JP2013500033A - ピロロキノリンキノン(quinine)依存性可溶性グルコースデヒドロゲナーゼの突然変異体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
特許文献1は、2つのサブユニットがジスルフィド架橋によって結合するように突然変異させたPQQ s−GDHを記載している。この突然変異は、415位及び414位の少なくとも1つのアミノ酸、並びに/又は同時に340位及び418位に位置する2つのアミノ酸をシステイン残基で置き換えることからなる。これらの修飾は、より良好な熱安定性を酵素に与えている。
特許文献2は、領域349〜377内の少なくとも1つのアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えたPQQ s−GDHを記載している。この修飾は、基質による阻害に対する感受性が低下した酵素をもたらし、したがって高濃度のグルコースの存在下で使用することができる。
野生型PQQ s−GDHを修飾して、より基質特異的なものにすることも可能である。或る基質に対して特異的な酵素は該基質が関与する反応しか触媒しないが、逆に基質特異性の低い酵素は、その天然基質に構造的に類似した基質に基づく反応を触媒することが可能である。PQQ s−GDHの天然基質はグルコースであるが、野生型PQQ s−GDHの特異性は低く、他の単糖類及び二糖類の酸化を触媒することも可能である。
このため、特許文献3は49位、67位〜69位、76位、89位、129位〜131位、167位〜170位、174位、188位、189位、207位、215位、245位、249位、300位、341位〜343位、349位、351位及び429位に位置するアミノ酸の少なくとも1つを置換すること、並びに/又はアミノ酸を428位と429位との間に導入することによってPQQ s−GDHを修飾することを提案している;
特許文献4は、428位と429位との間にロイシン、リシン又はアラニンを挿入することによってPQQ s−GDHを修飾することを提案している;
特許文献5は、PQQ s−GDHの75位、326位〜354位、278位〜320位及び162位〜197位のうちの1つの位置でアミノ酸を置換することを記載している;
特許文献6は、PQQ s−GDHの428位と429位との間にアミノ酸を挿入し、任意で428位のアミノ酸をロイシン、プロリン又はバリンで置換することを提言している;
特許文献7は、125位、128位、142位、168位、169位、170位、224位、230位、236位、345位、351位、416位又は428位に1つ又は複数の置換を有するアシネトバクター属のPQQ s−GDHの突然変異体を記載している。この文献は更に、多数の突然変異部位を有する具体的な突然変異体を列挙している;
特許文献8は、428位と429位との間にロイシン、アラニン又はリシンの挿入を有するアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumanii)のPQQ s−GDHの突然変異体、又は429位のアミノ酸がフェニルアラニン、プロリン、ロイシン又はチロシンで置換されている突然変異体を挙げている;
特許文献9は、348位のアミノ酸をアラニン、グリシン又はセリンで、428位のアミノ酸をロイシン、プロリン又はバリンで置換することを提案している。
これらの活性は、とりわけ生理的濃度、すなわち1mM〜10mMのグルコースで野生型酵素の活性よりも高い。酵素の活性は、PQQ s−GDHによるグルコースのグルコノラクトンへの酸化反応中に起こるレドックス試薬の着色をモニタリングすることによって定量化することができる。レドックス試薬は例えば、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)と組み合わせたフェナジンメトスルフェート(PMS)、フェリシアン化カリウム及びフェロセンである;
これらは高濃度でのグルコースの阻害効果に対する感受性が低い。
a)その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬、及び本発明によるPQQ s−GDH突然変異体を上記サンプル中に導入する工程、
b)酵素反応後にサンプルの着色の強さを測定する工程、
c)工程b)において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
d)上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含む、サンプルにおけるグルコースの溶液アッセイの方法に更に関する。
a)本発明によるグルコース電極を上記サンプル中に導入する工程、
b)サンプル中の電流の強さを測定する工程、
c)工程b)において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
d)上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルのグルコースアッセイの方法にも関する。
1.1.大腸菌の菌株
DH5α:supE44、ΔlacU169、(Φ80 lacZDM15)、hsdR17、recA1、endA1、gyrA96、thi−1、relA1(Hanahan, 1983)。この株はプラスミド作製及び定方向突然変異誘発に使用される。
pgp492:Nora Goosenから提供、アシネトバクター・カルコアセチカスの可溶性PQQグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列をクローニングすることによって得られた組み換えプラスミド(Cleton-Jansen et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436)。
LB富栄養培地:トリプトン10g/L;酵母エキス5g/L;NaCl 5g/L;蒸留水適量(全量1L);pH無調整、1バールで50分間オートクレーブ。
2.1.スーパーコンピテント細菌の形質転換
スーパーコンピテント細菌DH5αは、Inoueの方法によって作製する(Sambrook and Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
プラスミドDNA精製キット(Quiagen)を少量及び大量のDNA調製に使用する。
二本鎖DNAを、シークエンシングキットBigDyeターミネーターv1.1又はv3.1を用いてシークエンシングする。試薬は異なる蛍光マーカーを有する4つのddNTP(BigDyeターミネーター)、AmpliTaq DNAポリメラーゼ、及び反応に必要とされる他の全ての成分を含有する。伸長産物をシークエンサーABI 3130xlにかける前に精製して、取り込まれなかったマーカー、塩及び他の汚染物質を除去しなくてはならない。
突然変異誘発プロトコルでは、プラスミドの二本鎖の複製に関してポリメラーゼTaqよりも6倍信頼性の高いパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)のDNAポリメラーゼPfuを用いてPCRを行う。表Iに列挙したオリゴデオキシリボヌクレオチド(各々がプラスミドの鎖に相補的である)は、DNAポリメラーゼPfuによるDNA合成のプライマーとして働き、非再結合(non-religated)末端で突然変異したプラスミドをもたらす。
3.1.野生型PQQ s−GDH及び突然変異PQQ s−GDHの生成
アポ酵素s−GDHを大腸菌JM101株において、野生型s−GDH又は突然変異s−GDHをコードする配列を有する組み換えプラスミドpgp492によって生成させる。アンピシリン(200mg/L)を添加したLB培地(LBA)50mLの前培養物に、アンピシリン(100mg/mL)を添加したLB寒天皿上で単離されたクローンを播種し、37℃で一晩220rpmで攪拌する。培養物をLBA培地に100倍で播種する。これを37℃で攪拌しながら(220rpm)、OD600nmが0.4OD600nm/mL〜1OD600nm/mLとなるまでインキュベートする。次いで、培養物を400μMのIPTGによって誘導した後、25℃で20時間攪拌する(180rpm〜220rpm)。遠心分離(5285g、4℃)によって回収した細胞を、Tris 20mM、CaCl2 3mMの緩衝液(pH7.5)で洗浄し、−20℃又は添加剤を加えずに−80℃で保管する。
3.2.1.細胞破壊及びDNase Iでの処理
1リットルの培養物から得られた細胞ペレットを、Tris 20mM、CaCl2 3mMの緩衝液(pH7.5)20mL中に溶解させ、40Wの超音波処理出力で超音波1秒、停止1秒のサイクルで3分間超音波処理する。得られたサンプル(粗抽出物と呼ぶ)に最後に2mM MgCl2を添加し、室温で30分間DNase I(粗抽出物1mL当たり1U)で処理する。次いで、不溶性細胞残屑を20000gで45分間の遠心分離によって粗抽出物から除去する。
カットオフ値(cutoff threshold)が0.22μmのフィルター(Millex−GS 0.22μm、Millipore)で濾過して、OD280nmが10となるように希釈した超音波処理上清を、AKTA purifierシステム(GE Healthcare(登録商標))に接続し、Tris 20mM、CaCl2 3mMの緩衝液(pH7.5)で平衡化した陽イオン交換カラムsource 30S(GE Healthcare(登録商標))に投入する。溶出は同緩衝液中0Mから1MまでというNaCl勾配で、5mL/分の流速で行う。s−GDHタンパク質を含有する画分を合わせ、Amicon YM10膜上での遠心分離によって濾過することで濃縮する。この段階でs−GDHタンパク質は純粋であり、硫酸アンモニウム(90%飽和)の存在下、−20℃で沈殿形態で保管することができる。
3.2.3.1.分子量の決定
精製後のs−GDH単量体の分子量を、MALDI質量分析によって決定する。タンパク質をPD10カラム(GE Healthcare)上で脱塩し、重炭酸アンモニウム50mMの緩衝液(pH7.5)で溶出する。次いで、凍結乾燥したサンプルをMALDI−TOFによって分析すると、分子量が50234.83Daであることが確認される。この分子量はシグナルペプチドを有しないPQQ s−GDHの理論分子量に一致する。
精製(Tris 20mM、CaCl2 3mMの緩衝液(pH7.5))の終了時に、酵素溶液をPQQと共に室温で15分間プレインキュベートする。添加したPQQは、酵素のモル濃度(molarity of the concentration)の2倍に等しい最終濃度に相当する。次いで、Pipes 20mM、CaCl2 3mMの緩衝液(pH7)で平衡化したPD10カラム(GE Healthcare)上で脱塩することによって過剰のPQQを除去する。
溶液中の酵素濃度を、補因子PQQを有する又は有しない酵素(二量体又は単量体;吸光係数はそれぞれ1.28l・g−1・cm−1又は1.67l・g−1・cm−1である)を用いて280nmで測定したODから算出する(Olsthoorn et al., 1997)。
酵素試験は、リン酸ナトリウム20mMの緩衝液(pH7)中、37℃、3mLの容量でVarianの分光光度計を用いて、電子受容体として働くPMSを用いたDCIPの還元による消失を600nmで時間に応じてモニタリングすることで行う。酵素の特異的活性は、タンパク質1mg当たり1分間に消失したDCIPのμmol量で表される。PMS及びDCIPの濃度はそれぞれ0.6mM及び0.06mMである。酵素を−0.05OD600nm/分と−0.2OD600nm/分との間の傾きが測定されるように希釈する。
4.1.定常状態での速度定数(kcat)及びミカエリス定数(KM)の決定
実験はリン酸ナトリウム20mMの緩衝液(pH7)中37℃で、Varianの分光光度計上で行う。この試験における基質(グルコース及びマルトース)の濃度は、0mM〜800mMの間で変化させる。
(1)ミカエリス−メンテンモデル
kss=kcat×[S]/(KM+[S])
(2)二重直角双曲線関数(Double hyperbole)
kss=kcat1×[S]/(KM1+[S])+kcat2×[S]/KM2+[S])
(3)競合的阻害によるミカエリス−メンテンモデル
v/vmax=[S]/KS×(1+[S]/KS+[I]/KI)
図2A、図2B、図2C、図2D、図2E及び図2Fのグラフは、野生型(WT)及び428位で突然変異させた(N428C、N428Y、N428A、N428K、N428D及びN428E)アシネトバクター・カルコアセチカスの可溶性PQQグルコースデヒドロゲナーゼのグルコース又はマルトースの存在下での定常状態の速度論パラメータを示す。
4.2.1.pHに応じた活性
pHに応じた反応速度定数の変化の調査を、野生型酵素及び突然変異酵素をTris 120mM、イミダゾール30mM、酢酸30mMから構成される混合緩衝液(TIA)(NaClを用いてイオン強度を190mMに調整する)、又はpH範囲が6〜8のリン酸ナトリウム20mMの緩衝液(NaPi)中でインキュベートすることによって、5〜9のpH範囲にわたって行う。Varianの分光光度計を用いて37℃で実験を行う。PMSを第1の電子受容体として0.6mMの濃度で使用する。活性を、第2の電子受容体として0.06mMの濃度で使用されるDCIPの消失によって600nmでモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。野生型酵素又は突然変異酵素の最適活性は100%に対応し、各pHに対する活性を示す。
図3A及び図3Bは、野生型(WT)及び428位でシステインに突然変異させた(N428C)アシネトバクター・カルコアセチカスのPQQ s−GDHのpHに応じた活性を示すグラフである。これらの結果から、PQQ s−GDHのシステイン突然変異体(N428C)が野生型酵素の活性に匹敵する相対活性を示すことが示され、この突然変異がpHに関わらず相対活性の喪失をもたらさないことが実証される。
野生型PQQ s−GDH又は突然変異PQQ s−GDHのpHに応じた安定性を、精製した酵素を均質になるまでpH範囲5〜9の混合緩衝液で希釈することによって決定する。この混合緩衝液はTris 120mM、イミダゾール30mM、酢酸30mMから構成され、そのイオン強度をNaClを用いて190mMに調整する。希釈した酵素溶液(1μg/ml〜6μg/ml)を37℃でプレインキュベートする。時間に応じて様々なサンプルをとる。残存活性をリン酸ナトリウム20mMの緩衝液(pH7)中、0.06mM DCIP、0.6mM PMSの存在下でVarianの分光光度計を用いて37℃で測定する。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については75mM、突然変異体N428Cの試験については150mMである。
本発明による突然変異酵素は、その安定性が試験したpH範囲にわたって一定であるか否かを問わないが、pHに関わらず野生型酵素よりも良好な安定性を示す。特に、突然変異酵素はpHが7を超えても安定なままである。
4.3.1.温度に応じた活性
反応速度定数の変化を、リン酸ナトリウム20mMの緩衝液(pH7)中、0.06mMのDCIP及び0.6mMのPMSの存在下でpHに応じて調査する。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については75mM、突然変異体N428Cの試験については150mMである。温度は10℃〜60℃で変化させる。温度制御したVarianの分光光度計CARY UV Biomelt上で活性をモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。
図4は、野生型(WT)及び突然変異させた(N428)PQQ s−GDHの温度に応じた活性曲線を示す。
この研究は、リン酸ナトリウム20mMの緩衝液(pH7)中、0.06mMのDCIP及び0.6mMのPMSの存在下で行う。グルコース濃度は、野生型酵素の試験については75mM、突然変異体N428Cの試験については150mMである。温度は10℃〜60℃で変化させる。温度制御したVarianの分光光度計CARY UV Biomelt上で37℃で活性をモニタリングする。酵素を添加することによって試験を開始する。
200分未満のインキュベーション時間では、突然変異酵素N428Cが40℃及び50℃で野生型酵素よりも良好な活性を示すことが分かり、したがって血中グルコースアッセイキットについてのその利点が実証される。
システイン突然変異体(N428C)の特異性を様々な基質に関して評価した。
突然変異体N428Cのkssの生値は大半の基質について野生型酵素の値よりも高いが、相対活性(或る基質に対する酵素の特異性を別の基質と比較して特徴付ける)から、突然変異体N428Cがグルコースに対してより特異的であることが示される。したがって、4mMの基質では、マルトースを基質とすると、野生型酵素についてはグルコースと比べた相対活性は81%であることが測定されるのに対して、突然変異体N428Cの示すグルコースと比べたマルトースの相対活性は61%である。
Claims (15)
- 配列番号2のアシネトバクター・カルコアセチカスのPQQ s−GDHに対して少なくとも80%の同一率を有するPQQ s−GDHの突然変異体であって、428位に位置するそのアミノ酸が配列番号2と比べてシステイン、アラニン又はアスパラギン酸を含む群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、配列番号2のアシネトバクター・カルコアセチカスのPQQ s−GDHに対して少なくとも80%の同一率を有するPQQ s−GDHの突然変異体。
- PQQ s−GDHの突然変異体であって、428位に位置するそのアミノ酸が配列番号2と比べて置換されており、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号12及び配列番号14を含む群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、PQQ s−GDHの突然変異体。
- 請求項1又は2に記載の突然変異体PQQ s−GDHをコードすることを特徴とする核酸分子。
- 配列番号15と配列番号16との対、配列番号19と配列番号20との対、配列番号21と配列番号22との対、配列番号23と配列番号24との対、及び配列番号25と配列番号26との対を含む群から選択されるオリゴヌクレオチド対による、配列番号1の配列を有する核酸分子の突然変異によって得られることを特徴とする、請求項3に記載の核酸分子。
- 配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号11及び配列番号13を含む群から選択される配列を有することを特徴とする、請求項3又は4に記載の核酸分子。
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする、請求項1又は2に記載の酵素を発現する宿主細胞。
- サンプル中のグルコース濃度を測定するための請求項1又は2に記載のPQQ s−GDH突然変異体の使用。
- 前記サンプルが生体サンプル、特に血液であることを特徴とする、請求項8に記載の使用。
- 請求項1又は2に記載のPQQ s−GDHの突然変異体を含むことを特徴とするグルコースアッセイキット。
- 請求項1又は2に記載のPQQ s−GDHの突然変異体を少なくとも1つ含む被着物で被覆された導電材料を含むことを特徴とするグルコース電極。
- 請求項11に記載の電極からなることを特徴とするグルコースセンサー。
- アノードである請求項11に記載の第一電極と、カソードである第二電極とを備えることを特徴とするグルコースバイオ燃料電池。
- サンプルにおいて溶液中のグルコースを定量する方法であって、
a)その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬と、請求項1又は2に記載のPQQ s−GDH突然変異体とを前記サンプル中に導入する工程、
b)酵素反応後に前記サンプルの着色の強さを測定する工程、
c)工程b)において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
d)前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルにおいて溶液中のグルコースを定量する方法。 - サンプルのグルコースアッセイを行う方法であって、
a)請求項11に記載のグルコース電極を前記サンプル中に導入する工程、
b)前記サンプル中の電流の強さを測定する工程、
c)工程b)において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程、
d)前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程
を含むことを特徴とする、サンプルのグルコースアッセイを行う方法。
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