CN102264398B - 合成吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过引起具有高产品收率的高纯产品的合成路线来制备吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物，尤其是K-252a的聚合物缀合物及其衍生物的方法。在又一方面，本发明涉及新的K-252a的聚合物缀合物及其衍生物，其中将聚合物单元连接至K-252a或至K-252a衍生化合物的化学基团的特征在于5-元噁唑烷二酮式环状结构。这些新的聚合物缀合物通过具有高纯度和高收率的新合成路线来获得。

Description

合成吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物
本发明涉及通过引起具有高产品收率的高纯产品的合成路线来制备吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物，尤其是K-252a的聚合物缀合物及其衍生物的方法。
在又一方面，本发明涉及新的K-252a的聚合物缀合物及其衍生物，其中将聚合物单元连接至K-252a化合物或至K-252a衍生化合物的化学基团的特征在于5-元噁唑烷二酮式环状结构。这些新的聚合物缀合物通过具有高纯度和高收率的新合成路线获得。
在文献中，K-252a及其衍生物在预防、减轻和治疗激酶-有关的病理学状况，尤其是HMGB1-有关的病理学状况比如中枢和周围神经系统的神经障碍、神经病和神经变性疾病中的治疗潜力描述于(例如PCT/EP2005/008258，Annu Rev Pharmacol Toxicol.2004；44：451-74；Neurochem Int.2001 Nov-Dec；39(5-6)：459-68；Neuroport.2000 Nov9；11(16)：3453-6；Neuroscience.1998 Sep；86(2)：461-72；Brains Res.1994Jul 4；650(1)：170-4)。此外，现有技术公开了这些吲哚并咔唑化合物在预防、减轻和治疗皮肤病理学状况，尤其是与过度角质形成细胞增殖有关的皮肤病理学状况，比如银屑病中的治疗有效性(例如WO 2005/014003，Raychaudhuri等人，J.Invest.Dermatol.122：812-819，2004)。另外，在本领域中还报告K-252a及其衍生物可用作对抗NGF-相关的疼痛的活性试剂(例如Koizumi等人，J.Neurosci.8：715-721，1988；Doherty等人，Neurosci.Lett.96：1-6，1989；Matsuda等人，Neurosci.Lett.87：11-17，1988，Winston JH等人J.Pain(2003)4：329-337)。于是，吲哚并咔唑化合物K-252a及其衍生物的生物学重要性和治疗活性在文献中得以全面报告(例如Kim等人，Biol.Pharm.Bull.21：498-505，1998，Schneider等人，Org.Lett.7：1695-1698，2005)。
K-252a的聚合物缀合物及其衍生物和它们作为用于预防、减轻和治疗上述病理学状况的药物组合物中的活性试剂的用途公开于WO2007/022999。通过援引将所述申请的公开内容并入本文。根据WO2007/022999所述，缀合至聚合物和尤其是将聚二乙醇加入活性K-252a吲哚并咔唑衍生化合物的目的是开发所述活性化合物的给药形式，其使得可以改善药代动力学和毒理学性能，实现K-252a或其衍生物在各种可能施用途径中的最佳生物利用度。
描述于WO 2007/022999的制备K-252a的聚合物缀合物及其衍生物的合成途径包括将聚合物部分共价连接至K-252a化合物或其衍生物的吲哚并咔唑结构。尤其是，WO 2007/022999公开在适宜的反应条件下将异氰酸酯-活化的聚合物与K-252a或其衍生物四氢呋喃部分C3位上的羟基反应，从而获得脲键，其是在聚合物部分与活性化合物之间的共价连接。
由于具有高纯度的K-252a的聚合物缀合物及其衍生物是医学施用所高度需要的，本发明的目的是提供制备活性的吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物的方法，其引起以高且稳定的收率获得的高纯反应产品。此外，本发明的目的还是去掉繁复的纯化步骤并因此使得可以容易地纯化和回收目标缀合聚合物的化合物，以便最大化聚合物缀合反应的效率。
令人惊讶地，发明人发现将K-252a或衍生物化合物与用作缀合反应的初始聚合物试剂的ω-1-H-咪唑-甲酰胺聚合物部分进行反应将提供受控缀合过程，从而获得所得吲哚并咔唑-聚合物缀合物的希望的较高收率和纯度。
因此，本发明涉及制备式(I)吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物的方法
Figure BPA00001390607800031
其中
R1和R2是相同或不同的残基并且各自独立选自：
(a)氢，卤素，取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，羟基，低级烷氧基，羧基，低级烷氧基羰基，酰基，硝基，氨基甲酰基，低级烷基氨基羰基，-NR5R6，其中R5和R6各自独立选自氢，取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，取代的或未取代的芳烷基，取代的或未取代的低级烷基氨基羰基，取代的或未取代的低级芳基氨基羰基，烷氧羰基，氨基甲酰基，酰基或者R5和R6与氮原子相组合以形成杂环基团，
(b)-CO(CH2)jR4，其中j是1至6，而R4选自
(i)氢，卤素，-N3，
(ii)-NR5R6，其中R5和R6如前文所定义，
(iii)-SR7，其中R7选自氢，取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，取代的或未取代的芳烷基，-(CH2)aCO2R10(其中a是1或2，而其中R10选自氢和取代的或未取代的低级烷基)和-(CH2)aCO2NR5R6，
(iv)-OR8，-OCOR8，其中R8选自氢，取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基；
(c)-CH(OH)(CH2)jR4，其中j和R4如前文所定义；
(d)-(CH2)dCHR11CO2R12或-(CH2)dCHR11CONR5R6，其中d是0至5，R11是氢，-CONR5R6，或-CO2R13，其中R13是氢或取代的或未取代的低级烷基，而R12是氢或取代的或未取代的低级烷基；
(e)-(CH2)kR14，其中k是2至6而R14是卤素，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，-COOR15，-OR15，(其中R15是氢，取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基或酰基)，-SR7(其中R7如前文所定义)，-CONR5R6，-NR5R6(其中R5和R6如前文所定义)或-N3；
(f)-CH＝CH(CH2)mR16，其中m是0至4，而R16是氢，取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的低级烯基，取代的或未取代的低级炔基，取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基，-COOR15，-OR15(其中R15如前文所定义)-CONR5R6或-NR5R6(其中R5和R6如前文所定义)；
(g)-CH＝C(CO2R12)2，其中R12如前文所定义；
(h)-C≡C(CH2)nR16，其中n是0至4而R16如前文所定义；
(i)-CH2OR22，其中R22是三-低级烷基甲硅烷基，其中所述三个低级烷基是相同或不同的或者其中R22具有与R8相同的含义。
(j)-CH(SR23)2和-CH2-SR7，其中R23是低级烷基，低级烯基或低级炔基而其中R7如前文所定义；并且
R3是氢，卤素，酰基，氨基甲酰基，取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的烯基，取代的或未取代的低级炔基或氨基；并且
W1和W2独立地是氢，羟基或者W1和W2一起代表氧；
而其中X是聚合物部分，
其中所述方法包含将通式(II)的ω-1H-咪唑-甲酰胺聚合物化合物
Figure BPA00001390607800051
其中X如上文所定义，
与通式(III)吲哚并咔唑化合物反应
Figure BPA00001390607800052
其中R1，R2，R3，W1和W2如上文所定义并且其任选受保护基团保护，而其中Y代表离去基团，并且其中所述方法还任选包括将保护基团自所述任选保护的R1，R2，R3，W1和W2脱保护以获得式(I)化合物。
用来合成式(I)缀合物聚合物化合物的本发明缀合反应过程是在有机溶剂中用碱进行催化。优选所述碱是强碱。在本发明的优选实施方式中，所述碱选自碱金属氢化物，叔胺和/或醇盐。在本发明非常优选实施方式中，催化本发明的聚合物缀合反应的碱是氢化钠。然而，还能够使用其它碱，比如甲醇钠或三乙胺。
碱催化剂与式(III)化合物的摩尔浓度比优选为约1∶1至约4∶1，最优选约1∶1至约1.5∶1，最优选约1∶1。
另外，本发明反应在有机溶剂中进行，优选在无水条件，也即在无水有机溶剂中进行。优选，缀合过程的溶液混合物中的含水量等于或小于200ppm。有机溶剂可以选自二氯甲烷，氯仿，N，N-二甲基甲酰胺。在本发明非常优选的实施方式中，所述有机溶剂是二氯甲烷，甚至更优选无水二氯甲烷。
根据本发明还优选的缀合反应在惰性气氛下，比如氮或氩气氛下进行。
此外，本发明过程的反应优选约-10℃至约60℃进行，更优选约0℃至约25℃进行，最优选在0℃的初始步骤之后在室温下进行。
在根据本发明方法制备目标式(I)化合物之后，然后可以将式(I)聚合物缀合物自反应混合物分离并纯化。根据本发明的优选实施方式，式(I)化合物通过用快速色谱法纯化粗制混合物获得。优选使用自动化的梯度快速纯化系统，并配有适宜的柱和溶剂。纯化方法优选选自反相和正相柱，而调节/洗脱溶剂优选选自不同混合比的二氯甲烷，水，甲醇，乙腈，甲酸铵缓冲溶液。在本发明的非常优选实施方式中，式(I)吲哚并咔唑-聚合物化合物通过配有C18柱体的反相快速色谱法纯化，纯化通过用乙腈/5mM甲酸铵缓冲剂(pH 3.5)40∶60等度洗脱来进行(如实施例3中所述)。在本发明的又一优选实施方式中，式(I)吲哚并咔唑-聚合物化合物通过正相快速色谱法(如实施例4和5.3所述)纯化。
然后，可以将产品例如在硫酸钠上干燥，滤出，在25℃减压蒸发除去溶剂。目标产品的纯化通过本领域技术人员已知的普通技术来进行。
在纯化步骤之后，作为结果的式(I)聚合物化合物具有的纯度为至少约95％。更优选，在纯化步骤之后，式(I)化合物具有的纯度为至少约98％。在甚至更优选的实施方式中，作为结果的聚合物化合物具有的纯度为98.5％，99％或甚至99.5％。
此外，本发明方法引起的式(I)化合物的总质量收率按反应物式(III)化合物的重量计为约40％至约98％重量，优选约50％至约95％重量。
式(III)的残基Y是离去基团，也即该基团在本发明的聚合物缀合反应条件下自式(III)化合物的结构脱除以获得式(I)化合物的噁唑烷二酮式环，其将聚合物部分共价连接至K-252a或其衍生化合物的吲哚并咔唑结构。根据本发明，通式(II)化合物的咪唑环也在缀合反应期间自聚合物反应物部分脱除以获得式(I)化合物。
在本发明的优选实施方式中，式(III)的离去基团Y选自三氟甲磺酸酯，甲苯磺酸酯，甲磺酸酯，硫酸酯，卤素，羟基或低级烷氧基。在特别优选的实施方式中，式(III)的离去基团Y是低级烷氧基或羟基。最优选，离去基团Y是低级烷氧基，尤其是甲氧基。
用本发明方法共价连接至吲哚并咔唑化合物的并且例如在通式(I)和(II)中用X表示的聚合物部分，必须是生物可相容的，可以是天然或半合成或合成来源的并且可以具有线性或支化的结构。优选，本发明中的聚合物X选自聚(亚烷基氧化物)，尤其是(聚乙烯)氧化物。然而，其它示范性聚合物不加限制地包括聚丙烯酸，聚丙烯酸酯/盐，聚丙烯酰胺或其N-烷基衍生物，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸酯，聚乙基丙烯酸，聚乙基丙烯酸酯/盐，聚乙烯基吡咯烷酮，聚(乙烯基醇)，聚乙醇酸，聚乳酸，聚(乳酸-co-羟基乙酸)，右旋糖酐，脱乙酰壳多糖，聚氨基酸，羟乙基淀粉。
为了参与本发明方法，尤其是为了官能化为本发明方法的反应物式(II)聚合物，上述聚合物部分应携带氨基官能端基或应被官能化为携带氨基官能端基。于是，聚合物部分应是通式X-NH2的氨基活化的聚合物。
实际上，式(II)初始聚合物反应物这样获得：将聚合物部分的氨基与1，1-羰基二咪唑化合物反应，获得通式(II)的ω-1H-咪唑-甲酰胺聚合物化合物。
式(II)的ω-1H-咪唑-甲酰胺聚合物化合物的形成优选在有机溶剂比如二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺中进行。在非常优选的实施方式中，有机溶剂是二氯甲烷，甚至更优选无水二氯甲烷。
根据本发明还优选ω-氨基聚合物的活化在惰性气氛下，比如氮或氩气氛下进行。
此外，本发明的ω-1H咪唑甲酰胺聚合物化合物的形成反应优选在约10℃至约60℃，更优选在约15℃至约25℃，最优选在室温下进行。
在本发明的非常优选实施方式中，聚合物部分X是聚乙二醇(PEG)部分，其中末端OH基团能够任选地例如用C1-C5烷基或C1-C5酰基，优选用C1-、C2-或C3-烷基或C1-、C2-或C3基团修饰。优选，经修饰的聚乙二醇是末端烷氧基-取代的聚乙二醇，更优选甲氧基-聚乙烯-二醇(mPEG)。
根据本发明所用的聚合物具有的分子量为约100至约100000Da，优选约200至约50000Da，更优选约500至约10000Da。根据本发明的一个优选方面，聚合物是短链聚(乙二醇)，优选末端烷氧基-取代的PEG，比如甲氧基-取代的聚(乙二醇)，其分子量为约200至约1500Da，优选约400至约1200Da，甚至更优选约550至约1100。在最优选的实施方式中，短链PEG或mPEG具有的平均分子量为约550Da或约1100Da。根据本发明的第二优选方面，聚合物是长链聚(乙二醇)，优选末端烷氧基-取代的PEG，比如甲氧基-取代的聚(乙二醇)，其分子量为约4000至约6000Da，优选约4500至约5500Da。在本发明此方面最优选的实施方式中，长链PEG或mPEG具有的平均分子量为约2000Da或约5000Da。
如上文所用，定义本发明聚合物部分的分子量的值和范围的术语“约”意指所指的值和/或范围能够在±20％，优选在±10％内变化。
如本申请中所用，除非本文中另有清楚的说明，下述各术语应具有如下所述的含义。
术语“低级烷基”，在单独使用或与其它基团组合的情况下，意指直链或支化的低级烷基，其含有1-6个碳原子，优选1-5，更优选1-4和特别优选1-3或1-2个碳原子。这些基团尤其包括甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，戊基，异戊基，新戊基，1-乙基丙基，己基，等。“低级烷氧基”、“低级烷氧羰基”、“低级烷基氨基羰基”、“低级羟基烷基”和“三-低级烷基甲硅烷基”基团的低级烷基部分具有上文定义的“低级烷基”含义。
“低级烯基”基团定义为C2-C6烯基，其可以是直链或支化的并可以为Z或E形式。所述基团包括乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，异丁烯基，2-丁烯基，1-戊烯基，(Z)-2-戊烯基，(E)-2-戊烯基，(Z)-4-甲基-2-戊烯基，(E)-4-甲基-2-戊烯基，戊二烯基，例如，1，3或2，4-戊二烯基，等。更优选的C2-C6-烯基是C2-C5-，C2-C4-烯基，甚至更优选C2-C3-烯基。
术语“低级炔基”基团是指C2-C6-炔基，其可以是直链或支化的并包括乙炔基，丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-甲基-1-戊炔基，3-戊炔基，1-己炔基，2-己炔基，3-己炔基等。更优选的C2-C6-炔基是C2-C5-，C2-C4-炔基，甚至更优选C2-C3-炔基。
术语“芳基”基团是指C6-C14-芳基，其含有6多至14个环碳原子。这些基团可以是一、二或三环的并且是稠环。优选的芳基包括苯基，联苯基，萘基，蒽基，菲基等。“芳基羰基”和“芳基氨基羰基”基团的芳基部分具有如前文所定义的相同含义。
术语“杂芳基”基团可以含有1至3个独立选自氮、硫或氧的杂原子并且是指C3-C13-杂芳基。这些基团可以是一、二或三环的。本发明的C3-C13杂芳基包括杂芳族以及饱和及部分饱和的杂环基团。这些杂环可以是单环、双环、三环的。优选的5或6-元杂环基团噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，吡喃基，吗啉基，吡嗪基，甲基吡咯基，和哒嗪基。C3-C13-杂芳基可以是双环杂环基团。优选的双环杂环基团是苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲哚基，咪唑基，和嘧啶基。最优选的C3-C13-杂芳基是呋喃基和吡啶基。
术语“低级烷氧基”包括烷氧基，其含有1至6个碳原子，优选1至5，更优选1-4，特别优选1至3或1至2个碳原子并且可以是直链或支化的。这些基团包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，异丙氧基，叔-丁氧基，戊氧基，己氧基等。
术语“酰基”包括低级烷酰基，其含有1至6个碳原子，优选1至5，1至4，1至3或1至2个碳原子并且可以是直链或支化的。这些基团包括优选甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰，异丁酰，叔丁酰，戊酰基和己酰基。“酰氧基”基团的酰基部分具有如前文所定义的相同含义。
术语“卤素”包括氟，氯，溴，碘，等。
术语“芳烷基”基团是指C7-C15-芳烷基，其中烷基被芳基取代。烷基和芳基可以选自如前文所定义的C1-C6烷基和C6-C14-芳基，其中碳原子总数是7至15。优选的C7-C15-芳烷基是苄基，苯基乙基，苯基丙基，苯基异丙基，苯基丁基，二苯基甲基，1，1-二苯基乙基，1，2-二苯基乙基。“芳烷氧基”基团的芳烷基部分具有如前文所定义的相同含义。
取代的低级烷基、烯基和炔基具有1至3个独立选择的取代基，比如低级烷基，羟基，低级烷氧基，羧基，低级烷氧羰基，硝基，卤素，氨基，一-或二-低级烷基氨基，二氧杂环戊烷，二噁烷，二硫杂环戊烷，和二硫酮。取代的低级烷基、烯基和炔基的低级烷基取代基部分，和低级烷氧基、低级烷氧羰基的低级烷基部分，和取代的低级烷基、烯基和炔基的一-或二-低级烷基氨基取代基具有如前文所定义的“低级烷基”的相同含义。
取代的芳基，取代的杂芳基和取代的芳烷基各自具有1至3个独立选择的取代基，比如低级烷基，羟基，低级烷氧基，羧基，低级烷氧羰基，硝基，氨基，一-或二-低级烷基氨基，和卤素。取代基中的低级烷基、低级烷氧基、低级烷氧羰基和一-或二-低级烷基氨基的低级烷基部分具有上文所定义的低级烷基的相同含义。
R5和R6与氮原子相组合形成的杂环基团包括吡咯烷基，哌啶基，哌啶基，吗啉基，吗啉代，硫代吗啉代，N-甲基哌嗪基，吲哚基，和异吲哚基。
优选，R1和R2独立地选自氢，卤素，硝基，-CH2OH，-(CH2)kR14，-CH＝CH(CH2)mR16，-C≡C(CH2)nR15，-CO(CH2)jR4，其中R4是-SR7，CH2O-(取代的或未取代的)低级烷基(其中取代的低级烷基优选是甲氧基甲基，甲氧基乙基或乙氧基甲基)，-NR5R6。
在R1和R2的上述优选含义中，残基R14优选选自苯基，吡啶基，咪唑基，噻唑基，四唑基，-COOR15，-OR15(其中R15优选选自氢，甲基，乙基，苯基或酰基)，-SR7(其中R7优选选自取代的或未取代的低级烷基，2-噻唑啉和吡啶基)和-NR5R6(其中R5和R6优选选自氢，甲基，乙基，苯基，氨基甲酰基和低级烷基氨基羰基)。此外，残基R16优选选自氢，甲基，乙基，苯基，咪唑，噻唑，四唑，-COOR15，-OR15和-NR5R6(其中残基R15，R5和R6具有如上文所述的优选含义)。在R1和R2的上述优选含义中，残基R7优选选自取代的或未取代的低级烷基，取代的或未取代的苯基，吡啶基，嘧啶基，噻唑和四唑。此外，k优选是2，3或4，j优选是1或2而m和n独立地优选是0或1。
优选R3是氢或乙酰基，最优选氢。另外，W1和W2各自优选是氢。
本发明的优选实施方式是指缀合至聚合物部分的化合物K-252a。甚至更优选的实施方式是指K-252a的聚合物缀合物及其衍生物，其中将聚合物单元连接至K-252a化合物或至K-252a衍生化合物的化学基团的特征在于5-元噁唑烷二酮式环状结构。因此，在本发明非常优选的实施方式中，式(I)聚合物缀合物是这样的化合物，其中R1，R2，R3，W1，和W2是氢而X是聚合物部分。根据本发明该非常优选的实施方式，聚合物部分是聚乙二醇(PEG)或甲氧基-聚乙二醇(m-PEG)部分。甚至更优选，本发明优选实施方式的聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇是长链PEG或mPEG聚合物，其具有的平均分子量为约2000Da或约5000Da。类似优选的是短链聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇，其具有的平均分子量为约550Da或约1100Da。
本发明方法任选包含用保护基团保护K-252a吲哚并咔唑化合物或衍生化合物的取代基R1，R2，R3，W1和W2中的一个、多个或全部的步骤。在该上下文中，术语“保护基团”是指本领域已知的取代基R1，R2，R3，W1和W2的任意衍生物，如果需要，其可以用来在合成程序期间掩蔽R1，R2，R3，W1和W2并且能够随后在引起R1，R2，R3，W1和W2取代基恢复的条件下除去而不导致对分子其余部分的不希望效果。尤其是-如果需要-在本发明的缀合过程期间将保护基团引入取代基R1，R2，R3，W1和W2中的一个、多个或全部以获得K-252a或衍生化合物的吲哚并咔唑结构的C3位置上的聚合物缀合的化学选择性。在缀合反应之后，可以将一个或多个保护基团可逆地除去以便恢复所牵涉的取代基R1，R2，R3，W1和W2的初始官能团，从而获得式(I)吲哚并咔唑缀合的化合物。
根据本发明，可以将本领域已知任意适宜保护基团用于该目的。选择适宜保护基团以及保护和脱保护取代基R1，R2，R3，W1和W2的任意适宜手段和条件可以由技术人员通过其有机合成领域的普通知识来实现。所用保护和脱保护的手段和条件取决于所牵涉官能团R1，R2，R3，W1和W2的性质。羟基、氨基、和/或羧基残基的保护基团优选选自丙酮化合物，亚乙基甲氧基甲基，2-甲氧基乙氧基甲基，苄氧基甲基，四氢吡喃基，甲基，乙基，异丙基，叔丁基，苄基，三苯基甲基，叔丁基二甲基甲硅烷基，三苯基甲硅烷基，甲氧羰基，叔丁氧基羰基，苄氧基羰基，芴基甲氧羰基，乙酰基，苯甲酰基，甲苯磺酰基，二甲氧基苄基，硝基苯基氧基羰基，硝基苄氧基羰基，烯丙基，芴基甲基，四氢呋喃基，苯甲酰甲基，丙酮醇，苯基，三甲基甲硅烷基，吡咯烷基，吲哚基，肼基和本领域已知的其它保护基团，比如可以参见Greene T.W.等人，Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，John Wiley and Son，New York，NY(2007)的那些。尤其通过对选择性附加和除去保护基团而不导致对化合物其余部分的不利影响的适用性来选择保护和脱保护反应的试剂和条件。在技术人员的实践中，适宜的条件和试剂是普遍已知的。
根据本发明，式(I)化合物还可以制为药学上可接受的盐，包括无机酸比如盐酸，氢碘酸，氢溴酸，磷酸，偏磷酸，硝酸和硫酸的盐以及有机酸，比如酒石酸，乙酸，柠檬酸，苹果酸，苯甲酸，羟基乙酸，葡糖酸，琥珀酸，芳基磺酸，(例如，对-甲苯磺酸，苯磺酸)，磷酸，丙二酸，等的盐。形成药学上可接受的盐的适宜酸是本领域技术人员已知的。另外，式(I)化合物的药学上可接受的盐可以用药学上可接受的阳离子来形成。药学上可接受的阳离子是本领域技术人员已知的并且包括碱金属阳离子(Li+，Na+，K+)，碱土金属阳离子(Mg2+，Ca2+，Ba2+)，铵和有机阳离子，比如季铵阳离子。
本发明的又一方面是新的K-252a的聚合物缀合物及其衍生物，其中将聚合物单元连接至K-252a化合物或至K-252a衍生化合物的化学基团的特征在于5-元噁唑烷二酮式环状结构。这些新的聚合物缀合物通过本文公开的新合成方法来制备。
因此，本发明的又一方面尤其是式(I)吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物
Figure BPA00001390607800141
其中R1，R2，R3，W1和W2以及聚合物部分X如上文中所详细定义，或其药学上可接受的盐。
在最优选的实施方式中，本发明涉及式(I)的新的聚合物缀合物化合物，其中R1，R2，R3，W1和W2是氢而聚合物部分X是聚乙二醇(PEG)或末端烷氧基-取代的PEG，例如优选甲氧基-聚乙二醇(m-PEG)。该化合物对应于根据本发明的K-252a聚合物缀和的化合物。优选，聚合物部分是长链聚乙二醇，甚至更优选末端烷氧基-取代的PEG比如甲氧基-聚乙二醇(m-PEG)，其具有的平均分子量为约2000Da或约5000Da。同样优选地，聚合物部分是短链聚乙二醇，甚至更优选末端烷氧基-取代的PEG比如甲氧基-聚乙二醇(m-PEG)，其具有的平均分子量为约550Da或约1100Da。
本申请的发明人令人惊讶地发现与缺少聚合物的吲哚并咔唑化合物成员相比和尤其是与K-252a本身或其衍生物相比，相应的式(I)聚合物缀合的化合物展示由于其增加的溶解度而改善的药代动力学和毒理学性能，这导致治疗的和生物学活性的化合物的改善的生物利用度。在本发明的又一方面，令人惊讶地发现式(I)聚合物缀合的吲哚并咔唑化合物在局部给药之后由于其增加的分子尺寸和两亲性显示受限的全身性吸收，从而增强局部治疗有效性和生物学有效性并降低由于局部施用的全身性毒性和/或副作用。
本申请发明人还已令人惊讶地发现式(I)吲哚并咔唑-聚合物缀合物，与缺少聚合物的吲哚并咔唑化合物本身且尤其是K-252a及其衍生物的非选择性激酶抑制活性相比，展示对TrkA酪氨酸激酶的抑制活性的选择性的显著增加。从而，将吲哚并咔唑化合物和尤其是K-252a缀合至根据本发明的聚合物分子提供对其治疗靶标有选择性并导致不希望副作用减少的活性试剂。
于是，本发明的又一方面是式(I)化合物作为药物中的活性试剂的用途。在本发明的优选方面中，式(I)化合物用作全身性给药和治疗的药物中的活性试剂。在类似优选的方面中，本发明涉及式(I)化合物用作局部药物中的活性试剂的用途。
尤其是，本发明的缀合的聚合物化合物用作预防、减轻和治疗HMGB1-有关的病理学状况的药物中的活性试剂。HMGB1-有关的病理学是患者中的病症，其中在生物学流体和组织中存在与普通受试者中的浓度相比增加浓度的核蛋白质HMGB1和/或乙酰化的或非乙酰化形式的HMGB1同种蛋白，在普通受试者中这些HMGB1核蛋白实际上是不可检测的。细胞外HMGB1s充当潜在的趋化性促炎性趋化因子。因此，HMGB1-有关的病理学状况是具有强烈炎性基础的病理学状况，刺激细胞因子比如TNF-α、IL-1、IL-6等导致的病理学状况，或毒性事件导致的病理学状况比如中毒，感染，烧伤，等。尤其是，高浓度的HMGB1蛋白质和同种蛋白已在脓毒症患者的血浆中，类风湿关节炎患者的血浆和滑液中，阿尔茨海默氏病患者的脑中，黑色素瘤患者的血浆和组织中，全身性红斑狼疮患者的血浆中，动脉粥样硬化患者的动脉粥样硬化斑块中，等，被发现和测定。生物学流体和组织中的HMGB1蛋白质和/或同种蛋白的确定和证明可以通过本领域技术人员已知的常规诊断工具来检测，包括例如通过ELISA测试来检测等。
因此，各种疾病的特征在于细胞外HMGB1的有关存在，其尤其包括但不限于炎性疾病，狭窄，再狭窄，动脉粥样硬化，类风湿关节炎，自身免疫病，肿瘤，传染性疾病，脓毒症，急性炎性肺伤害，红斑狼疮，神经变性疾病，中枢和周围神经系统疾病和多发性硬化。在特别优选的实施方式中，式(I)缀合的聚合物化合物用于预防、减轻和治疗心血管疾病，特别动脉粥样硬化和/或在血管成形术期间或在其之后发生的再狭窄。更优选，药物用于阻断、阻滞和/或损伤在血管成形术期间或在其之后的再狭窄中的结缔组织再生。
在本发明的特别优选方面中，式(I)缀合的聚合物化合物有效地用作预防、减轻和治疗神经障碍、神经病和中枢和周围神经系统的神经变性疾病的药物中的活性试剂。
发明人还发现新的聚合物缀合物化合物通过全身性治疗能够减少和/或抑制血浆细胞因子分泌。因此，聚合物缀合物化合物用作全身性给药的药物中的活性试剂，其用于预防、减轻和/或治疗其中牵涉血浆细胞因子分泌增加的病理学状况。这些病理学状况优选是其中主要牵涉TNF-α，IFN-γ，MCP-1，MIP-1和/或RANTES分泌的病理学状况。
尤其是，在本发明的上下文中，与增加的血浆细胞因子分泌有关的病理学状况包括但不限于炎性疾病，自身免疫病，全身性炎性反应综合征，器官移植之后的再灌注损伤，心血管病，产科和妇科疾病，传染性疾病，变应性和特应性疾病，固体和液体肿瘤病理学状况，移植排斥疾病，先天疾病，皮肤病学疾病，神经学疾病，恶病质，肾病，医源性中毒病况，代谢性和自发性疾病，和眼科疾病。
在最优选的实施方式中，本发明化合物用作全身性治疗的药物中的活性试剂，其用于预防、减轻和/或治疗
Figure BPA00001390607800171
疾病，斯耶格伦氏病综合征，脉管炎，葡萄膜炎，视网膜病。
在本发明的又一具体方面中，本发明的缀合的聚合物化合物优选用作预防、减轻和/或治疗皮肤病理学状况的局部药物中的活性试剂。本发明发明人已发现本文描述的缀合的聚合物化合物很有利地用作局部药物，原因是它们在经皮给予的情况下不显示不利或毒性效果(例如刺激)或者任意光毒性效果(例如光诱变性，光毒性或光敏作用)(如下述实施例中描述的研究所示)。
在本发明的上下文中，皮肤病理学状况优选是特征在于角质形成细胞过度增殖的病理学状况，比如银屑病，特应性皮炎，慢性湿疹，痤疮，毛发红糠疹，瘢痕疙瘩，肥厚性瘢痕和皮肤肿瘤，比如角化棘皮瘤，鳞状细胞癌，基底细胞癌。在更优选的实施方式中，本发明化合物用作预防、减轻和治疗银屑病的局部药物中的活性试剂。
由于本发明化合物在抑制TrkA中增加的选择性，本发明的又一方面是所述缀合的化合物在预防、减轻和治疗TrkA在导致病理学状况发展的病理生理学机制中起关键作用的病理学状况中的用途。在此方面，在本发明的非常优选的实施方式中，式(I)、(II)和/或(III)的缀合的K-252a聚合物化合物用作预防、减轻和治疗NGF-相关的疼痛和痛觉增敏的药物中的活性试剂。
于是，本发明的又一方面是如前文所定义的式(I)化合物，任选与药学上可接受的载体、助剂、稀释剂或/和添加剂一起，用于制备预防、减轻或/和治疗如前文所定义的病理学状况的药物的用途。
式(I)化合物或其药学上可接受的盐能够原样给予，或者根据药理学活性和给药意图以各种药物组合物形式给予。本发明的又一方面是药物组合物，其包含有效量的至少一种式(I)化合物，任选包含药学上可接受的载体，助剂，稀释剂或/和添加剂。药物载体，助剂，稀释剂或/和添加剂是本领域技术人员已知的并因此可以用于包含本发明化合物的药物组合物的配制剂中。
本发明化合物能够用作药物组合物中的单一活性试剂。另选地，式(I)化合物可以与一种或数种其它活性试剂组合使用，所示其它活性试剂是例如治疗上述定义的病理学状况中的其它活性药剂。
尤其是，本发明的聚合物缀合物化合物可以与至少一种类固醇抗炎药物和/或一种能够抑制炎性细胞因子级联的早期介导物的其它试剂，例如选自TNF、IL-1α、IL-1β、IL-Ra、IL-8、MIP-1α、MIF-1β、MIP-2、MIF和IL-6的细胞因子的拮抗剂或抑制剂，组合使用。特别有用抗炎药物选自阿氯米松二丙酸盐，安西奈德，倍氯米松二丙酸盐，倍他米松，倍他米松苯甲酸盐，倍他米松二丙酸盐，倍他米松磷酸钠，倍他米松磷酸钠和乙酸盐，倍他米松戊酸盐，氯倍他索丁酸盐，氯倍他索丙酸盐，氯可托龙特戊酸盐，皮质醇(氢化可的松)，皮质醇(氢化可的松)乙酸盐，皮质醇(氢化可的松)丁酸盐，皮质醇(氢化可的松)环戊丙酸盐，皮质醇(氢化可的松)磷酸钠，皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠，皮质醇(氢化可的松)戊酸盐，可的松乙酸盐，地奈德，去羟米松，地塞米松，地塞米松乙酸盐，地塞米松磷酸钠，二氟拉松二乙酸盐，二氟可龙戊酸盐，氟氢可的松乙酸盐，氟氢缩松，氟米松特戊酸盐，氟尼缩松，氟轻松，醋酸氟轻松，氟可龙，氟米龙，氟氢缩松，丙醋氟替卡松，哈西奈德，卤倍他索丙酸酯，甲羟松，甲泼尼龙，甲泼尼龙乙酸盐，甲泼尼龙琥珀酸钠，糠酸莫米松，帕拉米松乙酸盐，泼尼松龙，泼尼松龙乙酸盐，泼尼松龙磷酸钠，泼尼松龙叔丁乙酸盐，泼尼松，曲安西龙，曲安西龙乙酸盐，曲安奈德，曲安西龙二乙酸盐，己曲安奈德。有用的细胞因子拮抗剂或抑制剂选自英利昔单抗，依那西普或阿达木单抗。
能够与本发明聚合物化合物组合使用的其它试剂是例如RAGE的拮抗剂和/或抑制剂，HMGB1的拮抗剂和/或抑制剂，Toll-类受体(TCR)与HMGB1相互作用的拮抗剂和/或抑制剂，凝血调节蛋白的N-端凝集素类功能域(D1)和/或具有曲状结构的合成双链核酸或核酸类似物分子，如通过援引并入本文的国际专利申请WO 2006/002971中所述。
本发明的药物组合物可以以本领域技术人员例如医师已知的方便方式给予。尤其是，本发明的药物组合物可以通过注射或输注给予，尤其是通过静脉内，肌内，经粘膜，皮下或腹膜内注射或输注和/或通过口服，局部，皮肤，鼻，吸入，气雾剂和/或直肠施用，等。给药可以是局部或全身性的。优选，本发明的化合物和药物组合物的给药可以这样进行：非经肠道给药，特别是液体溶液或悬浮液形式；或口服给药，特别是片剂或胶囊形式，或鼻内地，特别是粉末、鼻滴剂或气雾剂形式；或者经由例如软膏剂、霜剂、油剂、脂质体或经皮贴剂皮肤给药。
根据本发明的一方面，药物组合物全身地给予。尤其是，聚合物缀合物化合物能够通过注射或输注给予，尤其是通过静脉内，肌内，经粘膜，皮下或腹膜内注射或输注和/或通过口服给药。
在最优选的实施方式中，本发明的药物组合物通过局部施用给予，尤其是通过皮肤施用。在皮肤施用的情况下，本发明化合物的给药可以以脂质体形式进行。
在本发明最优选的实施方式中，通过可逆地固定化在医学装置表面上来给予药物组合物，尤其是通过将本发明的化合物和组合物结合、包衣和/或包埋在医学装置比如但不限于支架、导管、手术设备、插管、心瓣膜或血管假体上。在将医学设备与体液或身体组织接触之后，可逆地固定化的化合物得以释放。因而，经包覆的医学设备充当洗脱药物的药物递送装置，借此可以控制药物递送动力学，从而例如提供即释的或者受控的、延缓的或持续的药物递送。医学装置的包覆技术是本领域技术人员所熟知的。
本发明的药物组合物可以用于诊断或治疗用途。对于诊断用途，式(I)化合物可以以标记形式存在，例如以含有同位素的形式存在，所述同位素是例如放射性同位素或可以由核磁共振检测的同位素。在局部施用的情况下，优选的治疗用途是预防、减轻和治疗银屑病和皮炎，而在全身性施用的情况下，优选的治疗用途则是预防、减轻和治疗再狭窄中的结缔组织再生。
本发明化合物在药物组合物中的浓度能够变化。所述浓度将取决于各种因素：比如待给予药物的总剂量，所用化合物的化学特征(例如，疏水性)，给药途径，患者的年龄、体重和症状。一般地，在含有约0.1至10％w/v化合物的生理学缓冲水溶液提供本发明化合物用于非经肠道给药。典型剂量范围是约1μg至约1g/kg体重每天；优选的剂量范围是约0.01mg/kg至100mg/kg体重每天，和优选约0.1至20mg/kg 1至4次每天。待给予药物的优选剂量可能取决于各种变量：比如疾病或障碍的类型和进展程度，具体患者的整体健康状况，所选化合物的相对生物学效力和化合物赋形剂的配制剂及其给药途径。
根据本发明的经改善的合成方法应由下述图和实施例来进一步解释，然而，其不应限制本发明的主题。
图1显示根据本发明的方法的优选实施方式。将吲哚并咔唑化合物K-252a与α-甲氧基-ω-1H-咪唑-甲酰胺聚乙二醇(mPEG-NH-CO-Im)反应，提供根据本发明的K-252a甲氧基聚乙二醇缀合物。在本发明的该优选化合物中，甲氧基-聚乙二醇经由5-元噁唑烷二酮式环状结构共价连接至活性的K-252a化合物。
图2显示于400MHz的磁场下DMSO-d6溶剂中的活化聚合物mPEG-NH-CO-Im的1H-NMR谱图。
图3显示采用直接输注离子阱电喷雾离子化的情况下mPEG-NH-CO-Im在500-1400m/z范围的ESI-MS谱图。
图4显示于400MHz下DMSO-d6溶剂中的图1的K-252a聚合物缀合物的1H-NMR谱图。
图5显示于400MHz下DMSO-d6溶剂中的图1的K-252a聚合物缀合物的13C-NMR谱图。
图6显示采用直接输注离子阱电喷雾离子化的情况下图1的K-252a聚合物缀合物在500-1400m/z范围的ESI-MS谱图。
图7显示图1的K-252a聚合物缀合物对TrkA的抑制曲线。
实施例
实施例1：合成α-甲氧基-ω-1H-咪唑-甲酰胺聚乙二醇(mPEG-NH-CO-Im)
Figure BPA00001390607800221
在氮气氛下，于500ml体积的圆底烧瓶中，将35.0g的mPEG-NH2(MW 1892)(含量96％，17.76mmol)溶于85ml二氯甲烷。减压除去溶剂，通过机械泵干燥化合物2小时。然后，在氮气氛下将基底物溶于150ml二氯甲烷，将溶液转移入2l体积的三颈圆底烧瓶。
在室温下，将4.80g的1，1-羰基二咪唑(含量90％，26.64mmol)加入上述溶液。在室温下，于氮气氛下搅拌混合物，通过TL色谱法(洗脱液CH2Cl2/MeOH 90∶10)检查。用茚三酮溶液处理TLC以便使存在的伯胺基团显色(紫色)。
在2小时内完成反应。在0℃冷却混合物，通过在激烈搅拌下缓慢加入二乙醚(700ml，60分钟)沉淀固体产品。在0℃搅拌混合物30分钟，再加入300ml二乙醚。在玻璃烧结的盘式过滤漏斗上过滤产品，用100ml二乙醚洗涤，在真空下干燥。获得34.0g的无水白色固体(收率94％)。
通过1H-NMR和ESI-MS表征产品。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：8.24(m，1H，CH)，7.69(m，1H，CH)，7.27(s，1H，NH)，7.02(s，1H，CH)，3.55(m，CH2PEG)，3.40(m，2H，CH2NH)，3.22(s，3H，OCH3)。
ESI-MS(峰簇+2)…944.4，966.4，988.5，1010.5，1032.5…(质量增加+47，相对mPEG-NH2的峰簇+2：897.4，919.4，941.5，963.5，985.5)。
实施例2：用于制备噁唑烷二酮式缀合物的K-252a的聚合物缀合反应
该过程的方案见于图1中。
在氮气氛下，在500ml体积的圆底烧瓶中，将33.0g的mPEG-NH-CO-Im(16.00mmol)溶于85ml二氯甲烷。减压除去溶剂，通过机械泵干燥化合物2小时。
在配有恒温设备、机械搅拌器和温度计的2l体积的反应器中，在氮气氛下，将6.21g的K-252a(含量98％，13.29mmol)溶于1.85L二氯甲烷，冷却溶液至0℃。在氮气氛下，加入0.53g的氢化钠(含量60％，13.29mmol)，搅拌混合物10分钟。将经干燥的mPEG-NH-CO-Im溶于90ml二氯甲烷，在0℃于氮气氛中将该溶液加入K-252a与NaH在二氯甲烷中的混合物。在0℃搅拌混合物30分钟，然后加热至25℃，在该温度保持搅拌10分钟。
通过HPLC分析反应混合物以便评价K-252a的转化和化合物在混合物中的比率。在25℃经过10分钟之后，将3.60g的1，1-羰基二咪唑(含量90％，19.93mmol)加入反应混合物，在25℃搅拌溶液30分钟。通过HPLC分析反应混合物以确认酰胺副产物(K-252a的9位羧酸部分的mPEG缀合物)转化为所希望的噁唑烷二酮式缀合物。用甲酸(含量98％)中和反应混合物至最终pH 6(约2ml，53mmol)。
在25℃减压除去溶剂，获得44.0g的浅黄色粗制产品。
粗制产品中缀合物的HPLC纯度大于90％。粗制混合物中所希望产品的含量为约65-70％w/w。
实施例3：通过反相快速色谱法纯化K-252a的噁唑烷二酮式缀合物
将实施例2的缀合步骤中获得的粗制混合物通过反相快速色谱法进行纯化。使用配有Flash 65iM KP-C18柱体的Biotage HorizonSystem。将制备批料划分为各3.0g的15个等分试样。分开处理各等分试样。
首先用200ml溶剂以100％乙腈至乙腈/水40∶60的梯度，然后在等度条件下用40∶60的pH 3.5的200ml乙腈/5mM甲酸铵，来调节C18柱。
将3.0g的粗制产品溶于3.0ml N，N-二甲基甲酰胺，将溶液装载于柱上。通过用乙腈/5mM甲酸铵pH 3.5 40∶60等度洗脱进行纯化。对收集的单独级分进行HPLC分析，合并纯级分。在25℃减压除去溶剂，获得约2g的纯的湿产品。
按照前述程序纯化各等分试样并最终将各纯的湿产品级分溶于10ml二氯甲烷，然后合并。溶液在硫酸钠上干燥。滤出固体，在25℃减压除去溶剂。
通过NMR谱图分析获得的固体产品，检测到约1moleq的甲酸铵。为了除去该盐，将产品溶于50ml二氯甲烷，在用二氯甲烷润湿的硅胶垫上洗脱。通过用700ml二氯甲烷/甲醇9∶1溶剂混合物洗脱回收产品。收集洗脱物，在25℃减压除去溶剂。将产品再次溶于80ml二氯甲烷，在0℃在激烈搅拌下通过加入500ml二乙醚进行沉淀，以获得固体产品。在玻璃烧结的盘式过滤漏斗上过滤产品，用100ml二乙醚洗涤，在真空下干燥16小时。
获得16.0g的浅黄色粉末，总收率(缀合+纯化)为51％。
通过NMR、ESI-MS和HPLC表征产品。通过NMR用内标测定含量，其对应于至101％w/w。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：9.25(d，1H，CH)，8.70(s，1H，NH)，8.11(d，1H，CH)，7.95(d，1H，CH)，7.70(d，1H，CH)，7.51(m，2H，CH)，7.42(m，2H，CH)，7.31(m，1H，CH)，5.05(s，1H，NHCH2)，3.90-3.40(m，CH2PEG)，3.25(s，3H，OCH3)，2.35(m，4H，CH3+1h CH2)。
13C-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：172.3，172.0，153.7，139.4，137.5，133.5，128.1，126.2，124.9，124.0，123.2，122.3，121.6，120.8，120.4，117.0，115.4，113.5，109.9，98.4，90.6，85.3，71.8，70.0，68.9，66.3，58.5，45.9，40.0，23.16。
ESI-MS(峰簇+2)…1128.2，1150.3，1172.3，1194.3，1216.3…(质量增加+230.8，相对mPEG-NH2的峰簇+2：897.4，919.4，941.5，963.5，985.5)。
精确质量：在记录谱与理论谱之间的精确质量差异对应于2ppm。于是，作为结果的聚合物化合物具有的纯度为至少约98％。
实施例4：通过正相快速色谱法纯化K-252a的噁唑烷二酮式缀合物
如上述实施例1和2的描述进行合成过程，在该合成过程中获得21.7g的粗制产品。
得自所述缀合步骤的粗制混合物通过正相快速色谱法用BiotageHorizon System纯化，其配有装填340g的KP-SIL(二氧化硅)的SNAP柱体(尺寸71x168mm)。将粗制产品划分为2个等分试样，将其各自分开一次纯化(各等分试样分别含10.86g和10.8g粗制产品)。
用940ml二氯甲烷/甲醇96∶4v/v平衡SNAP柱体。流速65ml/min。
用预装填的SNAP样品预装器(samplet)柱体(34g)进行样品加载：将粗制物质溶于10ml二氯甲烷，将溶液施用于样品预装器柱体并将样品预装器插入SNAP柱体。
用下述洗脱SNAP柱体，流速65ml/min：
-705ml二氯甲烷/甲醇96∶4v/v；
-1881ml二氯甲烷/甲醇93∶7v/v；
-942ml二氯甲烷/甲醇85∶15v/v。
将首先999ml的洗脱溶剂弃去，然后以111ml体积的级分收集洗脱溶剂。
收集的单独级分通过HPLC分析，合并含有HPLC纯度＞98％的缀合的产品化合物的各级分(纯级分)。
类似地纯化来自缀合步骤的10.8g粗制混合物的残余等分试样。
合并得自纯化粗制混合物的2个等分试样的所选级分，在25℃减压除去溶剂至干，提供8.11g的缀合物产品，将其再次溶于29ml二氯甲烷，冷却至2℃，在激烈搅拌下通过在15分钟内加入150ml二乙醚进行沉淀。在2℃搅拌混合物15分钟，然后加入225ml二乙醚。通过在烧结的玻璃滤器(G4)上过滤分离沉淀的固体，在25℃于真空下干燥16小时，提供6.95g的试验品，是白色至浅黄色固体。HPLC分析测得的纯度为99％。
实施例5：K-252a的噁唑烷二酮式缀合物的合成过程
1)合成MeO-PEG-NH-CO-Im
在氮气氛下，将MeO-PEG-NH2(MW1892，8.06g)溶于二氯甲烷(25ml)，在40℃于减压下蒸馏除去溶剂。然后，在40℃在真空下(＜40毫巴)干燥残余物(MeO-PEG-NH2)超过2小时。
在25℃在氮气氛下，将经干燥的MeO-PEG-NH2(上述)溶于二氯甲烷(35ml)，将1，1’-羰基二咪唑(1.02g)加入该溶液，在室温下搅拌混合物超过2小时。(离子配对色谱法(IPC)：≥95％转化)
将反应混合物冷却至0℃，然后在1小时内在激烈搅拌下加入230ml二乙醚。在0℃搅拌混合物30分钟，在25分钟内再加入69ml二乙醚。滤饼用二乙醚(23ml)洗涤两次，在最高40℃下于真空下干燥至恒定重量，得到8.25g的MeO-PEG-NH-CO-Im，是白色固体。
2)聚合物缀合反应
在氮气氛下，将MeO-PEG-NH-CO-Im(72.0g)溶于二氯甲烷(185ml)，在40℃减压蒸馏除去溶剂。在40℃于真空下(＜40毫巴)干燥残余物＞2小时。
将K252a(13.11g)溶于二氯甲烷(3920ml)，然后将溶液冷却至0℃。分批加入氢化钠(1.17g，60％)。
将经干燥的MeO-PEG-NH-CO-Im溶于二氯甲烷(140ml)，在＜5℃将该溶液加入K252a的反应混合物，在0℃搅拌混合物＞30分钟。然后，将混合物溶液加热至25℃，保持在该温度搅拌10分钟。(IPC 1：K252a的转化＞96％)。
将1，1’-羰基二咪唑(7.11g)加入反应混合物，在25℃搅拌溶液＞30分钟(IPC 2：粗制产品∶酰胺的比率＞80∶20)。
加入甲酸(5ml)将反应混合物调节至pH 6。在25℃减压蒸馏除去溶剂，在25℃于真空下干燥残余物至恒定重量。
3：纯化和分离聚合物缀合物
在＜35℃，将粗制混合物(81g)溶于325ml二氯甲烷超过15分钟，在C盐垫(3cm)上过滤。C盐用81ml二氯甲烷洗涤。在＜35℃减压蒸馏除去溶剂，在35℃干燥至恒定重量，获得77.0g固体物质。将固体物质溶于770ml二氯甲烷。
在Knauer制备型HPLC系统上用Biotage的快速KP-SIL 75L柱体(75x300mm，800g二氧化硅)纯化来自实施例5.2的粗制物质。在应用加料溶液之前，将柱体用1.5l正庚烷清洗并用3l的DCM∶MeOH＝96∶4(v∶v)平衡。对于各批次，注射200ml上述加料溶液DCM∶MeOH＝96∶4(v∶v)(载量20g)，用185ml/min的流速和描述如下的梯度开始洗脱。
  分   ％MeOH
  0.00   4
  8.30   4
  80.10   15
  80.10   50
  108.00   50
各柱体仅用于一个批次。将产品洗脱25至90分钟。收集、分析并根据其纯度(IPC：＞98％a/a)合并各级分。
然后在35℃减压除去溶剂。在35℃于真空下将固体干燥至恒定重量，获得粗制物质(37.92g)。将该物质溶于140ml二氯甲烷，冷却至2℃。在2℃加入700ml二乙醚，搅拌＞15分钟。在2℃加入1050ml二乙醚。
将悬浮液经由吸滤器过滤。滤饼用母液洗涤，干燥至恒定重量，获得32.6g经纯化的药物物质。根据HPLC分析获得的纯度为98.99％。
下述实施例描述用本发明的聚合物缀合物吲哚并咔唑化合物，尤其是用通过本发明合成过程获得的聚合物缀合物，所进行的数种研究，所述合成过程例如描述于实施例1-5。经测试的缀合物化合物(也指定为“试验品”)是K252a的具PEG的噁唑烷二酮式缀合物(1892MW)。
实施例6：K-252a的噁唑烷二酮式缀合物对TrkA的IC50的体外评价
该研究的意图是测量实施例3缀合物对TrkA激酶的IC50。将试验化合物溶于二甲亚砜(DMSO)，然后将该溶液进一步用测试缓冲剂稀释25-倍以制备最终的试验化合物溶液。以下述浓度测试缀合物：30000nM，10000nM，3000nM，1000nM，300nM，100nM，30nM，10nM，3nM和1nM。
与用于制备试验化合物的方法类似地制备用于试验对照的参比化合物(星孢素)。
测试程序为离板(Off-chip)迁移率变动测试(Mobility Shift Assay(MSA))，报告如下：
1)用测试缓冲剂[20mM HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，0.01％Triton X-100，2mM DTT(1，2-二硫代-苏糖醇)，pH7.5]制备5μl的x4化合物溶液，5μl的x4底物(CSKtide 1000nM)/ATP(75μM)/金属溶液(Mg 5mM)，和10μl的x2激酶溶液，混合，在室温下于聚丙烯384孔微量培养板的孔中温育1或5小时(s)*。(*；取决于激酶)
2)向孔中加入60μl的终止缓冲剂(QuickScout Screening AssistMSA；Carna Biosciences)
3)将反应混合物转移至LabChip3000系统(Caliper Life Science)，分离并定量产品和底物肽峰
4)通过计算自产品(P)和底物(S)肽的峰高的产品比率(P/(P+S))来评价激酶反应。
将反应对照(完全反应混合物)的读出值定为0％抑制，而将背景(酶(-))读出值定为100％抑制，然后计算各试验溶液的百分比抑制。通过拟合四参数对数曲线自浓度对％抑制曲线计算IC50值。通过计算自产品(P)和底物(S)肽的峰高的产品比率(P/(P+S))评价激酶反应。
缀合物对TrkA的IC50值为202nM，参比化合物(星孢素)对TrkA的相应IC50值为0.372nM。这些结果概括于图7中。
实施例7：大鼠中的急性皮肤毒性研究
在将单次皮肤剂量给药至大鼠之后研究实施例3缀合物的急性毒性。
将2000mg/kg的单次给药给予至5只雄性和5只雌性动物的组，持续24小时。在安排给药之前一天在总体表面积10％的估计面积上将软毛自躯干背部表面除去。小心进行以避免对皮肤的任意损害或磨损。在其制备之后立即将试验品以4ml/kg体重的剂量体积局部给予。将配制试验品的所需等分试样在大小2.5x2.5cm的纱布上均匀铺开。然后，将此纱布贴剂置于动物皮肤上，在此情况下试验品直接接触皮肤。将合成膜条置于经处理场所上，并通过用一定长度的弹性粘合剂绷带环绕动物躯干将整个组装物固定位置。
在24小时之后，除去胶带包扎。然后，用微温水自从经处理的皮肤位点轻柔地洗净任意剩余的试验品。在整个研究中，每日检查全部动物两次。这样检查动物对治疗的反应征兆：在给药时，在给药之后第1天于大约30分钟、2和4小时检查，然后每日检查持续总共14天。这样称量各动物：在分配研究这天，在给药这天(第1天)和在第8和第15天。在14天之后杀死全部动物，进行尸体解剖检查。
在该研究期间未观察到雄性或雌性动物中发生死亡和临床征兆。研究结束时所观察到的动物体重变化在该动物种类和年龄的期望范围之内。在终止研究尸体解剖时未发现动物中的内部异常。在经处理位点未观察到异常。
这些结果指出，在2000mg/kg水平皮肤暴露24小时之后，所述试验化合物对大鼠不具毒性效果。未发生死亡说明LD50大于2000mg/kg。
实施例8：在大鼠中进行13周皮肤毒性研究，随后恢复4周
该研究的意图是评价在13周期间内每日皮肤给药(6小时暴露)之后试验品在大鼠中的毒性，并且研究在4个联贯周期间内自任意潜在处理相关效果的恢复可能。也评价毒物代谢动力学特征。
三组，各10只雄性和10只雌性Sprague Dawley大鼠(参见表1：雄性编号为偶数，雌性编号为奇数)通过皮肤施用以0.5、2.5和5mg/kg/天的剂量持续13个联贯周接受试验品(表1：组号2-4)。第四个类似构成的组接受单独的媒介物(纯水)，充当对照(表1：组号1)。将各性别的五只额外动物包括在高组和对照组(表1：组号分别为4和1)，用于恢复评价。此外，将用于毒物代谢动力学的3个卫星组，包括9只雄性和9只雌性(表2：组号分别为5-8)，和1个对照组，包括3只雄性和3只雌性(表2：组号5)，作为用于毒物代谢动力学评价的主要组进行处理。
赋予处理的组别和动物编号总结于下表1和2：
表1(主要组)：
表1
表2(卫星组)：
表2
Figure BPA00001390607800321
在开始给药之后大约3小时，每天检查处理位点。在与相邻的未处理皮肤相比的情况下，根据下表为位点刺激赋予数值：
Figure BPA00001390607800322
结果
在研究期间未发生处理相关的死亡率(高剂量组的1只雌性在研究第40天死亡)，未观察到处理相关的临床征兆。未记录到体重的有关差异而经处理动物的食品消耗在整个研究中可与对照比拟。
在处理位点未观察到刺激征兆(刺激指数为0)。
在处理末期进行的眼部检查未检测到处理相关的损伤。
从血液学观点来说，在高剂量组动物和中剂量组雌性中观察到白细胞减少症显示在恢复末期的部分可逆性。未观察到毒理学意义的其它变化。
临床化学和尿分析都未观察到毒理学意义的变化。
末期体重在对照与经处理组之间是可比拟的。
未观察到毒理学意义的绝对和相对器官重量变化。
在宏观和微观观察之后，未注意到处理相关的变化。
就毒物代谢动力学而言，在第1天，在接受0.5、2.5和5mg/kg/天的试验品的雄性和雌性中，试验品的血浆水平一般在LLOQ(定量下限，＝49.9ng/ml)以下，而仅单独的动物给药后2至8小时有时候显示稍＞LLOQ的值。测量值不与剂量水平成比例。
在第4和第13周观察到相似结果，此时检测到低吸收发生率。这在第4周于雄性中特别明显，其仅在接受5mg/kg/日的试验品的动物中在给药后6至8小时显示稍＞LLOQ的偶然值，并且在第13周于雌性中特别明显(仅于5mg/kg/天在给药后4至8小时值稍＞LLOQ)。
对用单独的媒介物处理的动物组，未测量到可检测的水平。基于上述结果，在每日给药持续13周之后未发生蓄积。
结论
在所研究试验品的任意剂量水平(也即0.5、2.5和5mg/kg/天)未观察到不良作用。与对照相比观察到经处理动物中的轻度白细胞减少症，但是并不认为其具有毒理学重要性，原因是其量值低，一般是非剂量相关的并且不受任意微观变化支持。因此，5mg/kg/天的高剂量认为是在13周期间内每日向大鼠皮肤给药之后对试验品未观察到不良作用的水平(NOAEL)。
血浆样品分析的结果显示试验品通过皮肤途径仅得以最低地吸收。
实施例9：在兔子中进行13周皮肤毒性研究，随后恢复4周
以0.5、2.5和5mg/动物/天的剂量水平在13周期间内每日皮肤给药之后研究试验品的毒性，并且研究在4个联贯周期间内自任意潜在处理相关效果的恢复。
三组，各6只雄性和6只雌性不含特定病原物(SPF)的新西兰白兔(参见表3：雄性编号为偶数，雌性编号为奇数)，通过皮肤施用以0.5、2.5和5mg/动物/天的剂量持续13个联贯周接受试验品(表3，组号分别为2-4)。第四个类似构成的组接受单独的媒介物(纯水)，充当对照(表3，组号1)。对照和高剂量组(表3，组号分别为4和1)，包括各性别3只额外动物，用于恢复评价。
组别和处理总结于下表3：
表3
Figure BPA00001390607800341
进行下述研究：每日临床征兆，体重，食品消耗，处理位点的宏观观察，临床病理研究，末期体重，器官重量，死后的宏观观察和组织病理学检查。
于第1天和第13周自各动物取血液样品用于毒物代谢动力学评价。
每天在开始给药之后大约3小时检查处理位点。在与相邻的未处理皮肤相比的情况下，根据下表为位点刺激赋予数值：
Figure BPA00001390607800351
结果
在研究期间未发生处理相关的死亡(在研究第29天人道处死恢复对照组的1只雄性)，未观察到处理相关的临床征兆。
在宏观观察经处理位点之后未观察到刺激征兆。
在研究期间未记录到体重的有关差异，经处理动物的食品消耗在整个研究中可与对照比拟。
处理末期进行眼部检查，未检测到处理相关的损伤。
对于血液学和临床化学，未记录到毒理学意义的变化。
就毒物代谢动力学而言，在第1周，在多数接受2.5mg/kg/天试验品的雄性中和接受5mg/kg/天的雌性中，试验品的血浆水平稍＞LLOQ(定量下限，＝51.30ng/ml)。仅以0.5和5mg/kg/天给药的单独雄性动物有时候显示稍＞LLOQ的值。与雌性相比，吸收发生率在雄性中稍高。吸收不与剂量水平成比例。
在第13周也观察到很低的吸收。给药后2至24小时一般报告＞LLOQ的值。该吸收在雌性中比在雄性中稍高。
对于用单独媒介物处理的动物，未测量到可检测的水平。
基于上述结果，在每日给药持续13周之后未发生蓄积。
在对照与经处理组的末期体重是可比拟的，未观察到绝对和相对器官重量毒理学意义的变化。
在宏观和微观观察之后，未注意到处理相关的变化。
结论
在所研究试验品的任意剂量水平(也即0.5、2.5和5mg/动物/天)未观察到不良作用。因此，5mg/kg/天的高剂量认为是在13周期间内每日向兔子皮肤给药之后对试验品的未观察到不良作用的水平(NOAEL)。
血浆样品分析结果显示试验品仅通过皮肤途径得以最低地吸收。
实施例10：大鼠中的急性静脉内毒性研究
在向Sprague Dawley大鼠静脉内给药单次剂量(10ml/kg，生理学盐水中)，随后观察14-天，研究实施例3缀合物的急性毒性。
以2000mg/kg对单组5只雄性和5只雌性动物给药。通过用连接至适宜容量的注射器的皮下针以10ml/kg体重的剂量体积注射入尾部静脉，以所选水平配制的试验品在制备之后立即向动物给药。在整个研究中，每日检查全部动物两次。
这样检查动物的对处理的反应征兆：在给药时，在给药第1天之后大约30分钟、2和4小时，然后每日，持续共14天。这样称量各动物：分配研究这天，给药(第1天)这天和第2、8和15天。在观察末期处死全部动物，进行尸体解剖检查。
在雄性和雌性动物中均未发生死亡。在给药这天在全部动物中观察到的临床征兆是减少的活性和竖毛。在研究第二周期间，注意到单只雌性中的背部脱毛。
研究末期观察到的体重变化在动物的该品系和年龄的期望范围内。在尸体解剖检查中未检测到任意动物中的内部异常。在注射位置未观察到异常。
这些结果指出缀合物在以2000mg/kg体重剂量水平单次静脉内给药之后对大鼠没有毒性效果。仅在动物中观察到次要的临床征兆。在以试验剂量水平注射入尾部静脉的情况下试验品受到局部耐受。
实施例11：L5178Y TK+/-小鼠淋巴瘤细胞中的突变(波动方法)
用波动方法这样检查试验品的诱变活性：在不存在和存在S9代谢性活化的情况下，测试在体外处理之后对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞中5-三氟胸苷抗性突变型的诱导。该方法可以检测基因突变，诱裂和致非整倍原的效果。
该研究所用的突变测试方法基于鉴定变得抗毒性胸苷类似物三氟胸苷(TFT)的L5178Y群落。该类似物能够通过胸苷激酶(TK)代谢为核苷，其用于引起TK-活性细胞死亡的核酸合成。
据推定通过TK基因突变形成的TK-缺乏性细胞不能代谢三氟胸苷，并因此在其存在下存活并生长。
在L5178Y小鼠淋巴瘤细胞中，编码TK酶的基因位于染色体11。在TK基因座(TK+/-)杂合的细胞可以发生单步正向突变成为剩余很少或无TK活性的TK-/-基因型。
所用细胞，L5178Y TK+/-，衍生自源于DBA/2小鼠中由甲基胆蒽诱导的胸腺肿瘤的两个无性系之一。TK突变系统在L5178Y小鼠淋巴瘤细胞中的用途已被良好地表征和确证(Clive D，Johnson KO，SpectorJF，Batson AG，Brown MM.Validation and characterization of theL5178Y/TK+/- mouse lymphoma mutagen assay system.Mutat Res.1979 Jan；59(1)：61-108.)并为大多数管理机构所接受。
小鼠淋巴瘤测试常常产生指定为小或大的TFT抗性群落的双峰尺度分布。已评价的是活性等位基因内的点突变和缺失(基因内事件)产生大群落。小群落引起部分损伤，其不仅影响活性TK等位基因也影响其表达调节细胞生长速率的侧翼基因。
发现试验品可溶于RPMI 1640完全培养基，浓度为50.0mg/ml。
进行初步细胞毒性测试。基于溶解度结果，在不存在和存在S9代谢的情况下，以5000μg/ml的最大剂量水平测试试验品。宽范围的低剂量水平包括在处理系列中：2500，1250，625，313，156，78.1，39.1和19.5μg/ml。
不存在S9代谢性活化的情况下，使用短处理时间，在数个浓度注意到相对存活的轻度减少，不存在剂量关系。使用长处理时间的情况下，在两个较高浓度观察到毒性，其将相对存活减少为同时阴性对照值的大约60％。
在S9代谢性活化存在的情况下，于任意浓度测试都未观察到有关毒性。
基于初步试验中获得的毒性结果，用描述于下表4的剂量水平进行有关突变为5-三氟胸苷抗性的两个独立试验：
表4
Figure BPA00001390607800391
在不存在或存在S9代谢的情况下，在用试验品处理之后未观察到有关的突变频率增加。
在不存在或存在S9代谢的情况下，将溶剂和阳性对照处理包括入各突变实验。溶剂对照培养物中的突变频率属于普通范围以内。用阳性对照处理获得的显著增加指出测试系统的功能正常。
结论是，在报告的实验条件下，不存在或存在S9代谢性活化的情况下，在体外处理之后试验品不诱导小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的突变。
实施例12：细菌(鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌)中的光诱变性测试
检查试验品的光诱变活性：在暴露于光之后，测试原核有机体，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(Escherichia coli)中至原养的反向突变。
使用三种鼠伤寒沙门氏菌测交品系，TA1537，TA98和TA100，和大肠杆菌测交品系，WP2。用各种剂量的紫外光辐射用软琼脂中的试验品共同制板的细菌。
采用Ames等人于1975年开发而Maron和Ames于1983年修订的程序。
试验品作为无菌蒸馏水中的溶液使用。
在毒性试验中，以5000μg/板的最大剂量水平并且以大约以半对数间隔的四个低浓度：1580、500、158和50.0μg/板来测试试验品。基于最大耐受剂量为各细菌测交品系选择两种宽间隔的UV剂量。在试验品的任意浓度或在任意UV辐射剂量未观察到有关毒性。
用板掺入方法进行两个独立的实验。
以5000μg/板的最大剂量水平并且以2倍稀释间隔的四个低剂量水平：2500、1250、625和313μg/板来测试试验品。经制备的板暴露于下述UVA和UVB剂量(表5)：
表5
Figure BPA00001390607800401
结果
在试验品的任意剂量水平，在任意测交品系中，在任意UV辐射剂量下，试验品都不诱导相对背景UV效果的回复体群落数量的两倍增加。
结论
结论是，在紫外光存在下进行处理的情况下，试验品不诱导鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或大肠杆菌(Escherichia coli)的反向突变。
实施例13：体外中国仓鼠卵巢细胞中的染色体畸变(光诱变性测试)
在不存在或存在UVA/UVB辐射的情况下在体外处理之后，测试试验品导致中国仓鼠卵巢细胞中的染色体损害的能力。
测试中使用5000，2500，1250，625，313，156，78.1和39.1μg/ml的剂量水平进行染色体损害测试，在不存在或存在紫外光。
将试验品的溶液制备于Hank平衡盐溶液(HBSS)中。
在不存在或存在紫外光的情况下，处理细胞3小时，并使用20小时的收获时间，相应于大约1.5个细胞循环。
该实验包括适当的阴性和阳性对照。在各试验点制备2种细胞培养物。
选择剂量水平，用于为基于试验品处理的细胞毒性的染色体畸变评分，该染色体畸变由收获时间的细胞计数减少测定。
由于在整个剂量范围未观察到显著毒性，为评分所选的剂量水平为5000，2500和1250μg/ml，在不存在或存在紫外光。
为各培养物的染色体畸变进行一百个中期涂布的评分。
结果
在用试验品处理之后，不存在或存在紫外光的情况下，包括或排除间期的情况下，与有关对照值相比未观察到统计学上显著的携带畸变的细胞发生率增加。
在用阳性对照丝裂霉素-C和8-甲氧补骨脂素处理之后观察到携带畸变的细胞数(包括和排除间期)统计学上显著的增加，这指出试验系统的功能正常。
结论
基于这些结果得出结论，在所报告的实验条件下，在不存在或存在紫外光的情况下，在体外处理之后试验品不诱导中国仓鼠卵巢细胞中的染色体畸变。
实施例14：Balb/C 3t3细胞光毒性测试(中性红摄取)
评价试验品的潜在体外光毒性：测量中性红摄取，用于评价对用不同剂量试验品处理并暴露于UVA辐射的Balb/c 3T3细胞培养物的细胞毒性。用Earle平衡盐溶液(EBSS)制备试验品溶液。
在存在(+UVA)和不存在(-UVA)光的情况下进行寻找初步剂量范围的实验以便选择用于主要试验的适当剂量水平。以1000μg/ml的最大剂量水平(研究方案中指出的上限)且以宽范围的低剂量水平：500，250，125，62.5，31.3，15.6和7.81μg/ml测试试验品。由于在存在和不存在UVA辐射的情况下无法计算IC50值，因此也无法计算光刺激因子(PIF)值。在该情况下，认为化学品为非光毒性的。将相同剂量范围用于主要测试。
用下述剂量水平进行主要实验：1000，500，250，125，62.5，31.3，15.6和7.81μg/ml。在存在和不存在紫外光的情况下的存活曲线显示相似特征，这确认在寻找初步剂量范围的实验中获得的结果。由于两种曲线均无IC50值，所以无法计算光刺激因子(PIF)值。平均光效果(MPE)为0.089，其属于非光毒性范围。
由于该实验得到清楚的阴性结果，不再进行进一步的实验。
阳性对照氯丙嗪诱导可接受的阳性反应，其PIF值为21.9，这指出测试系统的功能正常。
由于无法计算的PIF或MPE＜0.1预测“无光毒性”，基于获得的结果，得出的结论是在所报告实验条件下试验品应定为“非光毒性”。
实施例15：豚鼠中的试验品0.1％霜剂光刺激性/光敏作用研究
在局部施用至皮肤并暴露于紫外光之后，用豚鼠模型评价试验品0.1％霜剂导致光变应性和/或光刺激性反应的潜力。
研究划分为2个阶段。
在第一阶段，在6组动物中评价试验品的光刺激特性。将这些用来确定用于敏化测试的试验品的适宜浓度，并提供光诱导刺激的信息。动物如下处理(表6)：
表6
  组号   处理   UV辐射   动物数
  1   媒介物+对照品   是   5
  2   媒介物+对照品   否   5
  3   媒介物+试验品   是   5
  4   媒介物+试验品   否   5
  5   媒介物+8-甲氧补骨脂素   否   5
  6   媒介物+8-甲氧补骨脂素   是   5
研究的第二阶段是评价敏化，其中将共5组处理如下(表7)：
表7
Figure BPA00001390607800441
1弗氏完全佐剂
光刺激性
用2个(辐射)各5只动物的组进行光刺激性试验，用对照和试验品，即霜剂安慰剂和试验品0.1％霜剂，分别处理(参见表6，组1和3)，并用2个类似构成的组(参见表6，组2和4)以相同方式处理但是不加辐射。将未经稀释的试验或对照品(100％)的等分试样，2种浓度(20％和50％，纯水中)的试验和对照品和单独的媒介物(纯水)，在动物背部准备的划定皮肤位点上均匀铺开。在给药之后，将辐射组(组1和3)动物暴露于UVA(10焦耳/cm2)和UVB(0.1焦耳/cm2)辐射。以0.001％、0.01％和0.1％的浓度，在5只试验(辐射)和5只对照(非辐射)动物(分别参见表6组6和5)中，用相同方法研究阳性对照参比物质8-甲氧补骨脂素。在暴露于对照、试验或参比品之后大约1，4，24，48和72小时，检查经处理位点对处理的刺激性反应证据。
结果
在用试验品0.1％霜剂处理并UV辐射的位点观察到1/5动物中的轻度刺激。在用试验品处理但未UV-辐射的4/5动物中观察到轻度至明显的反应。
在用对照品(霜剂安慰剂)处理但未UV-辐射的1/5动物中也观察到轻度反应。
在用单独媒介物处理的位点未观察到反应。
在用试验品处理的动物中观察到的刺激性反应并未如在UV-辐射(较高严重性)的和在未辐射的动物中所观察到的那样受到光诱导。
在未辐射的用对照品处理的动物中也观察到轻度偶发反应。
用阳性对照参比品8-甲氧补骨脂素处理然后暴露于紫外光的动物，在用2种较高研究浓度0.01％和0.1％处理的位点展示明显至适中的红斑和轻度水肿。在暴露至8-甲氧补骨脂素而不随后暴露于紫外光的那些动物中未观察到反应，这展示所观察的反应是光诱导的。
光敏作用
光敏作用试验这样进行：用对照品和试验品诱导的2个10只动物的组(参见表7组8和9)，和用所选媒介物(纯水)诱导的1个10只动物的对照组(参见表7组7)。在诱导敏化的试验中，用弗氏完全佐剂的乳液皮内注射动物。在2周内共6次将100％浓度的试验和对照品局部施用在FCA注射位置的区域上。给药之后，将动物暴露于UVA(10焦耳/cm2)和UVB(0.1焦耳/cm2)辐射。以相同方式处理对照组动物但用所选媒介物(纯水)代替试验或对照品。在最终诱导暴露之后大约2周，通过分别于20％和50％浓度局部施用媒介物和试验或对照品攻击全部动物。选择这些浓度的原因是基于光刺激性试验获得的结果认为它们在紫外辐射的情况下对皮肤无刺激性。给药之后，将2个试验组和对照组的动物暴露于UVA(10焦耳/cm2)和UVB(0.1焦耳/cm2)辐射。用媒介物和试验或对照品局部处理各动物上的额外位点，但是处理之后并不暴露于紫外辐射。在攻击暴露之后大约24、48和72小时，检查经处理位点的对处理有所反应的证据。
用相同方法研究阳性对照参比品葵子麝香已证明试验系统的有效性。用该物质以丙酮中15％的浓度诱导1个5动物的组(参见表7组11)。以相同方式用单独媒介物(丙酮)处理3只动物的对照组(参见表7组10)。选用参比品(葵子麝香)在丙酮中10％的浓度进行攻击。
结果
用对照品，霜剂安慰剂，于50％浓度攻击随后紫外辐射，在组中的(组8)10/10动物中引起对于对照品的反应。在经处理但未辐射的位点，在组8的6/10动物中观察到对于对照品的反应。用对照品攻击处理随后紫外辐射的位点，在5/5对照组动物(组7)中也观察到反应；而在用对照品处理但未辐射的位点，在4/5对照动物中也观察到反应。未观察到对单独媒介物的反应。
用试验品0.1％霜剂于20％浓度攻击随后紫外辐射在组(组9)的8/10动物中引起对试验品的反应。在经处理但未辐射的位点，在组9动物中未观察到对试验品的反应。用试验品攻击处理随后紫外辐射的位点，在5/5对照组动物(组7)中也观察到反应；而在用试验品处理但未辐射的位点，在1/5对照动物中也观察到反应。未观察到对单独媒介物的反应。
基于上述结果，在用试验或对照品处理的动物中观察到反应。在对照组动物(未用试验品诱导)中观察到的反应是由于物质的刺激性效果而不是由于敏化。此外，在未UV-辐射的位点也观察到反应。
作为结果，用试验和对照品以5％的低浓度进行第二攻击(再攻击)。
在用试验和对照品于5％浓度再攻击并随后紫外辐射的组8和9任意动物中未观察到反应。在经处理但未辐射的位点，在组8或9动物中未观察到对试验或对照品的反应。在用对照或试验品攻击处理的对照组动物(组7)中，未观察到任意位点的反应。未观察到对单独媒介物的反应。
用参比品(葵子麝香)于10％浓度攻击阳性对照动物并随后紫外辐射在组(组11)的4/5动物中产生反应(很轻度至轻度红斑)。在经处理但未辐射的位点，在组11动物中未观察到对参比品的反应。在用媒介物诱导的组10只动物中，未观察到对参比品的反应。这指出试验系统能够检测物质的光变应特性。
结论
获得的结果指出在关于紫外光的皮肤暴露下试验品0.1％霜剂未能导致光刺激性或光变态反应。

Claims (59)

1.制备式(I)吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物的方法，
Figure FSB00001118088500011
式(I)
其中
R1、R2、
R3、
W1和W2是氢；并且
聚合物部分X是聚乙二醇或末端烷氧基取代的聚乙二醇；
其中所述方法包括将通式(II)的ω-1H-咪唑-甲酰胺聚合物化合物
式(II)
其中X如上文所定义，与通式(III)的吲哚并咔唑化合物反应
Figure FSB00001118088500021
式(III)
其中R1，R2，R3，W1和W2如上文所定义并且其任选受保护基团保护而其中Y代表离去基团，并且其中所述方法还任选包括脱保护基团R1，R2，R3，W1和W2以获得式(I)化合物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法在碱存在下在有机溶剂中进行。
3.根据权利要求2的方法，其中所述碱与式(III)化合物的摩尔比为1∶1至4∶1。
4.根据权利要求3的方法，其中所述碱与式(III)化合物的摩尔比为1∶1至1.5∶1。
5.根据权利要求4的方法，其中所述碱与式(III)化合物的摩尔比为1∶1。
6.根据权利要求2至5中任一项的方法，其中所述碱选自碱金属氢化物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述碱金属氢化物是氢化钠。
8.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述方法在有机溶剂中进行。
9.根据权利要求8的方法，其中所述有机溶剂是选自二氯甲烷、氯仿和N，N-二甲基甲酰胺的无水有机溶剂。
10.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述方法在惰性气氛下进行。
11.根据权利要求10的方法，其中所述惰性气氛是氮或氩气氛。
12.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述方法于-10至60℃的温度进行。
13.根据权利要求12的方法，其中所述方法于-10至25℃的温度进行。
14.根据权利要求13的方法，其中所述方法在0℃的初始步骤之后在室温下进行。
15.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述式(I)聚合物缀合物化合物通过色谱纯化直接获得。
16.根据权利要求15的方法，其中式(I)聚合物缀合物化合物的所述纯化在溶剂中进行。
17.根据权利要求16的方法，其中所述溶剂选自不同混合比率的二氯甲烷、水、甲醇、乙腈、甲酸铵缓冲溶液。
18.根据权利要求1至5中任一项的方法，其得到的式(I)化合物收率按式(III)化合物的重量计为40％至95％重量。
19.根据权利要求18的方法，其得到的式(I)化合物收率按式(III)化合物的重量计为50％至95％重量。
20.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述离去基团Y选自三氟甲磺酸酯，甲苯磺酸酯，甲磺酸酯，硫酸酯，卤素，羟基或C1-C6烷氧基。
21.根据权利要求20的方法，其中所述离去基团Y是C1-C6烷氧基。
22.根据权利要求21的方法，其中所述C1-C6烷氧基是甲氧基。
23.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述聚合物X是甲氧基-聚乙二醇。
24.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述聚合物X具有的分子量为100至100000Da。
25.根据权利要求24的方法，其中所述聚合物X具有的分子量为200至50000Da。
26.根据权利要求23的方法，其中所述聚合物X具有的平均分子量为500至10000Da。
27.根据权利要求26的方法，其中所述聚合物X具有的平均分子量为550Da、1100Da、2000Da或5000Da。
28.式(I)吲哚并咔唑化合物的聚合物缀合物，
Figure FSB00001118088500051
式(I)
其中
R1，R2，R3，W1，W2和X如权利要求1或权利要求23至27中所定义；
或其药学上可接受的盐。
29.根据权利要求28的聚合物缀合物，其中所述聚合物X是甲氧基-聚乙二醇，其具有的平均分子量为500至10000Da。
30.根据权利要求29的聚合物缀合物，其中所述聚合物X具有的平均分子量为550Da、1100Da、2000Da或5000Da。
31.根据权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物，用于药物中。
32.根据权利要求31的聚合物缀合物，用于局部施用的药物中。
33.根据权利要求31的聚合物缀合物，用于全身性施用的药物中。
34.根据权利要求33的聚合物缀合物，所述全身性施用是注射、输注或吸入。
35.药物组合物，其包含权利要求28至30中任一项的至少一种聚合物缀合物，任选包含药学上可接受的载体。
36.药物组合物，其包含权利要求28至30中任一项的至少一种聚合物缀合物，任选包含药学上可接受的助剂。
37.药物组合物，其包含权利要求28至30中任一项的至少一种聚合物缀合物，任选包含药学上可接受的添加剂。
38.根据权利要求37的药物组合物，其中所述添加剂是稀释剂。
39.根据权利要求35至38中任一项的药物组合物，用于诊断或/和治疗应用。
40.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备预防、减轻或/和治疗HMGB1-有关的病理学状况的药物的用途。
41.权利要求40的用途，其中所述HMGB1-有关的病理学状况选自狭窄，再狭窄，动脉粥样硬化，自身免疫病，肿瘤，传染性疾病，脓毒症，急性炎性肺损伤，中枢和周围神经系统的疾病。
42.权利要求40的用途，其中所述HMGB1-有关的病理学状况选自类风湿关节炎，红斑狼疮，神经变性疾病和多发性硬化。
43.权利要求40至42中任一项的用途，其中所述聚合物缀合物可逆地固定化在医学装置表面上。
44.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备预防、减轻和/或治疗中枢和周围神经系统的神经障碍和神经病的药物的用途。
45.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备预防、减轻和/或治疗中枢和周围神经系统的神经变性疾病的药物的用途。
46.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备预防、减轻或/和治疗皮肤病理学状况的药物的用途。
47.权利要求46的用途，其中所述皮肤病理学状况的特征是角质形成细胞的过度增殖。
48.权利要求46的用途，其中所述皮肤病理学状况是银屑病，特应性皮炎，慢性湿疹，痤疮，毛发红糠疹，瘢痕疙瘩，肥厚性瘢痕和皮肤肿瘤。
49.权利要求48的用途，其中所述皮肤病理学状况是银屑病。
50.权利要求46至49中任一项的用途，其中所述药物制备用于局部给药。
51.权利要求50的用途，其中所述给药以脂质体形式进行。
52.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备预防、减轻或/和治疗NGF-相关的疼痛和痛觉增敏的药物的用途。
53.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻和/或治疗炎性疾病，自身免疫病，器官移植之后的再灌注损伤，心血管病，产科和妇科疾病，传染性疾病，变应性和特应性疾病，固体和液体肿瘤病理学状况，移植排斥疾病，先天疾病，皮肤病学疾病，神经学疾病，恶病质，肾病，医源性中毒病况，代谢性和自发性疾病，和眼科疾病。
54.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、减轻和/或治疗全身性炎性反应综合征。
55.权利要求28至30中任一项的聚合物缀合物用于制备预防、减轻和/或治疗Behcet疾病、斯耶格伦氏综合征、脉管炎、葡萄膜炎、视网膜病的药物的用途。
56.权利要求52至55中任一项的用途，其中所述药物用于全身性给药。
57.权利要求40至42、44至49和51至54中任一项的用途，其中与至少一种抗炎药物组合使用。
58.权利要求43的用途，其中与至少一种抗炎药物组合使用。
59.权利要求50的用途，其中与至少一种抗炎药物组合使用。
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