KR20190008509A

KR20190008509A - 항산화 및 항노화 효능이 있는 식물성 자원의 개발

Info

Publication number: KR20190008509A
Application number: KR1020170090086A
Authority: KR
Inventors: 김영대; 김영민
Original assignee: 김영대; 김영민
Priority date: 2017-07-16
Filing date: 2017-07-16
Publication date: 2019-01-24

Abstract

본 발명은 항산화효과 및 피부 노화 억제 효과를 지닌 새로운 식물성 자원을 확보하고, 피부 노화 억제효과를 지닌 화장품 및 기능성 제품을 개발하는데 기초자료를 제공하기 위하여 수행되었다. 잔대(Adenophora triphylla), 비름(Amaranthus mangostanus), 무궁화(꽃; Hibiscus syriacus), 비수리(Lespedeza cuneata), 수세미(열매; Luffa aegyptiaca), 들깨(잎; Perilla frutescens), 쇠비름(Portulaca oleracea), 돌나물(Sedum sarmentosum), 세발나물(Spergularia marina), 고들빼기(Youngia sonchifolia) 분말을 에틸아세테이트로 추출하였다. 식물성 자원을 건조하였을 때의 수분함량은 약 5.4~6.8% 범위이었으며, 에틸아세테이트로 추출했을 때의 추출수율은 약 14~17%이었다. 총폴리페놀화합물 함량은 비름이 약 1,300 mg/100g(건조중량)으로 가장 높았고, 약 88%의 라디칼 소거율을 나타내었다. 잔대의 총폴리페놀화합물은 약 720 mg/100g(건조중량)이었고, 라디칼 소거율은 약 80%로 가장 낮은 항산화활성을 나타내었다. 실험에 사용한 모든 식물성 자원의 라디칼 소거율은 80%을 나타내어, 항산화 효과가 있는 것으로 사료되었다. 무궁화, 쇠비름, 돌나물 추출물은 피부노화 과정을 촉진하는 elastase를 90% 이상 저해하였고, 콜라겐을 분해하는 collagenase 활성을 저해하는 효과도 우수하였다. 상기 3종의 추출물은 섬유아세포에서의 collagen 생성을 증가시켰다.

Description

항산화 및 항노화 효능이 있는 식물성 자원의 개발{Development of plant materials having antioxidant and antiaging capacities}

본 발명은 항산화 및 항노화 효능이 있는 식물성 자원을 개발하여 화장품 소재로 활용하고자 한다.

우리나라는 지난 20년 동안 전체 인구에서 고령 인구(65세 이상)가 차지하는 비율이 꾸준히 증가하여, 2000년 고령인구가 340만 명으로 전체 인구의 7.2%를 넘으면서 고령화사회(고령인구가 14% 이상인 사회)에 진입하였고, 2010년에는 고령인구가 11.1%(545만 명)에 도달하였다. 우리나라의 고령 인구는 세계적으로 볼 때는 많은 편이 아니지만 고령화 속도는 미국일본프랑스독일 등에 비해 그 속도가 매우 빨라, 2018년에 고령사회, 2026년에 초고령사회(고령인구가 20% 이상인 사회)가 될 것으로 예상하고 있다.

뷰티산업(Beauty industry)은 인체를 건강하고 아름답게 관리하기 위하여 제공되는 서비스 및 서비스 제공에 사용되는 화장품 등의 개발과 관련된 산업으로 웰빙(well-being), 감성소비와 같은 새로운 소비 트렌드에 부합하여 성장세에 있으며, 보건의료 등과 관련되어 새로운 수요를 창출하고 있다. 기능성화장품은 의약품은 아니지만 다른 유형의 화장품과 달리 기능적인 효과를 가지고 있어 식품의약품안전청의 심사를 받은 제품만 시중에서 “기능성화장품”으로 표시하여 유통이 될 수 있으며 점차 소비자들 사이에서 수요가 증대되고 있다. 기능성 화장품 세부 유형별로는 자외선 차단(32.7%), 주름개선(23.0%), 미백(18.6%) 효과 등을 지닌 제품의 시장 점유율이 높으며, 생산액도 증가하고 있는 추세이다. 또한 천연물로부터 주름개선 효과가 있는 소재를 개발하고자 하는 연구도 매우 활발히 진행되고 있다.

피부가 노화되는 원인은 노화 현상에 의한 내인성 노화(intrinsic aging)와 광노화(photoaging)로 나눌 수 있는데, 자외선에 의해 교원질(collagen) 합성이 감소되고, 교원질을 비롯한 세포외 기질 단백질의 분해효소인 matrix metalloprotein -ases(MMPs)의 발현이 증가되어, MMPs에 의해 교원질을 비롯한 기질단백질이 분해되어 주름이 생긴다.

피부노화에 영향을 주는 활성산소는 피부에 대한 자외선의 작용으로 생성된다. 활성산소는 지질과산화, 기질 단백질 분해효소(MMPs)의 활성화, 콜라겐(교원질)과 엘라스틴(탄력질)의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히아루론산 사슬의 절단, 멜라닌 생성반응촉진, DNA 산화와 같은 손상을 야기시킨다. 그 결과 피부 탄력감소, 주름살, 기미 및 주근깨 등으로 특징 지워지는 피부노화가 가속화된다. 피부세포를 보호하고 결합조직의 손상을 억제하여 피부노화를 지연 및 예방하기 위해서는 활성산소의 과잉 생성을 억제하고 생성된 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화방어시스템 구축이 필요하다. 이러한 항산화 방어시스템은 크게 두 가지로 구분되는데, 한 가지는 효소에 의한 방어기전(항산화효소)이며, 다른 한 가지는 비효소적항산화 방어기전(항산화제)이다.

Mo EK, Kim SM, Yang SA, OH CJ, Sung CK. Assessment of antioxidant capacity of sedum (Sedum sarmentosum) as a valuable natural antioxidant source. Food Science and Biotechnology 20: 1061-1067 (2011) Nam HJ, Kim YB. Aging and skin aging. The journal of Korean Oriental Medical Ophthalmology and Otolaryngology and Dermatology 7: 51-62 (2004) Phillai, C. K., Phillai, K. S. (2002). Antioxidants in health. Indian Journal of Physiology and Pharmacology 46, 1-5. Portillo, M. E., Corvec, S., Borens, O., Trampus, A. (2013). Propionibacterium acnes: An understanding pathogen in implant-associated infections. Biomed Research International, 2013, 1-10.

노인을 위한 제품 및 피부 노화를 억제하는 소재에 대한 필요도가 증가하므로 이와 관련된 소재 및 제품 개발이 필요한 상황이다. 따라서 항산화 효과를 지니면서 피부 단백질분해효소의 생합성을 억제할 수 있는 천연 소재를 탐색하여 새로운 건강기능성(화장품) 제품을 개발하는데 과학적인 기초자료를 제공하고자 본 발명을 진행하였다.

본 발명은 식물성 자원을 용매(에틸아세테이트)로 추출하고 농축한 후 항산화능은 총폴리페놀화합물 함량을 측정하고 organic radical scavenging capacity를 DHHP assay로 측정하고 항노화활성은 elastase 저해효과와 collagenase 저해효과 및 collagen 생성양을 측정하여 항산화능 및 항노화능이 있는 식물성 자원을 선택, 개발하고자 한다.

본 발명의 결과는 새로운 화장품 및 건강기능성 제품 개발의 근거로 활용될 수 있다.

시료의 수분함량과 추출수율 사이의 상관관계 총폴리페놀화합물 함량과 항산화능(DPPH) 사이의 상관관계 식물성 자원의 에틸아세테이트 추출물이 elastase 활성도에 미치는 영향. AT; Adenophora triphylla, AM; Amaranthus mangostanus, HS; Hibiscus syriacus, LC; Lespedeza cuneata, LA; Luffa aegyptiaca, PF; Perilla frutescens, PO; Portulaca oleracea, SS; Sedum sarmentosum, SM; Spergularia marina, YS; Youngia sonchifolia.

<실시예 1> 식물성 자원의 제조

식물성 자원 9종(잔대, 비름, 비수리, 수세미, 들깻잎, 쇠비름, 돌나물, 세발나물, 고들빼기)을 3회 세척한 후 건조(80℃)하였다. 무궁화(Hibiscus syriacus)는 대전시 복수동에서 꽃 부위를 채집하여 다른 시료와 동일한 방법으로 건조하였다. 건조한 시료는 분쇄하고 체에 걸러 직경이 500 nm 이하인 것을 실험에 사용하였다. 건조 분말 50 g에 에틸아세테이트 300 mL를 넣고 실온(20±3℃)에서 12시간 진탕추출하고(110 rpm), 추출액을 여과수집하였다. 추출수율율을 증가시키기 위하여 상기 조작을 3회 반복하였다. 추출물은 회전감압농축로 용매를 휘발시키고(37±2℃), -20℃에 저장하였다.

<시험예 1> 시료의 수분함량과 추출수율

건조 시료의 수분함량은 수분측정기로 측정하였다. 실험에 사용한 시료의 부위는 일반적으로 먹을 수 있는 부위를 사용하였다. 무궁화(꽃)는 우리나라에서는 식품으로 허용되어 있지 않으나 ‘목단화’라는 명칭의 생약으로써 이용되고 있다(식품의약품안전처). 건조하여 분말화된 시료의 수분함량은 약 5.3~6.8%로 시료 간의 유사한 수분함량을 나타내었다(표 1). 시료별 추출수율은 약 15~17% 정도였다(표 1).

추출하고자 하는 분말(시료)에 함유된 수분의 양이 많을 경우, 물에 의해 용매의 추출 작용이 저하되어 유효성분의 추출 수율이 감소하는 것으로 보고되고 있다. 도 1에서와 같이, 시료의 수분함량과 추출수율 사이에는 상관관계가 형성되지 않았다(r² = 0.2466). 따라서 본 실험에 사용된 시료의 수분함량은 기능성 성분을 추출하는 용매의 추출수율에는 영향을 미치지 않은 것으로 추정하였다.

명 칭	학 명	*사용 부위*	*수분함량(%)*	추출수율(%)
잔대	Adenophora triphylla	뿌리	*5.39±0.75*	*16.89±5.05*
비름	Amaranthus mangostanus	잎	*6.03±0.94*	15.71±4.89
무궁화	Hibiscus syriacus	꽃	*5.74±1.03*	15.48±5.12
비수리	Lespedeza cuneata	잎	5.88±0.88	14.95±5.95
수세미	*Luffa aegyptiaca*	열매	*6.14±1.05*	15.07±4.82
들깨	Perilla frutescens	잎	*5.79±0.97*	15.90±5.42
쇠비름	Portulaca oleracea	*줄기, 잎*	*6.45±1.14*	13.92±6.36
돌나물	Sedum sarmentosum	*줄기, 잎*	*6.82±0.81*	15.72±3.94
세발나물	Spergularia marina	*줄기, 잎*	*5.91±0.93*	14.84±5.75
고들빼기	Youngia sonchifolia	전초	*6.18±1.08*	15.24±4.69

<시험예 2> 총폴리페놀화합물 함량

폴리페놀화합물(total polyphenol compound, TPC) 함량은 Folin-Ciocalteu 법으로 측정하였다. 추출액 100 μL를 시험관에 넣고, 0.01% 유화제(tween-20)를 함유한 증류수를 넣어 부피를 500 μL로 조정하였다. Folin-Ciocalteu 시약 250 μL와 20% Na₂CO₃ 1.25 mL를 넣어 혼합한 후, 45℃에서 15분간 반응시키고, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총폴리페놀화합물의 함량은 갈릭산(mg)/건조중량(100g)으로 나타내었다. 갈릭산(100~1,000 μg/mL)을 이용하여 calibration curve(표준흡광곡선)로부터 총폴리페놀화합물 함량을 산출하였다. 시료의 전자공여효과(organic radical 소거 효과)는 DPPH 법으로 측정하였다. 시료 100 μL에 2.9 mL DPPH 용액(ethanol에 DPPH를 녹여 0.1 M로 만들었다)을 혼합한 후 30분간 어두운 곳(실온)에서 반응시키고, 517 nm에서 흡광도를 측정하여 유리된 DPPH 라디칼의 감소정도를 측정하였다. 시료의 organic radical 소거 효과는 아래와 같이 라디칼 소거율(percentage radical scavenging, RP% = (시료가 없을 때의 흡광도-시료의 흡광도)/시료가 없을 때의 흡광도)로 산출하였다.

폴리페놀화합물은 모든 고등식물체에 존재하는 생리활성물질이다. 식물체에는 폴리페놀화합물을 비롯하여 비타민 C, 토코페롤, 카로티노이드와 같은 다양한 형태의 항산화성분이 존재하는데, 폴리페놀화합물이 식물의 항산화력을 나타내는 주요 물질인 것으로 알려져 있다. 이러한 항산화제는 염증 및 동맥경화증 예방효과, 항암활성 등의 다양한 생리활성 효과를 나타낸다. 표 2에서와 같이, 시료의 폴리페놀화합물 함량은 비름이 가장 많았고, 잔대가 가장 적었다. 실험한 시료의 라디칼 소거능은 약 80~88% 정도를 나타내어, 모든 시료가 높은 항산화능을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 도 2에서와 같이, 시료의 폴리페놀화합물 함량과 시료의 항산화능 사이에는 강한 양의 상관관계가 성립되었다(r² = 0.9635). 따라서 시료의 라디칼 소거능이 우수한 것은 총폴리페놀화합물때문인 것으로 사료되었다.

명 칭	학 명	Antioxidant capacity
명 칭	학 명	*TPC* *(mg/100g* ^* )	DPPH (%)
잔대	Adenophora triphylla	*715.04*	80.29
비름	Amaranthus mangostanus	*1,258.50*	87.93
무궁화(꽃)	Hibiscus syriacus	*739.17*	80.56
비수리	Lespedeza cuneata	745.32	81.50
수세미	*Luffa aegyptiaca*	*1,057.70*	84.81
들깻잎	Perilla frutescens	*1,024.05*	84.64
쇠비름	Portulaca oleracea	*1,084.82*	85.58
돌나물	Sedum sarmentosum	*842.23*	81.56
세발나물	Spergularia marina	*909.06*	83.71
고들빼기	Youngia sonchifolia	*868.09*	81.66

<시험예 3> Elastase 저해 효과

시료 100 μL를 시험관에 취하고 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 elastase, pancreatic solution (Type I： From Porcine Pancreas 유래, 0.6 units/mL) 용액 50 μL를 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)-3-p-nitroanilide (1 mg/mL)을 100 μL를 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시키고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

시료가 elastase 활성을 저해시키는 효과를 측정한 결과는 도 3과 같다. 90% 이상의 저해율을 나타내는 시료는 무궁화(Hibiscus syriacus), 쇠비름(Portulaca oleracea), 돌나물(Sedum sarmentosum) 추출물이었다. 수세미 추출물(LA)은 폴리페놀화합물 함량이 높았으나 elastase 활성을 저해하는 효과는 낮았다.

<시험예 4> collagen 활성도 저해 효과 및 collagen 합성

0.1 M Tris-HCI buffer(pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazo- benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (0.3 mg/mL)를 녹인 기질액 250 μL 및 시료 100 μL의 혼합액에 collagenase (0.2 mg/mL) 150 μL를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 6% citric acid 500 μL를 넣어 반응을 정지시켰다. Ethylacetate 1.5 mL을 첨가하여 상등액을 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

섬유아세포(murine fibroblast, NIH3T3 cell lines; KCLB No. 21658)를 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum, 25 mM HEPES, 25 mM NaHCO₃, 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소의 배양기에서 배양접시의 75%가 monolayer를 형성하도록 배양하였다. Trypsin-EDTA로 세포를 회수하여 2×10⁴ cells/well의 농도로 96-well plate에 세포를 나누어 분주하고 5시간동안 37℃, 5% 이산화탄소의 배양기에서 배양한 후, 시료를 농도별로 순차첨가한 후, 37℃, 5% 이산화탄소의 배양기에서 3일간 배양하였다. MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액 (5 mg/mL phosphate buffered saline)을 20 μL씩 각각의 well에 분주하고 빛을 차단하여 2시간동안 37℃에서 반응시킨 후, MTT 용액과 배지를 제거하였다. 100 μL dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하고 20분 후에 550 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포생존율을 산출하였다. NIH 3T3 섬유아세포를 4×10⁴ cells/well로 6-well plate에 분주하여 24시간동안 배양한 후 배지를 제거하였다. 시료가 함유된 배지를 첨가하여 24시간동안 배양한 후, 5% FBS가 함유된 배지(시료 무첨가 배지)로 교체하여 다시 24시간 동안 배양한 후 배양상등액을 수집하여 단백질 함량을 Bradford assay kit로 측정하였다. 섬유아세포에서 생성된 collagen 양은 total collagen assay kit (BioVision, Milpitas, CA, USA)로 측정하였다. 즉, 단백질 100 μL에 Sircol dye 1mL/sample로 첨가하여 30분간 교반한 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리하여 얻어진 pellet은 alkali reagent (1 mL/sample)를 넣어 완전히 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagen 함량은 대조구에서의 collagen 함량을 기준으로 시료 처리에 의해 생성/감소된 collagen 함량을 상대적인 비율로 나타내었다.

시료가 섬유아세포의 생존율(세포독성)에 미치는 영향을 측정한 결과, 추출물의 처리 농도가 증가할수록 세포의 생존율이 감소하였다 (표3). 섬유아세포가 90%까지 생존을 나타내는 농도(μg/mL)는 잔대 313.23, 비름 377.97, 무궁화(꽃) 446.83, 비수리 321.91, 수세미 725.53, 들깻잎 505.22, 쇠비름 545.39, 돌나물 439.73, 세발나물 464.05, 고들빼기 249.41이었다. 다른 시료에 비해 고들빼기는 높은 세포 독성을 나타내었고, 수세미는 낮은 세포독성을 나타내었다. 모든 시료가 250 μg/mL 농도에서는 90% 이상의 생존율을 나타내었다. 따라서 시료가 collagen 생성 및 대사에 미치는 영향을 평가하는 실험에 사용하는 추출물의 농도를 250 μg/mL로 결정하였다.

명 칭	학 명	처리 농도 (μg/mL)
명 칭	학 명	*250*	500	*1,000*
잔대	Adenophora triphylla	*92.04*	80.49	40.53
비름	Amaranthus mangostanus	*94.32*	92.04	65.49
무궁화(꽃)	Hibiscus syriacus	*95.99*	89.61	*75.31*
비수리	Lespedeza cuneata	90.48	85.47	*70.88*
수세미	*Luffa aegyptiaca*	*95.81*	94.99	85.44
들깻잎	Perilla frutescens	*97.42*	96.32	*73.48*
쇠비름	Portulaca oleracea	*95.04*	90.54	*82.08*
돌나물	Sedum sarmentosum	*96.88*	92.48	70.94
세발나물	Spergularia marina	*94.09*	93.22	75.23
고들빼기	Youngia sonchifolia	*90.06*	80.32	57.96

시료가 collagenase 활성을 저해하는 정도는 쇠비름 > 돌나물 > 비수리 > 무궁화 > 잔대 > 세발나물 순이었다(표 4). 이들은 collagenase 활성을 80% 이상 저해하였다. 비름, 수세미, 들깻잎은 70% 정도로 collagenase 활성을 저해하였고, 고들빼기는 collagenase 활성을 거의 억제하지 못하였다.

추출물(250 μg/mL)을 섬유아세포에 처리한 후에 생성된 콜라겐 양을 측정하였다(표 4). 쇠비름 > 돌나물 > 비수리 > 수세미 > 무궁화 순으로 콜라겐 생성을 촉진하였고, 비름, 세발나물, 고들빼기는 콜라겐 생성에 미치는 영향이 미미하였다.

명 칭	학 명	*Collagenase 저해율(%)*	Collagen 생성율(%)
잔대	Adenophora triphylla	*88.51*	45.87
비름	Amaranthus mangostanus	*78.92*	24.95
무궁화(꽃)	Hibiscus syriacus	*89.04*	52.09
비수리	Lespedeza cuneata	89.71	56.44
수세미	*Luffa aegyptiaca*	*78.64*	55.82
들깻잎	Perilla frutescens	*72.83*	49.42
쇠비름	Portulaca oleracea	*94.09*	59.69
돌나물	Sedum sarmentosum	*91.55*	58.11
세발나물	Spergularia marina	*80.04*	20.19
고들빼기	Youngia sonchifolia	*45.98*	10.39

Claims

잔대(Adenophora triphylla), 비름(Amaranthus mangostanus), 무궁화(꽃; Hibiscus syriacus), 비수리(Lespedeza cuneata), 수세미(열매; Luffa aegyptiaca), 들깨(잎; Perilla frutescens), 쇠비름(Portulaca oleracea), 돌나물(Sedum sarmentosum), 세발나물(Spergularia marina), 고들빼기(Youngia sonchifolia)의 에틸아세테이트 분획물