JP2013216646A

JP2013216646A - マトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤及び抗菌ペプチド産生促進剤

Info

Publication number: JP2013216646A
Application number: JP2012111993A
Authority: JP
Inventors: Yu Goto; 悠後籐; Maya Hongo; 麻耶本郷
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Chemical Industries Inc
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-10-24

Abstract

【課題】優れたマトリックスメタロプロテア−ゼ（MMPs：Matrix metalloproteinase）活性阻害作用、抗菌ペプチド産生促進作用を有する天然物抽出物を有効成分とするMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤、特に、MMP−１活性阻害剤、ｈDB-１産生促進剤を提供する。
【解決手段】センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分とするMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤。MMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤は、MMPs及び／又は抗菌ペプチドが関与する疾患・症状の予防又は治療薬として期待出来る。
【選択図】図１

Description

本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs：Matrix Metalloproteinases）活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤に関するものである。

マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs：Matrix metalloproteinases）は、生体組織を構成する各種コラ−ゲン、組織骨格を構成するプロテオグリカン、細胞接着因子のラミニン・フィブロネクチン等の細胞外マトリックスを分解する酵素として知られている。また、活性中心に金属イオン（亜鉛イオン）が配座するMMPsは、前記の生体成分を分解することにより様々な生物活性発現に関与している。生体成分のコラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外マトリックスは、通常、MMPs及びその生体内阻害因子であるTIMP（Tissue inhibitor of metalloproteinase）とのバランスにより調整されており、このバランスが崩れた場合、例えば、MMPs活性亢進による細胞外マトリックスの分解が促進された場合に様々な疾患症状が発症する。

MMPsは、大きく分泌型及び膜結合型の２種類に分類され、異なる分布及び基質特異性を有する３０種類以上のサブタイプが存在することが報告されている。これらのサブタイプの内、MMP１は、タイプI型コラーゲンに対する基質特異性を有し、癌の転移及び浸潤（例えば、特許文献１を参照）、急性冠症候群（心筋梗塞、不安定狭心症、心臓虚血による突然死）（例えば、非特許文献１を参照）、歯肉炎、歯周炎等の歯周病（例えば、特許文献２を参照）、慢性閉塞肺疾患（例えば、特許文献３を参照）、皮膚の弾性低下、しわ形成（例えば、特許文献４を参照）、変形性関節症、慢性関節リュウマチ等の関節疾患等の疾患に関与することが報告されている。さらに、MMP１活性を調節する成分の研究も盛んに行われ、かかる作用を有する成分としては、癌細胞の転移抑制作用を有するメナテトレン（例えば、特許文献５を参照）、変形性関節症等の予防又は改善作用を有するアディポネクチン（例えば、特許文献６を参照）、アテローム性動脈硬化、急性冠症候群に対する作用が期待される化合物（例えば、特許文献７を参照）、アミノ酸誘導体（例えば、非特許文献２を参照）、フラボノイド誘導体（例えば、非特許文献３を参照）、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の肌荒れ、抗老化症状に対する予防又は改善する作用を有するウーロンチャ抽出物（例えば、特許文献８を参照）等が報告されている。また、MMP１をはじめとする皮膚に存在するMMPsは、皮膚構造及び機能に深く関与する細胞外マトリックスの恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等を維持し、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態を保つのに役立っている。

一方、皮膚、口腔、気管、消化管などの外部と接触する上皮細胞において微生物感染に対する抵抗性因子として産生される抗菌性物質には、抗菌ペプチドが存在する。抗菌ペプチドは、その広い抗菌活性による殺菌作用のほか、他の抗菌剤とは異なり耐性が出来難いことなどの免疫的な観点より大きな注目が集まっている。主要な抗菌ペプチドとしては、陽性に帯電したペプチドであるデフェンシンが良く知られている。さらに、ヒトが産生する抗菌ペプチドのデフェンシンは、主に好中球が産生するα−デフェンシン（HNP）と、上皮細胞が産生するβ−デフェンシン（hBD）に分類され、α−デフェンシンには６種類（HNP１−６）、β−デフェンシンには４種類（hBD１−４）のサブタイプが報告されている。抗菌ペプチドには、本来的な抗菌作用に加え、口腔粘膜障害改善作用（例えば、特許文献９を参照）、歯周炎改善作用（例えば、特許文献１０を参照）、抗腫瘍作用及び癌細胞増殖抑制作用（例えば、特許文献１１を参照）、皮膚バリア機能向上作用（例えば、特許文献１２を参照）等が報告されている。さらに、抗菌ペプチドは、ざ瘡（皮疹）、過敏性腸症候群（例えば、特許文献１３を参照）、統合失調症、乾癬、創傷治癒、敗血症（例えば、特許文献１４を参照）、上皮及び繊維芽細胞の増殖、血管形成、並びに脈管形成などの疾患・症状に関与することも示唆されている。このため、抗菌ペプチド産生を調整する作用を有する成分には、前記疾患・症状を予防又は改善する効果が期待、特に、抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分は、幅広い抗菌スペクトルを有し耐生が出来難い抗菌剤、敗血症治療薬、過敏性腸症候群治療薬、肌荒れ予防又は改善剤、抗老化剤としての開発が期待出来る。

特開２００７−１２６４１８号公報特開２００２−０２９９５３号公報特開２０１１−１４０５１１号公報特開２００８−０２４６３８号公報再表２００４−０９３８５８号公報特開２００４−３４５９６８号公報特開平１１−２９２８３９号公報特開２００７−３０２６０４号公報特表２０００−５０１３８８号公報特開２００１−２８８１０５号公報特開２００１−００２５８２号公報特開２０１１−１６８５５５号公報特開２００４−１０７３０２号公報特表２００２−５１６３３９号公報

Ikeda, U. et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 35（6）, 886-890（2000） Hirayama, R. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 5（4）, 765-778（1997） Chan-Woo Lee et. al., bioorganic & Medicinal Chemistry, 16, 732-738（2008）

本発明のMMPs活性阻害剤（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物）のMMP−１活性阻害（産生抑制）作用に関する評価結果を示す図である。本発明のMMPs活性阻害剤（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物）のMMP−１活性阻害（産生抑制）作用による培養上清の色調変化を示す図である。本発明のMMPs活性阻害剤（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物）のMMP−１活性阻害（蓄積量減少）作用に関する評価結果を示す図である。本発明の抗菌ペプチド産生促進剤（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物）のｈBD−１産生促進作用に関する評価結果を示す図である。本発明のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物の皮膚バリア機能向上作用に関する評価結果を示す図である。

本発明は、優れたMMPs活性阻害作用、抗菌ペプチド産生促進作用を有する天然物抽出物を有効成分として含有するMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明者等は、MMPs活性阻害作用、抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分を求め鋭意努力を重ねた結果、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物が、優れたMMPs産生阻害作用、抗菌ペプチド産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下の通りである。
＜１＞センダン科センダン属インドセンダン（Melia azadirachta）より得られる植物抽出物を有効成分として含有する、MMPs活性阻害剤。
＜２＞前記MMPsが、MMP−１である、＜１＞に記載のMMPs活性阻害剤。
＜３＞センダン科センダン属インドセンダン（Melia azadirachta）より得られる植物抽出物を有効成分として含有する、抗菌ペプチド産生促進剤。
＜４＞前記抗菌ペプチドが、デフェンシン（defensin）である、＜３＞に記載の抗菌ペプチド産生促進剤。
＜５＞前記デフェンシンが、hBD−１である、＜３＞又は＜４＞に記載の抗菌ペプチド産生促進剤。

本発明によれば、天然物由来の植物抽出物であるセンダン科センダン属インドセンダン（Melia azadirachta）より得られる植物抽出物を有効成分として含有するMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤を提供することが出来る。

以下、本発明の実施の形態に関し説明する。本発明のMMPs活性阻害剤、並びに、抗菌ペプチド産生促進剤は、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。ここで本発明の植物抽出物とは、抽出物自体、抽出物の分画、精製した分画、抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。また、本発明のMMPs活性阻害剤は、MMPs酵素活性を抑制し細胞外マトリックス成分の分解を抑制する作用を有する成分のほか、細胞外マトリックス成分の産生を促進する作用を有する成分も包含する。また、本発明のMMPs活性化阻害剤としては、MMPs産生を抑制する成分、MMPs蓄積量を減少させる成分などが好適に例示出来る。本発明のMMPs活性阻害剤は、特にMMP−１活性阻害作用に優れ、後述するMMPs、取り分け、MMP−１が関与する症状又は疾患等への適用が好ましい。一方、本発明の抗菌ペプチド産生促進剤は、抗菌ペプチド産生促進作用、特にｈBD−１産生促進作用に優れ、後述する抗菌ペプチド、取り分け、hBD−１が関与する症状又は疾患等に適用することが好ましい。

本発明のMMPs活性阻害剤は、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分とすることを特徴とする。MMPsは、生体組織を構成する各種コラ−ゲン、組織骨格を構成するプロテオグリカン、細胞接着因子のラミニン・フィブロネクチン等の細胞外マトリックスを分解する酵素であり、様々な疾患症状の発症・悪化等に関与する。特に、MMP−１は、癌の転移及び浸潤、急性冠症候群（心筋梗塞、不安定狭心症、心臓虚血による突然死）、歯肉炎、歯周炎等の歯周病、慢性閉塞肺疾患、皮膚の弾性低下、しわ形成、変形性関節症、慢性関節リュウマチ等の関節疾患等の疾患の発症・悪化に関与する。本発明のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分とするMMPs活性阻害剤は、優れたMMPs産生阻害作用、取り分け、MMP−１産生阻害作用を有し、かかる作用を介し細胞外マトリックスの破壊が病態と関連する前記の症状、疾患に対し予防又は改善効果を発揮することが期待出来る。本発明のMMPs産生阻害剤が対象とする症状及び疾患の発症・悪化としては、細胞外マトリックスの破壊が病態と関連する症状及び疾患であれば特段の限定なく適用することが出来る。尚、本発明のMMPs活性阻害剤の実施形態の用途は、前記の用途に限定されるものではなく、MMP−１活性阻害作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることが出来る。

本発明の抗菌ペプチド産生促進剤は、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分とすることを特徴とする。抗菌ペプチドは、３０個前後のアミノ酸より構成される生体の微生物感染に対する抵抗性因子として産生される抗菌性物質であり、defensin、cathelicidin、dermcidin等が知られている。抗菌ペプチドは、皮膚、口腔、気管、消化管などの外部と接触する上皮組織に存在し、自然免疫及び獲得免疫に深く関与している。ヒトが産生する主要な抗菌ペプチドとしては、デフェンシンが良く知られている。陽性に帯電したデフェンシンは、微生物の細胞膜に穴を開けることにより強力且つ幅広い抗菌スペクトルを有しする殺菌作用を発現する。デフェンシンには、主に好中球が産生するα−デフェンシン（HNP）及び上皮細胞が産生するβ−デフェンシン（hBD）が知られ、α−デフェンシンには６種類（HNP１−６）、β−デフェンシンには４種類（hBD１−４）のサブタイプが存在する。さらに、デフェンシンをはじめとする抗菌ペプチドは、その幅広い抗菌スペクトル、並びに、耐生が出来難いことから高い殺菌作用を有する成分として注目されている。本発明の抗菌ペプチド産生促進剤は、抗菌ペプチド産生が抑制されることにより生じる症状・疾患であれば特段の限定なく適用することが出来る。かかる症状又は疾患としては、例えば、微生物感染、口腔粘膜障害、歯周炎、腫瘍作用及び癌細胞増殖、皮膚バリア機能低下による肌荒れ、ざ瘡（皮疹）、過敏性腸症候群、統合失調症、乾癬、創傷治癒、敗血症、上皮及び繊維芽細胞の増殖、血管形成、並びに脈管形成などの疾患・症状等が好適に例示出来る。この様に、抗菌ペプチド産生を促進する作用を有する成分には、前記疾患・症状を予防又は改善する効果が期待出来る。特に、抗菌ペプチド産生促進作用を有する成分は、幅広い抗菌スペクトルを有し耐生が出来難い抗菌剤、敗血症治療薬、過敏性腸症候群治療薬、肌荒れ予防又は改善剤、抗老化剤としての開発が期待出来る。

また、本発明のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、優れたMMPs活性阻害作用、抗菌ペプチド産生促進作用を有する。MMPs活性阻害作用及び抗菌ペプチド産生促進作用を合わせ持つ成分は、前記疾患・症状の内、特に、肌荒れ予防又は改善、抗老化（シワ形成に対する予防又は改善）用に好適である。本発明のMMPs活性阻害作用、並びに、抗菌ペプチド産生促進作用を併せ持つ成分には、皮膚において、MMP活性阻害作用による皮膚の構造的な修復効果と、抗菌ペプチドによる皮膚バリア機能向上改善効果を同時に発揮することが可能であるため、両作用による相乗的な予防又は治療効果が期待出来る。

本発明のMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤の有効成分であるセンダン科センダン属インドセンダン（学名：Melia azadirachta、別名：ニーム）は、インドを原産地とする常緑高木であり、日本においては、伊豆半島以南の暖地沿岸に野生状に生育しており、容易に入手することが出来る。また、インドセンダンの若芽は茹でることにより食用に、果実及び樹皮は、生薬として利用されている。

本発明のMMPs活性阻害剤及び抗菌ペプチド産生促進剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物の作製に用いる部位としては、全草、地上部、葉、花、花穂、果実、茎、樹皮、枝葉、幹、根茎、根皮、根、種子等から選択される１種又は２種以上を用いることが出来、葉を用いることが、特に好ましい。また、本発明のセンダン科センダン属インドセンダより得られる植物抽出物は、日本に於いて自生又は生育された植物、漢方生薬原料などとして販売される日本産のものを用い植物抽出物を作製することも出来るし、一丸ファルコス株式会社などの植物抽出物を扱う会社より販売されている市販の植物抽出物を購入し、使用することも出来る。抽出物は、前記の抽出部位から溶媒を用い直接抽出することで得られるもののほか、圧搾処理を施した後に得られる圧搾液及び／又は残渣に溶媒を加え抽出することで得られるものも、本発明における抽出物の定義の範疇に含まれる。また、抽出に際しては、全草、葉又は地上部は予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。抽出方法に付いては、その溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、又は抽出時間を任意に設定することが出来る。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、１０〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。

本発明において使用するセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を施すことが可能で、精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、種々の分離モ−ド（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティ−等）を有するクロマトグラフィ−を用いた分画、濾紙やメンブランフィルタ−、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、pH調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組合わせた処理を行うことが可能である。

本発明で使用するセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物の形態としては、液状、固形状、粉末状、ペ−スト状、ゲル状等いずれの形状でも良く、最終的な製品を構成する上で最適な形状を任意に選択することができる。

前記抽出溶媒は、本発明で使用する植物抽出物を得るための抽出溶媒としては、供する製品の使用目的、種類、あるいは後に行う加工処理等を考慮した上で選択すれば良いが、通常では、水、メタノ−ル、エタノ−ル、プロピルアルコ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ル、イソブタノ−ル等の低級アルコ−ル或いは含水低級アルコ−ル、プロピレングリコ−ル、１，３−ブチレングリコ−ル、１，２−ブチレングリコ−ル、１，４−ブチレングリコ−ル、１，５−ペンタンジオ−ル、１，２−ペンタンジオ−ル、１，３−ペンタンジオ−ル、１，４−ペンタンジオ−ル、１，３，５−ペンタントリオ−ル、グリセリン、ポリエチレングリコ−ル（分子量１００〜１０万）等の多価アルコ−ル或いは含水多価アルコ−ル、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエ−テル、ジメチルエ−テル、エチルメチルエ−テル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノ−ル、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等）やアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）の中から選ばれる１種もしくは２種以上の混液を用いるのが望ましい。但し、用途により溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用したり、あるいは抽出後に溶媒を除去しやすい、揮発性の高い溶媒を用いて抽出を行い、溶媒除去後水等に溶解させるといった方法も可能である。又、適宜搾取抽出を行っても良い。

本発明のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分とするMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤の投与量は、症状及び疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等により適宜選択すればよい。本発明のMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤を含有する組成物の内、特に皮膚外用剤に関して述べれば、皮膚外用剤全量に対し０．００１質量％〜１０質量％、より好ましくは、０．０５質量％〜７質量％、さらに好ましくは、０．０１〜５質量％含有させることがより好ましい。これは、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分とするMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤の皮膚外用剤全量に対する含有量が、少なすぎるとMMPs活性阻害作用、抗菌ペプチド産生促進作用による前述の症状及び疾患の発生・悪化に対する予防又は改善作用が低化する傾向が存在し、多すぎても、効果が頭打ちになる傾向を示すため、この系の自由度を損なう場合が存するためである。また、本発明のMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤は、優れたMMPs活性阻害作用、抗菌ペプチド産生促進作用、具体的には、MMP１産生阻害作用、ｈBD−１産生促進作用に優れるほか、標的部位への集積性及び選択性に優れ、高い安全性及び安定性を有するために、医薬、食品、化粧料（但し、医薬部外品を含む）などへの使用が好ましい。また、本発明のMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤を含有する組成物の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、症状及び疾患の種類に応じて、その予防又は改善方法を適宜選択すればよい。

尚、本発明の実施形態のMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤は、通常ヒトに対し好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対し適用することが出来る。

以下に、実施例を挙げて、本発明について、更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。

＜試験例１：MMP−１産生阻害（産生抑制）作用評価＞
以下の手順に従い、本発明のMMPs活性阻害剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物のMMP−１産生阻害（産生抑制）作用を評価した。手順を以下に示す。尚、本発明のMMPs活性阻害剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、一丸ファルコス株式会社より購入した植物抽出物（商品名：ニームリーフリキッドB）を使用した。正常ヒト真皮線維芽細胞を２４穴プレートに７．０×１０⁴cells/well播種し、１０%ウシ胎児血清（FBS）含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、SIGMA ALDRICH社）にて３７℃、５％CO₂条件下で２４時間培養した後、培地を１%FBS含有DMEMに交換し、さらに６時間培養した。培地交換６時間後、細胞をPBSにて洗浄し、UVB（４０mJ/cm²）を照射した。UVB照射後、被験物質（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物、最終濃度０．３、１、３（v/v％））又は５０%ブチレングリコール（BG）（溶媒コントロール、最終濃度０．３、１、３（v/v％））を１%FBS含有DMEMに溶解させた培地に培地交換し、４８時間培養した。培養終了後、培養上清を回収し、ANASPEC社製 SensoLyte MMP−１ ELISAキットを用いて培養上清中のMMP−１濃度を測定した。結果を図１に示す。また、前記のMMP−１濃度測定に使用した最終溶液をガラス管に移し、色調変化を比較することによりMMP−１活性阻害作用を検討した。結果を図２に示す。

図１に示す結果より、本発明のMMPs活性阻害剤のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、溶媒コントロールに対し濃度依存的なMMP−１活性阻害（産生抑制）作用を示した。また、図２の結果より、本発明のMMPs活性化阻害剤のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、優れたMMP−１活性阻害（産生阻害）作用を示した。以上の結果より、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物には、前述のMMPs活性阻害剤が対象とする疾患・症状に対する予防又は改善効果が期待出来る。

＜試験例２：MMP−１活性阻害（蓄積量減少）作用評価＞
以下の手順に従い、本発明のMMPs活性化阻害剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物のMMP−１活性阻害（蓄積量減少）作用を評価した。手順を以下に示す。尚、本発明のMMPs活性阻害剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、一丸ファルコス株式会社より購入した植物抽出物（商品名：ニームリーフリキッドB）を使用した。正常ヒト真皮線維芽細胞を２４穴プレートに７．０×１０⁴cells/well播種し、１０%ウシ胎児血清（FBS）含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、SIGMA ALDRICH社）にて３７℃、５％CO₂条件下で２４時間培養した後、培地を２%FBS含有DMEMに交換し、さらに２４時間培養した。培地交換２４時間後、培養上清を回収し（添加前サンプル）、被験物質（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物、最終濃度３（v/v％））又は５０％ブチレングリコール（BG）（溶媒コントロール、最終濃度３（v/v％））を２％FBS含有DMEMに溶解させた培地に培地交換し、さらに２４時間培養した。被験物質投与２４時間後、培養上清を回収し、ANASPEC社製 SensoLyte MMP−１ ELISAキットを用いて培養上清中のMMP−1濃度を測定した。結果を図３に示す。

図３の結果より、本発明のMMPs活性阻害剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、コントロールに対し培養上清中のMMP−１蓄積量が顕著に減少していた。以上の結果より、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物には、前述のMMPs活性阻害剤が対象とする疾患・症状に対する予防又は改善効果が期待出来る。

＜試験例３：ｈBD−１mRNA発現亢進作用評価＞
以下の手順に従い、本発明の抗菌ペプチド産生促進剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物の抗菌ペプチド（ｈBD−１）産生促進作用を評価した。手順を以下に示す。尚、本発明の抗菌ペプチド産生促進剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、一丸ファルコス株式会社より購入した植物抽出物（商品名：ニームリーフリキッドB）を使用した。正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）（倉敷紡績株式会社）を２４穴プレートに６．０×１０^４cells/well播種し、０．１５mM-Ca含有培地（humedia-KG2、倉敷紡績株式会社）にて３７℃、５％CO_２条件下で４日間培養した。培養４日後、被験物質（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物、最終濃度３v/v％）又は５０％ブチレングリコール（BG）（溶媒コントロール、最終濃度３（v/v％））を１．４５mM-Ca含有Humedia-KG２に溶解させた培地に培地交換し、４８時間培養した。培養終了後、細胞を回収し、RNeasy Mini Kit (QIAGEN社) を用いてトータルRNAを抽出し、得られたトータルRNAからSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (invitrogen社) を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAをテンプレートとしてQuantiFast SYBR Green PCR kit (QIAGEN社) を用いてリアルタイムPCRを行い、検量線法によりhBD1 mRNA発現量を相対定量した。このとき、18S rRNAを内在性コントロールとし、初期遺伝子量を補正した。本試験のｈBD−１mRNA発現亢進作用は、溶媒コントロール添加時のｈBD−１mRNA発現量を1とした場合の割合で表示した。結果を図４に示す。

図４の結果より、本発明の抗菌ペプチド産生促進剤のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、溶媒コントロールに対し優れた抗菌ペプチド産生促進作用（hBD−１mRNA発現促進作用）を示した。以上の結果より、センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、前述の抗菌ペプチド産生促進作剤が対象とする疾患・症状に対する予防又は改善効果が期待出来る。

＜試験例４：本発明のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物の皮膚バリア機能向上作用評価＞
以下の手順に従い、本発明のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物の経皮上電気抵抗値（TER値：transepitherial electrical resistance値）を測定することにより、TJ等の細胞間接着構造体の形成促進作用による皮膚バリア機能向上作用を評価した。手順を以下に示す。尚、本発明の抗菌ペプチド産生促進剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、一丸ファルコス株式会社より購入した植物抽出物（商品名：ニームリーフリキッドB）を使用した。正常ヒト表皮角化細胞を１２穴トランズウェル（０．４μmポアを有するポリエチレンテレフタレート膜）に１×１０^５cellｓ/well播種し、０．１５mM-Ca含有Humedia-KG２にて３７℃、５％CO_２条件下で３日間培養後、培地を１．４５mM-Ca含有Humedia-KG２に交換し、さらに４日間培養した。培養４日後、被験物質（センダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物、最終濃度３（v/v％））又は５０％ブチレングリコール（BG）（溶媒コントロール、最終濃度３（v/v％））を１．４５mM-Ca含有Humedia-KG２に溶解させた培地に培地交換して培養を継続し、試料添加０時間後から２４時間後にかけてのTER変化をMillicell ERSにより測定した。尚、本試験の皮膚バリア機能向上作用を表すTER変化は、溶媒コントロール添加時のTER変化を１とした場合の割合で表示した。結果を図５に示す。

図５の結果より、本発明のMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤であるセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物は、優れた皮膚バリア機能向上作用を有する。

本発明のセンダン科センダン属インドセンダンより得られる植物抽出物を有効成分とするMMPs活性阻害剤、抗菌ペプチド産生促進剤は、肌荒れ予防又は改善をはじめとする、MMPs及び／又は抗菌ペプチドが関与する症状及び疾患の予防又は治療薬に応用することが出来る。

Claims

センダン科センダン属インドセンダン（Melia azadirachta）より得られる植物抽出物を有効成分として含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs：Matrix metalloproteinases）活性阻害剤。
前記マトリックスメタロプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ１（MMP−１）である、請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤。
センダン科センダン属インドセンダン（Melia azadirachta）より得られる植物抽出物を有効成分として含有する、抗菌ペプチド産生促進剤。
前記抗菌ペプチドが、デフェンシン（defensin）である、請求項３に記載の抗菌ペプチド産生促進剤。
前記デフェンシンが、ヒトβ−デフェンシン−１（hBD−１：human β−defensin−１）である、請求項３又は４に記載の抗菌ペプチド産生促進剤。