JP2012513447A - インドロカルバゾール化合物のポリマー結合体の合成 - Google Patents

Abstract

本発明は、高製品収率で高純度の製品をもたらす合成経路によって、インドロカルバゾール化合物のポリマー結合体、特にＫ−２５２ａおよびその誘導体のポリマー結合体を製造するための方法に関する。さらなる態様において、本発明は、ポリマー単位をＫ−２５２ａまたはＫ−２５２ａ誘導体化合物に結合させる化学基が５員オキサゾリジンジオン環構造によって特徴づけられるＫ２５２ａおよびその誘導体の新規のポリマー結合体に関する。これらの新規のポリマー結合体は、新規の合成経路を介して高純度および高収率で得られる。

Description

本発明は、高製品収率で高純度の製品をもたらす合成経路によって、インドロカルバゾール化合物のポリマー結合体、特にＫ−２５２ａおよびその誘導体のポリマー結合体を製造するための方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、ポリマー単位をＫ−２５２ａ化合物またはＫ−２５２ａ誘導体化合物に結合させる化学基が５員オキサゾリジンジオン環構造によって特徴づけられるＫ２５２ａおよびその誘導体の新規のポリマー結合体に関する。これらの新規のポリマー結合体は、新規の合成経路を介して高純度および高収率で得られる。

文献には、キナーゼ関連病状、特に、中枢および末梢神経系の神経障害、神経疾患および神経変性障害などのＨＭＧＢ１関連病状の予防、緩和および治療におけるＫ−２５２ａおよびその誘導体の治療能力が記載されている（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８２５８、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００４；４４：４５１−７４；Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ．２００１ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３９（５−６）：４５９−６８；Ｎｅｕｒｏｐｏｒｔ．２０００ Ｎｏｖ ９；１１（１６）：３４５３−６； Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８ Ｓｅｐ；８６（２）：４６１−７２；Ｂｒａｉｎｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｊｕｌ ４；６５０（１）：１７０−４）。さらに、現状技術文献では、皮膚病、特に、乾癬などの過剰ケラチノサイト増殖に関連する皮膚病の予防、緩和および治療におけるこれらのインドカルバゾール化合物の治療効果が開示されている（例えば、ＷＯ ２００５／０１４００３，Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２２：８１２−８１９，２００４）。さらに、現状技術文献において、Ｋ−２５２ａおよびその誘導体はＮＧＦ関連疼痛に対する活性薬として有用であることが報告された（例えば、Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７１５−７２１，１９８８；Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．９６：１−６，１９８９；Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．８７：１１−１７，１９８８，Ｗｉｎｓｔｏｎ ＪＨ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐａｉｎ（２００３）４：３２９−３３７）。したがって、インドロカルバゾール化合物Ｋ−２５２ａおよびその誘導体の生物学的重要性および治療活性も文献に報告されている（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２１：４９８−５０５，１９９８，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７：１６９５−１６９８，２００５）。

Ｋ−２５２ａおよびその誘導体のポリマー結合体、ならびに上記病状の予防、緩和および治療に有用な医薬組成物における活性薬としてのそれらの使用がＷＯ２００７／０２２９９９に開示されている。前記出願の開示内容は、参考として本明細書で援用される。ＷＯ２００７／０２２９９９によれば、活性Ｋ−２５２ａインドロカルバゾール誘導体化合物のポリマーへの結合、特にペグ化の目的は、薬物動態学的および毒性学的性能の向上を可能にして、様々な可能性のある応用経路におけるＫ−２５２ａまたはその誘導体の最良の生物学的利用能を達成する前記活性化合物の投与形態を開発することである。

Ｋ−２５２ａおよびその誘導体のポリマー結合体の製造のためのＷＯ２００７／０２２９９９に記載の合成アプローチは、Ｋ−２５２ａ化合物またはその誘導体のインドロカルバゾール構造に対するポリマー部分の共有結合を含む。特に、ＷＯ２００７／０２２９９９には、好適な反応条件下で、イソシアネート活性化ポリマーと、Ｋ−２５２ａまたはその誘導体のテトラヒドロフラン部分のＣ３位のヒドロキシル基とを反応させることによって、ポリマー部分と活性化合物との共有結合としてカルバミド結合を得ることが開示されている。

高純度のＫ−２５２ａおよびその誘導体のポリマー結合体が医療用途に大いに必要とされるため、高収率および一定収率で得られる高純度の反応生成物をもたらす、活性インドロカルバゾール化合物のポリマー結合体の製造のための方法を提供することが本発明の目的であった。また、本発明の目的は、さらに、複雑な精製工程を排除すること、およびポリマー結合反応の効率を最大にするために目標のポリマー結合化合物の容易な精製および回収を可能にすることであった。

意外にも、発明者らは、Ｋ−２５２ａまたは誘導体化合物と、結合反応の出発ポリマー試薬として使用されるω−１−Ｈ−イミダゾールカルボキサミドポリマー部分とを反応させると、結合プロセスが制御されるため、生成するインドロカルバゾール−ポリマー結合体の所望のより高い収率および純度が得られることを見い出した。

したがって、本発明は、式（Ｉ）

［式中、
Ｒ¹およびＲ²は、同一の、または異なる残基であり、それぞれ独立して、
（ａ）水素、ハロゲン、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アシル、ニトロ、カルバモイル、低級アルキルアミノカルボニル、−ＮＲ⁵Ｒ⁶［式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、それぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アラルキル、置換もしくは非置換低級アルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換低級アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、カルバモイル、アシルから選択され、またはＲ⁵およびＲ⁶は、窒素原子と一緒になって複素環基を形成する］、
（ｂ）−ＣＯ（ＣＨ₂）_jＲ⁴［式中、ｊは、１〜６であり、Ｒ⁴は、
（ｉ）水素、ハロゲン、−Ｎ₃
（ｉｉ）−ＮＲ⁵Ｒ⁶［式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、上記定義の通りである］
（ｉｉｉ）−ＳＲ⁷［式中、Ｒ⁷は、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アラルキル、−（ＣＨ₂）_aＣＯ₂Ｒ¹⁰（式中、ａは、１または２であり、Ｒ¹⁰は、水素および置換もしくは非置換低級アルキルからなる群から選択される）および−（ＣＨ₂）_aＣＯ₂Ｒ⁵Ｒ⁶からなる群から選択される］、
（ｉｖ）−ＯＲ⁸、−ＯＣＯＲ⁸［式中、Ｒ⁸は、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択される］からなる群から選択される］、
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ₂）_jＲ⁴［式中、ｊおよびＲ⁴は、上記定義の通りである］、
（ｄ）−（ＣＨ₂）_dＣＨＲ¹¹ＣＯ₂Ｒ¹²または−（ＣＨ₂）_dＣＨＲ¹¹ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶［式中、ｄは、０〜５であり、Ｒ¹¹は水素、−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶または−ＣＯ₂Ｒ¹³［Ｒ¹³は、水素または置換もしくは非置換低級アルキルであり］であり、Ｒ¹²は、水素または置換もしくは非置換低級アルキルである］、
（ｅ）−（ＣＨ₂）_kＲ¹⁴［式中、ｋは２〜６であり、Ｒ¹⁴は、ハロゲン、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、−ＣＯＯＲ¹⁵、−ＯＲ¹⁵（式中、Ｒ¹⁵は水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリールまたはアシルである）、−ＳＲ⁷（式中、Ｒ⁷は上記定義の通りである）、−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶、−ＮＲ⁵Ｒ⁶（式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、上記定義の通りである）または−Ｎ₃である］、
（ｆ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₂）_mＲ¹⁶［式中、ｍは、０〜４であり、Ｒ¹⁶は、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、−ＣＯＯＲ¹⁵、−ＯＲ¹⁵（式中、Ｒ¹⁵は上記定義の通りである）、−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶または−ＮＲ⁵Ｒ⁶（式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、上記定義の通りである）である］、
（ｇ）−ＣＨ＝Ｃ（ＣＯ₂Ｒ¹²）₂［式中、式中、Ｒ¹²は上記定義の通りである］
（ｈ）−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ₂）_nＲ¹⁶［式中、ｎは０〜４であり、Ｒ¹⁶は上記定義の通りである］、
（ｉ）−ＣＨ₂ＯＲ²²［式中、Ｒ²²は、３つの低級アルキル基が同一であるか、もしくは異なるトリ低級アルキルシリルであるか、またはＲ²²はＲ⁸と同じ意味を有する］、
（ｊ）−ＣＨ（ＳＲ²³）₂および−ＣＨ₂−ＳＲ⁷［式中、Ｒ²³は、低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニルであり、Ｒ⁷は、上記定義の通りである］からなる群から選択され、
Ｒ₃は、水素、ハロゲン、アシル、カルバモイル、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニルまたはアミノであり、
Ｗ¹およびＷ²は、独立して、水素、ヒドロキシであり、またはＷ¹およびＷ²は、一緒になって酸素を表し、
Ｘは、ポリマー部分である］のインドロカルバゾール化合物のポリマー結合体を製造するための方法であって、一般式（ＩＩ）

［式中、
Ｘは、上記定義の通りである］のω−１Ｈ−イミダゾール−カルボキサミドポリマー化合物と、一般式（ＩＩＩ）

［式中、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂は、上記定義の通りであり、保護基により場合によって保護されており、Ｙは脱離基を表す］のインドロカルバゾール化合物とを反応させることを含み、式（Ｉ）の化合物を得るために、さらに場合によって、場合によって保護されたＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂から保護基を脱保護することを含む方法に関する。

式（Ｉ）の結合ポリマー化合物を合成するための本発明の方法の結合反応は、有機溶媒中で塩基によって触媒される。好ましくは、塩基は強塩基である。本発明の好適な実施形態において、塩基は、アルカリ金属水素化物、第三級アミンおよび／またはアルコキシドからなる群から選択される。本発明の非常に好適な実施形態において、本発明のポリマー結合反応を触媒する塩基は、水素化ナトリウムである。しかし、ナトリウムメトキシドなどの他の塩基または、トリメチルアミンを使用することもできる。

塩基触媒と式（ＩＩＩ）の化合物とのモル比は、好ましくは、約１：１〜約４：１、最も好ましくは約１：１〜約１．５：１、最も好ましくは約１：１である。

また、本発明の反応は、好ましくは無水条件の有機溶媒、すなわち乾燥有機溶媒中で実施される。好ましくは、結合プロセスの溶液混合物における水分含有量は、２００ｐｐｍ以下である。有機溶媒をジクロロメタン、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの群から選択することができる。本発明の非常に好適な実施形態において、有機溶媒は、ジクロロメタン、さらにより好ましくは無水ジクロロメタンである。

本発明によれば、結合反応を、窒素またはアルゴン雰囲気などの不活性ガス雰囲気下で実施することはさらに好適である。

さらに、本発明の方法の反応は、好ましくは、０℃の初期工程後に、約−１０℃〜約６０℃、より好ましくは約０℃〜約２５℃、最も好ましくは室温で実施される。

本発明の方法による式（Ｉ）の目標化合物の製造に続いて、式（Ｉ）のポリマー結合体を反応混合物から分離および精製することができる。本発明の好適な実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、フラッシュクロマトグラフィーによる粗製混合物の精製によって得られる。好ましくは、自動化勾配フラッシュ精製システム（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｌａｓｈ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）が使用され、好適なカラムおよび溶媒を備える。精製方法は、好ましくは、逆相カラムおよび直接相カラムから選択され、調整／溶離溶媒は、好ましくは、ジクロロメタン、水、メタノール、アセトニトリル、異なる混合比のギ酸アンモニウム緩衝液から選択される。本発明の非常に好適な実施形態において、式（Ｉ）のインドロカルバゾール−ポリマー化合物は、Ｃ１８カートリッジを備えた逆相フラッシュクロマトグラフィーによって精製され、精製は、（実施例３に報告される）アセトニトリル／５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ３．５）４０：６０を用いるアイソクラティック溶離によって実施される。本発明のさらなる好適な実施形態において、式（Ｉ）のインドロカルバゾール−ポリマー化合物は、（実施例４および５．３に記載される）順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製される。

次いで、生成物を例えば硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾別することができ、溶媒を２５℃にて減圧下で蒸発により除去する。目標生成物の精製は、当業者に既知の一般的な技法によって実施される。

精製工程後、式（Ｉ）の生成ポリマー化合物は、少なくとも約９５％の純度を有する。より好ましくは、精製工程後、式（Ｉ）の化合物は、少なくとも約９８％の純度を有する。さらにより好適な実施形態において、生成ポリマー化合物は、９８．５％、９９％、またはさらに９９．５％の純度を有する。

さらに、本発明の方法は、式（ＩＩＩ）の反応化合物の質量に基づいて、全質量収率の約４０質量％〜約９８質量％、好ましくは約５０質量％〜約９５質量％の式（Ｉ）の化合物をもたらす。

式（ＩＩＩ）の残基Ｙは、脱離基、すなわち、ポリマー部分をＫ−２５２ａまたはその誘導体化合物のインドロカルバゾール構造に共有結合させる式（Ｉ）の化合物のオキサゾリジンジオン環を得るために、本発明のポリマー結合の反応条件下で式（ＩＩＩ）の化合物の構造から脱離される基である。本発明によれば、式（Ｉ）の化合物を得るために、一般式（ＩＩ）の化合物のイミダゾール環もポリマー反応部分から結合反応時に脱離される。

本発明の好適な実施形態において、式（ＩＩＩ）の脱離基Ｙは、トリフレート、トシレート、メシレート、スルフェート、ハロゲン、ヒドロキシまたは低級アルコキシ基を含む群から選択される。特に好適な実施形態において、式（ＩＩＩ）の脱離基Ｙは、低級アルコキシ基またはヒドロキシ基である。最も好ましくは、脱離基Ｙは、低級アルコキシ基、特にメトキシ基である。

本発明の方法によりインドロカルバゾール化合物に共有結合され、例えば、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）においてＸによって表されるポリマー部分は、生体適合性でなければならず、天然または半合成もしくは合成起源であり、直鎖状または分枝状構造を有することができる。好ましくは、本発明におけるポリマーＸは、ポリ（アルキレンオキシド）、特に（ポリエチレン）オキシドから選択される。しかし、さらなる例示的なポリマーとしては、限定することなく、ポリアクリル酸、ポリアクリレート、ポリアクリルアミドまたはそのＮ−アルキル誘導体、ポリメタクリル酸、ポリメタクリレート、ポリエチルアクリル酸、ポリエチルアクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリコール酸、ポリアクチン酸、ポリ（乳酸−共−グリコール）酸、デキストラン、キトサン、ポリアミノ酸、ヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。

本発明の方法に共有するため、特に本発明の方法の式（ＩＩ）の反応ポリマーに官能化されるために、上記ポリマー部分は、アミノ官能性末端基を保持するか、またはアミノ官能性末端基を保持するように官能化されるべきである。したがって、ポリマー部分は、一般式Ｘ−ＮＨ₂のアミノ活性化ポリマーであるべきである。

実際、式（ＩＩ）の出発ポリマー反応物質は、ポリマー部分のアミノ基と１，１−カルボニルジイミダゾール化合物とを反応させて、一般式（ＩＩ）のω−１Ｈ−イミダゾール−カルボキサミドポリマー化合物を得ることによって得られる。

式（ＩＩ）のω−１Ｈ−イミダゾール−カルボキサミドポリマー化合物の形成は、好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中で実施される。非常に好適な実施形態において、有機溶媒は、ジクロロメタン、さらにより好ましくは無水ジクロロメタンである。

本発明によれば、ω−アミノポリマーを窒素またはアルゴン雰囲気などの不活性ガス雰囲気下で実施することがさらに好適である。

さらに、本発明のω−１Ｈイミダゾールカルボキサミドポリマー化合物の形成の反応は、好ましくは、約１０℃〜約６０℃、より好ましくは約１５℃〜約２５℃、最も好ましくは室温で実施される。

本発明の非常に好適な実施形態において、ポリマー部分Ｘは、末端ＯＨ基を例えばＣ₁〜Ｃ₅アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₅アシル基、好ましくはＣ₁−、Ｃ₂−もしくはＣ₃−アルキル基またはＣ₁−、Ｃ₂−もしくはＣ₃基で場合によって変性することができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である。好ましくは、変性ポリエチレングリコールは、末端がアルコキシ置換されたポリエチレングリコール、より好ましくはメトキシ−ポリエチレン−グリコール（ｍＰＥＧ）である。

本発明に従って使用されるポリマーは、約１００〜約１０００００Ｄａ、好ましくは約２００〜約５００００Ｄａ、より好ましくは約５００〜約１００００Ｄａの範囲の分子量を有する。本発明の１つの好適な態様によれば、ポリマーは、分子量が約２００〜約１５００Ｄａ、好ましくは約４００〜約１２００Ｄａ、さらにより好ましくは約５５０〜約１１００の範囲である短鎖ポリ（エチレングリコール）、好ましくはメトキシ置換ポリ（エチレングリコール）などの末端がアルコキシ置換されたＰＥＧである。最も好適な実施形態において、短鎖ＰＥＧはまたはｍＰＥＧは、約５５０Ｄａまたは約１１００Ｄａの平均分子量を有する。本発明の第２の好適な態様によれば、ポリマーは、分子量が約４０００〜約６０００Ｄａ、好ましくは約４５００〜約５５００Ｄａの範囲である長鎖ポリ（エチレングリコール）、好ましくはメトキシ置換ポリ（エチレングリコール）などの末端がアルコキシ置換されたＰＥＧである。本発明のこの態様の最も好適な実施形態において、長鎖ＰＥＧまたはｍＰＥＧは、約２０００Ｄａまたは約５０００Ｄａの平均分子量を有する。

本発明のポリマー部分の分子量の値および範囲を定めるために以上に使用されている「約」という用語は、指定値および／または範囲の限界が±２０％以内、好ましくは±１０％以内で変動し得ることを指す。

本出願に使用されているように、そうでないことが本明細書に明示される場合を除いて、以下の用語の各々は、以下に記載の意味を有するものとする。

「低級アルキル」という用語は、単独で、または他の基と組み合わせて使用される場合は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個または１〜２個の炭素原子を含む直鎖状または分枝状低級アルキル基を指す。これらの基は、特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、アミル、イソアミル、ネオペンチル、１−エチルプロピルおよびヘキシル等を含む。「低級アルコキシ」、「低級アルコキシカルボニル」、「低級アルキルアミノカルボニル」、「低級ヒドロキシアルキル」および「トリ低級アルキルシリル」基の低級アルキル部分は、上記定義の「低級アルキル」と同じ意味を有する。

「低級アルケニル」基は、直鎖状または分枝状であってもよく、ＺまたはＥ型であってもよいＣ₂〜Ｃ₆アルケニル基として定義される。当該基は、ビニル、プロペニル、１−ブテニル、イソブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、（Ｚ）−２−ペンテニル、（Ｅ）−２−ペンテニル、（Ｚ）−４−メチル−２−ペンテニル、（Ｅ）−４−メチル−２−ペンテニルおよびペンタジエニル、例えば１，３または２，４−ペンタジエニル等を含む。より好適なＣ₂〜Ｃ₆−アルケニル基は、Ｃ₂〜Ｃ₅−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルケニル基、さらにより好ましくはＣ₂〜Ｃ₃−アルケニル基である。

「低級アルキニル」基という用語は、直鎖状または分枝状であってもよく、エチニル、プロピル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ペンチニル、３−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニルおよび３−ヘキシニル等を含むＣ₂〜Ｃ₆−アルキニル基を指す。より好適なＣ₂〜Ｃ₆−アルキニル基は、Ｃ₂〜Ｃ₅−、Ｃ₂〜Ｃ₄−アルキニル基、さらにより好ましくはＣ₂〜Ｃ₃−アルキニル基である。

「アリール」基という用語は、６〜１４個までの環炭素原子を含むＣ₆〜Ｃ₁₄−アリール基を指す。これらの基は、これらの基は、一環式、二環式または三環式であってもよく、縮合環である。好適なアリール基は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニルおよびフェナントレニル等を含む。「アリールカルボニル」および「アリールアミノカルボニル」基のアリール部分は、上記定義のと同じ意味を有する。

「ヘテロアリール」基という用語は、窒素、硫黄または酸素から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含むことができ、Ｃ₃〜Ｃ₁₃−ヘテロアリール基を指す。これらの基は、一環式、二環式または三環式であってもよい。本発明のＣ₃〜Ｃ₁₃ヘテロアリール基は、複素芳香族ならびに飽和および部分飽和複素環基を含む。これらの複素芳香族は、一環式、二環式、三環式であってもよい。好適な５または６員複素環基は、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジル、ピラニル、モルホニル、ピラジニル、メチルピロリルおよびピリダジニルである。Ｃ₃〜Ｃ₁₃−ヘテロアリールは、二環式複素環基であってもよい。好適な二環式複素環基は、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、インドリル、イミダゾリルおよびピリミジニルである。最も好適なＣ₃〜Ｃ₁₃−ヘテロアリールは、フリルおよびピリジルである。

「低級アルコキシ」という用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個または１〜２個の炭素原子を含むアルコキシ基を含み、直鎖状または分枝状であってもよい。これらの基は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、イソプロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシおよびヘキソキシ等を含む。

「アシル」という用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜５個、１〜４個、１〜３個または１〜２個の炭素原子を含む低級アルカノイルを含み、直鎖状または分枝状であってもよい。これらの基は、好ましくは、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、第三級ブチリル、ペンタノイルおよびヘキサノイルを含む。「アシルオキシ」基のアシル部分は、上記定義のと同じ意味を有する。

「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード等を含む。

「アラルキル」基という用語は、アルキル基がアリールによって置換されたＣ₇〜Ｃ₁₅−アラルキルを指す。アルキル基およびアリールを、炭素原子の総数が７〜１５である、上記定義のＣ₁〜Ｃ₆アルキル基およびＣ₆〜Ｃ₁₄−アリール基から選択することができる。好適なＣ₇〜Ｃ₁₅−アラルキル基は、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、フェニルイソプロピル、フェニルブチル、ジフェニルメチル、１，１−ジフェニルエチル、１，２−ジフェニルエチルである。「アラルキルオキシ」基のアラルキル部分は、上記定義のと同じ意味を有する。

置換低級アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシル、低級アルコキシカルボニル、ニトロ、ハロゲン、アミノ、モノまたはゾ低級アルキルアミノ、ジオキソラン、ジオキサン、ジチオランおよびジチオンなどの１〜３個の独立して選択された置換基を有する。置換低級アルキル、アルケニルおよびアルキニル基の低級アルキル置換基部分、ならびに置換低級アルキル、アルケニルおよびアルキニル基の低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニルおよびモノまたはジ低級アルキルアミノ置換基の低級アルキル部分は、上記定義の「低級アルキル」と同じ意味を有する。

置換アリール、置換ヘテロアリールおよび置換アラルキル基は、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、ニトロ、アミノ、モノまたはジ低級アルキルアミノおよびハロゲンなどの１〜３個の独立して選択された置換基をそれぞれ有する。それらの置換基の中の低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニルおよびモノまたはジ低級アルキルアミノ基の低級アルキル部分は、上記定義の低級アルキルと同じ意味を有する。

窒素原子と一緒になったＲ⁵およびＲ⁶によって形成された複素環基は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジノ、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリノ、Ｎ−メチルピペラジニル、インドリルおよびイソインドリルを含む。

好ましくは、Ｒ¹およびＲ²は、水素、ハロゲン、ニトロ、−ＣＨ₂ＯＨ、−（ＣＨ₂）_kＲ¹⁴、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₂）_mＲ¹⁶、−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ₂）_nＲ¹⁵、−ＣＯ（ＣＨ₂）_jＲ⁴［式中、Ｒ⁴は−ＳＲ⁷である］、ＣＨ₂Ｏ−（置換もしくは非置換）低級アルキル（置換低級アルキルは、好ましくはメトキシメチル、メトキシエチルまたはエトキシメチルである）、−ＮＲ⁵Ｒ⁶からなる群から独立して選択される。

Ｒ¹およびＲ²の上記好適な意味において、残基Ｒ¹⁴は、好ましくは、フェニル、ピリジル、イミダゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、−ＣＯＯＲ¹⁵、−ＯＲ¹⁵（式中、Ｒ¹⁵は、好ましくは、水素、メチル、エチル、フェニルまたはアシルから選択される）、−ＳＲ⁷（式中、Ｒ⁷は、好ましくは、置換もしくは非置換低級アルキル、２−チアゾリンおよびピリジルから選択される）および−ＮＲ⁵Ｒ⁶（式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、好ましくは、水素、メチル、エチル、フェニル、カルバモイルおよび低級アルキルアミノカルボニルから選択される）から選択される。さらに、残基Ｒ¹⁶は、好ましくは、水素、メチル、エチル、フェニル、イミダゾール、チアゾール、テトラゾール、−ＣＯＯＲ¹⁵、−ＯＲ¹⁵および−ＮＲ⁵Ｒ⁶（式中、残基Ｒ¹⁵、Ｒ⁵およびＲ⁶は、上記の好適な意味を有する）から選択される。Ｒ¹およびＲ²の上記好適な意味において、残基Ｒ⁷は、好ましくは、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換フェニル、ピリジル、ピリミジニル、チアゾールおよびテトラゾールからなる群から選択される。さらに、ｋは、好ましくは２、３または４であり、ｊは、好ましくは１または２であり、ｍおよびｎは、独立して好ましくは０または１である。

好ましくは、Ｒ³は、水素またはアセチル、最も好ましくは水素である。また、各Ｗ¹およびＷ²は、好ましくは水素である。

本発明の好適な実施形態は、ポリマー部分に結合された化合物Ｋ−２５２ａに関する。さらにより好適な実施形態は、ポリマー単位をＫ−２５２ａ化合物またはＫ−２５２ａ誘導体化合物に結合させる化学基が５員オキサゾリジンジオン環構造によって特徴づけられるＫ−２５２ａおよびその誘導体のポリマー結合体に関する。したがって、本発明の非常に好適な実施形態において、式（Ｉ）のポリマー結合体は、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂が水素であり、Ｘがポリマー部分である化合物により表される。本発明のこの非常に好適な実施形態によれば、ポリマー部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）部分である。本発明の好適な実施形態のさらにより好適なポリエチレングリコールまたはメトキシ−ポリエチレングリコールは、平均分子量が約２０００Ｄａまたは約５０００Ｄａの長鎖ＰＥＧまたはｍＰＥＧポリマーである。平均分子量が約５５０Ｄａまたは約１１００Ｄａの短鎖ポリエチレングリコールまたはメトキシ−ポリエチレングリコールも好適である。

本発明の方法は、Ｋ−２５２ａまたは誘導体化合物のインドロカルバゾール化合物１つ以上またはすべての置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂を保護基で保護する工程を場合によって含む。この文脈において、「保護基」という用語は、必要であれば、合成処理時にＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂をマスクするために使用することができ、分子の残りに対して望ましくない影響を与えることなくＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂置換基を回収させる条件下で後に除去することができる当該技術分野で既知の置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂の任意の誘導体を指す。特に、必要であれば、Ｋ−２５２ａまたは誘導体化合物のインドロカルバゾール構造のＣ３位に対するポリマー結合の化学選択性を得るために、本発明の結合プロセスを通じて置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂の１つ以上またはすべてに対して保護基を導入することができる。結合反応後、関与する置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂の本来の官能基を戻して、式（Ｉ）のインドロカルバゾール結合化合物を得るために、１つまたは複数の保護基を逆に除去することができる。

本発明によれば、当該技術分野で既知の任意の好適な保護基をこの目的に使用することができる。好適な保護基、ならびに置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂を保護および脱保護するための任意の好適な手段および条件の選択を、当業者が有機合成の技術におけるその一般的知識によって達成することができる。採用される保護および脱保護の手段および条件は、関与する官能基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂の性質に応じて決まる。ヒドロキシ、アミノおよび／またはカルボキシ残基に対する保護基は、好ましくは、アセトニド、エチリデン、メトキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、ベンジルオキシメチル、テトラヒドロピラニル、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ベンジル、トリフェニルメチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリフェニルシリル、メトキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、アセチル、ベンゾイル、トルエンスルホニル、ジメトキシベンジル、ニトロフェニルオキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボニル、アリル、フルオレニルメチル、テトラヒドロフラニル、フェナシル、アセトール、フェニル、トリメチルシリル、ピロリジル、インドリル、ヒドラジノ、およびＧｒｅｅｎｅ Ｔ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００７）に見い出すことができるものなどの当該技術分野で既知の他の保護基から選択される。保護および脱保護反応の試薬および条件は、特に、化合物の残りに悪影響を及ぼすことなく保護基を選択的に結合および除去するそれらの適性について選択される。好適な条件および試薬は、当業者の慣行において一般的に既知である。

本発明によれば、式（Ｉ）の化合物を、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの無機酸の塩、ならびに酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、アリールスルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）、リン酸およびマロン酸などの有機酸の塩を含む製剤学的に認容性の塩として製造することもできる。製剤学的に認容性の塩の形成のための好適な酸は、当業者に既知である。また、式（Ｉ）の化合物の製剤学的に認容性の塩を製剤学的に認容性のカチオンで形成することができる。製剤学的に認容性のカチオンは、当業者に既知であり、アルカリカチオン（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）、土類アルカリカチオン（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋）、第四級アンモニウムカチオンなどのアンモニウムおよび有機カチオンを含む。

本発明のさらなる態様は、ポリマー単位をＫ−２５２ａ化合物またはＫ−２５２ａ誘導体化合物に結合させる化学基が５員オキサゾリジンジオン環構造によって特徴づけられるＫ−２５２ａおよびその誘導体の新規のポリマー結合体である。これらの新規のポリマー結合体は、本明細書に開示されている新規の合成方法によって製造される。

したがって、特に、本発明のさらなる態様は、式（Ｉ）

［式中、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂ならびにポリマー部分Ｘは、以上に詳細に定義されている通りである］のインドロカルバゾール化合物、またはその製剤学的に認容性の塩のポリマー結合体である。

最も好適な実施形態において、本発明は、式（Ｉ）［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂は水素であり、ポリマー部分Ｘは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または末端がアルコキシ置換されたＰＥＧ、例えば好ましくはメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）である］の新規のポリマー結合化合物に関する。この化合物は、本発明によるＫ−２５２ａのポリマー結合化合物に対応する。好ましくは、ポリマー部分は、平均分子量が約２０００Ｄａまたは約５０００Ｄａである長鎖ポリエチレングリコール、さらにより好ましくはメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）などの末端がアルコキシ置換されたＰＥＧである。同様に、好ましくは、平均分子量が約５５０Ｄａまたは約１１００Ｄａである短鎖ポリエチレングリコール、さらにより好ましくはメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）などの末端がアルコキシ置換されたＰＥＧである。

意外にも、インドロカルバゾール化合物の構成要素と比較して、特にポリマーを欠くＫ−２５２ａそのものまたはその誘導体と比較して、式（Ｉ）の対応するポリマー結合化合物は、溶解度が大きいため、向上した薬物動態学的および毒性学的性能を発揮して、治療および生物活性化合物の生物学的利用能の向上をもたらすことが本出願の発明者らによって見い出された。本発明の別の態様において、意外にも、式（Ｉ）のポリマー結合インドロカルバゾール化合物は、分子サイズおよび両親媒性が大きいことにより、局所投与されると限られた全身吸収を示すため、局所的治療および生物学的効果を高めるとともに、局所的適用により全身毒性および／または副作用を低減することが見い出された。

意外にも、式（Ｉ）のインドロカルバゾール−ポリマー結合体は、インドロカルバゾール化合物そのもの、特にポリマーを欠くＫ−２５２ａおよびその誘導体の非選択的キナーゼ阻害活性と比較して、ＴｒｋＡチロシンキナーゼに対する阻害活性における選択性の有意な向上を示すことが本出願の発明者らによって見い出された。したがって、本発明によるポリマー分子に対するインドロカルバゾール化合物、特にＫ−２５２ａの結合は、望ましくない副作用の必然的な減少とともに、その治療目標に関して選択性がある活性薬の提供に至る。

したがって、本発明のさらなる態様は、医薬における活性薬としての式（Ｉ）の化合物の使用である。本発明の好適な態様において、式（Ｉ）の化合物は、全身投与および治療のための医薬における活性薬として使用される。同様に好適な態様において、本発明は、局所的医薬における活性薬としての式（Ｉ）の化合物の使用に関する。

特に、本発明の結合ポリマー化合物は、ＨＭＧＢ１関連病状の予防、緩和および治療に有用な医薬における活性薬として使用される。ＨＭＧＢ１関連病状は、ＨＭＧＢ１核タンパク質が実際的に検出不可能である正常な被験体における濃度と比較して、高濃度のアセチルかまたは非アセチル化の形の核タンパク質ＨＭＧＢ１および／またはＨＭＧＢ１相同タンパク質が生体液および組織に存在する患者の状態である。細胞外ＨＭＧＢ１は、化学走性炎症誘発性ケモカインとして作用する。したがって、ＨＭＧＢ１関連病状は、強炎症性の基礎を有する病状、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６等のサイトカインの刺激に起因する病状、または中毒、感染、火傷等の毒性事象に起因する病状である。特に、高濃度のＨＭＧＢ１タンパク質および相同タンパク質は、敗血症の患者の血漿、リウマチ様関節炎患者の血漿および滑液、アルツハイマー病患者の脳、メラノーマ患者の血漿および組織、全身性紅斑性狼瘡患者の血漿、アテローム硬化症患者のアテローム斑等に見い出され、確認された。生体液および組織におけるＨＭＧＢ１タンパク質および／または相同タンパク質の確認および形跡を、例えばＥＬＩＳＡアッセイ等による検出を含む当業者に既知の一般的な診断手段によって検出することができる。

したがって、特に、炎症性疾患、狭窄、再狭窄、アテローム硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患、腫瘍、感染性疾患、敗血症、急性炎症性肺傷害、紅斑性狼瘡、神経変性疾患、中枢および末梢神経系の疾患ならびに多発性硬化症を含むが、それらに限定されない様々な疾患が、該当する細胞外ＨＭＧＢ１の存在によって特徴づけられる。特に好適な実施形態において、式（Ｉ）の結合ポリマー化合物は、心臓血管疾患、特に、血管形成の最中または後に起こるアテローム硬化症および／または再狭窄の予防、緩和および治療に使用される。より好ましくは、該医薬は、血管形成の最中または後の再狭窄における結合組織再生を阻止、妨害および／または阻害するために使用される。

本発明の特に好適な態様において、式（Ｉ）の結合ポリマー化合物は、中枢および末梢神経系の神経障害、神経疾患および神経変性障害の予防、緩和および治療のための医薬における活性薬としての使用に効率的である。

新規のポリマー結合体化合物は、全身治療による血漿サイトカイン分泌を低減および／または抑制することが可能であることが発明者らによってさらに証明された。したがって、ポリマー結合体化合物は、血漿サイトカイン分泌の増加が関与する病状の予防、緩和および／または治療に有用な全身投与のための医薬における活性薬として使用される。これらの病状は、好ましくは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１および／またはＲＡＮＴＥＳの分泌が主として関与する病状である。

特に、本発明の文脈において、血漿サイトカイン分泌の増加に関連する病状としては、炎症性疾患、自己免疫疾患、全身性炎症応答症候群、臓器移植後の再潅流傷害、心臓血管疾患、産科および婦人科疾患、感染性疾患、アレルギー性およびアトピー性疾患、固形および液体腫瘍病状、移植片拒絶疾患、先天性疾患、皮膚疾患、神経疾患、悪液質、腎臓疾患、医原性中毒状態、代謝性および特発性疾患、ならびに眼科疾患が挙げられるが、それらに限定されない。

最も好適な実施形態において、本発明の化合物は、ベーチェット病、シェーグレン症候群、血管炎、ブドウ膜炎、網膜炎の予防、緩和および／または治療に有用な全身治療のための医薬における活性薬として使用される。

本発明のさらに別の特定の態様において、本発明の結合ポリマー化合物を、皮膚病の予防、緩和および／または治療に有用な局所医薬における活性薬として使用することが好適である。本明細書に記載の結合ポリマー化合物は、（以下の実施例に記載される試験において示されるように）皮膚投与された場合における有害効果もしくは毒性効果（例えば刺激）、または光毒性効果（例えば光変異原生、光毒性もしくは光感作性）を示さないため、局所医薬として非常に有利に使用されることが発明者らによって証明された。

本発明の文脈において好適な皮膚病は、ケラチノサイトの過剰増殖によって特徴づけられる病状、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性湿疹、ざ瘡、毛孔性紅色粃糠疹、ケロイド、過形成性瘢痕および皮膚腫瘍、例えば、角化棘細胞腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌である。より好適な実施形態において、本発明の化合物は、乾癬の予防、緩和および治療に有用な局所医薬における活性薬として使用される。

ＴｒｋＡの阻害における本発明の化合物の向上した選択性により、本発明のさらなる態様は、ＴｒｋＡが、病状の発生を招く病態生理学的メカニズムにおいて重大な役割を果たす病状の予防、緩和および治療における前記結合化合物の使用である。この文脈では、本発明の非常に好適な実施形態において、式（Ｉ）、（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）のＫ−２５２ａポリマー化合物は、ＮＧＦ関連疼痛および痛覚過敏症の予防、緩和および治療のための医薬における活性薬として使用される。

したがって、本発明のさらなる態様は、上記定義の病状の予防、緩和および／または治療のための医薬の製造のために、上記定義の式（Ｉ）の化合物を場合によって製剤学的に認容性の担体、助剤、希釈剤および／または添加剤とともに使用することである。

式（Ｉ）の化合物またはそれらの製剤学的に認容性の塩をそのまま、または薬物動態活性および投与の目的に応じて様々な医薬組成物の形で投与することができる。本発明のさらに別の態様は、有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を場合によって製剤学的に認容性の担体、助剤、希釈剤および／または添加剤とともに含む医薬組成物である。医薬担体、助剤、希釈剤および／または添加剤は、当業者に既知であるため、本発明の化合物を含む医薬組成物の調合に適用され得る。

本発明の化合物を医薬組成物における唯一の活性薬として採用することができる。あるいは、式（Ｉ）の化合物を１つまたはいくつかの活性薬、例えば、上記定義の病状の治療における他の活性医薬と併用することができる。

特に、本発明のポリマー結合体化合物を少なくとも１つのステロイド性抗炎症薬、および／または炎症性サイトカインの初期媒介物質を阻害することが可能な１つのさらなる薬剤、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−Ｒ_a、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＭＩＦおよびＩＬ−６からなる群から選択されるサイトカインのアンタゴニストまたは阻害薬と併用することができる。特に有用な抗炎症薬は、ジプロピオン酸アルクロメタソン、アムシノニド、ジプロピオン酸ベクロメタソン、ベタメタソン、安息香酸ベタメタソン、ジプロピオン酸ベタメタソン、リン酸ベタメタソンナトリウム、リン酸および酢酸ベタメタソンナトリウム、吉草酸ベタメタソン、酪酸クロベタソール、プロピオン酸クロベタソール、ピバル酸クロコルトロン、コルチソール（ヒドロコルチソン）、酢酸コルチソール（ヒドロコルチソン）、酪酸コルチソール（ヒドロコルチソン）、シピオン酸コルチソール（ヒドロコルチソン）、リン酸コルチソール（ヒドロコルチソン）ナトリウム、コハク酸コルチソール（ヒドロコルチソン）ナトリウム、吉草酸コルチソール（ヒドロコルチソン）、酢酸コルチソン、デソニド、デソキシメタソン、デキサメタソン、酢酸デキサメタソン、リン酸デキサメタソンナトリウム、二酢酸ジフロラソン、吉草酸ジフルコルトロン、酢酸フルドロコルチソン、フルドロキシコルチド、ピバル酸フルメタソン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルトロン、フルオメトロン、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカソン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタソール、メドリソン、メチルプレドニソロン、酢酸メチルプレドニソロン、コハク酸メチルプレドニソロンナトリウム、葉酸モメタソン、酢酸パラメタソン、プレドニソン、酢酸プレドニソン、リン酸プレドニソンナトリウム、プレドニソロンテブテート、プレドニソン、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、二酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンヘキサセトニドから選択される。サイトカインの有用なアンタゴニストまたは阻害薬は、インフリキシマブ、エタネルセプトまたはアダリムマブから選択される。

本発明のポリマー化合物と併用することができるさらなる薬剤は、例えば、ＲＡＧＥのアンタゴニストおよび／または阻害薬、ＨＭＧＢ１のアンタゴニストおよび／または阻害薬、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＣＲ）とＨＭＧＢ１との相互作用のアンタゴニストおよび／または阻害薬、トロンボモデュリンの官能性Ｎ末端レクチン様ドメイン（Ｄ１）、および／または参考により本明細書で援用される国際特許出願ＷＯ２００６／００２９７１に記載されている屈曲形構造の合成二本鎖核酸もしくは核酸類似体分子である。

本発明の医薬組成物は、当業者、例えば医師に既知の従来の方法で投与され得る。特に、本発明の医薬組成物を注射もしくは注入、特に、静脈内、筋肉内、経粘膜、皮下もしくは腹腔内注射もしくは注入によって、かつ／または経口、局所、皮膚、経鼻、吸入、エアロゾルおよび／または直腸投与等によって投与することができる。投与は、局所投与または全身投与であってもよい。好ましくは、本発明の化合物および医薬組成物の投与を、特に溶液剤もしくは懸濁液剤の形の非経口投与、または特に錠剤もしくはカプセル剤の形の経口投与、または特に粉剤、点鼻剤もしくはエアロゾル剤の形の鼻内投与、または例えば軟膏剤、クリーム剤、油剤、リポソームもしくは経皮貼付剤を介する皮膚投与によって実施することができる。

本発明の一態様によれば、医薬組成物は、全身投与される。特に、ポリマー結合体化合物を注射もしくは注入、特に、静脈内、筋肉内、経粘膜、皮下もしくは腹腔内注射もしくは注入、および／または経口投与によって投与することができる。

さらに最も好適な実施形態において、本発明の医薬組成物は、局所投与、特に皮膚投与によって投与される。皮膚投与の場合は、本発明の化合物の投与をリポソームの形で実施することができる。

本発明のさらなる最も好適な実施形態において、医薬組成物は、特に、ステント、カテーテル、外科手術用具、カニューレ、心臓弁もしくは血管用人工装具を含むが、それらに限定されない医療デバイスに本発明の化合物および組成物を接着、コーティングおよび／または埋設することによって医療デバイスの表面に可逆的に固定される。医療デバイスを体液または体組織と接触させた後に、可逆的に固定された化合物を解放する。その結果、コーティングされた医療デバイスは、医薬を溶離する薬物送達デバイスとして作用することによって、薬物送達動態を制御して、例えば、即時放出、または制御、遅延もしくは持続放出を行うことができる。医療デバイスのコーティング法も当業者に既知である。

本発明の医薬組成物を診断または治療用途に使用することができる。診断用途では、式（Ｉ）の化合物が、標識された形、例えば、同位体、例えば放射性同位体、もしくは核磁気共鳴によって検出できる同位体を含む形で存在してもよい。好適な治療用途は、局所投与の場合は、乾癬および皮膚炎の予防、緩和および治療であり、全身投与の場合は、再狭窄における結合組織再生の予防、緩和および治療である。

医薬組成物における本発明の化合物の濃度は、異なり得る。濃度は、投与すべき薬物の全投与量、採用される化合物の化学特性（例えば疎水性）、投与経路、患者の年齢、体重および症候などの要因に左右されることになる。本発明の化合物は、典型的には、非経口投与では約０．１〜１０ｗ／ｖ％の化合物を含む生理緩衝水溶液で与えられる。典型的な投与量範囲は、１日毎に体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１ｇであり、好適な投与量範囲は、１日毎に体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１日毎に１回〜４回にわたって体重１ｋｇ当たり約０．１〜２０ｍｇである。投与すべき薬物の好適な投与量は、疾患または障害のタイプおよび進行の程度、特定の患者の全体的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的効果および化合物賦形剤の処方、ならびにその投与経路などの様々な可変要素に左右される可能性が高い。

本発明による改善型合成方法を以下の図面および実施例によってさらに説明するが、それらは、本発明の主題を制限するものではない。

図１は、本発明による方法の好適な実施形態を示す。本発明によるＫ−２５２ａのメトキシポリエチレングリコール結合体を得るために、インドロカルバゾール化合物Ｋ−２５２ａとα−メトキシ−ω−１Ｈ−イミダゾール−カルボキサミドポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−Ｉｍ）とを反応させる。本発明のこの好適な化合物において、メトキシ−ポリエチレングリコールは、５員オキサゾリジンジオン環構造を介して活性Ｋ−２５２ａに共有結合されている。 図２は、４００ＭＨｚの磁場におけるＤＭＳＯ−ｄ６溶媒中の活性化ポリマーｍＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ｌｍの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。 図３は、直接注入イオントラップエレクトロスプレー電離を用いた５００〜１４００ｍ／ｚの範囲のｍＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ｌｍのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図４は、４００ＭＨｚにおけるＤＭＳＯ−ｄ６溶媒中の図１のＫ−２５２ａポリマー結合体の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。 図５は、４００ＭＨｚにおけるＤＭＳＯ−ｄ６溶媒中の図１のＫ−２５２ａポリマー結合体の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。 図６は、直接注入イオントラップエレクトロスプレー電離を用いた５００〜１４００ｍ／ｚの範囲の図１のＫ−２５２ａポリマー結合体のＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図７は、ＴｒｋＡに対する図１のＫ−２５２ａポリマー結合体の阻害曲線を示す。

実施例
実施例１：α−メトキシ−ω−１Ｈ−イミダゾール−カルボキサミドポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−Ｉｍ）の合成

５００ｍｌ容量の丸底フラスコにて、３５．０ｇのｍＰＥＧ−ＮＨ₂（ＭＷ１８９２）（アッセイ９６％、１７．７６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気中で８５ｍｌのジクロロメタンに溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、化合物を２時間にわたってメカニカルポンプによって乾燥させた。次いで、基質を窒素雰囲気中で１５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、溶液を２ｌ容量の三口丸底フラスコに移した。

４．８０ｇの１，１−カルボニルジイミダゾール（アッセイ９０％、２６．６４ｍｍｏｌ）を室温で該溶液に添加した。混合物を窒素下で室温にて撹拌し、ＴＬクロマトグラフィー（溶離剤ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ９０：１０）によって確認した。第一級アミン基の存在（紫色）をスポットライトで照らすためにＴＬＣをニンヒドリン溶液で処理した。

反応は、２時間以内で完了した。混合物を０℃で冷却し、激しく撹拌しながらジエチルエーテルを徐々に添加（６０分で７００ｍｌ）することによって固体生成物を沈殿させた。混合物を０℃で３０分間撹拌し、さらに３００ｍｌのジエチルエーテルを添加した。生成物をガラス焼結ディスクフィルタ漏斗で濾過し、１００ｍｌのジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させた。３４．０ｇの乾燥白色固体を得た（収率９４％）。

生成物を¹Ｈ−ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳによって特徴づけた。

ＥＳＩ−ＭＳ（クラスター＋２）．．．９４４．４、９６６．４、９８８．５、１０１０．５、１０３２．５．．．（ｍＰＥＧ−ＮＨ₂のクラスター＋２．．．８９７．４、９１９．４、９４１．５、９６３．５、９８５．５に対して質量増加＋４７）

実施例２：オキサゾリジンジオン結合体の製造のためのＫ−２５２ａのポリマー結合反応
該方法のスキームを図１に示す。

５００ｍｌ容量の丸底フラスコにて、３３．０ｇのｍＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ｌｍ（１６．００ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気中で８５ｍｌのジクロロメタンに溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、化合物を２時間にわたってメカニカルポンプによって乾燥させた。

熱クライオスタット装置、機械的撹拌機および温度計を備えた２ｌ容量の反応器にて、６．２１ｇのＫ−２５２ａ（アッセイ９８％、１３．２９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で１．８５Ｌのジクロロメタンに溶解させ、溶液を０℃まで冷却した。０．５３ｇの水素化ナトリウム（アッセイ６０％、１３．２９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気中で添加し、混合物を１０分間撹拌した。乾燥したｍＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ｌｍを９０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、溶液を０℃で窒素雰囲気中でＫ−２５２ａとジクロロメタン中ＮａＨとの混合物に添加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いで２５℃に加熱し、撹拌下でこの温度に１０分間維持した。

Ｋ−２５２ａの変換および混合物における化合物の比率を評価するために、反応混合物をＨＰＬＣによって分析した。２５℃で１０分間放置した後、３．６０ｇの１，１−カルボニルジイミダゾール（アッセイ９０％、１９．９３ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、溶液を２５℃で３０分間撹拌した。アミド副産物（Ｋ−２５２ａの９位のカルボン酸部分によるｍＰＥＧ結合体）の所望のオキサゾリジンジオン結合体への変換を確認するために、反応混合物をＨＰＬＣによって分析した。反応混合物をギ酸（アッセイ９８％）で中和して最終ｐＨ６とした（約２ｍｌ、５３ｍｍｏｌ）。

溶媒を２５℃にて減圧下で除去し、４４．０ｇの淡黄色粗製物を得た。

粗製物における結合体のＨＰＬＣ純度は９０％を超えていた。粗製混合物における所望の生成物の含有量は、約６５〜７０％ｗ／ｗである。

実施例３：逆相フラッシュクロマトグラフィーによるＫ−２５２ａのオキサゾリジンジオン結合体の精製
実施例２の結合工程で得られた粗製混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。フラッシュ６５ｉＭ ＫＰ−Ｃ１８カートリッジを備えたバイオテージホライゾンシステムを使用した。製造バッチをそれぞれ３．０ｇの１５個のアリコットに分割した。アリコットを個別に処理した。

アイソクラティック条件で１００％アセトニトリルからアセトニトリル／水４０：６０、次いで２００ｍＬのアセトニトリル／５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．５）４０：６０の勾配を適用することによって最初に２００ｍＬの溶媒でカラムを調整した。

３．０ｇの粗製物を３．０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、溶液をカラムに充填した。精製をアセトニトリル／５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．５）４０：６０のアイソクラティック溶離によって実施した。回収した個々のフラクションをＨＰＬＣによって分析し、純粋のフラクションを一緒にした。溶媒を２５℃にて減圧下で除去し、約２ｇの純粋湿性生成物を得た。

前の手順に従って各アリコットを精製し、最後に各純粋湿性生成物フラクションを１０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、次いで一緒にした。溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別し、溶媒を２５℃にて減圧下で除去した。

得られた固体生成物をＮＭＲ分光法によって分析し、約１モル当量のギ酸アンモニウムを検出した。この塩を除去するために、生成物を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロメタンで湿らせたシリカゲルパッドで溶離させた。生成物を、７００ｍｌの溶媒混合物ジクロロメタン／メタノール９：１を用いた溶離によって回収した。溶離液を回収し、溶媒を２５℃にて減圧下で除去した。生成物を再び８０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、個体性生物を得るために５００ｍｌのジエチルエーテルを添加することによって激しく撹拌しながら０℃で沈殿させた。生成物をガラス焼結ディスクフィルタ漏斗で濾過し、１００ｍｌのジエチルエーテルで洗浄し、真空下で１６時間にわたって乾燥させた。

１６．０ｇの淡黄色粉末を５１％の全体収率（結合＋精製）で得た。

生成物をＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳおよびＨＰＬＣによって特徴づけた。内部標準を使用してＮＭＲによってアッセイを測定したところ、１０１％ｗ／ｗに対応した。

ＥＳＩ−ＭＳ（クラスター＋２）．．．１１２８．２、１１５０．３、１１７２．３、１１９４．３、１２１６．３．．．（ｍＰＥＧ−ＮＨ₂のクラスター＋２．．．８９７．４、９１９．４、９４１．５、９６３．５、９８５．５に対して質量増加＋２３０．８）

精密質量：記録されたスペクトルと理論上のスペクトルとの精密質量差は、２ｐｐｍに対応する。したがって、得られたポリマー化合物は、少なくとも約９８％の純度を有する。

実施例４：順相フラッシュクロマトグラフィーによるＫ−２５２ａのオキサゾリジンジオン結合体の精製
上記実施例１および２に記載されている合成方法を実施し、この合成処理で２１．７ｇの粗製物を得た。

前記結合工程により得られた粗製混合物を、３４０ｇのＫＰ−ＳＩＬ（シリカ）（サイズ７１×１６８ｍｍ）が装填されたＳＮＡＰカートリッジを備えたバイオテージホライゾンシステムを使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。粗製物を、それぞれ１回ずつ個別に精製される２つのアリコットに分割した（各アリコットは、それぞれ１０．８６ｇおよび１０．８ｇ）。

ＳＮＡＰカートリッジを９４０ｍｌのジクロロメタン／メタノール９６：４ｖ／ｖで平衡させた。流量は、６５ｍｌ／分であった。

予め装填されたＳＭＡＰＳサンプレットカートリッジを使用して、粗製材料を１０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、該溶液をサンプレットカートリッジに塗布し、サンプレットをＳＮＡＰカートリッジに挿入することによって、サンプル充填を実施した。

ＳＮＡＰカートリッジを、６５ｍｌ／分の流量で
− ７０５ｍｌのジクロロメタン／メタノール９６：４ｖ／ｖ、
− １８８１ｍｌのジクロロメタン／メタノール９３：７ｖ／ｖ、
− ９４２ｍｌのジクロロメタン／メタノール８５：１５ｖ／ｖ
により溶離させた。

最初の９９９ｍｌの溶離溶媒を廃棄物に送り、次いで溶離溶媒を１１１ｍｌ容量のフラクションで回収した。

回収した個々のフラクションをＨＰＬＣによって分析し、９８％を超える純度の結合生成物化合物を含むフラクション（純粋フラクション）を一緒にした。

結合工程による１０．８ｇの粗製混合物材料の残留アリコットを同様にして精製した。

粗製混合物の２つのアリコットの精製による選択フラクションを一緒にし、溶媒を２５℃にて減圧下で除去して乾固させ、８．１１ｇの結合体生成物を得て、それを再び２９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、２℃まで冷却し、激しく撹拌しながら１５０ｍｌのジエチルエーテルを１５分間で添加することによって沈殿させた。混合物を２℃で１５分間撹拌し、次いで２２５ｍｌのジエチルエーテルを添加した。沈殿した固体を凝結ガラスフィルタ（Ｇ４）による濾過によって単離し、２５℃にて真空下で１６時間にわたって乾燥させて、６．９５ｇの試験品目を白色からわずかに黄色の固体として得た。ＨＰＬＣ分析によって測定された純度は９９％であった。

実施例５：Ｋ−２５２ａのオキサゾリジンジオン結合体の合成方法
１）ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃｏ−ｌｍの合成
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂（ＭＷ１８９２、８．０６ｇ）を窒素雰囲気下でジクロロメタン（２５ｍｌ）に溶解させ、溶媒を４０℃にて減圧下で蒸留によって除去した。次いで、残渣（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂）を４０℃にて真空（＜４０ｍｂａｒ）下で２時間以上にわたって乾燥させた。

（上記による）乾燥ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂を２５℃にて窒素雰囲気下でジクロロメタン（３５ｍｌ）に溶解させ、１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．０２ｇ）を該溶液に添加し、混合物を室温で２時間以上にわたって撹拌した。（イオンペアリングクロマトグラフィー（ＩＰＣ）：≧９５％変換率）。

反応混合物を０℃まで冷却し、次いで２３０ｍｌのジエチルエーテルを激しく撹拌しながら１時間にわたって添加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、さらに６９ｍｌのジエチルエーテルを２５分間にわたって添加した。フィルタケークをジエチルエーテル（２３ｍｌ）で２回洗浄し、最大４０℃にて一定質量まで真空下で乾燥させて、８．２５ｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ｌｍを白色固体として得た。

２）ポリマー結合反応
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ｌｍ（７２．０ｇ）を窒素雰囲気下でジクロロメタン（１８５ｍｌ）に溶解させ、溶媒を４０℃にて減圧下で蒸留によって除去した。残渣を４０℃にて真空（＜４０ｍｂａｒ）下で２時間を超える時間にわたって乾燥させた。

Ｋ２５２ａ（１３．１１ｇ）をジクロロメタン（３９２０ｍｌ）に溶解させ、次いで溶液を０℃まで冷却した。水素化ナトリウム（６０％の１．１７ｇ）を少しずつ添加した。

乾燥ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ｌｍをジクロロメタン（１４０ｍｌ）に溶解させ、該溶液を５℃未満でＫ２５２ａの反応混合物に添加し、混合物を０℃で３０分間を超える時間にわたって撹拌した。次いで、該混合物溶液を２５℃に加熱し、この温度で１０分間にわたって撹拌を維持した（ＩＰＣ１：Ｋ２５２ａの変換率＞９６％）。

１，１’−カルボニルジイミダゾール（７．１１ｇ）を反応混合物に添加し、溶液を２５℃で３０分間を超える時間にわたって撹拌した（ＩＰＣ２：比 粗製物：アミド＞８０：２０）。

ギ酸（５ｍｌ）を添加して反応混合物のｐＨ６に調整した。溶媒を２５℃にて減圧下で蒸留によって除去し、残渣を２５℃にて真空下で一定質量まで乾燥させた。

３：ポリマー結合体の精製および単離
粗製混合物（８１ｇ）を３５℃未満で１５分間以上にわたって３２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、セライト床（３ｃｍ）で濾過した。セライトを８１ｍｌのジクロロメタンで洗浄した。溶媒を３５℃未満にて減圧下で蒸留によって除去し、３５℃で一定質量まで乾燥させて７７．０ｇの固体材料を得た。固体材料を７７０ｍｌのジクロロメタンに溶解させた。

実施例５．２の粗製材料を、バイオテージのフラッシュＫＰ−ＳＩＬ ７５Ｌカートリッジ（７５×３００ｍｍ、８００ｇのシリカ）を使用して、Ｋｎａｕｅｒ（クナウア）社の分取りＨＰＬＣシステムで精製する。原料溶液を塗布する前に、カートリッジを１．５ｌのｎ−ヘプタンでパージし、３ｌのＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９６：４（ｖ：ｖ）で平衡させた。各処理について、２００ｍｌの上記原料溶液ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９６：４８（ｖ：ｖ）（充填２０ｇ）を注入し、１８５ｍｌ／分の流量および以下に記載の勾配を用いて溶離を開始した。

各カートリッジを１回の処理に対して使用した。生成物は、２５分〜９０分まで溶離していた。フラクションを回収・分析し、それらの純度（ＩＰＣ：＞９８％ ａ／ａ）に応じて貯蔵した。

次いで、溶媒を３５℃にて減圧下で除去する。固体を３５℃にて真空下で一定質量まで乾燥させて粗製材料（３７．９２ｇ）を得る。該材料を１４０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、２℃まで冷却する。７００ｍｌのジエチルエーテルを２℃で添加し、１５分間を超える時間にわたって撹拌する。１０５０ｍｌのジエチルエーテルを２℃で添加する。

該懸濁液を吸引フィルタにより濾過する。フィルタケークを母液で洗浄し、一定質量まで乾燥させて３２．６ｇの精製薬物基質を得る。ＨＰＬＣ分析により得られた純度は９８．９９％であった。

さらなる実施例は、本発明のポリマー結合体インドロカルバゾール化合物、特に、例えば実施例１〜５に記載されている本発明の合成方法を通じて得られたポリマー結合体を用いて実施したいくつかの試験を説明する。試験された結合体化合物（「試験品目」とも呼ばれる）は、Ｋ−２５２ａのＰＥＧとのオキサゾリジンジオン結合体（１８９２ＭＷ）である。

実施例６：Ｋ−２５２ａのオキサゾリジンジオン結合体についてのＴｒｋＡに対するＩＣ₅₀のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
この試験の目的は、ＴｒｋＡキナーゼに対する実施例３の結合体についてのＩＣ₅₀を測定することであった。試験化合物をジメチル−スルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、次いで溶液をアッセイ緩衝液でさらに２５倍に希釈して、最終的な試験化合物溶液を作製した。結合体を３００００ｎＭ、１００００ｎＭ、３０００ｎＭ、１０００ｎＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭおよび１ｎＭの濃度で試験した。

アッセイ対照のための基準化合物（スタウロスポリン）を、試験化合物の調製に使用した方法と同様にして調製した。

アッセイ手順は、オフチップモビリティシフトアッセイ（ＭＳＡ）によるものであり、以下に報告される。

１）５μｌの４倍希釈化合物溶液、５μｌの４倍希釈基質（ＣＳＫｔｉｄｅ １０００ｎＭ）／ＡＴＰ（７５μＭ）／金属溶液（Ｍｇ ５ｍＭ）および１０μｌの２倍希釈キナーゼ溶液を、アッセイ緩衝液［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、０．０１％のトリトンＸ−１００、２ｍＭのＤＴＴ（１，２−ジチオ−トレイトール）、ｐＨ７．５］を用いて調製し、混合し、ポリプロピレン３８４ウェルマイクロプレートのウェルにて室温で１〜５時間＊インキュベートした（＊；キナーゼに依存する）。

２）６０μｌの停止緩衝液（ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓｉｓｔ ＭＳＡ；Ｃａｒｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をウェルに加えた。

３）反応混合物をＬａｂＣｈｉｐ３０００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に加え、生成物および基質ペプチドピークを分離し、定量した。

４）キナーゼ反応を、生成物（Ｐ）および基質（Ｓ）ペプチドのピーク高さから計算された生成物比（Ｐ／（Ｐ＋Ｓ））によって評価した。

反応対照（完全反応混合物）の読取り値を０％阻害率に設定し、バックグラウンド（酵素（−））の読取り値を１００％阻害率に設定し、次いで各試験溶液の阻害率を計算した。ＩＣ₅₀値を、４パラメータロジスティック曲線への適合によって濃度対％阻害率曲線から計算した。キナーゼ反応を、生成物（Ｐ）および基質（Ｓ）ペプチドのピーク高さから計算された生成物比（Ｐ／（Ｐ＋Ｓ））によって評価した。

ＴｒｋＡに対する結合体のＩＣ₅₀値は２０２ｎＭであり、ＴｒｋＡに対する基準化合物（スタウロスポリン）の対応するＩＣ₅₀値は０．３７２ｎＭであった。これらの結果を図７に要約する。

実施例７：ラットにおける急性皮膚毒性試験
実施例３の結合体の急性毒性を、ラットへの一回皮膚投与量の投与後に調査した。

２０００ｍｇ／ｋｇの一回投与量を、５匹の雄および５匹の雌の動物のグループに２４時間にわたって投与した。計画された投与の前日に、毛皮を胴体の背面から全体表面の１０％の推定面積だけ除去した。皮膚の損傷または摩耗を回避するために注意を払った。試験品目をその調製の直後に体重１ｋｇ当たり４ｍｌの投与容量で局所投与した。調合試験品目の必要なアリコットを２．５×２．５ｃｍの寸法のガーゼ上に均一に散布した。次いで、ガーゼ片を動物の皮膚上に配置して、試験品目を皮膚に直接接触させた。合成フィルムの細片を処理部位上に配置し、動物の胴体を弾性の接着性包帯で取り囲むことによって全アセンブリを所定位置に保持した。２４時間後にテープ包帯を除去することになる。次いで、処理した皮膚部位を、微温水を使用して、静かに洗浄して残留する試験品目を除去した。その試験全体を通じて、すべての動物を毎日２回検査することになる。動物を処理に対する反応の徴候について、投与時、１日目の投与の約３０分、２および４時間後、次いで全体で１４日間にわたって毎日検査した。試験に割り当てた日、投与日（１日目）、ならびに８および１５日目に各動物の体重を測定した。１４日の期間後に、すべての動物を屠殺し、解剖検査した。

試験を通じて、雄または雌の動物に死亡が発生せず、臨床的徴候も観察されなかった。試験の終了時に動物に観察された体重の変化は、この動物の種および年齢についての想定範囲内であった。試験の終了時の動物の検屍において内部異常が見い出されなかった。処理部位に異常が観察されなかった。

これらの結果は、試験化合物が、２０００ｍｇ／ｋｇの量の２４時間にわたる皮膚曝露後にラットに毒性効果を及ぼさないことを示している。死亡が発生しないことは、Ｌ₅₀が２０００ｍｇ／ｋｇを超えることを証明している。

実施例８：ラットにおける１３週間の皮膚毒性試験およびその後の４週間の回復期間
この試験の目的は、１３週間にわたる毎日の皮膚投与（６時間曝露）後のラットにおける試験品目の毒性を評価し、４連続週の期間にわたるあらゆる潜在的処理関連効果からの見込まれる回復を調査することであった。毒物動態プロファイルの評価も行った。

それぞれ１０匹の雄および１０匹の雌のスプラーグドーリーラットの３つのグループ（雄に偶数番号が付され、雌に奇数番号が付された、第１表参照）は、１３連続週間にわたって０．５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で皮膚投与により試験品目が与えられた（第１表：グループ番号２〜４）。第４の同様に構成されたグループは、媒体（精製水）のみが与えられ、対照としての役割を果たした（第１表：グループ番号１）。それぞれの性の５匹のさらなる動物を、回復評価に向けて、高グループおよび対照グループに含めた（第１表：それぞれグループ番号４および１）。加えて、９匹の雄および９匹の雌を含む毒物動態のための３つのサテライトグループ（第２表：それぞれグループ番号５〜８）ならびに３匹の雄および３匹の雌を含む１つの対照グループ（第２表：グループ番号５）を毒物動態評価のための主要グループとして処理した。

処理に割り当てたグループ識別番号および動物番号を以下の第１表および第２表に要約する。

第１表（主要グループ）：

第２表（サテライトグループ）：

処理部位を投与の開始の約３時間後に毎日検査した。近隣の未処理の皮膚と比較した場合の部位の刺激に、以下の表に従って数値を割り当てた。

結果
試験を通じて治療に関連する死亡は発生せず（高投与量グループの１匹の雌が試験の４０日目に死亡した）、処理に関連する臨床的徴候は観察されなかった。関連する体重変化は記録されず、処理動物の食餌消費量は、試験全体を通じて対照と同等であった。

処理部位において刺激の徴候は観察されなかった（刺激指数は０であった）。処理期間終了時に実施した眼検査で処理に関連する病変が検出されなかった。

血液学的観点から、高投与量グループの動物および中投与量グループの雌に観察された白血球減少症は、回復期間の終了時に部分的可逆性を示した。毒性的有意性の他の変化は観察されなかった。

臨床的化学検査および尿検査の双方から、毒性的有意性の他の変化は観察されなかった。

最終体重は、対照グループと処理グループの間で同等であった。毒性的有意性の絶対的および相対的臓器質量の変化は観察されなかった。

巨視的観察および微視的観察後に処理に関連する変化は認められなかった。

毒物動態に関することについては、１日目に、試験品目の血漿濃度は、０．５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ／日の試験品目が与えられた雄および雌において全般的にＬＬＯＱ（定量の下限、＝４９．９ｎｇ／ｍｌ）を下回っており、個々の動物が投与後２時間と８時間の間に時折ＬＬＯＱをわずかに上回る値を示したにすぎなかった。実測値は、投与量に比例していなかった。

同様の結果が、第４週および第１３週に観察され、より低い吸収発生率が検出された。これは、５ｍｇ／ｋｇ／日の試験品目が与えられた動物においてのみ投与後６時間と８時間の間にＬＬＯＱをわずかに上回る随時の値を示した雄における第４週、ならびに雌（５ｍｇ／ｋｇ／日のみの投与後４〜８時間の間にＬＬＯＱをわずかに上回る値）における第１３週に特に顕著であった。

媒体のみで処理されたグループの動物について検出可能な量を測定した。上記結果によれば１３週間にわたって毎日投与した後に蓄積が生じなかった。

結論
検査した試験品目の投与量（すなわち０．５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれにおいても悪影響は見られなかった。対照と比較した場合に、処理された動物に観察された軽微な白血球減少症は、規模が小さく、全般的に投与量に関連せず、いずれの巨視的変化によっても裏付けされていなかったため、毒性的に重要であると見なされなかった。したがって、５ｍｇ／ｋｇ／日の高投与量は、１３週間にわたってラットに毎日皮膚投与した後に、試験品目についての最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）であると考えられる。

血漿サンプル分析の結果は、試験品目が皮膚経路を介して最小限しか吸収されないことを示していた。

実施例９：ウサギにおける１３週間の皮膚毒性試験およびその後の４週間の回復期間
１３週間にわたって０．５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で毎日皮膚投与した後のラビットにおいて試験品目の毒性を調査し、４連続週の期間にわたるあらゆる潜在的処理関連効果からの回復を調査した。

それぞれ６匹の雄および６匹の雌のニュージーランドホワイトＳＰＦ（指定病原体無感染）ウサギの３つのグループ（雄に偶数番号が付され、雌に奇数番号が付された、第３表参照）は、１３連続週間にわたって０．５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で皮膚投与により試験品目が与えられた（第３表：それぞれグループ番号２〜４）。第４の同様に構成されたグループは、媒体（精製水）のみが与えられ、対照としての役割を果たした（第３表：グループ番号１）。対照および高投与量グループ（表３、それぞれグループ番号４および１）は、回復評価のための性別毎に３匹のさらなる動物を含んでいた。

グループ識別番号および処理を以下の第３表に要約する。

毎日の臨床的徴候、体重、食餌消費量、処理部位の巨視的所見、臨床的病状調査、最終体重、臓器質量、死後の巨視的観察および組織病理検査の調査を実施した。毒物動態評価のために１日目および第１３週に各動物から血液サンプルを採取した。

処理部位を投与開始の約３時間後に毎日検査した。近隣の未処理の皮膚と比較した場合の部位の刺激に、以下の表に従って数値を割り当てた。

結果
試験を通じて治療に関連する死亡は発生せず（回復対照グループの１匹の雄が試験の２９日目に人為的に屠殺された）、処理に関連する臨床的徴候は観察されなかった。

処理部位の巨視的観察により刺激の徴候は観察されなかった。

関連する体重変化は、試験を通じて記録されず、処理動物の食餌消費量は、対照と同等であった。

処理期間の終了時に実施した眼検査において、処理に関連する病変は検出されなかった。

血液学および臨床化学では、毒性的有意性の変化は記録されなかった。

毒物動態に関することについては、第１週に２．５ｍｇ／ｋｇ／日の試験品目が与えられた雄の大多数および５ｍｇ／ｋｇ／日が与えられた雌において試験品目の血漿濃度がＬＬＯＱ（定量の下限、＝５１．３０ｎｇ／ｍｌ）をわずかに上回った。０．５および５ｍｇ／ｋｇ／日が投与された個々の雄の動物のみが時折ＬＬＯＱをわずかに上回る値を示した。吸収の発生率は、雄の方が雌と比較してわずかに高かった。吸収は、投与量に比例していなかった。

第１３週にも非常に低い吸収が観察された。ＬＬＯＱを上回る値は、全般的に、投与後２〜２４時間の間で報告された。吸収は、雄より雌の方がわずかに大きかった。

媒体のみで処理された動物については検出可能な量が測定されなかった。

上記結果によれば１３週間にわたる毎日の投与後に蓄積が生じなかった。

最終体重は、対照グループと処理グループの間で同等であり、毒性的有意性の絶対的および相対的臓器質量の変化は観察されなかった。

巨視的観察および微視的観察後に処理に関連する変化は認められなかった。

結論
検査した試験品目の投与量（すなわち０．５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれにおいても悪影響は見られなかった。したがって、５ｍｇ／ｋｇ／日の高投与量は、１３週間にわたってウサギに毎日皮膚投与した後に、試験品目についての最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）であると考えられる。

血漿サンプル分析の結果は、試験品目が皮膚経路を介して最小限しか吸収されないことを示していた。

実施例１０：ラットにおける急性静脈内毒性試験
実施例３の結合体の急性毒性を、スプラーグドーリーラットへの一回投与量の静脈内投与（生理食塩水中１０ｍｌ／ｋｇ）後に調査し、その後に１４日間の観察期間を設けた。

５匹の雄および５匹の雌の動物の単一グループに２０００ｍｇ／ｋｇを投与した。体重１ｋｇ当たり１０ｍｌの投与容量で、好適な容量のシリンジに装着された皮下注射針を使用する尾静脈への注射によって、選択されたレベルの調合試験品目をその調製の直後に動物に投与した。試験全体を通じて、すべての動物を毎日２回検査した。

動物を処理に対する反応の徴候について、投与時、１日目の投与の約３０分、２および４時間後、次いで全体で１４日間にわたって毎日検査した。試験に割り当てた日、投与日（１日目）、ならびに２、８および１５日目に各動物の体重を測定した。観察期間の終了時にすべての動物を屠殺し、解剖検査した。

試験を通じて、雄および雌の動物の双方に死亡が発生しなかった。投与の日にすべての動物に観察された臨床的徴候は、活動および立毛の低下であった。一匹の雌において、試験の第２週を通じて背部の脱毛が認められた。

試験の終了時に観察された体重の変化は、この種族および年齢の動物について想定範囲内であった。検屍検査ではいずれの動物にも内部異常は検出されなかった。注射部位に異常が観察されなかった。

これらの結果は、結合体が、体重１ｋｇ当たり２０００ｍｇの投与量で一回静脈投与した後にラットに毒性効果をもたらさなかったことを示している。動物に軽度の臨床的徴候しか観察されなかった。試験品目は、試験した投与量で尾静脈に注射された場合に局部的に許容された。

実施例１１：Ｌ５１７８Ｙ ＴＫ^+/-マウスリンパ腫細胞の変異（変動法）
変動法を使用して、Ｓ９代謝活性の不在下および存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ処理後のマウスリンパ腫Ｌ５１７８Ｙ細胞の５−トリフルオロチミジン耐性変異体の誘発に対してアッセイすることによって、試験品目を変異誘発活性について調査した。この方法は、遺伝子変位、染色体異常誘発および異数性誘発効果を検出することができる。

この試験に使用した変異アッセイ方法は、毒性チミジン類似体トリフルオロチミジン（ＴＦＴ）に対して耐性になったＬ５１７８Ｙコロニーの識別に基づく。この類似体は、酵素チミジンキナーゼ（ＴＫ）によって、ＴＫ競合細胞の死をもたらす核酸合成に使用されるヌクレオシドに代謝され得る。

ＴＫ遺伝子の変異を介して生じることが想定されるＴＫ欠損細胞は、トリフルオロチミジンを代謝することができないため、その存在下で生存および成長することができない。

Ｌ５１７８Ｙマウスリンパ腫において、ＴＫ酵素に対してコードする遺伝子は、染色体１１上に存在する。ＴＫ部位（ＴＫ＋／−）において異型接合性である細胞は、単一ステップの順方向変異を生じて、ＴＫ活性がほとんどまたは全く維持されないＴＫ−／−遺伝子型になる。

使用した細胞、すなわちＬ５１７８Ｙ ＴＫ＋／−は、メチルコラントレンによってＤＢＡ／２マウスに誘発された胸腺腫瘍に由来する２つのクローンの一方から誘導される。Ｌ５１７８Ｙマウスリンパ腫細胞におけるＴＫ変異系の使用は、十分に特徴づけられ、検証され（Ｃｌｉｖｅ Ｄ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＯ，Ｓｐｅｃｔｏｒ ＪＦ，Ｂａｔｓｏｎ ＡＧ，Ｂｒｏｗｎ ＭＭ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ５１７８Ｙ／ＴＫ＋／− ｍｏｕｓｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｍｕｔａｇｅｎ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ．１９７９ Ｊａｎ；５９（１９）：６１−１０８）、たいていの管理機関によって認可されている。

マウスリンパ腫アッセイは、小形または大形と呼ばれるＴＦＴ耐性コロニーの二峰性のサイズ分布をしばしばもたらす。活性対立遺伝子内の点変異および欠失（遺伝子内事象）は、大形コロニーをもたらすと推定された。小形コロニーは、一部に、活性ＴＫ対立遺伝子だけでなく、その発現が細胞の成長速度をモジュレートするフランキング遺伝子にも影響を与える病変に起因する。

試験品目は、５０．０ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０完全培地に可溶であることが判明した。

予備的な細胞毒性アッセイを実施した。溶解度の結果に基づいて、Ｓ９代謝の不在下または存在下で５０００μｇ／ｍｌの最大投与量にて試験品目をアッセイした。広範囲のより低い投与量、すなわち２５００、１２５０、６２５、３１３、１５６、７８．１、３９．１および１９．５μｇ／ｍｌを処理系列に含めた。

Ｓ９代謝活性化の不在下で、短い処理時間を用いると、投与量と無関係に、いくつかの濃度において相対的生存率のわずかな低下が認められた。長い処理時間を用いると、同時的な負の対照値の約６０％において相対的生存率を低下させる２つのより高い濃度で毒性が観察された。

Ｓ９代謝活性化の存在下では、試験したいずれの濃度においても関連する毒性が観察されなかった。

予備的な試験で得られた毒性の結果に基づいて、５−トリフルオロチミジン耐性への変異についての２つの独立したアッセイを、以下の第４表に記載の投与量を使用して実施した。

Ｓ９代謝の不在または存在下で、試験品目による処理の後に関連する変異体頻度の増加が観察されなかった。

Ｓ９代謝の不在下および存在下で各変異実験に溶媒および正対照処理を含めた。溶媒対照培養における変異体頻度は、正常な範囲内にある。正対照処理で顕著な増加が得られ、アッセイ系が正確に機能していることが示された。

試験品目は、報告された実験条件下において、Ｓ９代謝活性化の不在下または存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏ処理した後に、マウスリンパ腫Ｌ５１７８Ｙ細胞に変異を誘発しないと結論づけられた。

実施例１２：細菌（ネズミチフス菌および大腸菌）における光変異誘発アッセイ
露光後、原核生物であるネズミチフス菌および大腸菌における原栄養性への逆変異のアッセイを行うことによって試験品目を光変異誘発活性について調査した。

３つのネズミチフス菌テスター菌株であるＴＡ１５３７、ＴＡ９８およびＴＡ１００、ならびに大腸菌テスター菌株であるＷＰ２を使用した。軟寒天にて試験品目と共培養された細菌に様々な量のＵＶ光を照射した。

採用した手順は、Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．１９７５によって開発され、Ｍａｒｏｎ ａｎｄ Ａｍｅｓ、１９８３によって修正された。

試験品目を無菌蒸留水の水溶液として使用した。

試験品目を５０００μｇ／プレートの最大投与量ならびにほぼ半対数間隔をおいた４つのより低い濃度：１５８０、５００、１５８および５０．０μｇ／プレートにて毒性試験でアッセイした。最大許容投与量に基づいて細菌テスター菌株毎に２つの広い間隔のＵＶ量を選択した。いずれの試験品目濃度においても、またはいずれのＵＶ放射線量においても関連する毒性は観察されなかった。

プレート挿入法を使用して、２つの独立した実験を実施した。

試験品目を５０００μｇ／プレートの最大投与量ならびに２倍希釈による間隔の４つのより低い投与量：２５００、１２５０、６２５および３１３μｇ／プレートにてアッセイした。調製したプレートを以下のＵＶＡおよびＵＶＢ量に曝露した（第５表）。

結果
試験品目は、試験品目のいずれの投与量においても、いずれのテスター菌株においても、いずれのＵＶ放射線量においても、バックグラウンドのＵＶ効果と比較して復帰変異体コロニーの数の２倍の増加を誘発しなかった。

結論
試験品目は、処理がＵＶ光の存在下で実施された場合に、ネズミチフス菌または大腸菌に逆変異を誘発しないと結論づけられる。

実施例１３：ｉｎ ｖｉｔｒｏのチャイニーズハムスタ卵巣細胞における染色体異常（光変異誘発アッセイ）
ＵＶＡ／ＵＶＢ放射線の不在下および存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理の後でチャイニーズハムスタにおける染色体損傷を引き起こす可能性について試験品目をアッセイした。

染色体損傷についての１つのアッセイを紫外光の不在下および存在下で５０００、２５００、１２５０、６２５、３１３、１５６、７８．１および３９．１μｇ／ｍｌの投与量にて実施した。

試験品目の溶液をハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で調製した。

ＵＶ光の不在下および存在下の双方において、細胞を３時間にわたって処理し、約１．５細胞周期に対応する２０時間の収穫時間を使用した。

実験には、適切な負対照および正対照を含めた。各試験点において２つの細胞培養物を調製した。

収穫時の細胞計数の減少によって測定される試験品目処理の細胞毒性に基づく染色体異常の評価のために投与量を選択した。

全投与量範囲にわたって顕著な毒性が観察されなかったため、評価のために選択された投与量は、ＵＶ光の不在下および存在下の双方において５０００、２５００および１２５０μｇ／ｍｌであった。

１００個の中期延展体を、各培養物の染色体異常について評価した。

結果
試験品目による処理後に、関連する対照値と比較した、ギャップを包含または排除する、異常を有する細胞の発生率の統計的に有意な増加は、紫外光の不在下または存在下において観察されなかった。

（ギャップを包含および排除する）異常を有する細胞の数の統計的に有意な増加は、正対照のミトマイシン−Ｃおよび８−メトキシプソラレンによる処理の後に観察され、試験系が正確に機能していることが示された。

結論
これらの結果によれば報告された実験条件下で、試験品目は、ＵＶ光の不在下または存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ処理の後にチャイニーズハムスタ卵巣細胞に染色体異常を誘発しないと結論づけられる。

実施例１４：Ｂａｌｂ／Ｃ３ｔ３細胞光毒性アッセイ（ニュートラルレッド取込み）
試験品目の潜在的ｉｎ ｖｉｔｒｏ光毒性を、異なる投与量の試験品目で処理され、ＵＶＡ放射線に曝露されたＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞に対する細胞毒性についてのニュートラルレッド取込みの測定によって評価した。アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）を使用して試験品目溶液を調製した。

主要アッセイに向けて適切な投与量を選択するために、光の存在下（＋ＵＶＡ）および不在下（−ＵＶＡ）での予備的な投与量範囲判定実験を実施した。１０００μｇ／ｍｌの最大投与量（試験プロトコルで示される上限）ならびに広範なより低い投与量：５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６および７．８１μｇ／ｍｌで試験品目をアッセイした。ＵＶＡ放射線の存在下および不在下の双方のＩＣ₅₀値を計算しなかったため、光刺激係数（ＰＩＦ）値を計算することもできなかった。この場合、その化学物質は、光無毒性であると見なされる。同じ投与量範囲を主要アッセイに使用した。

１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、１５．６および７．８１μｇ／ｍｌの投与量を使用して主要実験を実施した。ＵＶ光の存在下および不在下での生存率曲線が同様のプロファイルを示し、予備的な投与量判定実験で得られた結果が裏づけられた。両曲線についてのＩＣ₅₀値が存在しなかったため、光刺激係数（ＰＩＦ）値を計算することができなかった。平均光効果（ＭＰＥ）は、光無毒性範囲内の０．０８９であった。

この実験は、明らかに負の結果をもたらしたため、さらなる実験を実施しなかった。

正対照のクロルプロマジンは、２１．９のＰＩＦ値で許容し得る正の応答を誘発し、アッセイ系が正確に機能していることを示した。

非計算可能ＰＩＦまたはＭＰＥ＜０．１は、得られた結果に基づいて、「光無毒性」を予測するため、試験品目は、報告した実験条件下で「光無毒性」として分類されるべきであると結論づけられる。

実施例１５：モルモットにおける試験品目０．１％クリームの光刺激／光感作試験
紫外光への曝露を伴う皮膚に対する局所投与後に光アレルギーおよび／または光刺激反応を引き起こす試験品目０．１％クリームの可能性を、モルモットモデルを使用して評価した。

試験を２つの段階に分割した。

第１の段階では、試験品目の光刺激特性の評価を６つのグループの動物において実施した。これらを使用して、感作アッセイにおける使用のための試験品目の好適な濃度を確定するとともに、光誘発刺激に関する情報を提供した。動物を以下のように処理した（第６表）。

試験の第２の段階は、全部で５つのグループを以下のように処理した感作の評価であった（第７表）。

光刺激
それぞれ対照および試験品目、クリーム偽薬ならびに試験品目０．１％クリームで処理されたそれぞれ５匹の動物の２つの（照射）グループ（第６表、グループ１および３参照）、ならびに照射されないことを除いては同様に処理された２つの同様に構成されたグループ（第６表、グループ２および４参照）を使用して、光刺激試験を実施した。希釈されていない試験および対照品目のアリコット（１００％）、試験および対照品目の２つの濃縮物（精製水中２０％および５０％）ならびに媒体のみ（精製水）を、予め動物の背部に準備した所定の皮膚部位に均一に散布した。照射グループ（グループ１および３）の動物を、投与後に、ＵＶＡ（１０ジュール／ｃｍ²）およびＵＶＢ（０．１ジュール／ｃｍ²）放射線に曝露した。５匹の試験（照射）および５匹の対照（非照射）動物（第６表、それぞれグループ６および５参照）において０．００１％、０．０１％および０．１％の濃度で同じ方法を使用して、正対照基準物質の８−メトキシプソラレンを調査した。対照品目、試験品目または基準品目に対する曝露の約１、４、２４、４８および７２時間後に、処理部位を処理に対する刺激反応の形跡について調査した。

結果
１／５の動物において、試験品目０．１％クリームで処理され、ＵＶ照射された部位に軽微な刺激が観察された。試験品目で処理されたが、ＵＶ照射されていない４／５の動物に軽微または明確な反応が観察された。

対照品目（クリーム偽薬）で処理され、ＵＶ照射されていない１／５の動物にも軽微な反応が観察された。

媒体のみで処理された部位には反応が観察されなかった。

試験品目で処理された動物に観察された刺激反応は、ＵＶ照射動物にも、より高重度で非照射動物にも認められたため、光誘発されたものではなかった。

対照品目で処理された非照射動物にも軽微な随時の反応が観察された。

正対照基準品目の８−メトキシプソラレンで処理され、次いで紫外光に曝露された動物は、調査した２つのより高い濃度、すなわち０．０１％および０．１％で処理された部位に明確な、または中程度の紅斑および軽微な浮腫を示した。８−メトキシプソラレンに曝露され、後にＵＶ光に曝露されなかった動物には応答が見られず、観察された応答は、光誘発されたものであることが証明された。

光感作
対照品目および試験品目で刺激された１０匹の動物の２つのグループ（第７表、グループ８および９参照）、および選択された媒体（精製水）で刺激された１０匹の動物の１つの対照グループ（第７表、グループ７参照）を使用して光感作試験を実施した。感作を誘発させるために、フロインド完全アジュバントのエマルジョンを動物に皮内注射した。１００％濃度の試験および対照品目をＦＣＡの注射部位の間の領域に２週間にわたって全部で６回局所的に投与した。投与後に、動物をＵＶＡ（１０ジュール／ｃｍ²）およびＵＶＢ（０．１ジュール／ｃｍ²）放射線の双方に曝露した。対照グループの動物を同様にして処理したが、選択された媒体（精製水）を試験または対照品目の代わりに使用した。最終誘発曝露の約２週間後に、媒体ならびにそれぞれ２０％および５０％濃度の試験または対照品目の局所投与によってすべての動物を攻撃した。これらの濃度は、光刺激試験で得られた結果に基づいて、紫外線照射に関連して皮膚に対して刺激性がないと考えられたため選択された。投与後に、２つの試験グループおよび対照グループの動物をＵＶＡ（１０ジュール／ｃｍ²）およびＵＶＢ（０．１ジュール／ｃｍ²）放射線の双方に曝露した。各動物のさらなる部位を媒体および試験または対照品目の双方で局所的に処理したが、処理後に紫外線照射に曝露しなかった。攻撃曝露の約２４、４８および７２時間後に、処理部位を処理に対する反応の形跡について調査した。

正対照基準品目のムスクアンブレットを、同じ方法を使用して調査して、試験系の有効性を証明した。５匹の動物の１つのグループ（第７表、グループ１１参照）をアセトン中１５％の濃度のこの物質で誘発した。３匹の動物の対照グループ（第７表、グループ１０参照）を媒体（アセトン）のみで同様にして処理した。アセトン中基準品目（ムスクアンブレット）の１０％の濃度をその攻撃のために選択した。

結果
５０％濃度の対照品目、クリーム偽薬で攻撃した後に、紫外線照射すると、グループ（グループ８）の１０／１０の動物において対照品目に対する応答が生じた。対照品目に対する応答は、グループ８の６／１０の動物において、処理されたが照射されなかった部位に観察された。５／５の対照グループの動物（グループ７）において攻撃時に対照品目で処理された後に紫外線照射された部位、そして４／５の対照動物において対照品目で処理されたが照射されなかった部位にも反応が観察された。媒体のみに対する反応は観察されなかった。

２０％濃度の試験品目０．１％クリームで攻撃した後に、紫外線照射すると、グループ（グループ９）の８／１０の動物において試験品目に対する応答が生じた。グループ９の動物において処理されたが照射されなかった部位に、試験品目に対する応答が観察されなかった。５／５の対照グループの動物（グループ７）において攻撃時に試験品目で処理された後に紫外線照射された部位、そして１／５の対照動物において対照品目で処理されたが照射されなかった部位にも反応が観察された。媒体のみに対する反応は観察されなかった。

上記結果によれば、試験で処理された動物にも対照品目で処理された動物にも応答が観察されなかった。（試験品目で刺激されなかった）対照グループの動物に観察された反応は、感作でなく物質の刺激効果によるものであった。加えて、反応は、ＵＶ照射されなかった部位にも観察された。

このため、５％のより低い濃度で試験および対照品目を用いて第２の攻撃（再攻撃）を実施した。

５％濃度の試験および対照品目で再攻撃された後、紫外線照射されたグループ８および９のいずれの動物にも応答が観察されなかった。グループ８または９の動物において処理されたが照射されなかった部位に、試験または対照品目に対する応答が観察されなかった。攻撃時に対照または試験品目で処理された対照グループの動物（グループ７）において、いずれの部位にも反応が観察されなかった。媒体のみに対する反応は認められなかった。

正対照動物を１０％濃度の基準品目（ムスクアンブレット）で攻撃した後、紫外線照射すると、グループ（グループ１１）の４／５の動物において応答（非常に軽微または軽微な紅斑）が生じた。グループ１１の動物において処理されたが照射されなかった部位に基準品目に対する応答が観察されなかった。媒体で刺激されたグループ１０の動物に基準品目に対する応答が観察されなかった。これは、試験系が、物質の光アレルギー特性を検出できることを示している。

結論
得られた結果は、試験品目０．１％クリームが、紫外光を伴う皮膚曝露後に光刺激または光アレルギー応答を引き起こし得ることを示すものではない。

Claims (40)

1. 式（Ｉ）
   

   

   ［式中、
   Ｒ¹およびＲ²は、同一の、または異なる残基であり、それぞれ独立して、
   （ａ）水素、ハロゲン、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アシル、ニトロ、カルバモイル、低級アルキルアミノカルボニル、−ＮＲ⁵Ｒ⁶［式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、それぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アラルキル、置換もしくは非置換低級アルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換低級アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、カルバモイル、アシルから選択され、またはＲ⁵およびＲ⁶は、窒素原子と一緒になって複素環基を形成する］、
   （ｂ）−ＣＯ（ＣＨ₂）_jＲ⁴［式中、ｊは、１〜６であり、Ｒ⁴は、
   （ｉ）水素、ハロゲン、−Ｎ₃
   （ｉｉ）−ＮＲ⁵Ｒ⁶［式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、上記定義の通りである］
   （ｉｉｉ）−ＳＲ⁷［式中、Ｒ⁷は、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アラルキル、−（ＣＨ₂）_aＣＯ₂Ｒ¹⁰（式中、ａは、１または２であり、Ｒ¹⁰は、水素および置換もしくは非置換低級アルキルからなる群から選択される）および−（ＣＨ₂）_aＣＯ₂Ｒ⁵Ｒ⁶からなる群から選択される］、
   （ｉｖ）−ＯＲ⁸、−ＯＣＯＲ⁸［式中、Ｒ⁸は、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択される］からなる群から選択される］、
   （ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ₂）_jＲ⁴［式中、ｊおよびＲ⁴は、上記定義の通りである］、
   （ｄ）−（ＣＨ₂）_dＣＨＲ¹¹ＣＯ₂Ｒ¹²または−（ＣＨ₂）_dＣＨＲ¹¹ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶［式中、ｄは、０〜５であり、Ｒ¹¹は水素、−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶または−ＣＯ₂Ｒ¹³であり、Ｒ¹³は、水素または置換もしくは非置換低級アルキルであり、Ｒ¹²は、水素または置換もしくは非置換低級アルキルである］、
   （ｅ）−（ＣＨ₂）_kＲ¹⁴［式中、ｋは２〜６であり、Ｒ¹⁴は、ハロゲン、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、−ＣＯＯＲ¹⁵、−ＯＲ¹⁵（式中、Ｒ¹⁵は水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリールまたはアシルである）、−ＳＲ⁷（式中、Ｒ⁷は上記定義の通りである）、−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶、−ＮＲ⁵Ｒ⁶（式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、上記定義の通りである）または−Ｎ₃である］、
   （ｆ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₂）_mＲ¹⁶［式中、ｍは、０〜４であり、Ｒ¹⁶は、水素、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換低級アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、−ＣＯＯＲ¹⁵、−ＯＲ¹⁵（式中、Ｒ¹⁵は上記定義の通りである）、−ＣＯＮＲ⁵Ｒ⁶または−ＮＲ⁵Ｒ⁶（式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は、上記定義の通りである）である］、
   （ｇ）−ＣＨ＝Ｃ（ＣＯ₂Ｒ¹²）₂［式中、Ｒ¹²は上記定義の通りである］
   （ｈ）−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ₂）_nＲ¹⁶［式中、ｎは０〜４であり、Ｒ¹⁶は上記定義の通りである］、
   （ｉ）−ＣＨ₂ＯＲ²²［式中、Ｒ²²は、３つの低級アルキル基が同一であるか、もしくは異なるトリ低級アルキルシリルであるか、またはＲ²²はＲ⁸と同じ意味を有する］、
   （ｊ）−ＣＨ（ＳＲ²³）₂および−ＣＨ₂−ＳＲ⁷［式中、Ｒ²³は、低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニルであり、Ｒ⁷は、上記定義の通りである］からなる群から選択され、
   Ｒ₃は、水素、ハロゲン、アシル、カルバモイル、置換もしくは非置換低級アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換低級アルキニルまたはアミノであり、
   Ｗ¹およびＷ²は、独立して、水素、ヒドロキシであり、またはＷ¹およびＷ²は、一緒になって酸素を表し、
   Ｘは、ポリマー部分である］のインドロカルバゾール化合物のポリマー結合体を製造するための方法であって、
   一般式（ＩＩ）
   

   

   ［式中、
   Ｘは、上記定義の通りである］のω−１Ｈ−イミダゾール−カルボキサミドポリマー化合物と、一般式（ＩＩＩ）
   

   

   ［式中、
   Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂は、上記定義の通りであり、保護基により場合によって保護されており、Ｙは脱離基を表す］のインドロカルバゾール化合物とを反応させることを含み、式（Ｉ）の化合物を得るために、更に場合によって、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂基を脱保護することを含む前記方法。
2. 有機溶媒中塩基の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
3. 前記塩基と式（ＩＩＩ）の化合物とのモル比は、約１：１〜約４：１、好ましくは約１：１〜約１．５：１、より好ましくは約１：１である、請求項２に記載の方法。
4. 前記塩基は、アルカリ金属水素化物からなる群から選択され、特に水素化ナトリウムである、請求項２または３に記載の方法。
5. ジクロロメタン、クロロホルムおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの群から選択される有機溶媒、好ましくは無水有機溶媒中で実施される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
6. 不活性ガス雰囲気下、好ましくは窒素またはアルゴン雰囲気下で実施される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
7. ０℃の初期工程後に−１０〜６０℃、好ましくは２５℃までの、最も好ましくは室温で実施される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
8. 式（Ｉ）のポリマー結合体化合物は、クロマトグラフィー精製によって直接得られる、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
9. 式（Ｉ）のポリマー結合体化合物の精製は、好ましくは、ジクロロメタン、水、メタノール、アセトニトリル、異なる混合比のギ酸アンモニウム緩衝液から選択される溶媒中で実施される、請求項８に記載の方法。
10. 式（ＩＩＩ）の化合物の質量に基づいて、約４０質量％〜約９５質量％、好ましくは約５０質量％〜約９５質量％の式（Ｉ）の化合物の収率をもたらす、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
11. 脱離基Ｙは、トリフレート、トシレート、メシレート、スルフェート、ハロゲン、ヒドロキシまたは低級アルコキシ基から選択される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
12. 脱離基Ｙは、低級アルコキシ基、好ましくはメトキシ基である、請求項１０に記載の方法。
13. ポリマーＸは、ポリ（アルキレンオキシド）、特に（ポリエチレン）オキシドから選択される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
14. ポリマーＸは、好ましくは、メトキシ−ポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）などの末端がアルコキシで置換されたポリエチレングリコールから選択される（ポリエチレン）グリコール（ＰＥＧ）である、請求項１３に記載の方法。
15. ポリマーＸは、約１００〜約１０００００Ｄａ、好ましくは約２００〜約５００００Ｄａの分子量を有する、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
16. ポリマーＸは、平均分子量が約５００〜約１００００Ｄａ、例えば約５５０Ｄａ、約１１００Ｄａ、約２０００Ｄａまたは約５０００Ｄａの（ポリエチレン）グリコール、例えばｍＰＥＧである、請求項１４または１５に記載の方法。
17. Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂が水素である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
18. 式（Ｉ）
    

    

    ［式中、
    Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁、Ｗ₂およびＸは、請求項１または請求項１３から１６までのいずれかに定義されている通りである］のインドロカルバゾール化合物、またはその製剤学的に認容性の塩のポリマー結合体。
19. Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｗ₁およびＷ₂が水素である、請求項１８に記載のポリマー結合体。
20. ポリマーＸは、平均分子量が約５００〜約１００００Ｄａ、例えば約５５０Ｄａ、約１１００Ｄａ、約２０００Ｄａまたは約５０００Ｄａの（ポリエチレン）グリコール、例えばｍＰＥＧである、請求項１８または１９に記載のポリマー結合体。
21. 医薬に使用するための、請求項１８から２０までのいずれか一項に記載ポリマー結合体。
22. 局所投与のための医薬に使用するための、請求項２１に記載のポリマー結合体。
23. 例えば注射、注入または吸入による全身投与のための医薬に使用するための、請求項２１に記載のポリマー結合体。
24. 請求項１８から２０までのいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリマー結合体を、場合によって製剤学的に認容性の担体、助剤、希釈剤および／または添加剤とともに含む、医薬組成物。
25. 診断および／または治療用途のための、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. ＨＭＧＢ１関連病状の予防、緩和および／または治療のための医薬を製造するための、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載のポリマー結合体の使用。
27. ＨＭＧＢ１関連病状は、狭窄、再狭窄、アテローム硬化症、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患、腫瘍、感染性疾患、敗血症、急性炎症性肺傷害、紅斑性狼瘡、神経変性疾患、中枢および末梢神経系の疾患ならびに多発性硬化症から選択される、請求項２６に記載の使用。
28. 前記ポリマー結合体は、医療デバイスの表面に可逆的に固定される、請求項２６または２７に記載の使用。
29. 中枢および末梢神経系の神経障害、神経疾患および神経変性障害の予防、緩和および／または治療のための医薬を製造するための、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載のポリマー結合体の使用。
30. 皮膚病の予防、緩和および／または治療のための医薬を製造するための、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載のポリマー結合体の使用。
31. 前記皮膚病は、ケラチノサイトの過剰増殖によって特徴づけられる、請求項３０に記載の使用。
32. 前記皮膚病は、乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性湿疹、ざ瘡、毛孔性紅色粃糠疹、ケロイド、過形成性瘢痕および皮膚腫瘍である、請求項３０または３１に記載の使用。
33. 前記皮膚病は乾癬である、請求項３２に記載の使用。
34. 前記医薬は、局所投与のために製造される、請求項３０から３３までのいずれか一項に記載の使用。
35. 前記投与は、リポソームの形で実施される、請求項３４に記載の使用。
36. ＮＧＦ関連疼痛および痛覚過敏症の予防、緩和および／または治療のための医薬を製造するための、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載のポリマー結合体の使用。
37. 炎症性疾患、自己免疫疾患、全身性炎症応答症候群、臓器移植後の再潅流傷害、心臓血管疾患、産科および婦人科疾患、感染性疾患、アレルギー性およびアトピー性疾患、固形および液体腫瘍病状、移植片拒絶疾患、先天性疾患、皮膚疾患、神経疾患、悪液質、腎臓疾患、医原性中毒状態、代謝性および特発性疾患、ならびに眼科疾患の予防、緩和および／または治療のための医薬を製造するための、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載のポリマー結合体の使用。
38. ベーチェット病、シェーグレン症候群、血管炎、ブドウ膜炎、網膜炎の予防、緩和および／または治療のための医薬を製造するための、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載のポリマー結合体の使用。
39. 前記医薬は、全身投与に向けられる、請求項３６から３９までのいずれか一項に記載の使用。
40. 少なくとも１つの抗炎症薬と組み合わせた、請求項２６から３９までのいずれか一項に記載の使用。

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