CN114269346A - 用于治疗和预防纤维化疾病状态和癌症的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于将M2样巨噬细胞重新编程为M1样巨噬细胞的化合物、药物组合物和方法，所述重新编程逆转了在纤维化疾病和某些癌症过程中观察到的抗纤维化至促纤维化转变。所述化合物包含靶向细胞的模式识别受体的免疫调节剂，并且通过掺入靶向部分(例如，叶酸盐或其功能片段或类似物)而对所关注细胞具有特异性。可以包括和工程化可释放和/或不可释放的连接基，以促进免疫调节剂的最佳递送。化合物和组合物可以用于一种或多种治疗纤维化疾病和/或癌症的方法中。

Description

用于治疗和预防纤维化疾病状态和癌症的化合物和方法
优先权
本申请涉及和要求以下项的优先权：a)于2019年7月8日提交的美国临时专利申请号62/871,686；和b)于2019年7月9日提交的美国临时专利申请号62/872,146。上述申请的内容据此以全文引用的方式并入本公开中。
技术领域
本公开涉及用于使用一种或多种化合物治疗和预防纤维化疾病状态和/或癌症的化合物、药物组合物和方法，所述一种或多种化合物包含靶向部分并且将M2型巨噬细胞重新编程为M1型巨噬细胞。
背景技术
尽管许多纤维化疾病如特发性肺纤维化(IPF)很严重，但存在很少用于成功治疗的选择，并且常规可用的选择的几乎全部都被设计为减轻症状和延缓进展，而不是治愈基础疾病。例如，对于IPF，氧气疗法可以改善舒适度和生活方式，但对疾病进展几乎没有作用。类似地，虽然两种经FDA批准的药物(即吡非尼酮和尼达尼布(nintedanib))可能减慢疾病的发展，但两者都无法逆转现有的纤维化或停止进一步纤维化的产生。鉴于与许多纤维化疾病诸如IPF相关的高死亡率概率，因此亟需鉴定减慢或许甚至停止疾病进展的新策略。
此外，使用高效力的药物诸如丝裂霉素、紫杉醇和喜树碱，用化学疗法治疗癌症。在许多情况下，这些化学治疗剂显示出剂量响应效应，并且肿瘤抑制与药物剂量成比例。因此，侵袭性给药方案用于治疗肿瘤；然而，高剂量化学疗法由于对癌细胞的选择性差和对正常细胞的毒性而受到阻碍。缺乏肿瘤特异性是常规化学疗法需要克服的许多障碍之一。
尽管显然需要预防和治疗纤维化疾病和癌症两者，但这些病状仍然是全世界死亡和/或痛苦的重要原因，因为目前不存在可以治愈所述病状的有效治疗选择。此外，在药物或其他疗法可用的情况下，此类治疗通常采用高效力的药物，所述高效力的药物因为对所关注的纤维化细胞和/或癌细胞的选择性较差而对潜在受试者具有全身毒性的风险。需要的是不仅可有效破坏由激活的M2型(可替代地激活的)巨噬细胞引发的促纤维化和/或促生长因子周期的治疗，而且还能够以对相关细胞(无论是癌细胞还是其他经历纤维化疾病的细胞)的极高特异性来破坏所述促纤维化和/或促生长因子周期。
发明内容
在一些情形中，激活的M2表型巨噬细胞在纤维化疾病中起作用，例如通过分泌激活成纤维细胞以合成胶原和其他细胞外基质蛋白的促纤维化细胞因子。在某些情形中，这些巨噬细胞类似地导致在经历癌症的受试者中有问题的生长因子的释放。例如，此类生长因子可以促进癌性肿瘤的生长。此外，在一些情形中，巨噬细胞(例如同时)释放免疫抑制细胞因子。因此，巨噬细胞可以在促进纤维化疾病和/或癌症的建立和生长方面发挥重要作用。
特发性肺纤维化(IPF)是一种这样的纤维化疾病，例如，其是由胶原过度沉积引起的间质性肺病。在一些情形中，这种类型的纤维化导致肺的进行性僵硬化，并且在一些情形中，导致肺介导气体交换的能力的必然丧失。由于肺活量的这种进行性降低，估计IPF诊断后的中位存活时间仅为2.5-5年。在一些情形中，严重的相关病态(例如，慢性缺氧、疲乏、体重减轻、肌肉和关节疼痛、持续咳嗽和可动性丧失等)在病理学的后期阶段持续增加。在美国，每年诊断出约40000例新的IPF病例，并且大多数以死亡告终。
在一些情形中，源自组织驻留巨噬细胞或外周血单核细胞的激活的巨噬细胞通过分泌趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)、转化生长因子β1(TGFβ1)和/或血小板衍生生长因子(PDGF)来诱导成纤维细胞的激活。在一些情形中，这种激活促进成纤维细胞分泌胶原，其可以引起纤维化疾病和与之相关的癌症发展。在许多纤维化疾病的后期阶段，激活的巨噬细胞和肌纤维母细胞可以彼此交叉刺激，从而导致确保纤维化在整个肺部或身体的其他相关部分的蔓延的恶性循环。
在其他纤维化疾病中也观察到类似的病理。癌症还可涉及类似的免疫应答，诸如促进癌性肿瘤的生长(例如，归因于由激活的巨噬细胞分泌的生长因子)和/或促进癌性肿瘤中的胶原形成(例如，通过下游纤维化胶原产生，这可以通过阻断其药物渗透性而导致更难以治疗的癌性肿瘤)。
在一些实施方案中，本文提供了由式Q-L-T表示的化合物。在一些实施方案中，Q是叶酸盐受体结合配体的基团。在一些实施方案中，L是连接基。在一些实施方案中，T是toll样受体(TLR)激动剂的基团。在一些实施方案中，Q-L-T是其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，连接基是不可释放的连接基。在一些实施方案中，不可释放的连接基由下式表示：
Figure BDA0003510181380000021
在一些实施方案中，n为1-30。在一些实施方案中，n为1-24。在一些实施方案中，n为1-12。在一些实施方案中，n为1-3。在一些实施方案中，n为12。在一些实施方案中，n为3。
在一些实施方案中，w为0-5。在一些实施方案中，w为0-2。在一些实施方案中，w为1。
在一些实施方案中，TLR激动剂是toll样受体7(TLR7)激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂的基团具有由式X表示的结构：
Figure BDA0003510181380000031
在一些实施方案中，R1是-NH2或-NH-R1X。在一些实施方案中，R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000032
在一些实施方案中，R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：氢(H)、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基。在一些实施方案中，
Figure BDA0003510181380000033
是3-10元含氮(N)的非芳族单环或二环杂环。在一些实施方案中，R3是-OH、-SH、-NH2或-NH-R1X。在一些实施方案中，R1是-NH2或-NH-R1X；R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000034
Figure BDA0003510181380000035
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基，
Figure BDA0003510181380000036
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环；并且R3是-OH、-SH、-NH2或-NH-R1X。
在一些实施方案中，TLR激动剂的基团具有由式XX表示的结构：
Figure BDA0003510181380000037
在一些实施方案中，R1是-NH2或-NH-R1X。在一些实施方案中，R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000041
在一些实施方案中，R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基。在一些实施方案中，
Figure BDA0003510181380000042
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环。在一些实施方案中，X是CH、CR2或N。在一些实施方案中，R1是-NH2或-NH-R1X；R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000043
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基，
Figure BDA0003510181380000044
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环；并且X是CH、CR2或N。
在一些实施方案中，TLR7激动剂的基团具有由式XXX表示的结构：
Figure BDA0003510181380000045
在一些实施方案中，化合物还包含靶向部分与免疫调节剂或其药学上可接受的盐之间的连接基Ln，其中所述连接基Ln被构造成避免释放TLR7激动剂的游离形式，并且n是等于或小于50的整数。在一些实施方案中，连接基Ln包含聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物，n是选自范围1-32的整数，并且叶酸盐受体结合配体的基团是叶酸盐受体β(FBβ)结合配体。
在一些实施方案中，化合物具有由以下表示的结构：
Figure BDA0003510181380000051
在一些实施方案中，化合物具有由以下表示的结构：
Figure BDA0003510181380000052
在一些实施方案中，化合物具有由以下表示的结构：
Figure BDA0003510181380000061
在一些实施方案中，化合物具有由以下表示的结构：
Figure BDA0003510181380000062
在一些实施方案中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本公开的化合物，其中所述TLR7激动剂具有由式XX表示的结构。
在某些情形中，本文提供了治疗患有纤维化疾病状态或癌症的受试者的方法，所述方法包括使受试者的细胞与包含本文所述的化合物的至少一种化合物接触，其中所述免疫调节剂包含TLR 7、8或9的激动剂。
在一些实施方案中，本文提供了包含经由连接基与TLR激动剂附接的叶酸盐配体或其功能片段或类似物的化合物，所述TLR激动剂具有下式或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003510181380000071
在一些实施方案中，R1是胺基，R2是单键-NH-，并且R3是H、烷基、羟基基团或其任何其他取代基团，X是CH2、NH、氧(O)或硫(S)，并且连接基在R1、R2或R3处附接。
在一些实施方案中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的式中的任一者的化合物，其中所述连接基包含PEG连接基或PEG衍生物连接基，并且是在R3处附接的不可释放的连接基或是在R1、R2或R3处附接的可释放的连接基。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐选自氢溴化物、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、抗坏血酸盐、盐酸盐、酒石酸盐、三氟甲磺酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐或富马酸盐。
在一些实施方案中，本文提供了预防或治疗纤维化疾病状态的方法，所述方法包括使细胞与至少一种化合物(例如，由本文提供的式提供的任何化合物)接触，所述至少一种化合物包含经由连接基与叶酸盐配体或其功能片段或类似物附接的免疫调节剂或其药学上可接受的盐，其中所述免疫调节剂或其药学上可接受的盐靶向模式识别受体。在一些实施方案中，所述细胞包含经历纤维化疾病状态或处于经历纤维化疾病状态的风险下的受试者的细胞，并且使所述细胞与至少一种化合物接触还包括向所述受试者施用或应用治疗有效量的所述至少一种化合物。在一些实施方案中，受试者是经历IPF的患者，并且所述至少一种化合物通过静脉内、肌内、腹膜内、局部的方式或通过吸入施用于所述受试者。在一些实施方案中，纤维化疾病状态包括IPF或者肝、皮肤、膀胱、心脏、胰腺、前列腺或肾的纤维化疾病。
在一些实施方案中，所述方法还包括获得或已经获得来自所述受试者的样品；定量所述样品中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述一种或多种生物标志物中的每一种选自由以下组成的组：CCL18、精氨酸酶1(Arg1)、基质金属肽酶9(MMP9)、金属蛋白酶3(TIMP3)、白介素1β(IL-1β)、羟基脯氨酸、胶原、PDGF、TGFβ、叶酸盐受体β(FRβ)、肿瘤坏死F-α(TNFα)、干扰素γ(IFN-γ)、甘露糖受体(CD206)、分化簇163(CD163)、分化簇86(CD86)、白介素6(IL-6)、趋化因子10(CXCL10)和免疫干扰素(IFNα)；将所述样品中的所述一种或多种生物标志物中的每一种的表达水平与对照中的此类生物标志物的表达水平进行比较；并且如果CCL18、Arg1、MMP9、TIMP 3、IL-1β、PDGF、TGFβ、FRβ、CD206、CD163、羟基脯氨酸或胶原相对于对照的表达水平被上调或者TNFα、IFN-γ、IL-6、CXCL10、IFNα或CD86相对于对照的表达水平被下调或不表达，则向或已经向所述受试者施用治疗有效量的非缀合的激动剂或抑制剂。
在一些实施方案中，叶酸盐配体或其功能片段或类似物对FRβ具有特异性并且与细胞上的FRβ结合。
在一些实施方案中本文提供了包含与靶向细胞的模式识别受体的免疫调节剂或其药学上可接受的盐附接的靶向部分的化合物，所述靶向部分包含叶酸盐配体或其功能片段或类似物。
附图说明
考虑到本公开的各种示例性实施方案的以下详细描述，所公开的实施方案和本文中所含的其他特征、优点和方面以及实现它们的事物将变得显而易见。当结合附图时，将更好地理解此类详细描述，其中：
图1A示出了具有经由不可释放的连接基(例如，包含聚乙二醇(PEG)主链部分)与免疫调节剂(toll样受体7(TLR7)激动剂基团)附接的靶向部分(叶酸盐受体配体)的示例性化合物的化学结构。
图1B示出了具有经由可释放的连接基(例如，在其主链中包含二硫化物部分)与免疫调节剂(TLR7激动剂基团)附接的靶向部分(叶酸盐受体配体)的示例性化合物的化学结构，以及示例性药物释放机制。
图2示出了表示用于治疗经历纤维化疾病或癌症或处于经历纤维化疾病或癌症的风险下的受试者的方法的流程图。
图3A-3F示出了当在每种化合物的各种浓度下与示例性游离(非靶向)TLR7激动剂或示例性靶向(例如，具有叶酸盐受体结合配体)TLR7激动剂接触时从人M2型巨噬细胞测量的各种标志物水平的图形数据。在图3A-3C中所示的数据支持非靶向TLR7激动剂或靶向TLR7激动剂的施用成功地将M2型巨噬细胞重新编程至M1型巨噬细胞(即，下调M2型促纤维化巨噬细胞)，并且图3D-3F中所示的数据支持所测试化合物的施用上调M1型巨噬细胞；每个值表示每个组的平均值±S.D.；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.005，####P<0.0001；通过Dunnett多重比较检验，治疗组相对于M2未治疗组。
图4A-4E和图5A-5D示出了表示从与各种浓度的示例性游离或靶向TLR7激动剂一起孵育2小时(图4A-4E)或46小时(图5A-5D)的M2巨噬细胞测量的各种标志物水平的图形数据。图4A-4E和图5A-5D支持在施用游离和靶向TLR7激动剂后M2型促纤维化表型被下调。每个值表示每个组的平均值±S.D.；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.005，####P<0.0001；通过Dunnett多重比较检验，图4A-5D中的化合物1A和化合物1B治疗组相对于M2未治疗组。
图6A-6D示出了表示从用各种浓度的示例性游离和靶向TLR7激动剂治疗(i)48小时(图6A和6B)或(ii)2小时然后更换新鲜培养基并培养剩余46小时(图6C和6D)的M2巨噬细胞测量的各种标志物水平的图形数据。每个值表示每个组的平均值±S.D.；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.005，####P<0.0001；通过Dunnett多重比较检验，化合物1A和化合物1B治疗组相对于M2未治疗组。
图6E示出了支持THP-1(源自急性单核细胞性白血病患者的人单核细胞细胞系)诱导的巨噬细胞呈叶酸盐受体β(FRβ)阳性(FRβ+)的流式细胞术数据。
图6F示出了示例性靶向TLR7激动剂是稳定的。
图7A示出了从具有博来霉素(BM)诱导的实验纤维化并且使用抗小鼠FRβ抗体染色的小鼠获取的肺的染色图像，其中苏木精-伊红(H&E)染色在BM诱导肺损伤后第7天、第14天和第21天进行。
图7B示出了图7A的小图中的FRβ染色的定量。
图7C和7D示出了人特发性肺纤维化(IPF)肺组织(图7C)和健康人肺组织(图7D)的FRβ免疫组织化学(IHC)染色。
图7E示出了从用BM或不用(磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照)BM诱导实验性纤维化的小鼠获取并且用叶酸盐受体靶向荧光染料成像的小鼠组织/器官的图像。
图7F示出了具有BM诱导的实验性纤维化的小鼠的荧光激活细胞分选器(FACS)分析。
图8A展示了BM模型中的游离和靶向TLR7激动剂的治疗计划。
图8B-8G示出了从用图8A的BM模型治疗的小鼠测量促纤维化标志物水平(图8B-8D)和抗纤维化标志物水平(图8E-8G)。图8H示出了来自用图8A的BM模型治疗的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞数量。
图9A和9B示出了用非靶向和靶向TLR7药物治疗的具有肺纤维化的小鼠的存活曲线(图9A)和体重变化(图9B)。
图10A示出了作为纤维化的量度的肺组织羟基脯氨酸含量(μg/肺)。
图10B和10C示出了在图9A中具有H&E染色(图10B)和Masson三色(胶原)染色(图10C)的肺组织。
图11A和11B示出了用示例性靶向TLR7激动剂治疗的具有肺纤维化的小鼠的存活曲线(图11A)和体重变化(图11B)，每个值表示每个组的平均值±S.D.。
图12示出了本公开的示例性靶向TLR7激动剂对BM诱导的小鼠中纤维化的抑制的剂量依赖性效应。图12A示出了随时间推移与BM诱导的小鼠的体重有关的图形数据。图12B示出了用各种剂量的本文提供的示例性缀合物(例如，化合物1B)治疗的肺组织的羟基脯氨酸含量的测量。图12C示出了对具有各种染色的肺组织的组织学分析的图像。每个值表示每个组的平均值±S.D.；*P<0.05，**P<0.005，***<0.0005；通过斯氏t检验，盐水相对于媒介物组，治疗组相对于媒介物组。
图13A-13D示出了从根据本公开的方法用各种浓度的示例性靶向TLR7激动剂重新编程持续48小时的M2型巨噬细胞测量的各种标志物水平，并且每个值表示每个组的平均值±S.D.。
图14A-14C示出了从根据本公开的方法用各种浓度的示例性游离和靶向TLR7激动剂重新编程的M2型巨噬细胞测量的各种标志物水平。图14A-14C中所示的每个值表示每个组的平均值±S.D.；#P<0.05，##P<0.005，###P<0.0005，####P<0.0001；通过Dunnett多重比较检验，化合物3A、化合物3B和化合物3C治疗组相对于M2未治疗组。
图15示出了在用示例性游离和靶向TLR7激动剂治疗之后在图14A-14C的每组细胞中分泌的趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)蛋白质水平。
图16展示了用于BM鼠模型的方法学。
图17A和17B示出了本文提供的示例性靶向TLR7激动剂的纯度。
图18A-18F示出了来自图16的体内研究方法学的数据，包括存活曲线(图18A)、体重变化(图18B和18D)、存在BALF的细胞的浓度(图18C)、在活小鼠(图18E)和在所有小鼠(即包括活小鼠和在第21天前死亡的小鼠)(图18F)中的羟基脯氨酸浓度(μg HP/肺叶)。
图19示出了靶向和非靶向TLR7激动剂两者均将人单核细胞来源的促纤维化巨噬细胞重新编程为抗纤维化表型(图19A-19F)。平均值±SD。使用不配对双尾t检验(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)确定各组之间的统计学显著性。
图20示出了在用化合物1A与化合物1B治疗后在健康小鼠中的血浆细胞因子水平的比较(图20A-20F)。图20G示出了在用本文提供的示例性化合物治疗小鼠之后的体重变化，其中体重变化为在隔日给药期间的全身毒性的量度(n＝2)；平均值±SD。使用不配对双尾t检验(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)比较各组之间的统计学显著性。
图21示出了用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(细胞核；蓝色)、抗F4/80(巨噬细胞；红色)和抗甘露糖受体(CD206)染色的在图6中描述的健康肺和纤维化肺。
虽然本公开易受各种修改和替代形式的影响，但是其示例性实施方案在附图中以举例的方式示出并且在本文中进行详细描述。
具体实施方式
为了促进对本公开的原理的理解，现在将参考附图中示出的实施方案，并且将使用特定语言来描述相同的实施方案。然而，应当理解，这些实施方案的描述不旨在限制范围。相反，本公开旨在涵盖如由所附权利要求所限定的如在本申请的精神和范围内可包括的替代物、修改和等同物。如前所述，虽然此技术可以在一个或多个优选实施方案中展示和描述，但其组合物、化合物和方法可以包括许多不同的配置、形式、材料和附件。
在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对本公开的透彻理解。特定实例可以在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下实施，并且应当理解，本公开不限于特定生物系统、特定纤维化疾病或癌症或特定器官或组织，所述特定生物系统、特定纤维化疾病或癌症或特定器官或组织当然可以变化，但鉴于本文提供的数据仍然适用。
本公开的各种技术和机制有时将描述两个组分之间的连接(connection或link)。词语诸如附接、连接(linked)、偶联、连接(connected)和类似术语及其非自成一体的形态可互换使用，除非从上下文中说明了差异或另外变得清晰。这些词语和表述不一定表示直接连接，而是包括通过居间组分进行的连接。应当注意，两个组分之间的连接不一定意味着直接的不受阻碍的连接，因为多个其他组分可以驻留在注解的两个组分之间。因此，除非另有说明，否则连接不一定意味着直接的不受阻碍的连接。
此外，在可行且方便的情况下，附图和描述中使用相同的附图标记来指代相同或相似的部分或步骤。附图为简化的形式，而不是精确地按比例绘制。应当理解，本公开仅出于解释目的以这种方式呈现，并且本文所述的原理和实施方案可以应用于具有除本文具体描述之外的配置的化合物和/或组合物组分。实际上，明确地设想了本公开的组合物的组分和化合物可以定制以促进其期望的应用。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与化学和生物学领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本申请主题的实践或测试中，但在本文中描述了优选的方法和材料。另外，除非上下文清楚地指明，否则如本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。因此，例如，在化合物/组合物被“一个”烷基或芳基取代的情况下，所述化合物/组合物任选地被至少一个烷基和/或至少一个芳基取代。此外，除非另有具体说明，否则术语“约”是指百分比的值±10％和单位值的±1.0单位的范围；例如，“约1.0”是指从0.9至1.1的值的范围。
在某些实施方案中，本公开的化合物、组合物和方法可用于预防和/或治疗纤维化疾病。在某些实施方案中，所提供的化合物和/或组合物也可用于预防和/或治疗癌症。在一些实施方案中，本文提供的化合物、组合物和方法利用策略来(例如，选择性地)靶向先天性免疫系统，并且重新编程巨噬细胞从M2至M1的极化，并且例如利用其抗纤维化特性。
通常且在不受任何预期限制的情况下，本公开的新型化合物、组合物和方法靶向受试者的先天性免疫系统，并且重新编程巨噬细胞从M2至M1的极化以有利于M1型表型的抗纤维化特性。例如，在至少一个示例性实施方案中，此类化合物和组合物包含与免疫调节剂或其药学上可接受的盐偶联的靶向叶酸盐受体β(FRβ)的靶向部分(诸如叶酸盐受体结合配体或其基团)。如下文详细描述的，此类实施方案利用FRβ的有限表达来将全身施用的化合物直接定位至表达FRβ的细胞(例如，纤维化和/或癌组织的那些细胞)，使得免疫调节剂组分然后可以将激活的髓样细胞(例如M2样巨噬细胞)转换(例如重新编程)为抗纤维化M1极化。这种靶向设计有利地防止免疫系统的全身激活，并且因此避免毒性。
进一步的示例性实施方案可以包括设置在靶向部分与免疫调节剂之间的连接基。此类连接基可以是可释放的或不可释放的。如本文所述，包含可释放的连接基的本公开的化合物/组合物将在施用时导致靶向部分和免疫调节剂在或大致在免疫调节剂变得有活性的时候从彼此释放。另外地或可替代地，在本公开的化合物/组合物包含不可释放的连接基的实施方案中，当施用靶向部分和免疫调节剂时，在生理条件下不快速释放。以这种方式，组分在被靶向细胞摄取和/或激活免疫调节剂后保持在一起。
现在将描述本公开的各种实施方案，以及与支持本公开的实例有关的数据。首先，在脊椎动物中存在两种主要的免疫策略：先天性免疫系统和适应性免疫系统。先天性或非特异性免疫应答是针对非自身病原体的一线防御，并且由物理、化学和细胞防御组成。在另一方面，适应性免疫系统被要求对逃避或克服一级先天性免疫防御的病原体采取行动。
炎症反应在免疫中起关键作用。当组织损伤或检测到病原体时，例如引发炎症反应，并且动员免疫系统。先天性免疫系统的免疫细胞(即嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)是首先经由血管和淋巴系统被募集到组织损害或损伤的部位或病原体位置，然后是巨噬细胞。
先天性免疫系统的细胞可以表达感测和结合存在于微生物病原体或其他非自身分子中的特定蛋白质序列的特殊模式识别受体。如本文所用，“模式识别受体”意指并且包括在白细胞(例如，至少巨噬细胞)的膜上表达并且可以结合激活受体并最终导致先天性免疫应答(并且在某些情况下，最终发展出抗原特异性获得性免疫力)的特定配体的任何免疫受体。
可以与模式识别受体结合的两类分子的实例包括与微生物病原体相关的病原体相关分子模式和细胞损伤或死亡期间释放的与宿主细胞的组分相关的损伤相关分子模式。通过模式识别受体识别这些蛋白质序列可以引发信号转导途径，所述信号转导途径触发某些基因的表达，所述基因的产物控制先天性免疫应答(例如，在一些情况下，指导抗原特异性获得性免疫力的发展)。因此，模式识别受体介导这些信号传导途径，并且在某些情况下，可以用于正面或负面地控制先天性甚至适应性免疫应答。
巨噬细胞是已知通过吞噬作用消除病原体的一组多样化的白细胞，并且根据它们响应于局部组织环境而经历的特定分化，被广泛分类为具有M1表型或M2表型。在一些情形中，巨噬细胞通过暴露于干扰素γ(IFN-γ)、脂多糖(LPS)和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)而极化至M1表型。在某些情形中，M1表型的特征在于高水平的促炎症细胞因子(诸如白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素12(IL-12)、白介素18(IL-18)和/或白介素23(IL-23))的产生、介导对病原体的抗性的能力、强的杀微生物特性、高水平的反应性氮和氧中间体的产生和/或T辅助性1型(Th1)反应。在一些情形中，M1极化与先天性免疫应答的“攻击和杀伤”阶段相关。在某些情形中，M1极化运作以抑制或防止感染的初始建立和/或去除损伤的组织。
在某些情形中，在先天性免疫系统执行该“攻击和杀伤”阶段之后，巨噬细胞可以重新编程自身以变成愈合系统(即M2型)，并且例如释放生长因子以促进愈合。此类生长因子可包括(但不限于)某些细胞因子，诸如白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1(TGFβ)、趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)和/或白介素13(IL-13)。在某些情形中，暴露于此类细胞因子/生长因子可替代地激活M2巨噬细胞表型。
与M1相比，M2巨噬细胞可能与创伤愈合和组织修复相关。在一些情形中，M2巨噬细胞的特征在于其参与组织重塑、免疫调节/抑制和/或肿瘤促进。在具体实例中，M2巨噬细胞产生聚胺以诱导细胞增殖和/或产生脯氨酸以诱导胶原产生。虽然这种愈合反应在健康受试者中是有益的，但M2巨噬细胞的存在可能通过对患有纤维化疾病或癌症的那些受试者的免疫抑制和/或促进肿瘤生长和纤维化而具有显著不利的影响。
例如，纤维化病理学可以始于对上皮的未知创伤或损伤。响应于所得的组织损伤，可以释放趋化因子和其他因子以促进针对损伤组织的免疫细胞浸润(例如，先天性免疫应答)，所述免疫细胞例如包括采取M2样表型并且例如释放促纤维化细胞因子的单核细胞和巨噬细胞。然后，这些细胞因子的慢性分泌可激活组织驻留的和浸润性成纤维细胞/纤维细胞而变成肌纤维母细胞，所述肌纤维母细胞进而又分泌可以使周围组织硬化的胶原和其他胞外基质蛋白。在一些情形中，这些M2巨噬细胞通过促进纤维化使疾病恶化。例如，对于特发性肺纤维化(IPF)受试者，例如M2巨噬细胞可以浸润肺部并促进其中的纤维化，这进一步降低其功能性。在一些情形中，由M2表型产生的生长因子和其他细胞因子通过类似途径驱动癌性肿瘤生长。
将M2样巨噬细胞重新编程至M1样巨噬细胞
在某些癌症和纤维化疾病中，巨噬细胞可以不成比例地偏向于抗炎症(M2样)表型。在某些情形中，免疫调节剂可以将激活的髓样细胞(例如，M2样巨噬细胞)转化(例如，重新编程)为抗纤维化M1极化(例如，在这种情况下它们产生很少或不产生生长因子和/或相关细胞因子，并且例如减慢或甚至消除疾病状态的进展)。在某些情形中，本文提供的组合物和方法逆转了在纤维化疾病(例如，IPF和某些癌症)的发展过程期间观察到的抗纤维化至促纤维化转变。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法降低个体中或从受试者获取的样品中的纤维化生物标志物(例如，与促纤维化活性相关的那些生物标志物(例如，CCL18、羟基脯氨酸和胶原))的量/表达。如本文所用，“个体”、“受试者”或“患者”是哺乳动物(优选人)，但也可以是动物。
作为本文使用的术语的“标志物”或“生物标志物”可以描述为当经历活动性疾病状态的受试者的表达水平与受试者或从健康受试者或没有经历疾病状态的受试者采集的样品的表达水平显著不同时的差异表达。与正常或对照样品的表达水平或受试者的基线相比，差异表达的标志物可以过表达或表达不足(在紧邻前一段落中提及的实施方案中，生物标志物降低了或表达不足)。生物样品中标志物的增加或减少或定量可通过本领域已知的用于测量基因产物或转录物的存在和/或相对丰度的几种方法中的任一种来确定。标志物水平可以确定为绝对值、或相对于基线值、以及与截止指数相比的受试者标志物水平。可替代地，可相对于对照来确定一种或多种标志物的相对丰度，对照可为临床正常的受试者。此外，如本文所用，术语“基因过表达”和“过表达”(当与基因结合使用时)及其构词要素构成的词(formative)具有相关领域的普通技术人员对其赋予的含义，所述含义包括(但不限于)可以引起突变型表型和/或导致大量靶蛋白表达的野生型基因产物过表达或错误表达。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法增加抗纤维化生物标志物(例如，TNFα和IFN-γ)。在一些实施方案中，提供了逆转M2样表型转变的组合物(例如，提供针对纤维化疾病、其病症或病状的有效治疗)。
在至少一个实施方案中，包含免疫调节剂的药物用于制备本文所述的方法中使用的化合物。如本文所用，“免疫调节剂”意指通过诱导免疫系统的一种或多种组分的激活或活性增加来刺激或以其他方式影响受试者的免疫系统的任何药物、弹头(warhead)或其他组合物或化合物。例如但不限于，免疫调节剂可包括靶向一种或多种模式识别受体的化合物或组合物，除此之外或替代地还有免疫细胞中的靶向信号传导途径。
本公开的免疫调节剂的示例性实例包括但不限于toll样受体(TLR)激动剂、干扰素基因刺激剂(STING)、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLR)、视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体(RLR)、不存在黑色素瘤2(AIM2)样受体(ALR)、高级糖化最终产物受体(RAGE)、或位于细胞的内体或细胞质中的任何其他模式识别受体。另外或可替代地，本公开的免疫调节剂可包含在途径中的更下游起作用的激活B细胞
Figure BDA0003510181380000142
激活剂或
Figure BDA0003510181380000143
激酶抑制剂的核因子κ轻链增强子。表1提供了可用作本公开的免疫调节剂的此类
Figure BDA0003510181380000144
激活剂或
Figure BDA0003510181380000145
激酶抑制剂的实例。
表1.
Figure BDA0003510181380000146
激活剂/诱导剂
Figure BDA0003510181380000141
Figure BDA0003510181380000151
Figure BDA0003510181380000161
如本文所用，“TLR”是在先天性免疫系统中起作用的一类蛋白质，并且是模式识别受体的实例。TLR可以是识别来源于微生物的结构保守分子的单个跨膜受体。TLR可以在白细胞的膜上表达，所述白细胞包括例如树突状细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、适应性免疫细胞(例如，T和B淋巴细胞)和非免疫细胞(上皮和内皮细胞和成纤维细胞)。TLR的非限制性实例包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。在一些实施方案中，本文提供的TLR激动剂结合一种或多种TLR。在一些实施方案中，本文提供的TLR激动剂结合TLR7、TLR8或TLR9。在一些实施方案中，本文提供的TLR激动剂结合TLR7。在一些实施方案中，本文提供的TLR激动剂结合TLR7和TLR8。在一些实施方案中，激动剂是与受体结合并激活受体的配体。
可以使用适合于将激活的巨噬细胞(M2样表型)重新编程为M1样表型的任何治疗剂(例如，药物)，并且药物(或弹头)可在细胞的内体和/或细胞质(例如，取决于其结构)中运作。在至少一个实施方案中，治疗剂包含免疫调节剂(例如，正面控制模式识别受体和/或其下游信号传导途径(在每种情况下，先天性免疫系统的一部分)的一种免疫调节剂，例如，TLR、NLR、RLR、ALR、RAGE和/或STING激动剂和/或Pelle/白介素1受体相关激酶(IRAK)家族(诸如IRAK-M抑制剂))。在其他实施方案中，本文提供的化合物包含负面控制适应性免疫系统的磷酸肌醇3-激酶(PI3K)激酶抑制剂或其他抑制剂(例如，其可单独使用或与靶向模式识别受体的免疫调节剂结合使用)。在一些实施方案中，特别是在用于治疗IPF或其他纤维化病状时，组合物或化合物(例如，药物)包含以下的组合：(a)靶向模式识别受体和/或作为其先天性免疫系统下游信号传导途径的激动剂的免疫调节剂，和(b)雷帕霉素(mTOR)抑制剂(ATP竞争性或以其他方式)的哺乳动物靶标，例如雷帕霉素或CZ415。
在某些实施方案中，本文提供了包含与靶向细胞的模式识别受体的免疫调节剂(或其基团)附接的靶向部分(或其基团)的化合物，所述靶向部分包含叶酸盐配体或其功能片段或类似物。“叶酸盐”意指叶酸盐受体结合分子(包括例如叶酸和叶酸的类似物和衍生物(诸如但不限于亚叶酸、蝶酰基聚谷氨酸、蝶酰基-D-谷氨酸))以及叶酸盐受体结合蝶啶(诸如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸及其脱氮杂和二脱氮杂类似物)。
术语“脱氮杂”和“二脱氮杂”类似物是指具有取代了在天然存在的叶酸结构或其类似物或衍生物中的一个或两个氮原子的碳原子的本领域识别的类似物。例如，脱氮杂类似物可以包括叶酸盐、亚叶酸、蝶酰基聚谷氨酸以及叶酸盐受体结合蝶啶(诸如四氢蝶呤、二氢叶酸盐和四氢叶酸盐)的1-脱氮杂、3-脱氮杂、5-脱氮杂、8-脱氮杂和10-脱氮杂类似物。二脱氮杂类似物包括例如叶酸盐的1,5-二脱氮杂、5,10-二脱氮杂、8,10-二脱氮杂和5,8-二脱氮杂类似物。在本公开的上下文中可用作复合物形成配体的其他叶酸盐是叶酸盐受体结合类似物培美曲塞、百乐君、乙胺嘧啶、甲氧苄啶、普拉曲沙、雷替曲塞、氨基蝶呤、氨甲蝶呤(也称为甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸盐、2-脱氨基-二氢叶酸盐、脱氮杂类似物诸如1-脱氮杂氨甲蝶呤或3-脱氮杂氨甲蝶呤以及3′,5′-二氯代-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰基谷氨酸(二氯甲氨喋呤)。
叶酸(folic acid)和前述类似物和/或衍生物也被称为“叶酸盐(afolate/thefolate/folates)”，反映了它们与叶酸盐受体结合的能力。如本文所述，此类分子当与外源分子缀合时可有效增强跨膜转运，诸如经由叶酸盐介导的胞吞作用。前述物质可以用于本文所述的叶酸盐受体结合配体。如本文所用，术语“配体”是与化合物的中心原子或离子(例如，药物)附接的分子、离子或原子。
现在将提供本公开的新型化合物的某些实施方案。本领域技术人员将了解，本公开的化合物可表现出多态性。实际上，本公开的化合物可包含本文所述化合物的表现出所描述的有用特性的任何外消旋、光学活性、多态性、或立体异构形式、或其混合物，在本领域中熟知如何制备光学活性形式(例如，通过重结晶技术解析外消旋形式、通过从光学活性起始材料合成、通过手性合成、或通过使用手性固定相进行色谱分离)以及如何使用本文所述的标准测试或使用本领域熟知的其他类似测试来确定抗肿瘤活性。此外，除非另有明确说明，否则本文所描绘的结构还意在包括结构的所有立体化学形式，即每个不对称中心的右手(R)和左手(S)构型。因此，本公开的组合物的单一立体化学异构体以及对映异构体和非对映异构体混合物在本公开的范围内。
除非另有说明，否则本文列出的关于基团、取代基和范围的特定值仅用于说明目的；此类实例不排除在关于基团和取代基的限定范围内的其他限定值或其他值。例如，(C1-C6)烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基或己基；(C1-C3)烷基可以是碘代甲基、溴代甲基、氯代甲基、氟代甲基、三氟代甲基、2-氯代乙基、2-氟代乙基、2,2,2-三氟代乙基、或五氟代乙基；(C1-C3)烷氧基可以是甲氧基、乙氧基或丙氧基；并且(C2-C6)链烷醇基(alkanoyl)氧基可以是乙酰氧基、丙醇基氧基、丁醇基氧基、异丁醇基氧基、戊醇基氧基或己醇基氧基。
此外，在部分被R取代基或取代基团取代的情况下，所述基团可被称为“R取代的”。当部分为R取代的或另外描述为大体上包含取代的基团时，所述部分被至少一个R取代基取代并且每个取代基任选地不同。应当了解，取代的基团(或R取代基)可以包含任何分子或组合分子，条件是其包含基本上不影响化合物的总体结构和形状，也不改变对潜在化合物实现其预期目的(例如，与靶向模式识别受体的结合)所必需的任何氢键。
在取代基基团由从左到右书写的常规化学式指定时，它们同样涵盖由从右到左书写结构产生的化学上相同的取代基，例如，—CH2O—与—OCH2—等效。
在一些实施方案中，本文提供的化合物的免疫调节剂(例如，TLR7激动剂)基团是具有式XX(以及更具体地式XX′)的结构的基团：
Figure BDA0003510181380000181
其中，
R1B是-NH2或-NH-R1X，
R2B是氢(H)、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000182
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基，并且
Figure BDA0003510181380000183
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环，并且
X是CH或氮(N)；
如本文所用，烷基、烷氧基等表示直链(即，无支链)或支链或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且可包括具有指定的碳原子数目(即，C1-C10意指一至十个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基团的实例包括但不限于基团诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基；例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同源物和异构体。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的烷基基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基-2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高级的同源物和异构体。烷氧基是经由氧连接基(—O—)与分子的其余部分附接的烷基。在一些实施方案中，烷氧基是指通过式–O-烷基的氧原子键合的基团。
一般来说，术语“酰基”或“酰基取代基”是指通过从氧代酸(包括无机酸)去除一个或多个羟基基团产生的衍生物，并且含有双键氧原子和烷基基团。此外，对单个基团诸如“丙基”的提及仅包括直链基团，支链异构体诸如“异丙基”被明确提及。
在一些实施方案中，TLR7激动剂具有式X，TLR7激动剂通过连接基在R1A、R1B、R3A或R3B中的任一个处与靶向部分缀合；并且在TLR7激动剂具有式XX′的情况下，TLR7激动剂通过连接基在R1A、R1B、R3A或R3B中的一个处与靶向部分缀合。
如本文所用，术语“连接基”包括原子链，所述原子链在生物功能上适于与A、B或S形成化学键，并且连接分子的两个或更多个功能部分以形成本公开的化合物。例示性地，原子链可选自碳(C)、N、氧(O)、硫(S)、硅(Si)和磷(P)或C、N、O、S和P、C、N、O和S。原子链可共价地连接化合物(诸如叶酸盐和药物)的不同功能能力。连接基可包含各种各样的连接，诸如在连续主链中约2个至约100个原子的范围内，并且可包含可释放或不可释放的连接基。在一些实施方案中，本文提供的化合物的免疫调节剂(例如，TLR7激动剂)基团是具有式XXX(以及更具体地式XXX′)的结构的基团：
Figure BDA0003510181380000191
其中，
R1C是-NH2或-NH-R1X，
R2C是键、NH、-NR1X或CH2，
并且
如果适用，
Figure BDA0003510181380000201
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环；
XA是CH2、NH2或-NH-R1X；并且
每个R1X独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基，
其中TLR7激动剂通过连接基在R1C、R2C或R3B中的一个处与靶向部分缀合。
在一些实施方案中，化合物还包含在靶向部分与免疫调节剂之间或以其他方式连接靶向部分与免疫调节剂的连接基(“L”或“Ln”)。在一些实施方案中，连接基Ln被构造成避免免疫调节剂的释放，并且n是等于或小于50的整数。在一些实施方案中，连接基Ln包含聚乙二醇(PEG)连接基或PEG衍生物连接基，n是选自范围1-32的整数，并且靶向部分对叶酸盐受体β具有特异性。在一些实施方案中，n为1-50、1-10、2-8或2-4。
在一些实施方案中，L是可水解连接基。在一些实施方案中，L是不可水解连接基。在一些实施方案中，L是任选地取代的杂烷基。
除非另有说明，否则术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烷基的二价基团，如所示例的但不限于—CH2CH2CH2CH2—。通常，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链烷基或亚烷基基团，通常具有八个或更少的碳原子。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合意指由至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或支链或其组合，并且其中所述氮原子和硫原子可以任选地被氧化，并且所述氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子O、N、P、S和Si可以被放置在杂烷基基团的任何内部位置或烷基基团与分子的其余部分附接的位置上。实例包括但不限于—CH2—CH2—O—CH3,—CH2—CH2—NH—CH3,—CH2—CH2—N(CH3)—CH3,—CH2—S—CH2—CH3,—CH2—CH2—S(O)—CH3,—CH2—CH2—S(O)2—CH3,—CH2＝CH—O—CH3,—Si(CH3)3,—CH2—CH＝N—OCH3,—CH＝CH—N(CH3)—CH3,—O—CH3,—O—CH2—CH3,和—CN。最多两个杂原子可以是连续的，例如—CH2—NH—OCH3。
类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指(除非另有说明)衍生自杂烷基的二价基团，如所示例的但不限于—CH2—CH2—S—CH2—CH2和—CH2—S—CH2—CH2—NH—CH2。对于杂亚烷基基团，杂原子也可以占据链末端中的任一个或两个(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的方向不隐含书写连接基团的式的方向。例如，式—C(O)2R′—表示—C(O)2R′—和—R′C(O)2—两者。如上所述，如本文所用的杂烷基基团包括通过杂原子与分子的其余部分附接的那些基团，诸如—C(O)R′、—C(O)NR′、—NRR″、—OR、—SR′和/或—SO2R′。在叙述“杂烷基”，随后叙述特定杂烷基基团诸如—NR′R″等的情况下，应当理解，术语杂烷基和—NR′R″不是冗余的或相互排斥的。相反，叙述特定杂烷基基团来增加清楚度。因此，术语“杂烷基”在本文中不应被解释为排除特定杂烷基基团，诸如—NR′R″等。
在一些实施方案中，L是包含至少一个取代基的取代的杂烷基，所述至少一个取代基选自由以下组成的组：烷基、羟基、氧代、PEG、羧酸根和卤代基。除非另有说明，否则“卤代基”或“卤素”本身或作为另一个取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。
在一些实施方案中，L包含间隔物(例如，如本文别处所描述的)。在一些实施方案中，间隔物包含肽聚糖或糖。
在一些实施方案中，L是在其主链中具有至少一个二硫键的取代的杂烷基。在一些实施方案中，L是在其主链中具有至少一个二硫键的肽。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物、多肽或者多肽、肽或融合多肽的片段。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
在一些实施方案中，L包含-CONH-CH(COOH)-CH2-S-S-CH2-CRaRb-O-CO-、-CONH-CH(COOH)CRaRb-O-CO-、-C(O)NHCH(COOH)(CH2)2-CONH-CH(COOH)CRaRb-O-CO-或-C(O)NHCH(COOH)(CH2)2-CONH-CH(COOH)-CH2-S-S-CH2-CRaRb-O-CO-，其中Ra和Rb独立地是H、烷基或杂烷基(例如PEG)。
在一些实施方案中，L包含以下结构：
Figure BDA0003510181380000211
其中n和m各自独立地为0至10。
在一些实施方案中，L包含以下结构：
Figure BDA0003510181380000221
其中n为1至32。在至少一个示例性实施方案中，n为1至30，并且w为0至5。
在一些实施方案中，L包含以下结构：
Figure BDA0003510181380000222
其中n为1至30，并且w为0至5。
在一些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0003510181380000223
在一些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0003510181380000231
在一些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0003510181380000232
在一些实施方案中，化合物具有由下式表示的结构：
Figure BDA0003510181380000241
在某些实施方案中，本文提供了包含靶向部分的化合物，所述靶向部分包含经由连接基与包含TLR激动剂的免疫调节剂附接的叶酸盐配体或其功能片段或类似物，所述TLR激动剂具有以下由式XXX表示的结构：
Figure BDA0003510181380000242
其中R1是胺基，R2是单键-NH-，并且R3是H、烷基、羟基基团或其任何其他取代基团，X是CH2、NH、O或S，并且连接基在R1、R2或R3处附接。另外或可替代地，R1可以是-NH2或-NH-R1X；R2可以是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000243
R1X、R2X和R2Y中的每一者可独立地选自由H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基组成的组；
Figure BDA0003510181380000244
可以是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环；和/或X可以是CH、CR2或N。
在一些实施方案中，本文提供了包含本文提供的任何式或化合物的药物组合物，其中所述连接基包含PEG或PEG衍生物，并且在一些情形中，是附接在R3处的不可释放的连接基或附接在R1、R2或R3处的可释放的连接基。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐选自氢溴化物、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、抗坏血酸盐、盐酸盐、酒石酸盐、三氟甲磺酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐或富马酸盐。
在一些实施方案中，所述化合物包含TLR激动剂(例如，其基团)，例如但不限于TLR3激动剂、TLR7激动剂、TLR7/8激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂(例如，它们全部与存在于细胞内体中的toll样受体结合)。例如但不限于，在至少一个示例性实施方案中，药物/化合物的免疫调节剂可选自下表2中列出的化合物。
表2.TLR激动剂。
Figure BDA0003510181380000251
Figure BDA0003510181380000261
Figure BDA0003510181380000271
Figure BDA0003510181380000281
Figure BDA0003510181380000291
在一些实施方案中，本文提供的化合物是或包含式I的化合物(或基团)(例如，TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000292
或者其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，R1是胺。在一些实施方案中，R2是(例如单)键或胺(例如-NH-)。在某些实施方案中，R3是H、烷基、羟基基团或任何其他合适的取代基(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，X是CH2、NH、O或S。在其中本文提供的化合物包含式I的基团的一些实施方案中，靶向部分与其在任何合适的位置处(诸如在R1、R2和/或R3处或通过它们)缀合或连接(例如，通过连接基和/或直接地)。
在至少一个示例性实施方案中，本文所述的化合物是或包含式Ia的化合物(或基团)(例如，TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000301
或者其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，X是CH或N。在一些实施方案中，R1是-NH2或-NH-R1X。在一些实施方案中，R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000302
在具体实施方案中，R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基。在一些实施方案中，
Figure BDA0003510181380000303
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环。在其中本文提供的化合物包含式Ia的基团的一些实施方案中，靶向部分与其在任何合适的位置处(诸如在R1、R2和/或R3处或通过它们)缀合或连接(例如，通过连接基和/或直接地)。
在一些实施方案中，本文提供的化合物是或包含式II的化合物(或基团)(例如，TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000304
或者其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，R1是胺。在一些实施方案中，R2是(例如单)键或-NH-。在一些实施方案中，R3是H、烷基、羟基基团或如本文所述的任何其他取代基。在一些实施方案中，X是CH2、NH、O或S。在其中本文提供的化合物包含式II的基团的一些实施方案中，靶向部分与其在任何合适的位置处(诸如在R1、R2和/或R3处或通过它们)缀合或连接(例如，通过连接基和/或直接地)。
在其他实施方案中，本公开的化合物可包括包含式III的TLR激动剂(例如，或其基团)或其药学上可接受的盐的药物：
Figure BDA0003510181380000311
其中R1是胺基，并且R3是羟基基团。此外，如果需要，靶向部分(例如或其基团)或其他配体可在R1或R3处与式III的激动剂缀合(通过连接基或直接地)。式III的TLR激动剂(例如，或其基团)是TLR7激动剂，并且与常规可获得的TLR7激动剂相比具有至少十倍(10x)的效力。
在一些实施方案中，本文提供了式IV的TLR7激动剂(例如，或其基团)或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003510181380000312
其中R1是胺基，并且R2是单键-NH-。
在一些实施方案中，本文提供的化合物的施用(例如，施用于个体)将纤维化组织中的巨噬细胞从M2样表型转化为M1样表型。在一些实施方案中，刺激胶原合成的细胞因子(即，CCL18、PDGF和IL-1β)的降低发生在施用本文提供的化合物之后，并且抑制胶原产生的细胞因子(例如，IFN-γ)同时增加。值得注意的是，在至少一个实施方案中，在施用本文提供的化合物之后，细胞因子谱与M2样表型至M1样表型的重新编程一致。如本文所用，“谱”或“测定”是一组一种或多种标志物及其存在、不存在和/或相对水平或丰度(相对于一个或多个对照)。例如，细胞因子谱是存在于样品内的细胞因子的存在、不存在、相对水平或丰度的数据集。基因组或核酸谱是所表达核酸(例如转录物、mRNA等)的存在、不存在、相对水平或丰度的数据集。可替代地，谱可以被称为表达谱。
在一些实施方案中，重新编程的纯粹后果是肺泡空气囊增加、细胞外基质沉积减少和羟基脯氨酸/胶原生物合成减少；疾病的有效逆转(例如，参见实施例4)。
应当理解，尽管本文描述了特定药物和式，但可用于将激活的髓样细胞重新编程为抗纤维化M1样表型的任何化合物(例如，药物)都可以用于本文的新型化合物和方法中(例如，能够与模式识别受体结合并抑制其下游的至少一部分先天性免疫系统反应的任何化合物(例如，药物))。在一些实施方案中，本文所述的化合物的类似物和/或衍生物可以用于本文提供的靶向化合物中。
此外，可以施用多于一种化合物，并且在一些情形中，所述化合物可以包含不同药物。例如，不同的药物可以选自TLR7激动剂和TLR9激动剂。在又另一个实施方案中，可以将一种或多种化合物与一种或多种缀合和/或非缀合的药物(例如，下文所述的缀合实施方案)一起在组合物中施用。在一些实施方案中，本文所述的任何化合物和药物都可以根据本文所述的方法使用，并且在一些情形中，取决于期望的应用，可以与耗尽或抑制髓样来源的阻抑细胞(例如与癌症治疗有关)、下调生长因子的生产(例如，与IPF治疗有关的吡非尼酮)、经由抑制雷帕霉素复合物1(mTORC1)信号传导的哺乳动物靶标直接地修饰成纤维细胞(例如，与IPF或其他纤维化疾病状态的治疗有关的CZ415)的其他药物和/或任何其他抗纤维化和/或抗癌症药物和疗法组合。如本文所用，“下调(downregulation)”及其构词要素构成的词(例如“下调(down-regulation)”或“下调(down-regulated)”，例如)可以互换使用，并且是指标志物(诸如基因、核酸、代谢物、转录物、蛋白质或多肽)的水平降低。类似地，“上调(upregulation)”及其构词要素构成的词(例如“上调(p-regulation)”或“上调(up-regulated)”)也可以互换使用，并且是指标志物(诸如基因、核酸、代谢物、转录物、蛋白质或多肽)的水平增加。而且，途径(诸如信号转导或代谢途径)可以被上调或下调。
靶向部分
在一些情形中，与至少本文鉴定的常规药物的全身施用相关的毒性已排除其在治疗纤维化疾病、癌症或任何其他疾病状态方面的实际应用。例如，TLR激动剂可能不被个体耐受，并且在一些情形中，可能导致受试者死亡(例如，如果经由常规模式全身施用)。在一些实施方案中，本文提供的化合物(例如具有式I和/或II的化合物)比可以与本公开的化合物一起使用的常规药物显著更有效力，并且在一些情形中，用于规避全身毒性的机制是优选的。
在某些实施方案中，本文提供了与靶向部分缀合的治疗剂(例如，药物(如先前所描述)。在一些实施方案中，靶向部分包含靶向个体的特定区域或组织(例如，具有高特异性)的配体或其他原子或分子，并且在某些情形中可以包含例如激素、抗体和/或维生素。如下文进一步详细描述的，在至少一个实施方案中，靶向部分包含对FRβ具有(例如，高)亲和力的分子。在一些情形中，靶向部分对纤维化疾病或癌症的细胞或组织(视情况而定)所特有的任何受体具有特异性亲和力。
在一些情形中，FRβ在激活的髓样细胞(例如，主要激活的单核细胞和M2样巨噬细胞)中显著上调，例如，迄今为止的所有记录数据都支持在暴露于抗炎症或促炎症刺激物后仅在骨髓来源的细胞中诱导FRβ。叶酸盐受体可以在(例如，超过90％)非粘液卵巢癌中被上调。在某些情形中，叶酸盐受体存在于肾癌、脑癌、肺癌和乳腺癌中。例如，尽管存在许多本身不表达足够数量的叶酸盐受体以提供所需特异性的癌症，但癌性肿瘤确实表达髓样来源的阻抑细胞(MDSC)(例如其确实表达FRβ)，并且例如可以由本文提供的靶向部分靶向。在一些实施方案中，叶酸盐受体基本上不存在(例如，仅以极低水平存在)于健康(非髓样)组织(例如，无论肺、肝、脾、心脏、脑、肌肉、肠、胰腺、膀胱等)中。在一些情形中，甚至遍及全身丰富的休眠的组织驻存巨噬细胞也主要为FRβ阴性的。在一些情形中，例如在发炎组织、恶性病变和肾中有叶酸盐靶向成像剂的摄取。在某些情形中，没有癌症的受试者仅在肾和炎症部位中保留叶酸盐靶向药物。在一些情形中，叶酸盐受体表达的差异提供了选择性地靶向纤维化癌细胞的机制。
在一些实施方案中，本文提供的化合物和方法利用FRβ的有限表达将全身施用的有效力的化合物(例如，缀合物或药物)靶向/定位至纤维化和/或癌性组织。在一些情形中，本文提供的化合物被直接递送至表达FRβ的细胞，例如，这有利地防止免疫系统的全身激活，并且例如可以避免(例如，至少一部分)迄今为止已阻止全身性使用本文所述的非靶向化合物(例如，药物)的毒性。在一些实施方案中，将本文所述的方法用于治疗纤维化疾病和/或癌症，例如，不管癌症是否表达叶酸盐受体。在一些实施方案中，将叶酸和其他叶酸盐受体结合配体(或其基团)(例如叶酸盐)用作靶向部分，因为例如它们对FRβ具有亲和力。
叶酸是维生素B族的成员，并且可以例如通过参与核酸和氨基酸的生物合成而在细胞存活中起着关键作用。叶酸可以通过靶向激活的髓样细胞增强缀合的免疫调节剂药物的特异性，并且通过靶向叶酸盐受体阳性癌细胞增强缀合的抗癌药物的特异性。在一些情形中，本文提供了包含作为靶向部分的叶酸盐配体(或其基团)或其功能片段或类似物和免疫调节剂(例如，TLR7、TLR8、TLR 7/8、TLR9或TLR3激动剂)的化合物。在一些情形中，TLR7、TLR8、TLR 7/8、TLR9和TLR3存在于内体中。在一些实施方案中，化合物或其基团结合TLR。在一些实施方案中，TLR是TLR7。
吡啶并[2,3-d]嘧啶类似物配体(例如，或其基团)、其功能片段或类似物、或对FRβ具有亲和力(例如但不限于，高特异性)的任何其他分子、片段或原子都可替代地用作靶向部分(或其基团)。例如，与在约20℃/25℃/30℃/生理学的温度下的叶酸相比，此类叶酸盐类似物分子可以具有约0.01或更大的结合FRβ的相对亲和力。类似地，可以采用对纤维化和/或癌性细胞或组织具有高度特异性的亲和力的半乳凝素3配体、转位分子蛋白质(TSPO)配体和任何其他配体或靶向部分。
现在将提供合适的靶向部分(或其基团)的具体实例；然而，应当理解，本公开的靶向部分(或其基团)可以包含可用于靶向FRβ的任何配体(或其基团)，并且不限于本文指定的结构。配体(或其基团)可以结合FRβ。
在至少一个实施方案中，本文提供的化合物包括具有式V的结构或其功能片段或类似物的靶向部分(或其基团)：
Figure BDA0003510181380000341
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9各自独立地为N、NH、CH、CH2、O或S；
Y是C、CH、CH2、N、NH、O或S；
Z是谷氨酸、缬氨酸或作用物(substrate)；
R1和R2各自独立地是NH2、OH、SH、CH3或H；
R3是小时(hours)或烷基；
m和n各自独立地为0、1或介于0和1之间；并且
Figure BDA0003510181380000342
代表单键或双键C-C。
在另外的方面，作为非限制性实例，式V的靶向部分(或其基团)具有VI的结构(或其功能片段或类似物)：
Figure BDA0003510181380000343
其中
X1、X2、X3、X5、X6、X7、X8和X9各自独立地是N、NH、CH、CH2、O或S；
Y是C、CH、CH2、N、NH、O或S；
Z是谷氨酸、缬氨酸或作用物(substrate)；
R1和R2各自独立地是NH2、OH、SH、CH3或H；
R3是小时或烷基；
m和n各自独立地为0、1或介于0和1之间；并且
Figure BDA0003510181380000344
代表单键或双键C-C。
式V(或其功能片段或类似物)的另一个特异性靶向部分(或其基团)具有式VII的结构：
Figure BDA0003510181380000351
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9各自独立地为N、NH、CH、CH2、O或S；
Y是C、CH、CH2、N、NH、O或S；
Z是谷氨酸、缬氨酸或作用物(substrate)；
R1和R2各自独立地是NH2、OH、SH、CH3或H；
R3是小时或烷基；
m和n各自独立地为0、1或介于0和1之间；并且
Figure BDA0003510181380000352
代表单键或双键C-C。
在一些实施方案中，式VI的靶向部分(或其基团)具有式VIII的结构：
Figure BDA0003510181380000353
其中
X1、X2、X3、X5、X6、X7、X8和X9各自独立地是N、NH、CH、CH2、O或S；
Y是C、CH、CH2、N、NH、O或S；
Z是谷氨酸、缬氨酸或作用物(substrate)；
R1和R2各自独立地是NH2、OH、SH、CH3或H；
R3是小时或烷基；
m为0、1或介于0和1之间；并且
Figure BDA0003510181380000354
代表单键或双键C-C。
在一些实施方案中，式VI的靶向部分(或其基团)具有式IX的结构：
Figure BDA0003510181380000361
其中
X1、X2、X3、X5、X6、X7、X8和X9各自独立地是N、NH、CH、CH2、O或S；
Y是C、CH、CH2、N、NH、O或S；
Z是谷氨酸、缬氨酸或作用物(substrate)；
R1和R2各自独立地是NH2、OH、SH、CH3或H；
R3是小时或烷基；
m为0、1或介于0和1之间；并且
Figure BDA0003510181380000362
代表单键或双键C-C。
在一些实施方案中，式VII的靶向部分(或其基团)具有式X或XI的结构：
Figure BDA0003510181380000363
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9各自独立地为N、NH、CH、CH2、O或S；
Y是C、CH、CH2、N、NH、O或S；
Z是谷氨酸、缬氨酸或作用物(substrate)；
R1和R2各自独立地是NH2、OH、SH、CH3或H；
R3是小时或烷基；
m为0、1或介于0和1之间；并且
Figure BDA0003510181380000364
代表单键或双键C-C；或
Figure BDA0003510181380000371
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9各自独立地为N、NH、CH、CH2、O或S；
Y是C、CH、CH2、N、NH、O或S；
Z是谷氨酸、缬氨酸或作用物(substrate)；
R1和R2各自独立地是NH2、OH、SH、CH3或H；
R3是小时或烷基；
m为0、1或介于0和1之间；并且
Figure BDA0003510181380000372
代表单键或双键C-C。
本公开的靶向部分(例如，或其基团)的一些另外实施方案的化学结构和光谱数据在以下表3、表4、表5和表6中提供。
表3提供了具有式VIII的结构的靶向部分(例如，或其基团)的另外实施方案的非限制性实例。
表3.式VIII
Figure BDA0003510181380000373
Figure BDA0003510181380000381
Figure BDA0003510181380000391
表4提供了具有式IX的结构的靶向部分(例如，或其基团)的另外实施方案的非限制性实例。
表4.式IX
Figure BDA0003510181380000401
Figure BDA0003510181380000411
表5提供了具有式X的结构的靶向部分的另外实施方案的非限制性实例。
表5.式X
Figure BDA0003510181380000412
如前所述，代替叶酸盐，靶向部分(例如，其基团)可以是一种或多种非经典抗叶酸盐类似物，例如吡啶并[2,3-d]嘧啶或具有下表6中所阐述的式(例如，式的基团)的相似的类似物(或其基团)：
表6.非经典抗叶酸盐类似物
Figure BDA0003510181380000421
Figure BDA0003510181380000431
Figure BDA0003510181380000441
Figure BDA0003510181380000451
在一些情形中，本文提供的化合物包含与靶向部分(例如，其基团)缀合的药物(例如，其基团)(例如，免疫调节剂)。免疫调节剂(例如，其基团)可以直接或通过连接基(例如，任选地包含间隔物)与靶向部分(例如，其基团)缀合。图1A示出了化合物100的至少一个实施方案。此处，化合物100包含例如具有式I的免疫调节剂(或其药物或基团)102，其中R3是羟基基团。免疫调节剂(例如，其基团)102通过连接基106与靶向部分(例如，其基团)104缀合。此处，靶向部分(例如，其基团)106是叶酸盐，并且(例如，不可释放)连接基106是重复n次的PEG连接基，其中n介于1和32之间。
在至少一个实施方案中，但不限于，化合物100可以由下式表示：Q-L-T，其中Q是叶酸盐受体结合配体/靶向部分104的基团，L是连接基106，并且T是TLR激动剂/免疫调节剂102的基团。连接基L可以包含本文呈现的连接基式中的任一者。
类似地，图1B示出了化合物150的至少一个实施方案。化合物150具有通过(例如，可释放)连接基156与靶向部分(例如，其基团)154缀合的、作为TLR7激动剂(例如，其基团)的例如具有式III的免疫调节剂/药物(例如，其基团)152。
连接基(L或Ln)可以是可释放的或不可释放的。在一些情形中，例如包含不可释放的连接基的化合物的靶标是(例如，所关注细胞的)内体，然而可释放的连接基的靶标在一些情形中是(例如，所关注细胞的)内体、细胞质或两者。
在至少一个示例性实施方案中，连接基Ln被设置在靶向部分(例如，其基团)与免疫调节剂或其药学上可接受的盐之间，其中所述连接基L或Ln被构造成避免释放TLR7激动剂的游离形式，并且n是等于或小于50的整数。另外或可替代地，化合物可以包含含有PEG或PEG衍生物的连接基Ln，n可以是选自范围1至32的整数，并且靶向部分(例如，其基团)可以包含含有FRβ结合配体的叶酸盐受体结合配体的基团。
在连接基的上下文中，术语“可释放”意指包括至少一个键的连接基，所述键可以在生理条件下例如通过减少药剂不稳定的、pH不稳定的、酸不稳定的、碱不稳定的、氧化不稳定的、代谢不稳定的、生物化学不稳定的、酶不稳定的或基于对-氨基苄型的多价可释放键而断裂(例如化学或酶促水解)。应当了解，导致键断裂的生理条件不一定包括生物或代谢过程，而是可以包括在生理pH下或由于区室化到细胞器(诸如具有比胞质pH更低的pH的内体)中而发生标准化学反应(例如水解反应)。可切割键可以连接可释放的连接基内的两个相邻原子和/或例如在可释放的连接基的任一端或两端连接其他连接基部分或如本文所述的靶向部分和/或药物。在一些情形中，可释放的连接基被断裂成两个或更多个片段。在一些情形中，可释放的连接基与靶向部分分离。在一些实施方案中，靶向部分和免疫调节剂从彼此释放，并且免疫调节剂变得有活性。
相比之下，在连接基的上下文中，术语“不可释放”意指包括至少一个键的连接基，所述至少一个键在生理条件下不容易或快速断裂。在一些实施方案中，不可释放的连接基包含在生理条件下稳定的主链(例如，主链不易受水解(例如，水性水解或酶促水解)的影响)。在一些实施方案中，本文提供的包含不可释放的连接基的组合物不会释放组合物的任何组分(例如，靶向配体(例如，完全无定形(FA)-配体)或免疫调节剂(例如，TLR7激动剂)。在一些实施方案中，不可释放的连接基在主链中缺乏二硫键(例如，S-S)或酯。在一些实施方案中，所述组合物包含通过主链连接的靶向部分和免疫调节剂，所述主链在组合物循环的整个持续时间内(例如，在胞吞到靶细胞内体中的期间)基本上稳定。在一些实施方案中，当免疫调节剂靶向存在于细胞内体中的TLR、NOD样受体和/或其他模式识别受体时，包含不可释放的连接基的组合物是特别有益的。不可释放的连接基可以包含：酰胺、酯、醚、胺和/或硫醚(例如，硫代-马来酰亚胺)。虽然本文提供了具体实例，但应当理解，任何(一种或多种)分子均可以用于不可释放的连接基中，条件是形成在生理条件下不容易或快速断裂的至少一个键。
或许更具体地，不可释放的连接基包含在中性pH下例如小于百分之十(10％)(例如，小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.1％、小于0.01％或小于0.001％)将在水溶液(例如，缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲液))中在一定时间段(例如24小时)内水解的连接基。在一些实施方案中，在采用不可释放的连接基的情况下，所施用的缀合物化合物的小于约百分之十(10％)以及优选地小于百分之五(5％)或零释放游离药物(例如，在被靶向细胞/组织摄取之前的全身循环中)。在一些实施方案中，在施用的一(1)小时内，当化合物处于全身循环中时，小于百分之五(5％)的游离药物从缀合物中释放。
在一些实施方案中，靶向部分不从药物/免疫调节剂切割下在体内具有治疗有效性的化合物。在一些实施方案中，这是有利的，因为它允许包含有效力的药物(例如，TLR7激动剂)的靶向组合物的使用，例如因为在靶向递送化合物之前仅可忽略量(如果有的话)的药物(例如，免疫调节剂，例如TLR7激动剂)被释放(例如，全身地)。在一些实施方案中，调整活性组分的释放特性是制备有效药物组合物的困难方面。在一些实施方案中，包含本文提供的不可释放的连接基的组合物避免了制备有效药物组合物的困难(例如，通过去除对释放进行定时的必要性)。在一些实施方案中，本文提供的化合物的免疫调节剂或弹头在结合(例如，与靶向缀合物缀合)时是有活性的。在一些实施方案中，当弹头/免疫调节剂是有活性的时，不可释放的连接基和靶向部分防止(例如，由受试者的身体)释放激活免疫系统的毒性细胞因子(例如，白介素6(IL-6))(例如，因为化合物是特异性靶向的(例如，使用叶酸盐或其类似物))。在某些情形中，例如即使当与不可释放的连接基连接时化合物的弹头/免疫调节剂是有活性的，免疫调节剂也不能接近细胞内体中的适当(例如靶向)受体，直到化合物结合靶向受体(例如，叶酸盐受体)。
作为非限制性实例，图1A的连接基106是不可释放的PEG连接基，然而图1B的连接基156是自我牺牲的可释放的连接基(例如，包含二硫键(例如，S-S))。例如，图1B中所示的方案展示了化合物150在从靶向部分154切割后的自我牺牲级联。
在一些实施方案中，连接基156形成为使得药物仅在经过了足够的时间使化合物在施用后在受试者的全身循环内循环(例如，从非靶向组织中清除，并且被靶向细胞和/或受体捕获和内化)之后从靶向部分154切割。在一些实施方案中，释放的时间段将变化(例如，在不同的受试者之间(例如，基于多种因素))。在一些实施方案中，可释放的连接基可以被工程化，使得其直到施用后至少24小时或甚至在一周的时间段内不会被切割/释放。在一些实施方案中，化合物可以安全地穿过受试者的全身，并且任何未被靶向细胞(例如，表达FRβ的那些细胞)捕获的量可以在释放/激活之前排泄，从而预防毒性(例如，因为免疫调节剂在与可释放的连接基结合时没有活性)。
可释放的连接基和不可释放的连接基两者均可以被工程化以根据本领域中公知的或下文开发的方法诸如通过PEG化等优化(例如化合物的)生物分布、生物利用度和PK/PD和/或增加(例如化合物)在靶向组织中的摄取。在一些实施方案中，连接基被构造成在被细胞(例如，所关注的细胞(例如，待治疗的纤维化或癌症组织中的巨噬细胞)捕获之前避免药学上有活性的量的药物的在循环中的显著释放。
在一些实施方案中，包含本公开的可释放的连接基的化合物可以被设计成跨越内体的膜扩散并且例如扩散到靶向细胞的细胞质中。在一些实施方案中，可释放的连接基可以被设计成使得免疫调节剂直到化合物到达细胞质才被释放。
在一些实施方案中，本文提供的缀合物可以包含可释放的连接基(例如，以促进免疫调节剂在细胞质中的释放，例如其中所述免疫调节剂包含PI3K激酶、IRAK、或1-κ-β(IKβ)激酶激活剂(例如，使用Prostratin等)或激活B细胞的核因子κ-轻链-增强子(NF-kβ)(参见例如，表1)或髓样分化初级反应因子88(MyD88)激动剂)。在一些实施方案中，可释放的连接基防止免疫调节剂的释放，例如直到在靶向部分结合适当的靶标(例如，巨噬细胞叶酸盐受体)之后，被内化到靶向细胞的内体中，和/或扩散到细胞质(例如，其是期望的模式识别受体定位的地方)中。在一些实施方案中，可释放的连接基释放内体中的免疫调节剂。
在一些实施方案中，本文提供的连接基可以包含一个或多个间隔物(例如，以促进特定释放时间，促进靶向组织中的摄取的增加，和/或优化本文提供的化合物的生物分布、生物利用度和/或PK/PD)。间隔物可以包含烷基链、PEG、肽、糖、肽聚糖、可点击连接基(例如三唑类)、刚性连接基诸如聚脯氨酸和聚哌啶等中的一种或多种。
在一些实施方案中，包含PEG12的连接基显著降低了(如果不是完全避免的话)本文提供的化合物的非特异性摄取(例如，摄取到非靶向器官中(例如，在施用后摄取到受试者的肝和/或肾中))。在一些实施方案中，所述化合物避免递送至肝和肾。在一些实施方案中，靶向部分(其游离形式、其基团或其缀合物)不与非靶向细胞上的摄取受体结合(例如，只要器官不是靶向位点，并且因此可以避免对那些器官中的免疫复合物的刺激，这在临床环境中是高度有益的)。
在一些实施方案中，本文提供的包含不可释放的连接基的缀合物减少或消除从缀合物释放的呈其游离形式(例如，本文提供的化合物和/或配体的游离形式)的组分的毒性。
在至少一个实施方案中，连接基包含亲水性间隔物。在一些实施方案中，所述化合物具有式XII的结构(例如，经由含有第一亲水性间隔物的可释放的连接基与叶酸盐缀合的式III的TLR7激动剂的子结构)：
Figure BDA0003510181380000491
在一些实施方案中，所述化合物具有式XIII的结构(例如，经由包含第二亲水性间隔物的不可释放的连接基(共价键)与叶酸盐缀合的式III的TLR7激动剂的子结构)：
Figure BDA0003510181380000492
本文提供了示例性缀合化合物的具体实例。
在一些实施方案中，本文提供的化合物包含与免疫调节剂或其药学上可接受的盐的基团缀合的靶向部分的基团，使得所述免疫调节剂(或其基团)或其药学上可接受的盐在缀合时保持药学活性。靶向部分可以包含本文所述的任何靶向部分，并且在至少一个实施方案中，包含叶酸盐配体、任何其他叶酸盐受体结合分子(例如，或前述任一者的功能片段或类似物)或吡啶并[2,3-d]嘧啶类似物。在一些实施方案中，靶向部分(或其缀合物或基团)对FRβ具有特异性。
在一些实施方案中，本文提供的化合物包含一个或多个连接基，其中所述靶向部分的基团通过所述一个或多个连接基与免疫调节剂的基团缀合。例如，在免疫调节剂或其药学上可接受的盐具有式I或II的情况下，免疫调节剂的基团可以通过连接基或直接地在R1、R2或R3中的一个处与靶向部分的基团缀合。类似地，在免疫调节剂或其药学上可接受的盐具有式III的情况下，免疫调节剂的基团可以通过连接基或直接地在R1或R3中的一个处与靶向部分的基团缀合。可替代地，在免疫调节剂或其药学上可接受的盐具有式IV的情况下，免疫调节剂的基团可以通过连接基或直接地在R1或R2中的一个处与靶向部分的基团缀合。如本文所述，连接基可以是可释放的或不可释放的。
在一些实施方案中，本文提供的化合物的一个或多个连接基可以包含PEG、PEG衍生物或本领域已知的或下文所开发的可以实现本文所阐述的目的的任何其他连接基。在一些实施方案中，连接基可以被重复n次，其中n是正整数。例如但不限于，n可以是选自范围1-16、1-32、1-64或1-96的任何整数。为了实现化合物的期望功能性、大小和/或效力和/或鉴于期望的应用，可以选择连接基的重复次数(即，n)。在一些实施方案中，所述连接基中的一个或多个包含一个或多个间隔物(例如，其也可以用于特异性地设计化合物的特性)。
在一些实施方案中，连接基是可水解连接基。在一些实施方案中，连接基是不可水解连接基。在一些实施方案中，连接基是任选取代的杂烷基。在一些实施方案中，连接基是包含至少一个取代基的取代的杂烷基，所述至少一个取代基选自由以下组成的组：烷基、羟基、氧代、PEG、羧酸根和卤代基。在一些实施方案中，连接基包含间隔物(例如，如本文别处所描述的)。
在一些实施方案中，连接基是在其主链中具有至少一个二硫键的取代的杂烷基。在一些实施方案中，连接基是在其主链中具有至少一个二硫键的肽。
在一些实施方案中，连接基包含-CONH-CH(COOH)-CH2-S-S-CH2-CRaRb-O-CO-、-CONH-CH(COOH)CRaRb-O-CO-、-C(O)NHCH(COOH)(CH2)2-CONH-CH(COOH)CRaRb-O-CO-或-C(O)NHCH(COOH)(CH2)2-CONH-CH(COOH)-CH2-S-S-CH2-CRaRb-O-CO-，其中Ra和Rb独立地是H、烷基或杂烷基(例如，PEG)。
在一些实施方案中，连接基包含以下结构：
Figure BDA0003510181380000511
其中n和m各自独立地为0至10。
在一些实施方案中，连接基包含以下结构：
Figure BDA0003510181380000512
其中n和m各自独立地为0至10。
在一些实施方案中，连接基包含以下结构：
Figure BDA0003510181380000513
其中n为1至32。
在一些实施方案中，连接基包含以下结构：
Figure BDA0003510181380000521
其中n为1至16。
应当理解，化合物的基团(例如，表1或表2中任一者中的化合物的基团)、连接基(例如，如本文提供的)和配体的基团(例如，表3-6中任一者中的配体的基团)的任何组合都可以组合以形成本文提供的缀合物。在一些实施方案中，化合物的基团或配体的基团是碳原子或杂原子(例如，O、S、N等)。在一些实施方案中，化合物的基团是C或O。在一些实施方案中，配体的基团是C或O。在一些实施方案中，通过基团的放置来确定化合物和配体的附接点(例如，通过连接基)。在一些实施方案中，连接基包含间隔物(例如，如本文别处所描述)。还应当理解，本文提供的任何缀合物都可以在如实施例中提供的方法中所提供的类似过程中合成。
本文提供的缀合物的非限制性实例提供于表7中。
表7.缀合物的实例。
Figure BDA0003510181380000522
Figure BDA0003510181380000531
Figure BDA0003510181380000541
Figure BDA0003510181380000551
本文提供的缀合物的非限制性实例提供于表8中。
表8.缀合物的另外实例
Figure BDA0003510181380000552
Figure BDA0003510181380000561
Figure BDA0003510181380000571
Figure BDA0003510181380000581
Figure BDA0003510181380000591
在一些情形中，本文提供的缀合化合物具有式XIV的结构(例如，或其功能片段或类似物，包括经由可释放的连接基与叶酸盐缀合的式III的TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000601
在另一个实施方案中，本文提供的缀合化合物具有式XV的结构(例如，或其功能片段或类似物，包括经由可释放的连接基(例如，化合物3B)与叶酸盐缀合的式II的TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000602
在又另一个实施方案中，本文提供的缀合化合物具有式XVI的结构(例如，或其功能片段或类似物，包括经由包含三个PEG的不可释放的连接基(例如，化合物3D)与叶酸盐缀合的式II的TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000603
在仍另一个实施方案中，本文提供的缀合化合物具有式XVII的结构(例如，或其功能片段或类似物，包括经由包含十二个PEG的不可释放的连接基(例如，化合物3C)与叶酸盐缀合的式II的TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000611
本文提供的缀合化合物的另外实施方案具有式XVIII的结构(例如，或其功能片段或类似物，包括经由包含十六个PEG的不可释放的连接基(例如，化合物3D’)与叶酸盐缀合的式II的TLR7激动剂)：
Figure BDA0003510181380000612
本文提供的缀合化合物的另外实施方案具有式XIX的结构(例如，或其功能片段或类似物，包括与叶酸盐缀合的式III的TLR7激动剂(化合物1B))：
Figure BDA0003510181380000621
可以通过本领域技术人员实践的有机合成的常规方法制备本文所述的化合物。下文概述的一般反应序列表示可用于制备本公开的化合物的一般方法，并且不意图限制范围或实用性。
本发明的化合物的描述受本领域技术人员已知的化学键合原理的限制。因此，在基团可以被许多个取代基中的一个或多个取代的情况下，选择此类取代以便符合化学键合原理并且给出不固有不稳定的和/或本领域普通技术人员已知可能在环境条件(诸如水性、中性和若干已知生理条件)下不稳定的化合物。例如，根据本领域技术人员已知的化学键合原理，杂环烷基或杂芳基经由环杂原子与分子的其余部分附接，从而避免固有不稳定的化合物。
在两个或更多个多肽序列的背景下，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列是相同的或有指定百分比的肽是相同的(即，当关于在比较窗口或指定区域诸如靶向末端、叶酸盐末端、连接基、或弹头上的最大对应进行比较和对齐时在指定区域上的约60％同一性、优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用本领域已知的序列比较算法所测量的、或通过手动对齐和目视检查。此类序列然后被称为“基本上相同”。换句话说，同一性存在于整个序列的一个或多个区域上，只要维持分子的一般形状和结构以及(在适当时)氢键使得其基本上适合靶向结合位点并且充当其激动剂即可。
可以将本文所述的化合物以单位剂型和/或以含有一种或多种药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或媒介物的组合物、以及它们的组合施用。如本文所用，术语“施用”及其构词要素构成的词一般是指将本文所述的化合物引入宿主受试者的任何和所有手段，包括但不限于通过口服、静脉内、肌内、皮下、透皮、吸入、经颊、眼部、舌下、阴道、直肠和类似施用途径。
施用作为盐的本公开化合物可能是适当的。可接受的盐的实例包括但不限于碱金属(例如，钠、钾或锂)或碱土金属(例如，钙)盐；然而，当施用于所治疗的受试者时通常为无毒且有效的任何盐都是可接受的。类似地，“药学上可接受的盐”是指具有可以用于药物中的抗衡离子的那些盐。此类盐可以包括但不限于：(1)酸加成盐、其可以通过母体化合物的游离碱与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等、或者与有机酸诸如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等的反应而获得；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子被替换为金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)、或者与有机碱(诸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等)配合时所形成的盐。药学上可接受的盐是本领域技术人员熟知的，并且可以结合本文所述的实施方案来考虑任何此类药学上可接受的盐。
可以使用本领域已知的标准程序获得可接受的盐，所述标准程序包括(但不限于)使足够酸性的化合物与提供生理学上可接受的阴离子的合适碱反应。合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。例示性的但非限制性的实例包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、重硫酸盐/硫酸盐、硼酸盐、右旋樟脑磺酸盐(camsylate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟苯酰苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘化物/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐的盐。本文所述的化合物的合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。例示性的但非限制性的实例包括精氨酸、苄星青霉素、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、乙醇胺、钾、钠、氨丁三醇和锌盐。还可以形成酸和碱的半盐，例如，半硫酸盐和半钙盐。
如本文所用，术语“组合物”一般是指包含多于一种成分的任何制品，包括本文所述的化合物。应当理解，可以由本文所述的分离的化合物或由本文所述的化合物的盐、溶液、水合物、溶剂化物和其他形式制备本文所述的组合物。应当了解，某些官能团(诸如羟基、氨基和类似基团)能以化合物的各种物理形式与水和/或各种溶剂形成复合物。还应当理解，所述组合物可以由本文所述的化合物的各种无定形、非无定形、部分结晶、结晶和/或其他形态形式制备，并且所述组合物可以由本文所述的化合物的各种水合物和/或溶剂化物制备。因此，叙述本文所述的化合物的药物组合物包括本文所述的化合物的各种形态形式和/或溶剂化物或水合物形式中的每一者、或它们的任何组合或单独形式。
可以将本公开的化合物配制成药物组合物，并且以适于所选择的施用途径的各种形式施用于哺乳动物宿主(诸如人类患者)。例如，可以将药物组合物配制用于并经由口服或肠胃外、静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、硬膜外、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、瘤内、肌内、局部、吸入和/或皮下途径施用。实际上，在至少一个实施方案中，可以将如本文所述的化合物和/或组合物直接施用于血流中、肌肉中或内部器官中。
例如，在至少一个实施方案中，本发明化合物可以与药学上可接受的媒介物诸如惰性稀释剂或可同化食用载剂组合全身地施用(例如，口服地)。对于口服治疗施用，活性化合物可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可摄取片剂、经颊片剂、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片等的形式使用。组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以在(一种或多种)活性成分和粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂和/或甜味剂(如本领域已知的)的约1％至约99％重量之间。此类治疗有用组合物中的活性化合物的量为使得将获得有效的剂量水平。
在无菌条件下，例如通过冻干制备肠胃外化合物/组合物可以使用本领域技术人员熟知的标准药物技术容易地实现。在至少一个实施方案中，可以通过使用适当的配制品技术(诸如掺入溶解度增强剂)来增加可用于制备肠胃外组合物的化合物的溶解度。
如前所述，也可以经由输注或注射(例如，使用针(包括微针)注射器和/或无针注射器)施用本公开的化合物/组合物。活性组合物的溶液可以是水性的，任选地与无毒表面活性剂混合和/或可以含有载剂或赋形剂，诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地在从3至9的pH下)，但是对于一些应用，可以将它们更合适地配制成无菌非水性溶液或配制为干燥形式以与合适的媒介物诸如无菌、无热原水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)结合使用。例如，可以在甘油、液体PEG、三乙酸甘油酯及其混合物中和在油中制备分散体。在常规的存储和使用条件下，这些制剂还可以含有防腐剂以防止微生物的生长。
适合于注射或输注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌水性溶液或分散体或无菌粉末，其适于临时制备无菌可注射或不溶解性溶液或分散体，任选地包封在脂质体中。在所有情况下，最终剂型应为无菌的液体并且在生产和存储的条件下是稳定的。液体载剂或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，其包含例如但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体PEG等)、植物油、无毒甘油酯和/或其合适的混合物。在至少一个实施方案中，可以通过形成脂质体、在分散体的情况下通过维持所需的粒度或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过添加各种抗细菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在某些情况下，需要包括一种或多种等渗剂，诸如糖、缓冲剂或氯化钠。可以通过掺入配制成延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
可通过以下方式制备无菌可注射溶液：根据需要将活性化合物和/或组合物掺入具有上文所阐述的一种或多种其他成分的所需量的适当溶剂中，随后进行过滤器灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，它们产生在其先前无菌过滤的溶液中存在的活性成分加任何另外的所需成分的粉末。
对于局部施用，可能期望将本发明化合物作为与可以为固体或液体的皮肤病学上可接受的载剂组合的组合物或配制品施用于皮肤。例如，在某些实施方案中，固体载剂可以包括精细分开的固体诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。类似地，有用的液体载剂可以包含水、醇或二醇或水醇/乙二醇混合物，其中本发明化合物能以有效的水平溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂。另外或可替代地，可以添加佐剂诸如芳香剂和抗微生物剂以优化给定用途的特性。所得的液体组合物可以从吸收层施加，用于浸渍绷带和/或其他敷料，使用泵型或气溶胶喷雾器喷射到靶标区域，或简单地直接施加到受试者的所需区域。
增稠剂(诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、经修饰的纤维素或经修饰的矿物材料)也可以与液体载剂一起使用，以形成可扩散糊剂、凝胶、软膏、肥皂等直接施加到受试者的皮肤上。
如本文所用，术语“治疗有效的”、“治疗有效剂量”、“治疗有效量”、“预防有效量”、或“预防有效剂量”意指(除非另有具体说明)当施用一次或在治疗周期过程中施用时影响受试者的健康、幸福或死亡率(例如但不限于延迟与纤维化疾病或病状和/或癌症相关的一种或多种症状的发作和/或降低所述症状的严重性，如适用)的化合物的量。可以通过比较其在动物模型中的体外活性和体内活性来确定本公开的化合物的有用剂量。小鼠和其他动物中的有效剂量的外推方法是本领域已知的。实际上，化合物的剂量可以取决于宿主受试者的病状、所治疗的癌症或纤维化疾病、病理学如何进展、化合物施用途径和组织分布、以及其他治疗性治疗(诸如放射疗法或组合疗法中的另外的药物)的共同使用的可能性而显著变化。用于治疗所需的组合物的量(例如，治疗或预防有效的量或剂量)将不仅随着特定应用而变化，而且还随着所选择的盐(如适用)和受试者的特征(例如，年龄、状况、性别、受试者的体表面积和/或质量、对药物的耐受性)而变化，并且最终将由主治医师、临床医生或其他因素来决定。治疗有效或预防有效的量或剂量可以在以下范围内：例如，从约0.05mg/kg的患者体重至约30.0mg/kg的患者体重、或从约0.01mg/kg的患者体重至约5.0mg/kg的患者体重，包括但不限于0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg和5.0mg/kg，它们全部为kg患者体重。化合物的总的治疗或预防有效量可以以单剂量或分次剂量施用，并且可以根据执业医生的决定落在本文给出的典型范围之外。
在另一个实施方案中，化合物可以按以下治疗或预防有效量施用：从约0.5g/m至约500mg/m2、从约0.5g/m2至约300mg/m2、或从约100g/m2至约200mg/m2。在其他实施方案中，所述量可以为从约0.5mg/m2至约500mg/m2、从约0.5mg/m2至约300mg/m2、从约0.5mg/m2至约200mg/m2、从约0.5mg/m2至约100mg/m2、从约0.5mg/m2至约50mg/m2、从约0.5mg/m2至约600mg/m2、从约0.5mg/m2至约6.0mg/m2、从约0.5mg/m2至约4.0mg/m2、或从约0.5mg/m2至约2.0mg/m2。总量可以以单剂量或分次剂量施用，并且可以根据医生的决定落在本文给出的典型范围之外。这些量基于体表面积的m。
在一些实施方案中，关于测量来自受试者的样品中的某些生物标志物的表达和/或对细胞因子水平的分析，本公开的意义不是用于检测标志物或标志物集合的特定方法，而是哪些标志物被用于检测。有许多方法可以用于检测一种或多种生物标志物的表达、定量或谱。一旦鉴定出待检测或定量的标志物或标志物集合，就可以在提供适当的试剂的情况下使用(现在已知或下文开发的)几种技术中的任一种。当提供待鉴定的一种或多种生物标志物时，本领域技术人员将能够选择用于执行本文公开的方法的适当测定(例如，基于PCR或基于微量检测的核酸标志物测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质或抗体微阵列或类似的免疫测定等)。
化学实施例
实施例A：化合物1A的合成
根据下面方案1并且如以下文献所报道的来合成化合物1A：Nikunj M.Shukla,Cole A.Mutz,Subbalakshmi S.Malladi,Hemamli J.Warshakoon,RajalakshmiBalakrishna和Sunil A.David,“Regioisomerism-dependent TLR7agonism andantagonism in an imidazoquinoline；Structure-Activity Relationships in HumanToll-Like Receptor 7-Active Imidazoquinoline Analogues,”J Med Chem.2012年2月9日；55(3):1106-1116。
方案1
Figure BDA0003510181380000661
步骤1：合成l-氨基-2-甲基丙-2-醇(化合物)
将2,2-二甲基环氧乙烷(0.1g，1.388mmol)逐滴添加到20mL冰冷的氢氧化铵溶液中。将反应混合物在室温下搅拌12小时。真空去除溶剂，并将残余物溶解于甲醇中。将二叔丁基二碳酸酯(0.75g，3.47mmol)添加到反应混合物中并搅拌4小时。使用柱色谱法(24％乙酸乙酯(EtOAc)/己烷)纯化混合物，以获得2-羟基-2-甲基丙基氨基甲酸叔丁酯。将纯的2-羟基-2-甲基丙基氨基甲酸叔丁酯溶解于5mL三氟乙酸中并搅拌35分钟。减压去除溶剂，以提供作为三氟乙酸盐1′的l-氨基-2-甲基丙-2-醇。1H NMR 500MHz(500MHz,CDC13,δ(以ppm为单位))：δ8.62(s,2H),3.02(d,2H),2.06-2.04(m,2H),1.37-1.34(s,6H).
步骤2：合成2-甲基-l-(3-硝基喹啉-4-基氨基)丙-2-醇(化合物2)
将l-氨基-2-甲基丙-2-醇(化合物)(450mg，2.4mmol)的三氟乙酸盐添加到4-氯-3-硝基喹啉(化合物1)(250mg，1.2mmol)和Et3N(0.5ml，3mmol)在甲苯和2-丙醇的4:1混合物中的溶液里。将混合物加热至70℃持续半小时，直到固体开始沉淀。然后将反应混合物冷却，过滤，用甲苯/2-丙醇(7:3)、醚和冷水洗涤。将残余物在80℃下干燥以获得2-甲基-l-(3-硝基喹啉-4-基氨基)丙-2-醇(化合物2)。液相色谱-质谱法(LCMS)分析：[M+H]+m/z＝261。
步骤3：合成l-(3-氨基喹啉-4-基氨基)-2-甲基丙-2-醇(化合物3)
将2-甲基-l-(3-硝基喹啉-4-基氨基)丙-2-醇(化合物2)(450mg，1.72mmol)溶解在甲醇中，并且经Pd/C作为催化剂用氢气球氢化4小时。然后使用硅藻土过滤溶液，随后减压蒸发溶剂，以提供l-(3-氨基喹啉-4-基氨基)-2-乙基丙-2-醇(化合物3)。LCMS:[M+H]+m/z＝231.HNMR 500MHz(CDC13,δ(以ppm为单位的))：δ8.12(s,1H),7.61-7.58(m,1H),7.48-7.40(m,2H),4.90(s,2H),3.47(2H),1.35-1.21(s,6H).
步骤4：合成l-(4-氨基-2-丁基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(化合物5，TLR7A)
向化合物3(100mg，0.43mmol)在无水THF中的溶液里添加三乙胺(66mg，0.65mmol)和戊酰氯(62mg，0.52mmol)。然后将反应混合物搅拌6-8小时，然后真空去除溶剂。将残余物溶解在EtOAc中，用水和盐水洗涤，并且然后经Na2S04干燥以获得中间体酰胺化合物。将其溶解在甲醇(MeOH)中，随后添加氧化钙，并且在110℃下微波加热1小时。然后去除溶剂，并且将残余物使用柱色谱法(9％MeOH/二氯甲烷)纯化以获得化合物4(58mg)。向化合物4在MeOH:二氯甲烷:氯仿(0.1:1:1)的溶剂混合物中的溶液里添加3-氯过氧苯甲酸(84mg，0.49mmol)，并且将溶液在45-50℃下回流40分钟。然后去除溶剂，并且将残余物使用柱色谱法(20％MeOH/二氯甲烷)纯化以获得氧化物衍生物(55mg)。然后将其溶解在无水二氯甲烷中，随后添加苯甲酰基异氰酸酯(39mg，0.26mmol)，并在45℃下加热15分钟。然后真空去除溶剂，并且将残余物溶解在无水MeOH中，随后添加过量的甲醇钠。然后将反应混合物在80℃下加热一小时。真空去除溶剂，并且将残余物使用柱色谱法(11％MeOH/二氯甲烷)纯化以获得化合物5。LCMS：[M+H]+m/z＝312。HNMR 500MHz(CDC13,δ(以ppm为单位))：δ8.16-8.15(d,1H),7.77-7.46(d,1H),7.46-7.43(m,1H),7.33-7.26(m,1H),3.00-2.97(m,2H),1.84-1.78(m,2H),1.47-1.41(m,2H),1.36(s,6H),0.98-0.95(m,3H).
实施例B：化合物1B的合成
化合物1A随后可以用于根据下面方案2合成化合物1B。
方案2
Figure BDA0003510181380000681
化合物1A、叶酸盐和连接基可商购获得或可以根据本领域技术人员已知的方法制备。
在室温下在氮气气氛下将异双官能连接基7(88mg，0.213mmol)添加到化合物5(33mg，0.106mmol)和二甲基氨基吡啶(39mg，0.319mmol)在4mL二氯甲烷中的溶液里，并且将混合物在回流温度下搅拌7小时，此时对混合物的薄层色谱法(TLC)分析指示>80％的转化。将混合物浓缩，并且使用在二氯甲烷中的10％乙腈作为洗脱剂通过柱色谱法纯化。获得呈淡黄色固体的纯的产物化合物9。将化合物8(1当量)在二甲亚砜(DMSO)中的溶液以20分钟的间隔以3份添加到药物-连接基中间体化合物9(1.0当量-1.5当量)在具有二甲基氨基吡啶(1当量)的DMSO中的溶液里。在氩气下在室温下搅拌1-2小时之后，对混合物的LCMS分析指示形成所需叶酸盐-药物缀合物(化合物10)作为主要产物。通过制备型高效液相色谱法(HPLC)纯化混合物。LCMS:[M+H]+m/z＝959.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.58(s,1H),8.49(d,J＝8.8Hz,1H),7.90(d,J＝8.3Hz,1H),7.83–7.74(m,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,2H),7.48(t,J＝7.6Hz,1H),7.41(s,1H),7.06(s,1H),6.81(d,J＝6.2Hz,1H),6.61(d,J＝8.3Hz,2H),6.27(s,1H),4.43(d,J＝5.9Hz,2H),4.28(t,J＝6.6Hz,2H),4.00(d,J＝25.7Hz,3H),3.03(t,J＝7.5Hz,2H),2.97(dd,J＝13.0,6.5Hz,1H),2.09(s,2H),1.81(s,7H),1.40(q,J＝7.4Hz,2H),1.22(s,2H),1.13(s,2H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H).
实施例C：化合物2A的合成
可以根据方案3和方案4合成化合物2A。
方案3
Figure BDA0003510181380000691
方案4
Figure BDA0003510181380000692
加载半胱氨酸的Wang树脂(11)最初使用在二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶进行脱保护。在苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBop)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和DMF的存在下，用Fmoc-Glu(OtBu)-COOH处理游离胺。将偶联产物使用在DMF中的20％哌啶进行脱保护，并且在PyBop、DIPEA和DMF的存在下用蝶酸处理，从而产生化合物12。将三氟乙酰基基团用50％氨-DMF溶液进行脱保护。最后，使用三氟乙酸:三异丙基硅烷:水:三(2-羧基乙基)膦混合物溶液切割树脂，并且使用HPLC进行纯化，得到呈黄色固体的叶酸盐-半胱氨酸(13)。
化合物14最初用异双官能连接基试剂(15)处理，得到叶酸盐-半胱氨酸二硫化物中间体(16)。然后这与在DMSO中的叶酸盐-半胱氨酸(13)反应，并且使用HPLC进行纯化以产生化合物17(例如，化合物2A)。使用碳酸氢铵和乙腈作为缓冲体系，用LCMS表征所有化合物。化合物2A的LCMS观察到的质量为[M+H]+＝1082.2。
结合相关领域的现状，特别是根据上文所阐述的方案1、2和3，本公开提供了足够的细节，使得本领域的普通技术人员可以利用本文中所阐述的概念来合成本公开的所有其他化合物。
治疗方法
除了本文所述的化合物之外，还提供了用于提供治疗和/或预防纤维化疾病或癌症的方法。
在一些实施方案中，本文提供了治疗患有纤维化疾病状态或癌症的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的细胞与本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐、或包含本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐的(例如，药物)组合物接触，所述本文提供的任何化合物诸如具有式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII、式XVIII、式XX或式XXX中任一者的结构的化合物。在一些实施方案中，免疫调节剂包含TLR7、TLR8或TLR9的激动剂。
在一些实施方案中，本文提供了治疗有需要的个体中的肿瘤性、炎症性、自身免疫性或纤维化疾病或病症的方法，所述方法包含向所述个体施用本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐、或包含本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐的(例如，药物)组合物，所述本文提供的任何化合物诸如具有式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII、式XVIII、式XX或式XXX中任一者的结构的化合物。
在一些实施方案中，本文提供了治疗有需要的个体中的肿瘤性疾病或病症的方法，所述方法包含向所述个体施用本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐、或包含本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐的(例如，药物)组合物，所述本文提供的任何化合物诸如具有式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII、式XVIII、式XX或式XXX中任一者的结构的化合物。在一些实施方案中，所述肿瘤性疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，癌症选自膀胱癌、脑癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、胸腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、食管癌、胰腺癌和乳腺癌。
在一些实施方案中，本文提供了治疗有需要的个体中的纤维化疾病或病症的方法，所述方法包含向所述个体施用本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐、或包含本文提供的任何化合物或其药学上可接受的盐的(例如，药物)组合物，所述本文提供的任何化合物诸如具有式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、式XII、式XIII、式XIV、式XV、式XVI、式XVII、式XVIII、式XX或式XXX中任一者的结构的化合物。在一些实施方案中，所述纤维化疾病或病症是纤维化。在一些实施方案中，所述纤维化选自IPF、脂肪性肝病、肝硬化、结肠炎、慢性肝病、心脏纤维化和硬皮病。
在某些实施方案中，本文提供了预防或治疗纤维化疾病状态的方法，所述方法包括使细胞与至少一种化合物接触，所述至少一种化合物包含经由连接基与叶酸盐配体或其功能片段或类似物附接的免疫调节剂或其药学上可接受的盐，其中所述免疫调节剂或其药学上可接受的盐靶向模式识别受体。
在本文提供的化合物、组合物和/或方法的一些实施方案中，免疫调节剂包含TLR激动剂，并且具有由式X或XX表示的结构，或者是式X或XX的药学上可接受的盐：
Figure BDA0003510181380000711
其中在式X和XX中：
R1是-NH2或-NH-R1X，
R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基，
-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure BDA0003510181380000712
并且
Figure BDA0003510181380000713
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环；
其中在式X中，R3是-OH、-SH、-NH2或-NH-R1X；
其中在式XX中，X是CH、CR2或N；并且
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基。
在一些实施方案中，所述细胞包含经历纤维化疾病状态或处于经历纤维化疾病状态的风险下的受试者的细胞，并且使所述细胞与至少一种化合物接触还包括向所述受试者施用或应用治疗有效量的所述至少一种化合物。在一些实施方案中，受试者是经历IPF的患者，并且所述至少一种化合物通过静脉内、肌内、腹膜内、局部的方式或通过吸入施用于所述受试者。在一些实施方案中，纤维化疾病状态包括IPF或者肝、皮肤、膀胱、心脏、胰腺、前列腺或肾的纤维化疾病。
在一些实施方案中，所述方法还包括获得或已经获得来自所述受试者的样品；定量所述样品中的一种或多种生物标志物的表达水平，所述一种或多种生物标志物中的每一种选自由以下组成的组：CCL18、精氨酸酶1(Arg1)、基质金属肽酶9(MMP9)、金属蛋白酶3(TIMP 3)、IL-1β、羟基脯氨酸、胶原、PDGF、TGFβ、FRβ、TNFα、IFN-γ、抗甘露糖受体(CD206)、分化簇86(CD86)、分化簇163(CD163)、IL-6、趋化因子10(CXCL10)、免疫干扰素(IFNα)；将所述样品中的所述一种或多种生物标志物中的每一种的表达水平与对照中的此类生物标志物的表达水平进行比较；并且如果CCL18、Arg1、MMP9、TIMP 3、IL-1β、PDGF、TGFβ、FRβ、CD206、CD163、羟基脯氨酸或胶原相对于对照的表达水平被上调或者TNFα、IFN-γ、IL-6、CXCL10、IFNα或CD86相对于对照的表达水平被下调或不表达，则向或已经向所述受试者施用治疗有效量的非缀合的激动剂或抑制剂。在一些实施方案中，叶酸盐配体或其功能片段或类似物对FRβ具有特异性并且与细胞上的FRβ结合。
在至少一个实施方案中，提供了用于治疗和/或预防纤维化疾病(例如IPF)的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种化合物，所述一种或多种化合物包含与药物(经由连接基或以其他方式)附接的靶向部分(诸如，叶酸盐受体结合配体)，以用于将纤维化组织或器官中的M2样巨噬细胞重新编程至M1样表型。例如，药物可以是toll样受体激动剂(例如，具有式I、III或IV)或与叶酸盐缀合的可有效将巨噬细胞从M2表型重新编程至M1表型的任何其他分子或化合物。在至少一个实施方案中，所述药物可以选自TLR 3激动剂、TLR7激动剂、TLR 7/8激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。在一些实施方案中，所述药物可以将M2样巨噬细胞重新编程为M1表型，从而减少促纤维化细胞因子和生长因子产生。
在至少一个实施方案中，提供了用于治疗患有疾病状态或处于经历疾病状态的风险下的受试者的方法，其中所述疾病状态包括纤维化疾病状态或癌症，并且所述方法包括使所述受试者的细胞与至少一种化合物接触。所述至少一种化合物可以包含本公开的任何化合物，并且在至少一个示例性实施方案中，包含对FRβ具有特异性的靶向部分。在一些情形中，接触细胞可以通过静脉内、肌内、腹膜内、局部、口服或通过吸入或本文所述的任何其他施用模式向所述受试者施用所述至少一种化合物来实现。另外或可替代地，所述至少一种化合物可以包含含有一种或多种药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或媒介物或其组合的组合物。所施用的至少一种化合物的剂量可以由临床医生酌情修改；然而，所述至少一种化合物优选地以治疗有效或预防有效的量给药，并且在至少一个实施方案中，所述剂量在1nmol/kg受试者体重与50nmol/kg受试者体重之间的范围内。
现在参考图2，使用本公开的化合物中的一种或多种显示了表示用于预防或治疗纤维化疾病状态或癌症的方法1900的流程图。在至少一种情形中，方法1900包括使受试者的细胞与至少一种化合物接触的步骤，所述至少一种化合物包含经由连接基与叶酸盐配体或其功能片段或类似物附接的免疫调节剂(或其药学上可接受的盐)(步骤1902)。在至少一个示例性实施方案中，免疫调节剂或其药学上可接受的盐靶向模式识别受体。细胞可以包括例如经历纤维化疾病状态或处于经历纤维化疾病状态的风险下的受试者的细胞，并且所述至少一种化合物可以包括本文提供的化合物中的任一种。
在至少一个实施方案中，使细胞与至少一种化合物接触的步骤1902还包括向所述受试者施用或应用治疗有效量的所述至少一种化合物。另外或可替代地，所述至少一种化合物可以包含含有一种或多种药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或媒介物或其组合的组合物。
在至少一个实施方案中，所述疾病状态包括IPF或者肝、皮肤、心脏或肾的纤维化疾病。此外，所述受试者可以包括小鼠、人或任何其他哺乳动物。
除了步骤1902之外，方法1900还可以任选地包括步骤1904-1910。在步骤1904，从受试者获得生物样品，并且在步骤1906，定量样品中一种或多种生物标志物的表达水平。例如，样品可以从抽取自受试者的一定量的外周血获得。
定量步骤1906可以使用本领域已知的任何适当方法进行，并且可以包括例如qPCR、质谱法、ELISA和/或能够测量/定量生物标志物表达的任何其他模式。在至少一个示例性实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自由以下组成的组：CCL18、Arg1、MMP9、TIMP 3、IL-1β、PDGF、TGFβ、FRβ、羟基脯氨酸、胶原、TNFα、IFN-γ、CD206、CD163、IL-6、CXCL10、IFNα和CD86。
在步骤1908，将样品中的一种或多种生物标志物中的每一者的表达水平与对照中的此类生物标志物的表达水平进行比较。对照可以是健康个体或仅仅是没有经历所讨论的疾病状态的个体。在至少一个实施方案中，样品中的一种或多种生物标志物的表达水平与对照中的一种或多种相关生物标志物的表达水平之间的临床差异可以指示受试者患有所讨论的疾病状态。例如但不限于，如果比较步骤1908指示生物标志物CCL18、Arg1、CD163、MMP9、TIMP3、IL-1β、PDGF、TGFβ、FRβ、羟基脯氨酸、胶原和/或CD206(即，“促纤维化生物标志物”)中的一种或多种的表达与对照相比被上调，则其指示受试者经历与M2样巨噬细胞表型关联的促纤维化免疫反应。因此，在至少一个实施方案中，此类结果指示需要施用本公开的一种或多种化合物以将此类M2样巨噬细胞重新编程至M1表型。
相反，如果比较步骤1908指示前述生物标志物的表达与对照相比被下调，或者如果TNFα、IFN-γ和/或CD86(“抗纤维化生物标志物”)中的一种或多种的表达与对照相比被上调，那么在某些实施方案中这指示所述受试者对先前施用的化合物(如适用)显示出正面应答和/或所述受试者正在经历与M1表型关联的抗纤维化免疫应答。
任选地，在步骤1910，如果与对照中的相应表达水平相比，样品中的一种或多种促纤维化生物标志物的表达被上调，或者如果与对照中的相应表达水平相比，一种或多种抗纤维化生物标志物的表达被下调，则可以施用替代疗法。在至少一个实施方案中，替代疗法可以包括施用治疗有效量的先前在步骤1902施用的至少一种化合物的衍生物，其中所述衍生物包含关于采用不同靶向部分、不同的连接基大小和/或不同的免疫调节剂修饰的先前施用的至少一种化合物，以试图更好地优化所述至少一种化合物对受试者的功效。另外或可替代地，可以采用其他治疗，包括通常已知用于治疗所讨论的纤维化疾病的那些。步骤1904-1910可以根据需要或根据期望进行重复。
另外的实施方案可以提供用于治疗和/或预防癌症(无论是叶酸盐受体阳性还是叶酸盐受体阴性)的方法。例如，在某些情形中，这样的方法包括向宿主受试者施用治疗有效量和/或预防有效量的一种或多种化合物，所述一种或多种化合物包含与药物(经由连接基或以其他方式)附接的靶向部分以将癌性细胞和/或肿瘤细胞中的M2样巨噬细胞重新编程至M1样表型。在癌症是叶酸盐受体阴性的情况下，这种施用可以另外起到耗尽或抑制存在于此类组织/肿瘤中的MDSC的作用。例如但不限于，所述药物可以选自PI3k抑制剂、信号转导器和转录激活因子6(STAT6)抑制剂、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制剂、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂和抗炎症药物(例如，甲氨蝶呤)。在至少一个实施方案中，所述药物可以灭活MDSC。
在描述代表性实施方案中，本公开可能已经呈现了以特定步骤序列的方法和/或过程。就方法或过程不依赖于本文所阐述的特定步骤顺序来说，所述方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。如本领域普通技术人员将了解的，其他步骤顺序可能是合理的。因此，本文所公开的步骤的特定顺序不应解释为对权利要求的限制。另外，针对方法和/或过程的权利要求不应限于按照所书写的顺序执行其步骤，并且本领域技术人员可以容易地了解，所述顺序可以变化并且仍然保持在本公开的精神和范围内。
实施例
从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得人单核细胞THP-1细胞，并且将其在含有10％热灭活胎牛血清和1％青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的叶酸盐缺乏RPMI 1640培养基中进行培养。最初选择THP-1细胞作为模型系统，因为已知这种人单核细胞系在用IL-4、IL-6加IL-13刺激后获得M2样表型并产生大量的促纤维化细胞因子。
从Biolegend获得IFN-γ、IL-4、白介素6(IL-6)和白介素13(IL-13)。佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、脂多糖(LPS)、所有其他试剂和溶剂购自Sigma。
实施例1：THP-1细胞在体外向M2样巨噬细胞的分化和极化
将THP-1细胞以60000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。通过与200nM PMA一起孵育48小时，然后在新鲜RPMI培养基中孵育24小时，将细胞分化成非极化巨噬细胞。将所得的巨噬细胞通过以下方式极化至M2样表型：与20ng/ml IL-4、20ng/ml IL-13和5ng/mL IL-6一起孵育3天，然后用不同浓度的化合物1A和化合物1B重新编程48小时并且收获用于通过定量聚合酶链反应(qPCR)进行基因分析。将培养物在潮湿的5％CO2培养箱中维持在37℃。
为了评价有效力的TLR7激动剂(例如，化合物1A；例如，式III的)是否可以将促纤维化巨噬细胞重新编程为较少纤维化的表型，将IL-4、IL-6加IL-13刺激的THP-1细胞与不同浓度的非靶向化合物1A一起孵育，并且检查若干种促纤维化标志物(即，CCL18、CD206、IL-1β以及PDGFα和β)的mRNA水平。
如图3A-3C中所示，与化合物1A一起孵育48小时诱导了CCL18、CD206和IL-1β表达的降低，表明TLR7激动剂的确可以促进这些促纤维化极化的THP-1细胞向较少纤维化表型的转变。此外，当检查TNFα(抗纤维化表型的标志物)的表达时，观察到其表达增加(图3D)，证实了已发生THP-1从促纤维化性质到抗纤维化性质的转变。
实施例2：巨噬细胞重新编程的评价
为了证实叶酸盐缀合的TLR7激动剂可以引起与实施例1中所见的相同的THP-1重新编程，制备了化合物1B，其中用二硫化物自我牺牲键构建了将叶酸盐与化合物1A连接的可释放的连接基以允许化合物1A在化合物1B内化到细胞内的内体的还原环境中后的释放。
将不同浓度的化合物1A或化合物1B与上述极化的THP-1巨噬细胞一起孵育指定的时间，其后收获培养基用于分析所分泌的细胞因子和收集细胞用于qPCR分析。
根据制造商推荐的方案，使用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA)，从1x 105–2x 105个巨噬细胞中分离总RNA。然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA；#4368814)将RNA样品逆转录为cDNA。使用iTaqTMUniversal SYBR Green SuperMix(Bio-Rad Laboratories GmbH,Hercules,CA；#1725121)、iCycler热循环仪和iCycler iQ 3.0软件(Bio-Rad Laboratories GmbH,Hercules,CA)进行qPCR分析以跟踪表征巨噬细胞极化状态的标志物的表达。将IL-6、CXCL10、IFNα、IFN-γ和CD86用作M1表型的标志物，而将CCL18、CD206、CD163和Arg1用作M2表型的标志物。测量作为促纤维化表型的指示器的IL-1β、PDGFβ、MMP9和TIMP 3。将IRAK-4用作TLR7刺激的指示器。为了控制扩增产物的特异性，进行熔融曲线分析。在任何反应中均未观察到非特异性产物的扩增。对于每种标志物，以一式三份独立地分析每个样品。
在重复上述研究后(参见灰色条，图3A-3F)，观察到相同的定性变化，仅化合物1B的影响的量值略微减小。效力的这种减小是预期的，因为非靶向TLR7激动剂立即进入培养的细胞，然而其叶酸盐靶向相似物被设计成仅在叶酸盐受体结合和受体介导的胞吞作用之后进入细胞。
图4A-4E和图5A-5D示出了表示由诱导成M2巨噬细胞的THP-1细胞测量的各种标志物水平的图形数据，所述M2巨噬细胞细胞随后与不同浓度的化合物1B或化合物1A一起孵育2小时，用PBS洗涤，为了获得图5A-5D中所示的数据，再孵育46小时(对于图4A-4E中所示的数据，在初始2小时孵育后立即收获细胞)。在两个数据集中，收获细胞用于通过qPCR进行的基因分析。图4A-4C示出了CCL18 mRNA水平(图4A和图5A)、CD206mRNA水平(图4B和图5B)、IL-1βmRNA水平(图4C和图5C)和PDGFβmRNA(图4E)。数据支持在施用测试化合物之后M2型促纤维化表型被下调。特别地，化合物1B对巨噬细胞促纤维化/M2型标志物的下调多于化合物1A。此外，图4D示出了CD86 mRNA水平并且图5D示出了TNFα水平，该数据支持M1样表型在施用测试化合物后被上调。在收集时，未示出PDGFα的数据，因为在治疗后未观察到显著差异。
由于低分子量水溶性药物(如化合物1A和化合物1B)通常在注射的2小时内从体内排出，因此体内药物暴露的更具生理学相关性的体外模型用来限制细胞与药物一起孵育仅两小时，并且然后在不存在药物的情况下再孵育46小时之后检查药物功效。如图4A-4E中所示，当在将含有药物的培养基替换为无药物培养基之前将THP-1细胞与TLR7激动剂一起孵育2小时时，观察到化合物1B具有优于化合物1A的效力，特别是在TNFα诱导的情况下，其中叶酸盐靶向的缀合物显著改善。这最有可能是因为叶酸盐靶向的TLR7激动剂被叶酸盐受体阳性细胞捕获，然而化合物1A不被相同细胞保留。
这些数据支持化合物1B在体内重新编程促纤维化巨噬细胞方面应更为有效，具有附加的优点，即叶酸盐缀合的药物(例如，化合物1B)也应引起较少的全身毒性，因为它集中在表达FRβ的巨噬细胞中，并且不能进入在整个身体内占据主导地位的叶酸盐受体阴性细胞(例如，化合物1B被设计为不可渗透到叶酸盐受体阴性细胞)。
图6A-6D示出了表示从用不同浓度的药物治疗48小时(图6A和6B)或治疗2小时、然后替换成新鲜培养基并培养剩余的46小时(图6C和6D)的诱导M2的THP-1巨噬细胞测量的各种标志物水平的图形数据。在这两种情况下，收集细胞上清液，并且通过ELISA检测所分泌的CCL18蛋白和IL-1β。该数据支持在低浓度范围(0.1-10nM)下，TLR7化合物或叶酸盐靶向TLR7化合物的施用下调了CCL18和IL-1β的分泌。
此外，为了确保上述mRNA分析准确地反映由IL-4、IL-6加IL-13刺激的THP-1细胞产生的促纤维化细胞因子的水平，通过ELISA测定来定量THP-1上清液中的CCL18和IL-1β多肽的浓度。如图6A和6B中所示，化合物1A和化合物1B两者当与激动剂一起连续孵育48小时时诱导了CCL18和IL-1β的降低，然而，当药物暴露仅限于2小时时，再次发现化合物1B是优异的(参见图6C和6D)。
实施例3：通过流式细胞术表征FRβ表达
为了测量FRβ在THP-1衍生的巨噬细胞上的表达，进行荧光激活细胞分选器(FACS)分析。细胞使用
Figure BDA0003510181380000761
细胞分离溶液(Biolegend,San Diego,CA；#423201)分离，并用细胞刮刀轻轻地刮下。用PBS洗涤细胞，并且通过与Fc受体阻断溶液(Biolegend,SanDiego,CA；#422301)在室温下孵育10分钟来阻断非特异性结合。然后添加生物素化的抗人FRβ单克隆抗体(m909)，并且将细胞在冰上再孵育30分钟，然后在染色缓冲液(补充有2％FBS的PBS)中洗涤。然后将细胞在荧光素标记的链霉抗生物素(BD Biosciences,FranklinLakes,NJ；#554060)中在冰上孵育20分钟，在PBS中洗涤两次，用7AAD(活力染色)染色15分钟并且使用BD Accuri C6软件(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)通过流式细胞术进行分析。图6E示出了流式细胞术数据，所述流式细胞术数据支持THP-1巨噬细胞以及是FRβ+的并且因此适合于化合物1B的体外研究和本文所述的其他研究。
图6F证实了化合物1B在培养基中在37℃下的孵育期期间保持稳定。实际上，化合物1B在48小时孵育之后保留原始结构。
实施例4：博来霉素诱导的肺纤维化和促纤维化巨噬细胞在体内重新编程
还进行了研究以确定是否可以在体内用连接叶酸盐的药物特异性地靶向肺纤维化肺中的巨噬细胞。在测试用于诱导小鼠的肺纤维化的多个方案之后，选择了方案，其中0.75mg/kg博来霉素(BM)经由气管中的切口滴注到C57BL/6小鼠的肺中，并且允许小鼠在开始疗法之前进展通过纤维化的炎症和纤维化两个阶段。(BM模型被广泛认为在使得能够进行与体内环境中的纤维生成相关的机制研究方面是有用的。)
如图7A-7D中所示，使用本方案治疗的小鼠通常在BM治疗后第7天显示出纤维化，并且这种新生的纤维化在第14天发展成重度纤维化。然后，在第21天其开始自发消退之前，病理的进展继续了另外2-5天。
更具体地，在室温(22℃)下在12小时的光暗循环下在无病原体条件下饲养来自Charles River的八周龄C57BL6雄性小鼠(平均重量22g至25g)。在BM或PBS滴注之前，向小鼠投喂叶酸盐缺乏食物(Envigo Teklad Global大鼠食物丸粒)持续1周。可自由获得新鲜水和叶酸盐缺乏的饮食。所有动物程序均根据美国国家卫生研究院(National Instituteof Health)指南获得Purdue动物护理和使用委员会批准。
其后，用氯胺酮/赛拉嗪麻醉小鼠，并且使用脱毛发剂洗剂对小鼠的颈部剃毛，然后用70％酒精灭菌。在颈部上制造出小切口以可视化气管。将小鼠以75度角定位并且使用带26G针的1cc注射器气管内地注射100μL溶解于PBS中的无菌PBS或BM(Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI；#13877)(0.75mg/kg)。在整个实验过程中每隔一天监测体重。
为了评价是否可以用连接叶酸盐的药物特异性地靶向这些小鼠中的促纤维化肺巨噬细胞，在滴注后10天，将10nmol(用于体内成像)或100nmol(用于体内标记)的连接叶酸盐的近红外荧光染料(OTL38)在有或没有200倍过量的FA-葡糖胺(OTL38的竞争剂)的情况下注射到BM治疗的小鼠的尾静脉中并且评价主要器官中的染料摄取。
在2小时之后，使用CO2窒息将小鼠处死，并且立即在从腹部到颈部的皮肤中制造切口以暴露肺和气管。然后在上气管中引入小切口以用于插入钝化的22规格的针，并且将尼龙线系在气管周围以密封针周围的气管。然后将气管(含有插入的针)、肺和心脏通过小心地切割肺下方的结缔组织而一同取出，并且用Dieffenbach血管夹剪下左肺的支气管。向右肺注射PBS并使用1ml注射器抽吸3次，并且将回收的灌洗液保存在冰上。
然后分析支气管肺泡灌洗液(BALF)以确定靶向TLR7激动剂如何工作。将BALF样品在4℃下以1500rpm离心5分钟，并将上清液等分并储存在-80℃下用于细胞因子/趋化因子分析。将细胞沉淀再悬浮并在预热的RPMI1640培养基中培养2小时，并且然后在收获用于qPCR测定之前用预热的PBS洗涤3次。然后将右肺系上尼龙线，并且用于羟基脯氨酸含量的后续分析。使用插入的注射器用1ml PBS使左肺膨胀，并将其转移到10％福尔马林溶液中用于后续组织学分析。
称取上面收集的右肺的肺叶，置于压力紧密的小瓶(Supelco Inc.,Bellefonte,PA；#27003)中，并在120℃下在砂浴中用6N HCl(10ml/g，v/w)水解3.5小时。将水解溶液在4℃下冷却15分钟，并转移到1.5ml Eppendorf管中，然后在4℃下以12,000rcf离心15分钟。小心收集上清液，等分并用于羟基脯氨酸(HYP)分析。
对于随后的HYP分析，将10μl样品转移到96孔板中，并用10μl的5.3M氢氧化钠溶液中和。然后将异丙醇(40μl)添加到每个孔中，随后添加20μl氧化缓冲液，并且将混合物在室温下在振荡器上孵育5分钟。添加分析试剂(260μl)，并且将板在室温下在振荡器上孵育30秒并在60℃下立即孵育25分钟。在15分钟内在560nm处测量吸光度(A560)。根据先前报道的方案制备所有试剂。
对于肺切片的组织学分析，将固定肺(参见上文)包埋在石蜡中，切片并用苏木精-曙红(H&E)、Masson三色或F3(抗小鼠FRβ抗体)染色。由经许可的病理学家以盲法的方式检查组织切片。使用Aperio-Image Scope(Leica Biosystems,Wetzlar,DE)按切片定量超过90x106个细胞。
CCL18和IL-1β在诱导的THP-1细胞上清液中使用人DuoSet ELISA开发系统(R&DSystems Europe,Abingdon,UK；#DY394-05)和IL-1β人ELISA试剂盒(Thermo FisherScientific,Waltham,MA；#BMS224-2)如制造商所描述进行定量。使用ELISA MAXTM Deluxe(Biolegend,San Diego,CA；#430804)分析BALF样品的小鼠IFN-γ。
最后，对于体内叶酸盐成像研究，切除主要器官(心脏、肺、脾、肝、小肠、大肠和肾)并且使用AMI活体成像器(Spectral Instruments Imaging,Tucson,AZ)进行成像。对于体内叶酸盐受体标记研究，在安乐死后立即收获小鼠的肺，如所描述的通过gentleMACS带加热板的八通道组织解离器(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,DE；#130-096-427)用肺解离试剂盒(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,DE；#130-098-427)如所描述的通过手动或通过70μm细胞滤过器(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,DE；#130-098-462)进行消化。通过硫酸铵裂解使收集在过滤液中的细胞耗尽红细胞，在冷的PBS中洗涤2次，并且用针对所需巨噬细胞标志物的抗体在冰上标记30分钟(FITC-CD11b，Biolegend,San Diego,CA，#101205；FE-F4/80，Biolegend,San Diego,CA，#123109)。然后将标记的巨噬细胞在PBS中洗涤两次，用7AAD(活力染色)染色15分钟，并且使用BD Accuri C6软件(BDBiosciences,San Jose,CA)通过流式细胞术进行分析。
如图7A(上图)中所示，未治疗的肺(PBS对照列)和在第7天时的BM治疗的肺显示出通过最小细胞外基质互连的类似高密度的肺泡。相比之下，在BM滴注后第14天，空气囊的大小和频率显著减少，并且细胞外基质的密度明显增加，提示在治疗的小鼠中发展出显著的纤维化。到第21天，该模型中的病理学已经开始自发消退，许多小鼠最终到第35天从BM诱导的创伤中恢复。
到第7天炎症发展的证据可见于表达FRβ的巨噬细胞的浸润(参见图7A的下图和图7B中的定量)所述表达FRβ的巨噬细胞几乎完全从健康肺中消失但在BM暴露的肺中持续累积至第14天。此外，如先前在文献中报道的，用F3染色示出了FRβ在IPF肺中(主要在间质空间中)的显著表达(图7A)。FRβ的表达限于发炎的肺(IPF患者或BM诱导的PF，但不在健康的肺中)。此外，在施用BM后第7天在小鼠肺中观察到表达FRβ的巨噬细胞，在第14天时表达最大(图7B)。这些结果与先前报道的在发炎的肺中激活的巨噬细胞上的FRβ表达相佐证。
然后，通过在尾静脉注射后在BM治疗的小鼠但不在健康小鼠的肺中积累了OTL38(即叶酸盐靶向荧光染料)证明可以用连接叶酸盐的分子靶向这些表达FRβ的巨噬细胞。如图7B中所示，仅在健康小鼠的肾(即，其主要排泄部位)中观察到OTL38荧光，在其他组织中很少或没有摄取。
图7C和7D示出了人IPF肺组织(图7C)和健康人肺组织(图7D)的FRβIHC染色。在BM或PBS滴注之前在滴注后10天向八周龄C57BL/6雄性小鼠投喂叶酸盐缺乏食物持续1周，在用或不用200倍过量的FA-葡糖胺的情况下经由尾静脉向小鼠注射10nmol(用于体内成像)或100nmol(用于体内标记)的OTL38。在2小时之后，在分析之前将小鼠处死。对于体内叶酸盐成像研究，切除主要器官(心脏、肺、脾、肝、小肠、大肠和肾)并且使用AMI活体成像器(Spectral Instruments Imaging,Tucson,AZ)进行成像。对于体内叶酸盐受体标记研究，在安乐死后立即收获小鼠的肺，消化并且然后用针对所需巨噬细胞标志物(FITC-CD11b,PE-F4/80)的抗体和7AAD(活/死染色)进行标记，并且通过流式细胞术进行分析。
图7E示出了从具有(BM)或不具有(PBS对照)BM诱导的实验性纤维化的小鼠获取并且用叶酸盐受体靶向荧光染料OTL38成像的各种小鼠组织/器官的图像，其中在纤维化诱导后第10天在不存在(b)或存在(c)200倍过量的叶酸盐靶向葡糖胺(FRβ的竞争性试剂，其阻断OTL38的结合)的情况下向健康小鼠(a列)或BM治疗的小鼠(b列和c列)尾静脉注射10nmolOTL38，并且在2小时后实施安乐死用于组织切除和荧光成像，支持了本公开的发明性FA靶向缀合物表现出FRβ特异性结合而在其他健康组织中不摄取。
向BM治疗的小鼠中尾静脉注射OTL38不仅在肾中产生前述荧光，而且还在纤维化肺中产生显著的累积(参见图7E)。当同时用200倍过量的叶酸盐-葡糖胺(即，FRβ结合的竞争性抑制剂(参见图7E))注射BM治疗的小鼠时，可以通过对肺累积的几乎定量阻断证明这种肺摄取主要由叶酸盐受体介导。这些数据证明，叶酸盐靶向分子选择性地结合在纤维化组织中的表达叶酸盐受体的细胞，而不在身体的其他组织中累积到任何显著的程度。换句话说，事实上可以用连接叶酸盐的分子靶向表达FRβ的巨噬细胞，并且在临床应用中几乎专门定位于纤维化组织。因此，当将靶向部分用于本公开的化合物中时，未被靶向的纤维化(或癌性)组织捕获的任何TLR7激动剂将是最少的。
接下来，为了确定哪种细胞类型在BM治疗的小鼠的肺中捕获叶酸盐染料缀合物，用胶原酶消化来自上述动物的肺，并且通过流式细胞术检查细胞特异性染料摄取。图7F示出了通过在不存在(第2行)或存在(第3行)200倍过量的叶酸盐靶向[葡糖胺]的情况下尾静脉注射了PBS(第1行)或100nmol OTL38的经历BM诱导的实验性纤维化的这种小鼠的体内标记产生的来自FACS分析的数据。如图7F中所示，当从未注射OTL38的BM治疗的小鼠中分离时，无巨噬细胞样细胞显示出任何荧光(参见第1行)。相比之下，来自注射OLT38的纤维化小鼠的约22％的巨噬细胞样细胞显示出显著的叶酸盐靶向染料保留(第2行)，其支持OTL38靶向发炎的肺中的FRβ阳性巨噬细胞。实际上，染料摄取是特异性叶酸盐受体介导的，如通过同时尾静脉注射200倍过量的叶酸盐-葡糖胺实质上阻断了所有叶酸盐-染料保留的观察结果所证明，证明了染料的积累需要未占据的叶酸盐受体。重要的是，该结论还得到以下数据的支持，所述数据显示FRβ表达在未治疗的肺中实质上不可检测(参见图7A)，但在BM治疗的肺中发展纤维化期间显著增加(参见图7A-7D)。FRβ在人IPF患者的肺中也显著表达。
实施例5
在将附接药物靶向于所建立的表达FRβ的纤维化巨噬细胞的能力下，然后研究了叶酸盐靶向TLR7激动剂是否可以能够抑制BM治疗的小鼠中的纤维化的体征和症状。对于这一点，从第10天开始每隔一天用媒介物(含3％DMSO的PBS)或化合物1B静脉内注射BM治疗的小鼠(参见图8A)。因为TLR7-54激动剂引起快速体重减轻，随后死亡(参见图9A和9B)，所以不能在体内类似地评价化合物1A。在小鼠中的BM诱导的实验性纤维化中，炎症已知在BM滴注后持续约9-10天。因为炎症至纤维化的转换在该模型中发生在大约第9天至第14天，并且促纤维化标志物开始在约第10天开始，给药开始于第10天(图8A)。
每隔一天给予两种剂量，直到第21天。将一天的单独剂量分开6小时以防止对TLR激动剂的任何“耐受性”。然后在第21天将小鼠处死，并且立即进行支气管肺泡灌洗，随后切除肺用于免疫组织化学和对胶原和羟基脯氨酸的定量。
图8B-8G示出了表示从用图8A的BM模型治疗的小鼠测量的各种标志物水平的图形数据，其中BALF在第21天时收集并且在4℃下离心，将所得的沉淀重悬浮于培养基中并接种到96孔板中，培养2小时，用预热的PBS洗涤3次，并且收获细胞用于qPCR；数据显示了Arg1(图8B)、MMP9(图8C)、TIMP 3(图8D)(例如，促纤维化标志物)全部被下调。CD86(图8E)和IFN-γ(图8F)(例如，抗纤维化标志物)两者都被上调。此外，TLR7信号传导IRAK-4的负调节因子被上调(图8G)，以及存在的BALF细胞的数目(图8H)。实际上，在用不同剂量的化合物1B治疗后，小鼠BALF细胞的总数目以剂量依赖性方式降低。图8B-8G中所示的每个值表示每个组的平均值±S.D.；*P<0.05，**P<0.005，***<0.0005；对于盐水相对于媒介物组、化合物1A和化合物1B治疗组相对于媒介物组，通过斯氏t检验计算，除了BALF细胞计数和蛋白质浓度测量(其中化合物1B治疗组和媒介物组通过Dunnett多重比较检验计算)之外；并且媒介物＝含3％DMSO的PBS。
如图8B-8D中所示，对支气管肺泡灌洗细胞的巨噬细胞亚群中的促纤维化标志物的qPCR分析揭示了相对于对照小鼠，在BM诱导的小鼠中Arg1、MMP9、以及TIMP 3的组织抑制剂全部都升高。更重要的是，平行研究证明，当用化合物1B治疗BM诱导的小鼠时，相同的促纤维化标志物全部被抑制，从而产生与健康小鼠中所见的那些相似的纤维化标志物水平。与这些数据一致，对抗纤维化标志物的定量揭示了，CD86的转录物(qPCR)和IFN-γ的浓度(灌洗液的ELISA)在用化合物1B治疗后均升高(参见图7E和7F)。连同所观察到的IRAK-4的上调(即，TLR激活的标志物；图7G中所示的结果)和存在的BALF细胞的总数目在用不同剂量的化合物1B治疗后以剂量依赖性方式降低(图7H)，这些数据证明，施用叶酸盐靶向TLR7激动剂可以在体内将在BM治疗的小鼠的肺中的巨噬细胞从促纤维化M2样表型重新编程为抗纤维化M1样表型。
实施例6
进行另外的研究以确定上述的纤维化肺巨噬细胞的重新编程是否导致纤维化小鼠中的纤维化病状的实际改善。将来自上述小鼠的肺组织包埋在石蜡中，并且切片并用H&E和Masson三色进行染色以分别评价组织密度和细胞外胶原沉积。
图9A和9B示出了用非靶向和靶向TLR7激动剂治疗的具有实验性肺纤维化的小鼠的存活曲线(图9A)和体重变化(图9B)。数据支持施用本公开的化合物(此处，例如化合物1B)会增加BM治疗的小鼠的存活，而不引起显著的体重减轻。每个值表示每个组的平均值±S.D.。
图10A示出了肺组织羟基脯氨酸含量(μg/肺)以利用胶原沉积作为纤维化的量度。示出了以下各项中的每一者在第21天时的组织：健康对照(盐水)(●)、疾病对照(媒介物)(■)、用游离药物TLR7激动剂(化合物1A)治疗(▼)，以及用叶酸盐靶向TLR7激动剂(化合物1B)治疗(▲)。与媒介物对照(■)相比，用10nmol的化合物1B(▲)和化合物1A(▼)中的任一者治疗的BM诱导小鼠显示出每个肺的总羟基脯氨酸含量的显著降低。图9A中所示的每个值表示每个组的平均值±S.D.；*P<0.05，**P<0.005，***<0.0005；通过斯氏t检验，盐水相对于媒介物组，化合物1A和化合物1B治疗组相对于媒介物组。
图10B和10C示出了在图10A中表示的具有H&E染色(图10B)和Masson三色(胶原)染色(图10C)的肺组织的染色图像。
如图10B的小图的H&E染色中所示，健康肺含有大量被薄的网状膜包围的空气囊。相比之下，BM诱导的肺显示出少得多的具有空气囊曾经存在的细胞外基质明显沉积的肺泡。最重要的是，从第10天开始用化合物1B治疗的BM滴注的小鼠表现出类似于健康小鼠的肺结构(图10B)，提示化合物1A靶向纤维化肺巨噬细胞可有效地抑制肺纤维化的主要标志。通过平行肺切片的Masson三色染色记录了对纤维化的这种预防实际上涉及对胶原沉积的阻断(图10C)，其中在用化合物1B经由尾静脉注射的小鼠中强烈抑制了胶原染色(图10B)。因此，数据支持用至少化合物1B(▲)治疗的IPF小鼠证明了IPF病理学的抑制(例如，纤维化)。
最后，为了证实化合物1B确实实际上影响胶原在体内的产生，定量在受累肺的总水解物中的羟基脯氨酸(胶原的主要组分)。更具体地，用PBS灌注来自上述小鼠的肺组织，用酸水解，并分析羟基脯氨酸含量。如图10A中所示，纤维化的诱导会诱导羟基脯氨酸含量大大增加并且这种增加在用化合物1B治疗时被抑制。因此，数据支持用本公开的靶向TLR7激动剂化合物治疗减少(并且甚至抵消)在体内的胶原沉积以及因此纤维化。
总而言之，用优化的BM剂量(0.75mg/kg)注射的小鼠的总体存活率通过用化合物1B治疗而显著改善，然而在用化合物1A的情况下除了显示出显著的体重减轻(>25％，图7)以外没有对存活率的益处。虽然游离药物在减少羟基脯氨酸含量方面表现更好，但所见到的不良存活率可以归因于总体毒性(即体重减轻，参见图7B)。这并不令人意外，因为已知全身施用TLR7激动剂会引起毒性。
实施例7
由于使用非靶向TLR7激动剂治疗IPF(或其他纤维化疾病)已经被其免疫系统的全身激活和所产生的毒性阻止，因此评估任何明显毒性是否可能已经伴随化合物1B在小鼠中的全身施用。为此，从第10天开始每隔一天用0、1、3或10nmol的化合物1B治疗BM诱导的小鼠，并且在第21天进行体重、肺羟基脯氨酸含量和组织学分析。与常规的全身施用不同，靶向药物不仅改善了存活率，而且还减少了体重减轻，突出了靶向方法的显著性(图11A和11B)。
图12示出了使用胶原沉积作为纤维化的量度关于叶酸盐靶向TLR7激动剂对BM诱导的小鼠中的纤维化抑制的剂量依赖性效应的数据。数据通过以下表示：健康对照(PBS，●)，用媒介物(■)、1nmol化合物1B(○)、3nmol化合物1B(□)或10nmol化合物1B(▲)治疗的BM诱导的小鼠，其中子部分A显示了随时间推移与BM诱导的小鼠的体重有关的图形数据，子部分B显示了用不同剂量(10nmol、3nmol或1nmol的化合物1B)治疗的肺组织的羟基脯氨酸含量的测量值(μg/肺)，并且子部分C显示了用H&E染色和三色染色的右肺组织的组织学分析的图像。
如图11B和图12的子部分A中所见，在用0、1、3或10nmol化合物1B治疗的小鼠之间未观察到体重减轻的差异，表明使用该化合物的重复剂量没有引起肉眼能见到的毒性。但是，可以从对各种肺水解物的羟基脯氨酸含量的比较见到这些治疗仍然对肺纤维化具有预期影响，其中功效的次序为10nmol/小鼠>3nmol/小鼠>1nmol/小鼠>0nmol/小鼠(图12的子部分B和C)。更重要的是，肺组织学的详细分析证明了随着化合物1B的剂量增加，肺组织学得到改善，这表明TLR7激动剂最集中的组织实际上是显微镜形态最正常的组织。总而言之，这些数据支持TLR7激动剂靶向在纤维化组织中的FRβ+巨噬细胞可以有效地预防纤维化，而不会全身性激活免疫系统，否则会限制TLR7激动剂在人类中的使用。
最后，为了确定这种抗纤维化效应是否能够用较低剂量实现，从事了具有两个较低剂量(3nmol/kg和1nmol/kg)的治疗研究(图9和图10)。有趣的是，虽然低剂量显示出羟基脯氨酸含量和胶原沉积水平的显著降低，但10nmol剂量提供了最佳存活率。
实施例8
为了支持除化合物1A和化合物1B之外的本公开化合物的实施方案在应用中类似地表现，在体外研究中检查了本文的化合物的其他代表性实施方案。
图13A-13D示出了表示从人THP-1细胞测量的各种标志物水平的图形数据，所述人THP-1细胞用20ng/mL IL-4、20ng/mL IL-13、5ng/mL IL-6诱导为M2巨噬细胞。随后用不同nM浓度的具有式IV的TLR7激动剂(例如，化合物2A)重新编程细胞48小时，并且收获用于通过qPCR进行基因分析。获得相对于M2样巨噬细胞对照的表达的以下标志物mRNA水平：CCL18mRNA水平(图12A)、IL-1βmRNA水平(图13B)和TNFα水平(图13C)，并且图13D示出了在收集细胞上清液之后的蛋白质分析结果。通过ELISA检测分泌的CCL18蛋白。
在图13A-13D中，关于其将M2样巨噬细胞重新编程至M1样巨噬细胞的能力，评价了本公开的具有式IV的激动剂化合物(例如，化合物2A)。
首先，使用先前描述的方法和材料将人单核细胞(THP-1)细胞诱导为M2样表型。特别地，将THP-1细胞以60000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。通过与200nM PMA一起孵育48小时，然后在新鲜RPMI培养基中孵育24小时，将细胞分化成非极化巨噬细胞。通过与20ng/ml IL-4、20ng/ml IL-13和5ng/mL IL-6一起孵育48小时，将所得的巨噬细胞极化为M2样表型。将培养物在潮湿的5％CO2培养箱中维持在37℃。
为了评价化合物2A是否可以将促纤维化巨噬细胞重新编程为较少纤维化的表型，将IL-4、IL-6加IL-13刺激的THP-1细胞与不同浓度的化合物2A一起孵育，并且使用qPCR和ELISA检查若干种促纤维化标志物(即，CCL18、IL-1β和TNFα)的mRNA水平。
如图图13A和13B中所示，与化合物2A(游离药物)一起孵育48小时诱导了CCL18和IL-1β表达的降低，表明TLR7激动剂的确可以促进这些促纤维化极化的THP-1细胞向较少纤维化表型的转变。(注意：图13B示出了指示化合物2A在较低浓度下具有抑制反应和在高浓度下具有刺激反应的钟形曲线，这是与某些药物共同的反应曲线。)此外，当检查TNFα(抗纤维化表型标志物)的表达时，观察到其表达增加(图13C)，证实了已发生THP-1从促纤维化性质到抗纤维化性质的转变。
除了非缀合的TLR7激动剂之外，同样地评价本公开的缀合化合物。将人THP-1细胞按照本文所阐述的方法诱导为具有M2样表型的巨噬细胞(例如，使用20ng/mL IL-4、20ng/mL IL-13、5ng/mL IL-6)，然后用不同nM浓度的各种以下本公开化合物重新编程2小时：即具有式I和/或II的非缀合(游离药物)TLR7激动剂化合物(数据共同显示为化合物3A)、具有式XV的叶酸盐缀合TLR7激动剂化合物(具有可释放的连接基)(例如化合物3B)、具有式XVII的叶酸盐缀合TLR7激动剂化合物(具有不可释放的连接基)(例如化合物3C)和具有式XVI的叶酸盐缀合TLR7激动剂化合物(具有不可释放的连接基)(例如化合物3D)。随后收获细胞用于通过qPCR进行基因分析并且分析了CCL18(图14A)、CD206(图14B)和IL-1β(图14C)的相对表达。
定量了各种促纤维化(M2表型)标志物CCL18、IL-1β和CD206标志物的表达。如图14A-14C中所示，在施用化合物3B、化合物3D和化合物3C中的每一者之后这些促纤维化标志物中的每一者的表达减少，其中化合物3D和化合物3C化合物(两者均具有不可释放的连接基)相对于其他化合物最为有效。
图15示出了在用化合物3A、化合物3B、化合物3C或化合物3D治疗之后图14A-14C的THP-1细胞组中的每一者组中所分泌的CCL18蛋白质水平。在低浓度范围(0.1-10nM)下化合物3A和叶酸盐靶向TLR7化合物(例如，化合物3B、化合物3C和化合物3D)下调CCL18的分泌。
此外，收集细胞上清液，并且通过ELISA检测所分泌的CCL18蛋白。图15证实了化合物3A(游离药物)和叶酸盐靶向化合物(化合物3B、化合物3C和化合物3D)在低浓度范围(0.1-10nM)下全部都下调CCL18的分泌，进一步支持类似于结合化合物1A和化合物1B所描述的实例，这些化合物可以通过相似机制类似地将M2样促纤维化巨噬细胞重新编程至M1样抗纤维化巨噬细胞。
实施例9
在重复上述研究后(参见灰色条，图3A-3F)，观察到相同的定性变化，仅化合物1B的影响的量值略微减小。效力的这种减小是预期的，因为非靶向TLR7激动剂立即进入培养的细胞，然而其叶酸盐靶向相似物被设计成仅在叶酸盐受体结合和受体介导的胞吞作用之后进入细胞。由于低分子量水溶性药物(如化合物1A和化合物1B)通常在注射的2小时内从体内排出，因此体内药物暴露的更具生理学相关性的体外模型用来限制细胞与药物一起孵育仅两小时，并且然后在不存在药物的情况下再孵育46小时之后检查药物功效。如图4A-4E中所示，当在将含有药物的培养基替换为无药物培养基之前将THP-1细胞与TLR7激动剂一起孵育2小时时，观察到化合物1B具有优于化合物1A的效力，特别是在TNFα诱导的情况下，其中叶酸盐靶向的缀合物显著改善。这最有可能是因为叶酸盐靶向的TLR7激动剂被叶酸盐受体阳性细胞捕获，然而化合物1A不被相同细胞保留。
这些数据支持化合物1B在体内重新编程促纤维化巨噬细胞方面应更为有效，具有附加的优点，即叶酸盐缀合的药物(例如，化合物1B)也应引起较少的全身毒性，因为它集中在表达FRβ的巨噬细胞中，并且不能进入在整个身体内占据主导地位的叶酸盐受体阴性细胞(例如，化合物1B被设计为不可渗透到叶酸盐受体阴性细胞)。
此外，为了确保上述mRNA分析准确地反映由IL-4、IL-6加IL-13刺激的THP-1细胞产生的促纤维化细胞因子的水平，通过ELISA测定来定量THP-1上清液中的CCL18和IL-1β多肽的浓度。如图6A和6B中所示，化合物1A和化合物1B两者当与激动剂一起连续孵育48小时时诱导了CCL18和IL-1β的降低；然而，当药物暴露仅限于2小时时，再次发现化合物1B是优异的(参见图6C和6D)。
实施例10
图16展示了在BM鼠模型中本公开化合物的至少一个实施方案的体内研究方法，所述化合物具有式XVII(例如，化合物3C)。图17A和17B是化合物3C的LC-MS光谱，并且支持缀合物的高纯度，并且未检测到游离药物。
图18A-18F示出了来自图16的体内研究方法的受试者小鼠的结果，包括存活曲线(图18A)、体重变化(图18B和18D)、具有BALF的细胞的浓度(图17C)、在活小鼠(图18E)和在所有小鼠(例如，包括活小鼠和在第21天前死亡的小鼠)(图18F)中的羟基脯氨酸浓度(μgHP/肺叶)。10nmol浓度剂量的具有式XVII的化合物(例如，化合物3C)增加了受试者小鼠的存活率，同时降低了HP和BALF细胞的数量。而且，3nmol浓度剂量未显示出可测量的对受试者小鼠的益处。
实施例11
M2诱导的人单核细胞衍生的巨噬细胞用100nM化合物1A或化合物1B连续地治疗持续48小时，或者在存在或不存在FA-葡糖胺(竞争)的情况下最初持续2小时，随后在不存在药物的情况下持续46小时(2+46h)。如图19中所示，然后确定了促纤维化标志物Arg1(图19A)、CD206(图19B)和CD163(图19C)的mRNA水平、以及所分泌的促纤维化CCL18(图19D)和抗纤维化细胞因子CXCL10(图19E)和IL-6(图19F)的蛋白质水平(n＝3，技术重复)。通过用过量FA-葡糖胺(2+46h，竞争)阻断未占据的叶酸盐受体来抑制两组细胞因子的变化。该数据支持化合物1B结合叶酸盐受体，因为生物标志物的下调被过量FA-葡糖胺(竞争剂)阻断。
实施例12
向健康小鼠尾静脉注射10nmol化合物1A(圆形)或化合物1B(正方形)，并且在药物注射后的指定时间点收集外周血。(图20A-C)血浆IL-6(图20A)、IFNα(图20B)和TNFα(图20C)的测量(n＝3)。(图20D-F)。分别在治疗后1.5小时、1小时或1小时确定药物浓度对IL-6(图20D)、IFNα(图20E)和TNFα(图20F)的血浆水平的影响(n＝2)(图20G)。化合物1A刺激健康小鼠中的全身细胞因子释放，而化合物1B不会。此外，化合物1B刺激的炎症细胞因子释放低于化合物1A剂量的一半。这些数据表明，如果TLR7激动剂用叶酸盐受体靶向配体靶向肺巨噬细胞，则可以安全地采用TLR7激动剂将纤维化肺巨噬细胞重新编程至抗纤维化状态。
实施例13
将来自图6中描述的相同健康和纤维化肺的切片用DAPI(细胞核；蓝色)、抗F4/80(巨噬细胞；红色)和抗CD206(M2巨噬细胞标志物；绿色)染色，并且如方法中所描述用LeicaVersa 8全载玻片扫描仪获得图像(n＝2)。比例尺，100μm。治疗组之间的差异指示化合物1B在体内产生稳健的抗纤维化反应。
虽然本文已经相当详细地描述了化合物、组合物和方法的各种实施方案，但这些实施方案仅通过非限制性实例的方式提供。鉴于本公开，本文描述的实施方案的许多变化和修改对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。因此，本领域技术人员将会理解，在不脱离本公开的范围的情况下可以进行各种改变和修改，并且可以用等效物代替其要素。实际上，本公开并不旨在是详尽的或限制性过强的。本公开的范围将由所附权利要求以及其等效物限定。
另外，虽然本文提供的许多实例使用小鼠模型，但本领域普通技术人员将会了解，小鼠模型中的基因表达模式与人类病状的基因表达模式显示出异常显著相关性，并且在人和小鼠中许多途径通常受多种病状调节。因此，小鼠模型中的基因表达模式和疾病进展紧密地再现了人类病状(特别是关于炎症疾病和癌症)的那些基因表达模式和疾病进展，并且因此支持本文阐述的工作实例与人类数据、特定病状和应用相关。
因此，预期本说明书和所附权利要求将涵盖基于本公开对本领域普通技术人员而言显而易见的所有修改和改变。

Claims (26)

1.一种由下式表示的化合物：
Q-L-T
其中，
Q是叶酸盐受体结合配体的基团；
L是连接基；并且
T是toll样受体(TLR)激动剂或其药学上可接受的盐的基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述连接基是不可释放的连接基。
3.如权利要求2所述的化合物，其中所述不可释放的连接基由下式表示：
Figure FDA0003510181370000011
其中：
n为1-30；并且
w为0-5。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述TLR激动剂是toll样受体7(TLR7)激动剂。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述TLR激动剂的基团具有由式X表示的结构：
Figure FDA0003510181370000012
其中，
R1是-NH2或-NH-R1X，
R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure FDA0003510181370000013
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基，
Figure FDA0003510181370000021
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环，并且
R3是-OH、-SH、-NH2或-NH-R1X。
6.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中所述TLR激动剂的基团具有由式XX表示的结构：
Figure FDA0003510181370000022
其中，
R1是-NH2或-NH-R1X，
R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure FDA0003510181370000023
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基，
Figure FDA0003510181370000024
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环，并且
X是CH、CR2或N。
7.如权利要求6所述的化合物，其中所述TLR的基团是具有由式XXX表示的结构的TLR7激动剂：
Figure FDA0003510181370000025
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，所述化合物还包含在靶向部分与免疫调节剂或其药学上可接受的盐之间的连接基Ln，其中所述连接基Ln被构造成避免释放所述TLR7激动剂的游离形式，并且n是等于或小于50的整数。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，所述化合物包含连接基Ln，其中所述连接基Ln包含聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物，n是选自范围1-32的整数，并且叶酸盐受体结合配体的基团是叶酸盐受体β结合配体。
10.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有由以下表示的结构：
Figure FDA0003510181370000031
11.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有由以下表示的结构：
Figure FDA0003510181370000032
12.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有由以下表示的结构：
Figure FDA0003510181370000041
13.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有由以下表示的结构：
Figure FDA0003510181370000042
14.一种药物组合物，其包含如权利要求4所述的化合物，其中所述TLR7激动剂具有由式XX表示的结构：
Figure FDA0003510181370000043
其中，
R1是-NH2或-NH-R1X，
R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure FDA0003510181370000051
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基，
Figure FDA0003510181370000052
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环，并且
X是CH、CR2或N。
15.一种治疗患有纤维化疾病状态或癌症的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的细胞与包括如权利要求1-13中任一项所述的化合物在内的至少一种化合物或如权利要求14所述的药物组合物接触，其中TLR激动剂或其药学上可接受的盐的基团包含TLR 7、8或9的激动剂。
16.一种包含经由连接基与toll样受体(TLR)激动剂附接的叶酸盐配体或其功能片段或类似物的化合物，所述TLR激动剂具有下式或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003510181370000053
其中：
R1是胺基，
R2是单键-NH-，
R3是H、烷基、羟基基团或其任何其他取代基团，
X是CH2、NH、O或S，并且
所述连接基在R1、R2或R3处附接。
17.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-13中任一项所述的化合物或如权利要求16所述的组合物，其中所述连接基包含聚乙二醇(PEG)连接基或PEG衍生物连接基，并且是在R3处附接的不可释放的连接基或者在R1、R2或R3处附接的可释放的连接基。
18.如权利要求1-13或权利要求16中任一项所述的化合物或如权利要求14所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的盐选自氢溴化物、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、抗坏血酸盐、盐酸盐、酒石酸盐、三氟甲磺酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐或富马酸盐。
19.一种预防或治疗纤维化疾病状态的方法，所述方法包括：
使细胞与至少一种化合物接触，所述至少一种化合物包含经由连接基与叶酸盐配体或其功能片段或类似物附接的免疫调节剂或其药学上可接受的盐，其中所述免疫调节剂或其药学上可接受的盐靶向模式识别受体。
20.如权利要求19所述的方法，其中免疫调节剂包含式X或XX的toll样受体(TLR)激动剂，或者是式X或XX的药学上可接受的盐：
Figure FDA0003510181370000061
其中在式X和XX中：
R1是-NH2或-NH-R1X，
R2是H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基、杂芳基、-NH-R2X、-O-R2X、-S-R2X、
Figure FDA0003510181370000062
并且
Figure FDA0003510181370000063
是3-10元含N的非芳族单环或二环杂环；
其中在式X中，R3是-OH、-SH、-NH2或-NH-R1X；
其中在式XX中，X是CH或N；并且
R1X、R2X和R2Y中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、烷基、烯基、炔基、脂环族、芳基、联芳基和杂芳基。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述细胞包含经历纤维化疾病状态或处于经历纤维化疾病状态的风险下的受试者的细胞，并且使所述细胞与至少一种化合物接触还包括向所述受试者施用或应用治疗有效量的所述至少一种化合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述受试者是经历特发性肺纤维化的患者，并且所述至少一种化合物通过静脉内、肌内、腹膜内、局部的方式或通过吸入施用于所述受试者。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述纤维化疾病状态包括特发性肺纤维化或者肝、皮肤、膀胱、心脏、胰腺、前列腺或肾的纤维化疾病。
24.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括：
从所述受试者或已经从所述受试者获得样品；
定量所述样品中一种或多种生物标志物的表达水平，所述一种或多种生物标志物中的每一者选自由以下组成的组：趋化因子(C-C基序)配体18(CCL18)、精氨酸酶1(Arg1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、金属蛋白酶3(TIMP3)、白介素1β(IL-1β)、羟基脯氨酸、胶原、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGFβ)、叶酸盐受体β(FRβ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFN-γ)、甘露糖受体(CD206)、分化簇163(CD163)、分化簇86(CD86)、白介素6(IL-6)、趋化因子10(CXCL10)和免疫干扰素(IFNα)；
将所述样品中的所述一种或多种生物标志物中的每一者的表达水平与对照中的此类生物标志物的表达水平进行比较；并且
如果CCL18、Arg1、MMP9、TIMP 3、IL-1β、PDGF、TGFβ、CD206、CD163、FRβ、羟基脯氨酸或胶原相对于对照的表达水平被上调或者TNFα、IFN-γ、IL-6、CXCL10、IFNα和CD86相对于对照的表达水平被下调或不表达，则向所述受试者或已经向所述受试者施用治疗有效量的非缀合的激动剂或抑制剂。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述叶酸盐配体或其功能片段或类似物对于叶酸盐受体β具有特异性并且与所述细胞上的叶酸盐受体β结合。
26.一种包含与靶向细胞的模式识别受体的免疫调节剂或其药学上可接受的盐附接的靶向部分的化合物，所述靶向部分包含叶酸盐配体或其功能片段或类似物。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3217981A1 (en) * 2021-05-14 2022-11-17 Philip Low Folate receptor-targeted conjugates with brush border membrane enzyme-cleavable linkers and methods of use in imaging and treating cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003028634A2 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Purdue Research Foundation Method of treatment using ligand-immunogen conjugates
WO2016085967A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 Endocyte, Inc. Methods of treating cancer by targeting tumor-associated macrophages
WO2017205661A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Purdue Research Foundation Method of treating cancer by targeting myeloid-derived suppressor cells

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1850850A4 (en) * 2000-12-08 2011-06-15 3M Innovative Properties Co COMPOSITIONS AND METHOD FOR TARGETED ADMINISTRATION OF IMMUNE RESPONSE MODIFICATORS
BRPI0707945A2 (pt) * 2006-02-17 2011-05-17 Pfizer Ltd derivados de 3-deazapurina como modulares de tlr7
PE20081887A1 (es) * 2007-03-20 2009-01-16 Dainippon Sumitomo Pharma Co Nuevo compuesto de adenina
CN103566377A (zh) * 2012-07-18 2014-02-12 上海博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
CA3184740A1 (en) * 2020-07-08 2022-01-13 Purdue Research Foundation Compounds, compositions, and methods for the treatment of fibrotic diseases and cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003028634A2 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Purdue Research Foundation Method of treatment using ligand-immunogen conjugates
WO2016085967A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 Endocyte, Inc. Methods of treating cancer by targeting tumor-associated macrophages
WO2017205661A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Purdue Research Foundation Method of treating cancer by targeting myeloid-derived suppressor cells

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