚焦所述图像。
18.如权利要求14所述的方法，其中，
当把所述样品载玻片插入到所述样品托板中时，就自动地启动步骤(a’)和(b)。
19.如权利要求14所述的方法，其中，
所述数字成像传感器是平的，所述透镜包括消色差透镜对以及负透镜，所述消色差透镜对具有在所述数字成像传感器处的聚焦场，所述负透镜被定位成校正所述聚焦场的曲率。
20.如权利要求14所述的方法，其中，
所述光源是光谱受限的，以在所述成像传感器中产生一图像，所述图像在活细胞和死细胞之间作出区分。
21.如权利要求14所述的方法，还包括：
用活性染色剂处理所述细胞悬浮液，由此在所述成像传感器中产生一图像，所述图像在活细胞和死细胞之间作出区分。
22.如权利要求14所述的方法，其中，
所述数字成像传感器是彩色数字传感器。
23.如权利要求14所述的方法，其中，
步骤(c)包括将所述光学部件聚焦到所述内部腔室内的多个平面上。
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