KR20110118630A - 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬케이트의 합성 - Google Patents

인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬케이트의 합성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 높은 생성물 수율로 고순도의 생성물을 생성하는 합성 경로에 의해 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬게이트, 특히, K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 중합체 단위를 K-252a 또는 K-252a 유도체 화합물에 연결하는 화학적 작용기는 5-원 옥사졸리딘디온 고리 구조(5-member oxazolidindionic cyclic structure)를 특징으로 하는 것인 신규한 K-252a 또는 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이다. 이 신규한 중합체 컨쥬게이트는 고순도 및 고수율의 신규한 합성 경로를 통해 수득된다.

Description

인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬케이트의 합성{Synthesis of polymer conjugates of indolocarbazole compounds}
본 발명은 높은 생성물 수율로, 고 순도의 생성물을 생성하는, 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬게이트, 특히 K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 K-252a 및 그의 유도체의 신규한 중합체 컨쥬게이트로서, 상기 중합체 유닛을 K-252a 화합물 또는 K-252a 화합물 유도체에 결합시키는 화학적 작용기는 5-원 옥사졸리딘디온 고리 구조(5-member oxazolidindionic cyclic structure)를 특징으로 하는 것인 신규한 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이다. 이 신규한 중합체 컨쥬케이트는 신규한 합성 경로를 통해 고순도 및 고수율로 수득된다.
문헌에서, 키나아제-관련 질환, 특히, 신경 질환, 신경병증 및 중추신경계 및 말초신경계의 신경퇴행성 질환과 같은 HMGB1-관련 질환의 예방, 경감 및 치료에서의 K-252a 및 그의 유도체의 치료 효능이 개시된다(예를 들면, PCT/EP2005/008258, Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004;44:451-74; Neurochem Int. 2001 Nov-Dec;39(5-6):459-68; Neuroport. 2000 Nov 9;11(16):3453-6; Neuroscience. 1998 Sep;86(2):461-72; Brains Res. 1994 Jul 4;650(1):170-4). 또한, 종래 기술은 피부 질환, 특히, 과도한 각질세포 증식과 연관된 피부 질환, 예를 들면, 건선의 예방, 경감 및 치료에서 이 인돌로카르바졸 화합물의 치료 효과를 개시한다(예를 들면, WO 2005/014003, Raychaudhuri et al., J. Invest. Dermatol. 122:812-819, 2004). 또한, 당해 기술 분야에서 K-252a 및 그의 유도체는 NGF-관련 통증에 대한 활성제로서 유용한 것으로 보고되었다(예를 들면, Koizumi et al., J. Neurosci. 8:715-721, 1988; Doherty et al., Neurosci. Lett. 96:1-6, 1989; Matsuda et al., Neurosci. Lett. 87:11-17, 1988, Winston JH et al. J. Pain (2003) 4:329-337). 따라서, 인돌로카르바졸 화합물 K-252a 및 그의 유도체의 생물학적 중요성 및 치료 효능이 문헌에 잘 보고되어 있다(예를 들면, Kim et al., Biol. Pharm. Bull. 21:498-505, 1998, Schneider et al., Org. Lett. 7:1695-1698, 2005).
K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트 및 그의 전술된 질병의 예방, 경감 및 치료를 위해 유용한 약제학적 조성물 중 활성제로서의 용도가 WO 2007/022999에 개시된다. 상기 출원의 개시는 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. WO 2007/022999에 따르면, 활성 K-252a 인돌로카르바졸 유도체 화합물의 중합체로의 컨쥬게이션 및 특히, 페길화의 목적은 개선된 약역학적 및 독성학적 성능을 가능하게 하여, 다양한 적용 경로에서 K-252a 또는 그의 유도체의 최고의 생체이용률을 달성하는 상기 활성 화합물의 투여 제형을 개발하는 것이다.
WO 2007/022999에 기재된, K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트의 제조를 위한 합성 방법은 K-252a 화합물 또는 그의 유도체의 인돌로카르바졸 구조로의 공유 결합에 의한 중합체 모이어티의 부착을 포함한다. 특히, WO 2007/022999는 적합한 반응 조건 하에서 이소시아네이트-활성화 중합체와 K-252a 또는 그의 유도체의 테트라히드로퓨란 모이어티의 C3 위치에 있는 히드록시기의 반응을 개시하며, 상기 반응에 의해 중합체 모이어티와 활성 화합물 간의 공유결합으로서 카르바미드(carbamide) 결합이 수득된다.
고순도의 K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트는 의약적 적용을 위해 크게 요구되므로, 본 발명의 목적은 높고 안정된 수율로 수득된, 고순도의 반응 생성물을 초래하는, 활성 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공하는 것이었다. 또한, 본 발명의 목적은 중합체 컨쥬게이션 반응의 효율성을 극대화하기 위해, 복잡한 정제 단계들을 제거하고 표적 중합체 컨쥬게이션 화합물의 용이한 정제 및 회수를 가능하게 하는 것이었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 K-252a 또는 그의 유도체 화합물과 컨쥬게이션 반응의 출발 중합체 시약으로 이용된 ω-1-H-이미다졸-카르복사미드 중합체 모이어티의 반응이 제어된 컨쥬게이션 방법을 제공하고, 따라서, 결과물인 인돌로카르바졸-중합체 컨쥬게이트의 원하는 보다 높은 수율 및 순도를 얻었다는 것을 발견했다.
따라서, 본 발명은 하기 식 (I)을 가지며,
Figure pct00001
식 (I)
상기에서,
R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이한 잔기이고 각각 하기로 구성된 군으로부터 선택되며:
(a) 수소, 할로겐, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐, 아실, 니트로, 카르바모일, 저급 알킬아미노카르보닐, R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, 치환 또는 미치환 아랄킬, 치환 또는 미치환 저급 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 미치환 저급 아릴아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 카르바모일, 아실로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R6는 질소 원자와 함께 헤테로시클릭기를 형성하는 것인 -NR5R6이거나,
(b) j는 1 내지 6이고, R4는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것인 -CO(CH2)jR4:
(i) 수소, 할로겐, -N3,
(ii) R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같은 것인 -NR5R6,
(iii) R7은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, 치환 또는 미치환 아랄킬, -(CH2)aCO2R10(식 중에서, a는 1 또는 2이고, R10은 수소 및 치환 또는 미치환 저급 알킬로부터 선택됨), 및 -(CH2)aCO2NR5R6로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 -SR7,
(iv) R8은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴로부터 선택되는 것인 -OR8, -OCOR8,
(c) j 및 R4는 앞서 정의된 바와 같은 것인, -CH(OH)(CH2)jR4,
(d) d는 0 내지 5이고, R11은 수소, -CONR5R6, 또는 R13은 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬인 것인 -CO2R13이고, R12는 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬인 것인 -(CH2)dCHR11CO2R12 또는 -(CH2)dCHR11CONR5R6;
(e) k는 2 내지 6이고, R14는 할로겐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15는 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴 또는 아실임), -SR7(식 중에서, R7은 앞서 정의된 바와 같음), -CONR5R6, -NR5R6 (식 중에서, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같음) 또는 -N3인 것인 -(CH2)kR14;
(f) m은 O 내지 4이고, R16은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15은 앞서 정의된 바와 같음), -CONR5R6 또는 -NR5R6(식 중에서, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같음)인 것인 -CH=CH(CH2)mR16;
(g) R12는 앞서 정의된 바와 같은 것인 -CH=C(CO2R12)2;
(h) n은 0 내지 4이고, R16은 앞서 정의된 바와 같은 것인, -C≡C(CH2)nR16;
(i) R22는 세 개의 저급 알킬기가 동일하거나 또는 상이한 것인 트리-저급 알킬 실릴이거나 또는 R22는 R8과 동일한 의미를 갖는 것인 -CH2OR22;
(j) R23은 저급 알킬, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐이고, R7은 정의된 바와 같은 것인 -CH(SR23)2 및 -CH2-SR7;이고, 및
R3는 수소, 할로겐, 아실, 카르바모일, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐 또는 아미노이고; 및
W1 및 W2는 독립적으로 수소, 히드록시이거나 또는 W1 및 W2는 함께 산소를 나타내고;
및 X는 중합체 모이어티인 것인 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서,
상기 방법은 하기 일반 식 (II)를 가지며:
Figure pct00002
식 (II)
X는 앞서 정의된 바와 같은 것인 ω-1H-이미다졸-카르복사미드 중합체 화합물을
하기 일반 식 (III)을 가지며
Figure pct00003
식 (III)
상기에서 R1, R2, R3, W1 및 W2는 앞서 정의된 바와 같고 선택적으로 보호기에 의해 보호되며, Y는 이탈기를 나타내는 것인 인돌로카르바졸 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고,
상기 방법은 선택적으로, 식 (I)의 화합물을 수득하기 위해, 보호된 R1, R2, R3, W1 및 W2를 탈보호시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
식 (I)의 컨쥬게이트 중합체 화합물을 합성하는 본 발명의 방법의 컨쥬게이션 반응은 유기 용매 중의 염기에 의해 촉매된다. 바람직하게는, 상기 염기는 강염기이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 염기는 알칼리 금속 수소화물, 삼차 아민 및/또는 알콕시드의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 본 발명의 중합체 컨쥬게이션 반응을 촉매하는 염기는 소디움 수소화물이다. 그러나, 소디움 메톡시드, 또는 트리에틸아민과 같은 다른 염기들도 이용할 수 있다.
상기 염기 촉매 대 상기 식 (III)의 화합물의 몰비는 약 1:1 내지 약 4:1이고, 바람직하게는 약 1:1 내지 약 1.5:1이며, 보다 바람직하게는 약 1:1이다.
또한, 본 발명의 반응은 유기 용매 중에서, 바람직하게는 무수 조건, 즉, 무수 유기 용매(dry organic solvent) 중에서 수행된다. 바람직하게는, 컨쥬게이션 반응의 용액 혼합물 중 수분 함량은 200 ppm 이하이다. 상기 유기 용매는 디클로로메탄, 클로로포름 및 N,N-디메틸포름아미드의 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 상기 유기 용매는 디클로메탄, 훨씬 더 바람직하게는 무수 디클로로메탄이다.
본 발명에 따라, 컨쥬게이션 반응이 비활성 기체 대기, 예를 들면, 질소 또는 아르곤 대기 하에서 수행되는 것이 더 바람직하다.
또한, 본 발명의 방법의 반응은 바람직하게는 약 -10℃ 내지 약 60℃, 보다 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 25℃ 및 가장 바람직하게는 0℃에서의 초기 단계 후에 실온에서 수행된다.
본 발명의 방법에 따라 식 (I)의 표적 화합물의 제조 후에, 식 (I)의 중합체 컨쥬게이트를 반응 혼합물로부터 분리하고 정제할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 조 혼합물의 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제에 의해 식 (I)의 화합물이 수득된다. 바람직하게는 자동화된 구배 플래쉬 정제 시스템이 이용되며 적합한 컬럼 및 용매가 구비된다. 정제 방법은 바람직하게는 역상 및 정상(direct phase) 컬럼으로부터 선택되고, 조건화(conditioning)/용리 용매는 바람직하게는 상이한 혼합비의 디클로메탄, 물, 메탄올, 아세토니트릴, 암모늄 포르메이트(ammonium formate) 완충액으로부터 선택된다. 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 식 (I)의 인돌로카르바놀-중합체 화합물은 C18 카트리지가 장착된 역상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되고, 상기 정제는 아세토니트릴/5 mM 암모늄 포르메이트 완충액(pH 3.5) 40:60 (실시예 3에 보고됨)을 이용한 등용매 용리에 의해 수행된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 식 (I)의 인돌로카르바졸-중합체 화합물은 정상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제된다(실시예 4 및 5.3에 기재됨).
그 후, 생성물을 예를 들면, 황산나트륨 상에서 건조시키고 여과시키고 25℃에서 감압 하에 증발에 의해 용매를 제거한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 알려진 통상적인 기법에 의해 표적 생성물의 정제를 수행한다.
정제 단계 후에, 결과적으로 수득된 식 (I)의 중합체 화합물은 약 95% 이상의 순도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 정제 단계 후에 식 (I)의 화합물은 약 98% 이상의 순도를 갖는다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 결과적으로 수득된 중합체 화합물은 98.5%, 99% 또는 99.5%의 순도를 갖는다.
또한, 본 발명의 방법은 식 (III)의 반응물(reactant compound)의 중량 기준으로 약 40 중량% 내지 약 98 중량%, 바람직하게는 약 50 중량% 내지 약 95 중량%의 식 (I)의 화합물의 총 질량 수율(overall mass yield)을 갖는다.
식 (III)의 잔기 Y는 이탈기, 즉, 본 발명의 중합체 컨쥬게이션의 반응 조건 하에, 식 (I)의 화합물의 옥사졸리딘디온 고리를 수득하기 위해 식 (III)의 화합물의 구조로부터 분리되는 작용기이고, 상기 고리는 K252a 또는 그의 유도체 화합물의 인돌로카르바졸 구조에 중합체 모이어티를 공유결합에 의해 결합시킨다. 본 발명에 따르면, 식 (I)의 화합물을 수득하기 위해 컨쥬게이션 반응 동안 중합체 반응기 모이어티로부터 일반식 (II)의 화합물의 이미다졸 고리가 분리된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 식 (III)의 이탈기 Y는 트리플레이트, 토실레이트, 술페이트, 할로겐, 히드록시, 또는 저급 알콕시기를 포함한 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 식 (III)의 이탈기 Y는 저급 알콕시기 또는 히드록시기이다. 가장 바람직하게는, 이탈기 Y는 저급 알콕시기, 특히, 메톡시기이다.
본 발명의 방법에 따라 인돌로카르바졸 화합물에 공유결합에 의해 결합되고, 예를 들면, 일반식 (I) 및 (II)에서 X로 표시되는 중합체 모이어티는 생체적합성이어야 하고, 천연물 기원이거나, 반-합성물(semi-synthetic) 기원이거나 또는 합성물 기원일 수 있고 직선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 중합체 X는 폴리(알킬렌 옥시드), 특히, (폴리에틸렌)옥시드로부터 선택된다. 그러나, 추가적인 대표적 중합체는 폴리아크릴산, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드 또는 그의 N-알킬 유도체, 폴리메타크릴산, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸아크릴산, 폴리에틸아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(비닐알코올), 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리(락트-코-글리콜)산, 덱스트란, 키토산, 폴리아미노산, 히드록시에틸 전분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 참여하기 위해, 특히, 본 발명의 방법의 식 (II)의 반응물 중합체에 관능화(functionalize)되기 위해, 전술된 중합체 모이어티는 아미노 관능성 말단-기(amino functional end-group)를 가져야 하거나, 또는 아미노 관능성 말단기를 갖도록 관능화되어야 한다. 따라서, 중합체 모이어티는 일반식 X-NH2.의 아미노-활성화 중합체(amino-activated polymer)이어야 한다.
실제로, 식 (II)의 출발 중합체 반응물은 일반식 (II)의 ω-1H-이미다졸-카르복사미드 중합체 화합물을 수득하기 위해 중합체 모이어티의 아미노기와 1,1-카르보닐디이미다졸 화합물의 반응에 의해 수득된다.
식 (II)의 ω-1H-이미다졸-카르복사미드 중합체 화합물의 형성은 바람직하게는 디클로로메탄, 클로로포름, N,N-디메틸포름아미드와 같은 유기 용매 중에서 수행된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 유기 용매는 디클로로메탄이고, 훨씬 더 바람직하게는 무수 디클로로메탄이다.
ω-아미노 중합체의 활성화가 비활성 기체 대기, 예를 들면, 질소 또는 아르곤 대기 하에서 수행되는 것이 본 발명에 따라 더 바람직하다.
또한, 본 발명의 ω-1H-이미다졸 카르복사미드 중합체 화합물 형성의 반응은 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 60℃, 보다 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 25℃, 및 가장 바람직하게는 실온에서 수행된다.
본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 중합체 모이어티 X는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티이고, 이때, 말단 OH기는 선택적으로 예를 들면, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 아실기, 바람직하게는 C1-, C2- 또는 C3-알킬기 또는 C1-, C2- 또는 C3 기에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게는, 변형된 폴리에틸렌 글리콜은 말단 알콕시-치환(terminally alkoxy-substituted) 폴리에틸렌 글리콜, 보다 바람직하게는 메톡시-폴리에틸렌-글리콜(mPEG)이다. 본 발명에 따라 사용된 중합체는 약 100 내지 약 100,000 Da, 바람직하게는 약 200 내지 약 50,000 Da, 및 보다 바람직하게는 약 500 내지 약 10,000 Da의 분자량을 갖는다. 본 발명의 하나의 바람직한 양태에 따르면, 상기 중합체는 단쇄 폴리(에틸렌 글리콜), 바람직하게는 말단 알콕시-치환 PEG, 예를 들면, 약 200 내지 약 1500 Da, 바람직하게는 약 400 내지 약 1200 Da 및 훨씬 더 바람직하게는 약 550 내지 약 1100 Da 범위의 분자량을 갖는 메톡시-치환 폴리(에틸렌-글리콜)이다. 가장 바람직한 구체예에서, 단쇄 PEG 또는 mPEG는 약 550 Da 또는 약 1100 Da의 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 제2 바람직한 양태에 따르면, 상기 중합체는 장쇄 폴리(에틸렌-글리콜), 바람직하게는 말단 알콕시-치환 PEG, 예를 들면, 약 4,000 내지 약 6,000 Da, 바람직하게는 약 4,500 내지 약 5,500 Da 범위의 분자량을 갖는 메톡시-치환 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 본 발명의 이 양태의 가장 바람직한 구체예에서, 장쇄 PEG 또는 mPEG는 약 2,000 Da 또는 약 5,000 Da의 분자량을 갖는다.
본 발명의 중합체 모이어티의 분자량의 값 및 범위를 정의하기 위해 사용된 용어 "약(about)"은 표시된 값 및/또는 범위 한계가 ±20%, 바람직하게는 ±10% 내에서 변할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 달리 명시적으로 제공되지 않으면, 본 출원에서 사용된 하기의 용어 각각은 하기에 제시된 의미를 갖는다.
단독으로, 또는 다른 작용기와 함께 조합된 용어, "저급 알킬(lower alkyl)"은 1-6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1-5개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1-4개의 탄소 원자 및 특히 바람직하게는 1-3개, 또는 1-2개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 저급 알킬기를 의미한다. 이 작용기는 특히, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 세크-부틸, 터트-부틸, 펜틸, 아밀, 이소아밀, 네오펜틸, 1-에틸프로필, 헥실, 및 그 등가물을 포함한다. "저급 알콕시", "저급 알콕시카르보닐", "저급 알킬아미노카르보닐", "저급 히드록시알킬" 및 "트리-저급 알킬실릴"기의 저급 알킬 모이어티는 앞서 정의된 "저급 알킬"과 동일한 의미를 갖는다.
"저급 알케닐(lower alkenyl)"기는 직쇄형 또는 분지형일 수 있고, Z형 또는 E형일 수 있는 C2-C6 알케닐기로 정의된다. 그와 같은 작용기들은 비닐, 프로페닐, 1-부테닐, 이소부테닐, 2-부테닐, 1-펜테닐, (Z)-2-펜테닐, (E)-2-펜테닐, (Z)-4-메틸-2-펜테닐, (E)-4-메틸-2-펜테닐, 펜타디에닐, 예를 들면, 1,3- 또는 2,4-펜타디에닐, 및 그 등가물을 포함한다. 보다 바람직한 C2-C6 알케닐기는 C2-C5-, C2-C4-알케닐기이고 훨씬 더 바람직하게는 C2-C3-알케닐기이다.
용어 "저급 알키닐(lower alkynyl)"기는 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 C2-C6-알키닐 기를 의미하고 에티닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-펜티닐, 3-펜티닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐 및 그 등가물을 포함한다. 보다 바람직한 C2-C6-알키닐기는 C2-C5-, C2-C4-알키닐기이고, 훨씬 더 바람직하게는 C2-C3-알키닐기이다.
용어 "아릴(aryl)"기는 6개 내지 14개까지의 고리 탄소 원자(ring carbon atom)를 포함하는 C6-C14-아릴기를 의미한다. 이 작용기들은 모노시클릭(monocyclic), 비시클릭(bicyclic) 또는 트리시클릭(tricyclic)일 수 있고, 융합된 고리(fused ring)이다. 바람직한 아릴기는 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐 및 그 등가물을 포함한다. "아릴카르보닐" 및 "아릴아미노카르보닐"기의 아릴 모이어티는 앞서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "헤테로아릴(heteroaryl)"기는 질소, 황, 또는 산소로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 헤테로원자를 포함할 수 있고 C3-C13-헤테로아릴기를 의미한다. 이 작용기들은 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭일 수 있다. 본 발명의 C3-C13-헤테로아릴기는 헤테로방향족(heteroaromatics) 및 포화 및 부분적으로 포화된 헤테로시클릭 기를 포함한다. 이 헤테로시클릭은 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭일 수 있다. 바람직한 5원 또는 6원 헤테로시클릭기는 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 피리딜, 피라닐, 모르폴리닐, 피라지닐, 메틸피롤릴, 및 피리다지닐이다. C3-C13-헤테로아릴기는 비시클릭 헤테로시클릭기일 수 있다. 바람직한 비시클릭 헤테로시클릭기는 벤조푸릴, 벤조티에닐, 인돌릴, 이미다졸릴, 및 피리미디닐이다. 가장 바람직한 C3-C13-헤테로아릴은 푸릴 및 피리딜이다.
용어 "저급 알콕시"는 1개 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1개 내지 5개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자, 및 특히 바람직하게는 1개 내지 3개, 또는 1개 내지 2개의 탄소 원자를 포함하는 알콕시기를 포함하고 직쇄형 또는 분지형일 수 있다. 이 작용기들은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 이소프로폭시, 터트-부톡시, 펜톡시, 헥속시 및 그 등가물을 포함한다.
용어 "아실"은 1개 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1개 내지 5개의 탄소 원자, 1개 내지 4개의 탄소 원자, 1개 내지 3개의 탄소 원자, 또는 1개 내지 2개의 탄소 원자를 포함하는 저급 알카노일을 포함하고, 직쇄형 또는 분지형일 수 있다. 이 작용기들은 바람직하게는 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 3차 부티릴(teritiary butyryl), 펜타노일 및 헥사노일이다. "아실옥시"기의 아실 모이어티는 앞서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 및 그 등가물을 포함한다.
용어 "아랄킬(aralkyl)"기는 알킬기가 아릴에 의해 치환된 것인 C7-C15-아랄킬을 의미한다. 상기 알킬기 및 아릴은 앞서 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기 및 C6-C14-아릴기로부터 선택될 수 있고, 상기에서, 탄소 원자의 총 수는 7 내지 15개이다. 바람직한 C7-C15-아랄킬기는 벤질, 페닐에틸, 페닐프로필, 페닐이소프로필, 페닐부틸, 디페닐메틸, 1,1-디페닐에틸, 1,2-디페닐에틸이다. "아랄킬옥시"기의 아랄킬 모이어티는 앞서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다.
치환된 저급 알킬, 알케닐 및 알키닐기는 1개 내지 3개의 독립적으로 선택된 치환기, 예를 들면, 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복실, 저급 알콕시카르보닐, 니트로, 할로겐, 아미노, 모노- 또는 디-저급 알킬아미노, 디옥솔란, 디옥산, 디티올란, 및 디티온을 갖는다. 치환된 저급 알킬, 알케닐 및 알키닐기의 저급 알킬 치환기 모이어티, 및 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐 및 치환된 저급 알킬, 알케닐 및 알키닐기의 모노- 또는 디-저급 알킬아미노 치환기의 저급 알킬 모이어티는 앞서 정의된 바와 같은 "저급 알킬"과 동일한 의미를 갖는다.
치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴 및 치환된 아랄킬기는 각각 1개 내지 3개의 독립적으로 선택된 치환기, 예를 들면, 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐, 니트로, 아미노, 모노- 또는 디-저급 알킬아미노, 및 할로겐을 갖는다. 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐 및 치환기 중의 모노- 또는 디-저급 알킬아미노기의 저급 알킬 모이어티는 앞서 정의된 저급 알킬과 동일한 의미를 갖는다.
질소 원자와 결합된 R5 및 R6에 의해 형성된 헤테로시클릭기는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리디노, 모르폴리닐, 모르폴리노, 티오모르폴리노, N-메틸피페라지닐, 인돌릴, 및 이소인돌릴을 포함한다.
바람직하게는, R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, 니트로, -CH2OH, -(CH2)kR14, -CH=CH(CH2)mR16, -C≡C(CH2)nR15, R4는 -SR7인 것인 -CO(CH2)jR4, CH2O-(치환 또는 미치환) 저급 알킬(식 중에서, 상기 치환된 저급 알킬은 바람직하게는 메톡시메틸, 메톡시에틸 또는 에톡시메틸임), -NR5R6로 구성된 군으로부터 선택된다.
R1 및 R2의 전술된 바람직한 의미에서, 잔기 R14은 바람직하게는 페닐, 피리딜, 이미다졸릴, 티아졸릴, 테트라졸릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15는 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 페닐 또는 아실로부터 선택됨), -SR7(식 중에서, R7은 바람직하게는 치환 또는 미치환 저급 알킬, 2-티아졸린 및 피리딜로부터 선택됨) 및 -NR5R6 (식 중에서, R5 및 R6는 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 페닐, 카르바모일 및 저급 알킬아미노카르보닐로부터 선택됨)로부터 선택된다. 또한, 잔기 R16은 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 페닐, 이미다졸, 티아졸, 테트라졸, -COOR15, -OR15 및 -NR5R6(식 중에서, 상기 잔기 R15, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같은 바람직한 의미를 가짐)로부터 선택된다. R1 및 R2의 전술된 바람직한 의미에서, 잔기 R7은 바람직하게는 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 페닐, 피리딜, 피리미딜, 티아졸 및 테트라졸로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한, k는 바람직하게는 2, 3, 또는 4이고, j는 바람직하게는 1 또는 2이고, m 및 n은 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이다.
바람직하게는 R3은 수소 또는 아세틸이고, 가장 바람직하게는 수소이다.
또한, 바람직하게는, 각 W1 및 W2는 수소이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 중합체 모이어티에 컨쥬게이션된 화합물 K-252a에 관한 것이다. 훨씬 더 바람직한 구체예는 K-252a 및 그의 유도체의 중합체 컨쥬게이트에 관한 것이고, 상기 중합체 컨쥬게이트는 K-252a 화합물 또는 K-252a 유도체 화합물에 중합체 단위(unity)를 연결시키는 화학적 작용기가 5-원 옥사졸리딘디온 고리 구조인 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 식 (I)의 중합체 컨쥬게이트는 R1, R2, R3, W1, 및 W2는 수소이고, X는 중합체 모이어티인 것인 화합물로 표시된다. 본 발명의 이와 같은 매우 바람직한 구체예에 따라, 상기 중합체 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 바람직한 구체예의 폴리에틸렌 글리콜 또는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜은 약 2000 Da 또는 약 5000 Da의 평균 분자량을 갖는 장쇄 PEG 또는 mPEG 중합체이다. 약 550 Da 또는 약 1100 Da의 평균 분자량을 갖는 단쇄 폴리에틸렌 글리콜 또는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜도 마찬가지로 바람직하다.
본 발명의 방법은 선택적으로 K-252a 또는 유도체 화합물의 인돌로카르바졸 화합물의 치환기 R1, R2, R3, W1 및 W2 중 하나 이상 또는 이들 모두를 보호기로 보호하는 단계를 포함한다. 본 발명에서, 용어 "보호기(protecting group)"는 필요한 경우, 합성 과정 동안 R1, R2, R3, W1 및 W2를 가리고(mask) 나중에 상기 분자의 나머지에 대한 원치않는 효과 없이 R1, R2, R3, W1 및 W2 치환기가 회복될 수 있게 하는 조건 하에 제거될 수 있는, 당해 기술 분야에서 공지된 치환기 R1, R2, R3, W1 및 W2의 유도체를 의미한다. 특히, -필요한 경우- 보호기가 K-252a 또는 유도체 화합물의 인돌로카르바졸 구조의 C3 위치에서 중합체 컨쥬게이션의 화학선택성(chemoselectivity)을 수득하기 위해 본 발명의 컨쥬게이션 단계 동안 R1, R2, R3, W1 및 W2 중 하나, 그 이상 또는 모두에 도입된다. 컨쥬게이션 반응 후에, 관여된 치환기 R1, R2, R3, W1 및 W2의 원래의 관능기를 회복시켜, 식 (I)의 인돌로카르바졸 컨쥬게이트 화합물을 수득하기 위해 상기 하나 이상의 보호기가 가역적으로 제거될 수 있다.
본 발명에 따르면, 당해 기술 분야에서 알려진 적합한 보호기가 이 목적을 위해 이용될 수 있다. 치환기 R1, R2, R3, W1 및 W2를 보호하고 탈보호하기 위한 적합한 수단과 조건 및 적합한 보호기의 선택이 유기 합성 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 사용되는 보호 및 탈보호의 수단 및 조건은 관여된 관능기 R1, R2, R3, W1 및 W2의 속성에 따라 결정된다. 히드록시-, 아미노-, 및/또는 카르복시 잔기를 위한 보호기는 바람직하게는 아세토니드, 에틸리덴 메톡시메틸, 2-메톡시에톡시메틸, 벤질옥시메틸, 테트라히드로피라닐, 메틸, 에틸, 이소프로필, t-부틸, 벤질, 트리페닐메틸, t-부틸디메틸실릴, 트리페닐실릴, 메톡시카르보닐, t-부틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 플루오레닐메톡시카르보닐, 아세틸, 벤조일, 톨루엔술포닐, 디메톡시벤질, 니트로페닐옥시카르보닐, 니트로벤질옥시카르보닐, 알릴, 플루오레닐메틸, 테트라히드로퓨라닐, 펜아실, 아세톨, 페닐, 트리메틸실릴, 피롤리딜, 인돌릴, 히드라지노 및 Greene T.W., et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed., John Wiley and Son, New York, NY (2007)에서 확인될 수 있는 보호기와 같은, 당해 기술 분야에서 공지된 기타 보호기로부터 선택된다. 보호 및 탈보호 반응의 시약 및 조건은 특히 화합물의 나머지 부분에 불리한 영향을 미치지 않으면서 선택적으로 보호기를 부착하고 제거하기 위한 적합성을 위해 선택된다. 적합한 조건 및 시약은 당업자의 실무에서 일반적으로 알려져 있다.
본 발명에 따르면, 식 (I)의 화합물은 또한 염산, 요오드화수소산, 브롬화수소산, 인산, 메타포스포르산, 질산 및 황산과 같은 무기산의 염, 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산, 아릴술폰산(예를 들면, p-톨루엔 술폰산, 벤젠술폰산), 인산, 말론산 등과 같은 유기산의 염을 포함한 약제학적으로 허용가능한 염으로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염의 형성을 위한 적합한 염은 당해 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 또한, 식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 양이온에 의해 형성될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 양이온은 당해 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고 알칼리 양이온 (Li+, Na+, K+), 알칼리 토금속 양이온(earth alkali cation)(Mg2 +, Ca2 +, Ba2 +), 암모늄 양이온 및 유기 양이온, 예를 들면, 4차 암모늄 양이온을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 K-252a 및 그의 유도체의 신규한 중합체 컨쥬게이트로서, 상기 K-252a 화합물 또는 K-252a 유도체 화합물에 중합체 모이어티를 연결시키는 화학적 작용기는 5-원 옥사졸리딘디온 고리 구조인 것을 특징으로 하는 신규한 중합체 컨쥬게이트이다. 이 신규한 중합체 컨쥬게이트는 본 명세서에 개시된 신규한 합성 방법에 의해 제조된다.
특히, 본 발명의 또 다른 양태는 하기 식 (I)을 가지며,
Figure pct00004
식 (I)
식 중에서, R1, R2, R3, W1 및 W2 및 중합체 모이어티 X는 앞서 상세하게 정의된 바와 같은 것인 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 R1, R2, R3, W1 및 W2는 수소이고, 중합체 모이어티 X는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 말단 알콕시-치환 PEG, 예를 들면, 바람직하게는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(m-PEG)인 것인 신규한 식 (I)의 중합체 컨쥬게이트 화합물에 관한 것이다. 이 화합물은 본 발명에 따른 K-252a의 중합체 컨쥬게이트 화합물에 해당한다. 바람직하게는, 상기 중합체 모이어티는 장쇄 폴리에틸렌 글리콜이고, 훨씬 더 바람직하게는, 말단 알콕시-치환 PEG, 예를 들면, 약 2000 Da 또는 약 5000 Da의 평균 분자량을 갖는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(m-PEG)이다. 마찬가지로, 바람직하게 상기 중합체 모이어티는 단쇄 폴리에틸렌 글리콜이고, 훨씬 더 바람직하게는 약 550 Da 또는 약 1100 Da의 평균 분자량을 갖는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(m-PEG)과 같은, 말단 알콕시-치환 PEG이다.
본 발명자들은, 놀랍게도, 중합체를 갖지 않는, 인돌로카르바졸 화합물의 일원, 특히, K-252a 또는 그의 유도체에 비해, 상응하는 (I)의 중합체 컨쥬게이트 화합물은 치료적 및 생물학적 활성 화합물의 개선된 생체이용률(bioavailability)을 가져오는, 증가된 용해도 때문에 개선된 약동학 및 독성학적 성능을 보인다는 것을 발견했다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 놀랍게도 식 (I)의 중합체 컨쥬게이트 인돌로카르바졸 화합물은 국소 적용시, 그들의 증가된 분자 크기 및 양친매성(amphipathicity) 때문에 제한된 전신성 흡수를 보이고, 따라서, 국소 치료 및 생물학적 효과를 증가시키고, 국소 적용에 따른 전신 독성 및/또는 부작용을 감소시킨다는 것을 발견했다.
또한, 본 발명자들은 놀랍게도 중합체를 갖지 않는, 인돌로카르바졸 화합물 자체 및 특히, K-252a 및 그의 유도체의 비-선택적 키나아제 억제 활성에 비해, 식 (I)의 인돌로카르바졸-중합체 컨쥬게이트는 TrkA 티로신 키나아제에 대한 억제 활성에서 선택성의 유의성 있는 증가를 보인다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명에 따른 인돌로카르바졸 화합물 및 특히, K-252a의 중합체 분자로의 컨쥬게이션은 치료 표적에 대해 선택적이고, 결과적으로 바람직하지 않은 부작용을 감소시키는 활성제의 제공을 가져온다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 약제에서 식 (I)의 화합물의 활성제로서의 용도이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 식 (I)의 화합물은 전신 투여 및 치료를 위한 약제에서 활성제로 이용된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 국소 약제(topical medicament)에서 식 (I)의 화합물의 활성제로의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 컨쥬게이트(conjugated) 중합체 화합물은 HMGB1-관련 질환의 예방, 경감 및 치료를 위해 유용한 약제에서 활성제로 이용된다. HMGB1-관련 질환(HMGB1-associated pathology)은 HMGB1 핵 단백질이 실제로 검출가능하지 않은 정상 개체에서의 농도 대비, 아세틸화된 형태 또는 비-아세틸화된 형태(non-acetylated form)의 핵 단백질(nuclear protein) HMGB1 및/또는 HMGB1-상동성 단백질의 증가된 농도가 생물학적 유체(biological fluid) 및 조직에 존재하는 것인 환자의 상태이다. 세포외 HMGB1은 강력한 주화성 염증유발 케모카인(chemotactic pro-inflammatory chemokine)으로 작용한다. 따라서, HMGB1-관련 질환은 강한 염증성 기반을 갖는 질환, TNF-알파, IL-1, IL-6 등과 같은 사이토카인의 자극으로부터 유발되는 질환, 또는 중독, 감염, 화상 등과 같은 치명적인 사건들로부터 초래되는 질환이다. 특히, 고농도의 HMGB1 단백질 및 상동성 단백질이 패혈증 환자의 혈장, 류마티스 관절염 환자의 혈장 및 윤활액, 알쯔하이머병 환자의 뇌, 흑색종 환자의 혈장 및 조직, 전신 홍반 루푸스 환자의 혈장, 죽상경화증 환자의 죽상경화판(atherosclerotic plaque) 등에서 발견되고 결정되었다. 생물학적 유체 및 조직에서 HMGB1 단백질 및/또는 상동성 단백질의 결정 및 증거는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 알려진, 예를 들면, ELISA 분석에 의한 검출 등과 같은 통상적인 진단 도구에 의해 검출될 수 있다.
따라서, 다양한 질병이 세포외 HMGB1의 관련된 존재를 특징으로 하며, 이들은 특히, 염증성 질병(inflammatory disease), 협착, 재협착, 죽상경화증, 류마티스 관절염, 자가면역 질환, 종양, 감염성 질환, 패혈증, 급성 염증성 폐 손상, 홍반성 루푸스, 신경퇴행성 질환, 중추신경계 및 말초신경계 질환 및 다발성 경화증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 구체예에서, 식 (I)의 컨쥬게이트 중합체 화합물은 심혈관 질환, 특히, 죽상경화증, 및/또는 혈관성형술 동안 또는 그 후에 발생하는 재협착의 예방, 경감 및 치료를 위해 이용된다. 보다 바람직하게는, 상기 약제는 혈관성형술 동안 또는 그 후에 일어나는 재협착에서 결합 조직 재생을 차단, 지연 및/또는 손상시키기 위해 이용된다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 식 (I)의 컨쥬게이트 중합체 화합물은 신경 질환, 신경병증 및 중추신경계 및 말초신경계의 신경퇴행성 질환의 예방, 경감 및 치료용 약제의 활성제로의 용도를 위해 효율적이다.
또한, 본 발명자들은 신규한 컨쥬게이트 화합물이 전신 치료에 의해 혈장 사이토카인 분비를 경감 및/또는 억제할 수 있다는 것을 입증했다. 따라서, 상기 중합체 컨쥬게이트 화합물은 혈장 사이토카인 분비의 증가가 관여되는 질환의 예방, 경감 및/또는 치료를 위해 유용한 전신 투여용 약제에서 활성제로 이용된다. 이 질환들은 바람직하게는 TNF-α, IFN-γ, MCP-1, MIP-1 및/또는 RANTES의 분비가 주로 관여되는 질환이다.
특히, 본 발명에서, 증가된 혈장 사이토카인 분비와 관련된 질환은 염증성 질환, 자가면역 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 기관 이식 후 재관류 손상, 심혈관 질환(cardiovascular affection), 산부인과 질환(obstetric and gynecologic disease), 감염성 질환, 알레르기 및 아토피성 질환, 고형 종양 및 액체 종양 질환(solid and liquid tumor pathology), 이식 거부 질환, 선천성 질환, 피부 질환, 신경 질환, 악액질(cachexia), 신장 질환, 의원 중독 상태(iatrogenic intoxication condition), 대사질환 및 특발(idiopathic) 질환, 및 안과 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 베체트병(Behcet's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 혈관염, 포도막염, 망막병증의 예방, 경감 및/또는 치료를 위해 유용한 전신 치료용 약제에서 활성제로 이용된다.
본 발명의 또 다른 특정한 양태에서, 본 발명의 컨쥬게이트 중합체 화합물은 피부 질환의 예방, 경감 및/또는 치료를 위해 유용한 국소 약제(topical medicament)에서 활성제로 이용된다. 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트된 중합체 화합물이 (하기의 실시예에 기재된 연구에서 확인된 바와 같이) 피부에 적용시 유해하거나 또는 독성 효과(예를 들면, 자극), 또는 광독성(phototoxic) 효과(예를 들면, 광 돌연변이 유발성(photomutagenicity), 광독성 또는 광감작)를 보이지 않기 때문에 국소 약제로서 매우 유용하게 사용된다는 것을 입증했다.
본 발명의 맥락에서 바람직한 피부 질환은 각질세포의 과다 증식을 특징으로 하는 질환, 예를 들면, 건선, 아토피성 피부염, 만성 습진, 여드름, 홍색 비강진(pitiriasis rubra pilaris), 켈로이드, 비후성 반흔(hypertrophic scar) 및 각질가시세포종(keratoacanthoma), 편평세포암종, 기저세포암종과 같은 피부암이다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 건선의 예방, 경감 및 치료를 위해 유용한 국소 약제에서 활성제로 이용된다.
본 발명의 화합물의 TrkA의 억제에서의 증가된 선택성 때문에, 본 발명의 또 다른 양태는 TrkA가 병태생리적 메카니즘에서 중요한 역할을 수행하여, 질병의 발생을 초래하는 것인 질병의 예방, 경감 및 치료에서 상기 컨쥬게이트 화합물의 용도이다. 이와 관련하여, 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 식 (I), (II), 및/또는 (III)의 컨쥬게이트 K-252a 중합체 화합물은 NGF-관련 통증 및 통각과민의 예방, 경감 및 치료를 위한 약제에서 활성제로 이용된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 앞서 정의된 바와 같은 질병의 예방, 경감 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트, 희석제, 및/또는 첨가제와 조합된, 앞서 정의된 바와 같은 식 (I)의 화합물의 용도이다.
식 (I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 약리적 활성 및 투여 목적에 따라 그 자체로 또는 다양한 약제학적 조성물의 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트(adjuvant), 희석제 및/또는 첨가제와 함께 유효량의 하나 이상의 식 (I)의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이다. 약제학적 담체, 아쥬반트, 희석제 및/또는 첨가제가 당해 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고 따라서, 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 제제화에서 적용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 약제학적 조성물에서 유일한 활성제로 이용될 수 있다. 대안적으로, 식 (I)의 화합물은 하나 이상의 다른 활성제, 예를 들면, 전술된 질병의 치료에서 다른 활성제와 조합되어 이용될 수 있다.
특히, 본 발명의 중합체 컨쥬게이트 화합물은 하나 이상의 스테로이드계 항염증제 및/또는 염증성 사이토카인 캐스캐이드(inflammatory cytokine cascade)의 조기 매개체(early mediator)를 억제할 수 있는 추가적인 작용제, 예를 들면, TNF, IL-1α, IL-1β, IL-Ra, IL-8, MIP-1α, MIF-1β, MIP-2, MIF 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 길항제 또는 억제제와 조합되어 이용될 수 있다. 특히 유용한 항염증제는 알클로메타손 디프로피오네이트(alclometasone dipropionate), 암시노니드(amcinonide), 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손, 베타메타손 벤조에이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 소디움 포스페이트, 베타메타손 소디움 포스페이트 및 아세테이트, 베타메타손 발레레이트(valerate), 클로베타솔 부티레이트, 클로베타솔 프로피오네이트, 클로코르톨론 피발레이트, 코르티솔(히드로코르티손), 코르티솔(히드로코르티손) 아세테이트, 코르티솔(히드로코르티손) 부티레이트, 코르티솔(히드로코르티손) 시피오네이트(cypionate), 코르티솔(히드로코르티손) 소디움 포스페이트, 코르티솔(히드로코르티손) 소디움 숙시네이트, 코르티솔(히드로코르티손) 발레레이트, 코르티손 아세테이트, 데소니드, 데스옥시메타손, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 소디움 포스페이트, 디플로라손 디아세테이트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루드로코르티손 아세테이트, 플루드록시코르티드, 플루메타손 피발레이트, 플루니솔리드, 플루오시놀론 아세토니드, 플루시노니드, 플루오코르톨론, 플루오로메톨론, 플루란드레놀리드(flurandrenolide), 플루티카손 프로피오네이트, 할시노니드, 할로베타솔 프로피오네이트, 메드리손(medrysone), 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 모메타손 퓨로에이트(mometasone furoate), 파라메타손 아세테이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 소디움 포스페이트, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니손, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세테이트, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론 디아세테이트, 트리암시놀론 헥스아세토니드로부터 선택된다. 사이토카인의 유용한 길항제 또는 억제제는 인플릭시마브(infliximab), 에타네르셉트(etanercept) 또는 아달리무마브(adalimumab)로부터 선택된다.
본 발명의 중합체 화합물과 조합되어 이용될 수 있는 추가적인 작용제는 예를 들면, RAGE의 길항제 및/또는 억제제, HMGB1의 길항제 및/또는 억제제, 트롬보모듈린의 기능성 N-말단 렉틴-유사 도메인(D1)인 HMGB1과 Toll-유사 수용체(Toll-like receptor, TCR)의 상호작용의 길항제 및/또는 억제제, 및/또는 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제특허출원 WO 2006/002971에 기재된 바와 같은 굽은 형태(bent shape) 구조를 갖는 합성 이중가닥 핵산 또는 핵산 유사체 분자이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자, 예를 들면, 의사에 의해 알려진 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 특히, 본 발명의 약제학적 조성물은 주사 또는 주입, 특히, 정맥내, 근육내, 경점막(transmucosal), 피하 또는 복막내 주사 또는 주입 및/또는 경구 투여, 국소 투여, 경피 투여, 비강 투여, 흡입, 에어로졸 및/또는 직장 투여 등에 의해 투여될 수 있다. 투여는 국소성이거나 또는 전신성일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 및 약제학적 조성물의 투여는 비경구 투여에 의해, 특히, 액체 용액 또는 현탁액의 제형으로 이루어지거나 또는 경구 투여, 특히, 정제 또는 캡슐의 제형, 또는 비강내로, 특히, 분말, 점비제(nasal drop), 또는 에어로졸의 제형으로 이루어지거나, 또는 경피로, 예를 들면, 연고, 크림, 오일, 리포좀 또는 경피 패치의 제형으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 전신으로 투여된다. 특히, 중합체 컨쥬게이트 화합물은 주사 또는 주입에 의해, 특히, 정맥내, 근육내, 경점막, 피하, 또는 복막내 주사 또는 주입에 의해 및/또는 경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 국소 적용, 특히, 경피 적용에 의해 투여된다. 경피 적용의 경우, 본 발명의 화합물의 투여는 리포좀의 제형으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 가장 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 의료 장치의 표면에 가역적으로 고정화되어, 특히, 본 발명의 화합물 및 조성물을 스텐트(stent), 카테터(catheter), 외과수술 장비, 삽입관(cannulae), 심장판막, 또는 혈관 삽입물(vascular prostheses)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 의료 장치에 결합, 코팅, 및/또는 포접(embed)시키는 것에 의해 가역적으로 고정화시키는 것에 의해 투여된다. 의료 장치가 체액 또는 신체 조직과 접촉된 후, 가역적으로 고정된 화합물이 방출된다. 결과적으로, 코팅된 의료 장치가 약제를 용출시키는 약물 전달 장치로 작용하고, 그에 의해 약물 전달 동역학이 제어되어, 예를 들면, 즉시 방출, 제어(controlled), 지연(delayed), 또는 연장된(sustained) 약물 전달을 제공할 수 있다. 의료 장치의 코팅 기술은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 진단 또는 치료 적용을 위해 이용될 수 있다. 진단 적용을 위해, 식 (I)의 화합물은 표지된 형태, 예를 들면, 동위원소, 예를 들면, 방사성 동위원소 또는 핵 자기 공명에 의해 검출될 수 있는 동위원소를 포함하는 제형으로 존재할 수 있다. 바람직한 치료적 적용은 국소 적용의 경우, 건선 및 피부염의 예방, 경감 및 치료이고, 전신 적용의 경우, 재협착에서 결합 조직 재생의 예방, 경감 및 치료이다.
약제학적 조성물에서 본 발명의 화합물의 농도는 다양할 수 있다. 농도는 투여될 약물의 총 투여량, 이용되는 화합물의 화학적 특성(예를 들면, 소수성), 투여 경로, 환자의 연령, 체중 및 증상과 같은 인자들에 의존적일 것이다. 본 발명의 화합물은 비경구 투여를 위해 약 0.1 내지 10% w/v의 상기 화합물을 함유한 생리적 완충 수용액(aqueous physiological buffer solution)으로 제공된다. 통상적인 투여량 범위는 약 1 ㎍ 내지 약 1 g/kg 체중/일이고, 바람직한 투여량 범위는 약 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중/일이며, 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mg/kg으로 1일 1회 내지 4회 투여이다. 투여되는 약물의 바람직한 투여량은 질병 또는 질환의 유형 및 진행 정도, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 선택된 화합물과 화합물 부형제의 제제의 상대적인 생물학적 효능, 및 그의 투여 경로와 같은 변수에 의존적일 것이다.
본 발명에 따른 개선된 합성 방법이 하기의 도면 및 실시예에 의해 더 설명되나, 도면 및 실시예는 본 발명의 대상을 한정하지 않는다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예를 도시한다. 본 발명에 따른 K-252a의 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 컨쥬게이트를 생성하기 위해 인돌로카르바졸 화합물 K-252a를 α-메톡시-ω-1H-이미다졸-카르복사미드 폴리에틸렌 글리콜(mPEG-NH-CO-Im)과 반응시킨다. 본 발명의 이 바람직한 화합물에서, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜은 5-원 옥사졸리딘디온 고리 구조를 통해 활성 K-252a 화합물에 공유결합에 의해 결합된다.
도 2는 400 MHx의 자기장에서 DMSO-d6 용매 중 활성화된 중합체 mPEG-NH-CO-Im의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 직접 주입 이온 트랩 전자분무 이온화(direct infusion ion trap electrospray ionization)를 이용한, 500 내지 1400 m/z 범위에서의 mPEG-NH-CO-Im의 ESI-MS 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 400 MHz에서 DMSO-d6 용매 중 도 1의 K-252a 중합체 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 400 MHz에서 DMSO-d6 용매 중 도 1의 K-252a 중합체 컨쥬게이트의 13C-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 6은 직접 주입 이온 트랩 전자분무 이온화를 이용한, 500 내지 1400 m/z 범위에서의 도 1의 K-252a 중합체 컨쥬게이트의 ESI-MS 스펙트럼을 도시한다.
도 7은 TrkA에 대한 도 1의 K-252a 중합체 컨쥬게이트의 억제 곡선을 도시한다.
실시예 1: α-메톡시-ω-1H-이미다졸-카르복사미드 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG-NH-CO-Im)의 합성
Figure pct00005
500 ml 부피의 둥근 바닥 플라스크에서, 35.0 g의 mPEG-NH2 (MW 1892) (분석 순도(assay) 96%, 17.76 mmol)을 질소 대기 하에 85 mL의 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 감압 하에 용매를 제거하고 기계적 펌프에 의해 화합물을 2시간 동안 건조시켰다. 그 후, 기질을 질소 대기 하에 150 ml의 디클로로메탄에 용해시키고 용액을 2 l 부피의 3목 둥근 바닥 플라스크(three necks round bottom flask)로 옮겼다.
4.80 g의 1,1-카르보닐디이미다졸(분석순도 90%, 26.64 mmol)을 실온에서 상기 용액에 첨가했다. 질소 대기 하에 실온에서 혼합물을 교반하고 TL 크로마토그래피에 의해 확인하였다(용리액 CH2Cl2/MeOH 90:10). 일차 아민기의 존재를 확인하기 위해(보라색) TLC를 니히드린 용액으로 처리하였다.
반응은 2시간 내에 완료되었다. 혼합물을 0℃에서 냉각시키고 고체 생성물을 강한 교반 하에 디에틸 에테르를 서서히 첨가하여(60분에 걸쳐 700 ml 첨가) 침전시켰다. 상기 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고 추가적인 300 ml의 디에틸 에테르를 첨가했다. 생성물을 유리 소결(glass sintered) 디스크 필터 깔때기에서 여과시키고 100 ml의 디에틸 에테르로 세척하고 진공 하에 건조시켰다. 34.0 g의 건조된 백색 고체를 수득하였다(수율 94%).
생성물을 1H-NMR 및 ESI-MS에 의해 규명하였다.
1 H- NMR (DMSO-d6) d (ppm): 8.24 (m, 1H, CH), 7.69 (m, 1H, CH), 7.27 (s, 1H, NH), 7.02 (s, 1H, CH), 3.55 (m, CH2 PEG), 3.40 (m, 2H, CH2NH), 3.22 (s, 3H, OCH3).
ESI - MS (Cluster +2)...944.4, 966.4, 988.5, 1010.5, 1032.5...(mPEG-NH2의 클러스터 +2에 대한 질량 증가 +47...897.4, 919.4, 941.5, 963.5, 985.5).
실시예 2: 옥사졸리딘디온 컨쥬게이트의 제조를 위한 K-252a의 중합체 컨쥬게이션 반응
방법의 반응식이 도 1에 보고된다.
500 ml 부피의 둥근 바닥 플라스크에서, 33.0 g의 mPEG-NH-CO-Im (16.00 mmol)을 질소 대기 하에 85 ml의 디클로로메탄에 용해시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고 기계적 펌프에 의해 화합물을 2시간 동안 건조시켰다.
열 저온유지 유닛(thermo cryostat unit), 기계적 교반기 및 온도계가 장착된 2 l 부피 반응기에서, 6.21 g의 K-252a (분석순도 98%, 13.29 mmol)를 질소 대기 하에 1.85 L의 디클로로메탄에 용해시키고 용액을 0℃까지 냉각시켰다. 0.53 g의 소디움 수소화물 (분석순도 60%, 13.29 mmol)을 질소 대기 하에 첨가하고 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 건조된 mPEG-NH-CO-Im을 90 ml의 디클로로메탄에 용해시키고 용액을 질소 대기 하에 0℃에서 디클로로메탄 중 K-252a와 NaH의 혼합물에 첨가했다. 상기 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고 25℃까지 가열하고 이 온도에서 10분 동안 교반 하에 유지시켰다.
K-252a의 전환 및 혼합물 중 K-252a의 비율을 평가하기 위해 반응 혼합물을 HPLC로 분석하였다. 25℃에서 10분 후에, 3.60 g의 1,1-카르보닐디이미다졸 (분석 순도 90%, 19.93 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 용액을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 아미드 부산물(K-252a의 9번 위치에 있는 카르복시 모이어티에 의한 mPEG 컨쥬게이트)의 원하는 옥사졸리딘디온 컨쥬게이트로의 전환을 확인하기 위해 반응 혼합물을 HPLC로 분석하였다. 반응 혼합물을 포름산(assay 98%)으로 최종 pH 6까지 중성화시켰다(약 2 ml, 53 mmol).
감압 하에 25℃에서 용매를 제거하고 44.0 g의 엷은 황색 조 생성물을 수득했다.
조 생성물 중 컨쥬게이트의 HPLC 순도는 90%보다 높았다. 조 혼합물 중 원하는 생성물의 함량은 약 65 내지 70 % w/w이다.
실시예 3: 역상 플래쉬 크로마토그래피에 의한 K-252a의 옥사졸리딘디온 컨쥬게이트의 정제
실시예 2의 컨쥬게이션 단계에서 수득된 조 혼합물을 역상 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Flash 65iM KP-C18 카트리지가 장착된 Biotage Horizon 시스템을 이용했다. 생성 배치(batch)를 각각 3.0 g인 15개의 분량(aliquot)으로 나누었다. 상기 분량을 개별적으로 처리하였다.
C18 컬럼을 먼저 하기 구배를 적용하여 200 ml의 용매로 조건화시켰다: 100% 아세토니트릴로부터 아세토니트릴/물 40:60 및 그 후, 등장 조건의 200 ml의 아세토니트릴/5 mM 암모늄 포르메이트 pH 3.5 40:60.
3.0 g의 조 생성물을 3.0 ml의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고 수득된 용액을 상기 컬럼에 적재했다. 아세토니트릴/5 mM 암모늄 포르메이트 pH 3.5 40:60을 이용한 등장 용리(isocratic elution)에 의해 정제를 수행했다. 회수된 개별적인 분획을 HPLC로 분석하고 순수한 분획을 합쳤다. 25℃에서 감압 하에 용매를 제거하고 약 2 g 의 순수한 습윤 생성물(wet product)을 수득했다.
이전 절차에 따라 각 분량을 정제하고 최종적으로 각각의 순수한 습윤 생성물 분획을 10 ml의 디클로로메탄에 용해하고 합쳤다. 용액을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 고체를 여과에 의해 분리하고 용매를 25℃에서 감압 하에 제거했다.
수득된 고체 생성물을 NMR 분광분석법에 의해 분석하고 약 1 몰당량(moleq.)의 암모늄 포르메이트를 검출했다. 이 염을 제거하기 위해, 생성물을 50 ml의 디클로로메탄에 용해시키고 디클로로메탄으로 적신 실리카겔 패드 상에서 용리시켰다. 생성물을 700 ml의 용매 혼합물 디클로로메탄/메탄올 9:1에 의한 용리로 회수하였다. 용리물(eluate)을 수집하고 용매를 25℃에서 감압 하에 제거했다. 생성물을 다시 80 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 고체 생성물을 수득하기 위해 500 ml의 디에틸 에테르의 첨가에 의해 강한 교반 하에 0℃에서 침전시켰다. 생성물을 유리 소결 디스크 필터 깔때기 상에서 여과시키고, 100 ml의 디에틸 에테르로 세척하고 진공 하에 16시간 동안 건조시켰다.
51%의 총 수율(컨쥬게이션 + 정제)로 16.0 g의 엷은 황색 분말을 수득했다.
생성물을 NMR, ESI-MS 및 HPLC로 규명하였다. 내부 표준을 사용하여 NMR에 의해 순도(assay)를 분석하였고 순도는 101% w/w에 해당했다.
1 H- NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 9.25 (d, 1H, CH), 8.70 (s, 1H, NH), 8.11 (d, 1H, CH), 7.95 (d, 1H, CH), 7.70 (d, 1H, CH), 7.51 (m, 2H, CH), 7.42 (m, 2H, CH), 7.31 (m, 1H, CH), 5.05 (s, 1H, NHCH 2), 3.90-3.40 (m, CH2 PEG), 3.25 (s, 3H, OCH3), 2.35 (m, 4H, CH3 + 1h CH2).
13 C- NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 172.3, 172.0, 153.7, 139.4, 137.5, 133.5, 128.1, 126.2, 124.9, 124.0, 123.2, 122.3, 121.6, 120.8, 120.4, 117.0, 115.4, 113.5, 109.9, 98.4, 90.6, 85.3, 71.8, 70.0, 68.9, 66.3, 58.5, 45.9, 40.0, 23.16.
ESI - MS (Cluster +2) ...1128.2, 1150.3, 1172.3, 1194.3, 1216.3...(mPEG-NH2 의 클러스터 +2에 대한 질량 증가 +230.8 ...897.4, 919.4, 941.5, 963.5, 985.5).
정확한 질량(Exact mass ): 기록된 스펙트럼과 이론적 스펙트럼의 질량 정확도 차이(mass exact discrepancy)는 2 ppm이었다. 따라서, 결과적으로 수득된 중합체 화합물은 약 98% 이상의 순도를 갖는다.
실시예 4: 정상 플래쉬 크로마토그래피에 의한 K-252a의 옥사졸리딘디온 컨쥬게이트의 정제
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 합성 방법을 수행하고 본 합성에서, 21.7 g의 조 생성물을 수득하였다.
상기 컨쥬게이션 단계로부터 수득된 조 추출물을 340 g의 KP-SIL (Silica) (크기 71 x 168 mm)이 충진된 SNAP 카트리지가 장착된 Biotage Horizon System을 이용하여 정상(normal-phase) 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상기 조 생성물을 두 개의 분량으로 나누고 각각 별개로 1회 정제하였다(각 분량은 10.86 g의 조 생성물 및 10.8 g의 조 생성물이었음).
SNAP 카트리지를 940 ml의 디클로로메탄/메탄올 96:4 v/v로 평형화시켰다. 유량은 65 ml/분이었다.
조 물질(crude material)을 10 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 용액을 샘플 카트리지(samplet cartridge)에 적용하고 샘플을 SNAP 카트리지에 삽입하는 것에 의해 미리-충진된 SNAP 샘플 카트리지(34 g)를 이용하여 샘플 적재(loading)를 수행하였다.
상기 SNAP 카트리지를 65 ml/분의 유량으로 하기를 이용하여 용리시켰다:
- 705 ml의 디클로로메탄/메탄올 96:4 v/v;
- 1881 ml의 디클로로메탄/메탄올 93:7 v/v;
- 942 ml의 디클로로메탄/메탄올 85:15 v/v.
용리된 용매 중 최초 999 ml를 폐수(waste)로 버리고, 그 후, 용리된 용매를 111 ml 분획으로 수집하였다.
수집된 개별 분획을 HPLC로 분석하고 98%보다 높은 HPLC 순도를 갖는 컨쥬게이트 생성물 화합물을 포함하는 분획(순수 분획)을 합쳤다.
컨쥬게이션 단계로부터의 조 혼합물의 10.8 g의 잔류 분량(residual aliquot)을 유사하게 정제하였다.
조 혼합물의 두 개의 분량의 정제로부터 수득된 선택된 분획을 합치고, 25℃에서 감압 하에 용매를 건조 상태까지 제거하여, 8.11 g의 컨쥬게이트 생성물을 수득하고, 이를 다시 29 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 2℃까지 냉각시키고, 강한 교반 하에 15분 동안 150 ml의 디에틸 에테르를 첨가하여 침전시켰다. 상기 혼합물을 2℃에서 15분 동안 교반하고, 225 ml의 디에틸 에테르를 첨가하였다. 침전된 고체를 소결 유리 필터(G4) 상에서 여과에 의해 분리하고, 진공 하에 25℃에서 16시간 동안 건조시켜 6.95 g의 테스트 물질(test item)을 백색 내지 엷은 황색(white to slightly yellow) 고체로서 수득하였다. HPLC 분석에 의해 결정된 순도는 99%였다.
실시예 5: K-252a의 옥사졸리딘디온 컨쥬게이트의 합성 방법
1) MeO - PEG - NH - CO - Im 의 합성
MeO-PEG-NH2 (MW1892, 8.06 g)를 질소 대기 하에 디클로로메탄(25 ml)에 용해시키고 감압 하에 40℃에서 증류에 의해 용매를 제거했다. 그 후, 잔류물 (MeO-PEG-NH2)을 40℃에서 진공 (<40 mbar) 하에 2시간 이상 동안 건조시켰다.
(전 단계에서 수득된) 건조된 MeO-PEG-NH2를 25℃에서 질소 대기 하에 디클로로메탄 (35 ml)에 용해시키고, 1,1'-카르보닐디이미다졸 (1.02 g)을 수득된 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 이상 동안 교반하였다. (Ion-Pairing Chromatography (IPC): ≥ 95% 전환)
반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 그 후, 230 ml의 디에틸 에테르를 강한 교반 하에 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 추가적인 69 ml의 디에틸 에테르를 25분에 걸쳐 첨가하였다. 필터 케이크를 디에틸 에테르(23 ml)로 2회 세척하고 진공 하에 최대 40℃에서 일정한 중량까지 건조시켜 백색 고체로서 8.25 g의 MeO-PEG-NH-CO-Im을 수득하였다.
2) 중합체 컨쥬게이션 반응
MeO-PEG-NH-CO-Im (72.0 g)을 질소 대기 하에 디클로로메탄 (185 ml)에 용해시키고 감압 하에 40℃에서 증류에 의해 용매를 제거하였다. 잔류물을 40℃에서 2시간 이상 동안 진공 (< 40 mbar) 하에 건조시켰다.
K252a (13.11 g)를 디클로로메탄 (3920 ml)에 용해시키고 그 후 용액을 0℃까지 냉각시켰다. 소디움 수소화물 (1.17 g of 60%)을 소량씩 첨가했다.
건조된 MeO-PEG-NH-CO-Im을 디클로로메탄 (140 ml)에 용해시키고 용액을 5℃ 미만에서 K252a의 반응 혼합물에 첨가하고 상기 혼합물을 0℃에서 30분 이상 동안 교반하였다. 그 후, 상기 혼합물 용액을 25℃까지 가열하고 이 온도에서 10분 동안 교반하였다(IPC　1: K252a의 전환 > 96%).
1,1'-카르보닐디이미다졸 (7.11 g)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 용액을 30분 이상 동안 25℃에서 교반하였다 (IPC　2: 조 생성물(crude product):아미드의 비율 > 80:20).
포름산 (5 ml)을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 6까지 조정하였다. 용매를 감압 하에 25℃에서 증류에 의해 제거하고 잔류물을 진공 하에 25℃에서 일정한 중량까지 건조시켰다.
3: 중합체 컨쥬게이트의 정제 및 분리
조 혼합물 (81 g)을 15분 이상 동안 35℃ 미만의 온도에서 325 ml의 디클로로메탄에 용해시키고 셀라이트(Celite) 층(3 cm)을 통해 여과시켰다. 셀라이트를 81 ml의 디클로로메탄으로 세척하였다. 용매를 감압 하에 35℃ 미만의 온도에서 증류에 의해 제거하고, 35℃ 미만의 온도에서 일정한 중량까지 건조시켜 77.0 g의 고체 물질을 수득하였다. 상기 고체 물질을 770 ml의 디클로로메탄에 용해시켰다.
실시예 5.2로부터의 조 물질을 Biotage로부터의 Flash KP-SIL 75L 카트리지 (75x300 mm, 800 g 실리카)를 이용하여 Knauer 제조(preparative) HPLC 시스템에서 정제하였다. 공급 용액(feed solution)을 적용하기 전에, 상기 카트리지를 1.5 l n-헵탄으로 퍼징(purge)하고 3 l의 DCM:MeOH=96:4 (v:v)로 평형화시켰다. 각 수행에서, 200 ml의 전술된 공급 용액 DCM:MeOH=96:4 (v:v) (적재 20 g)을 주입하고 185 ml/분의 유량 및 하기에 기재된 구배로 용리를 개시하였다.
분 % MeOH
0.00 4
8.30 4
80.10 15
80.10 50
108.00 50
각 카트리지는 1회의 수행을 위해서만 이용했다. 생성물을 25분 내지 90분 동안 용리시켰다. 분획을 수집하고, 분석하고 순도에 따라 모았다(IPC: > 98% a/a).
그 후, 용매를 감압 하에 35℃에서 제거하였다. 고체를 진공 하에 35℃에서 일정한 중량까지 건조시켜 조 물질 (37.92 g)을 수득했다. 상기 물질을 140 ml 디클로로메탄에 용해시키고 2℃까지 냉각시켰다. 700ml의 디에틸 에테르를 2℃에서 첨가하고 15분 이상 동안 교반시켰다. 1050　ml 디에틸 에테르를 2℃에서 첨가하였다.
현탁액을 흡인 필터(suction filter)를 통해 여과시켰다. 필터 케이크를 모액으로 세척하고 일정 중량까지 건조시켜 32.6 g의 정제된 약물 물질을 수득하였다. HPLC 분석에 따라 수득된 순도는 98.99%였다.
추가적인 실시예는 본 발명의 중합체 컨쥬게이트 인돌로카르바졸 화합물, 특히, 본 발명의 합성 방법, 예를 들면, 실시예 1 내지 5에 기재된 방법을 통해 수득된 중합체 컨쥬게이트를 이용하여 수행된 여러 연구들을 설명한다. 테스트된 컨쥬게이트 화합물("테스트 물질(test item)"로도 지칭됨)은 PEG (1892 MW)와 K252a의 옥사졸리딘디온 컨쥬게이트이다.
실시예 6: K-252a의 옥사졸리딘디온 컨쥬게이트의 TrkA에 대한 IC50의 인 비트로 평가
본 연구의 목적은 TrkA 키나아제에 대한 실시예 3의 컨쥬게이트의 IC50을 측정하는 것이었다. 테스트 화합물을 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해시키고 용액을 분석 완충액(assay buffer)으로 25배 더 희석시켜 최종 테스트 화합물 용액을 제조하였다. 상기 컨쥬게이트를 하기의 농도로 테스트하였다: 30000 nM, 10000 nM, 3000 nM, 1000 nM, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM 및 1 nM.
분석 대조군을 위한 기준 화합물(스타우로스포린(Staurosporine))을 테스트 화합물의 제조를 위해 이용된 방법과 유사하게 제조하였다.
분석 절차는 Off-chip Mobility Shift Assay (MSA)이고, 하기에 보고된다:
1) 5 ㎕의 x4 화합물 용액, 5 ㎕의 x4 기질 (CSKtide 1000 nM)/ATP (75 μM)/금속 용액 (Mg 5 mM), 및 10 ㎕의 x2 키나아제 용액을 분석 완충액[20 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT (1,2-디티오트레이톨), pH7.5]을 이용하여 제조하고 혼합하고, 실온에서 폴리프로필렌 384 웰 마이크로플레이트의 웰에서 1 시간 또는 5 시간* 동안 인큐베이션시켰다. (*; 키나아제에 따라 결정됨)
2) 60 ㎕의 종료 완충액(Termination Buffer) (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences)을 상기 웰에 첨가했다.
3) 반응 혼합물을 LabChip3000 시스템(Caliper Life Science)에 적용하고, 생성물 및 기질 펩티드 피크를 분리하고 정량하였다.
4) 키나아제 반응을 생성물(P)과 기질(S) 펩티드의 피크 높이로부터 계산된 생성물 비율 (P/(P+S))에 의해 평가하였다.
반응 대조군(완전한 반응 혼합물)의 판독(readout) 값을 0% 억제로 설정하고, 백그라운드(효소(-))의 판독값을 100% 억제로 설정하고, 각 테스트 용액의 퍼센트 억제를 계산하였다. 4 파라미터 로지스틱 곡선(4 parameter logistics curve)에 맞추는(fit) 것에 의해 농도 대 % 억제 곡선으로부터 IC50 값을 계산했다.키나아제 반응을 생성물(P)과 기질(S) 펩티드의 피크 높이로부터 계산된 생성물 비율 (P/(P+S))에 의해 평가하였다.
TrkA에 대한 컨쥬게이트의 IC50 값은 202 nM이었고, TrkA에 대한 기준 화합물(스타우로스포린)의 상응하는 IC50 값은 0.372 nM이었다. 이 결과가 도 7에 요약된다.
실시예 7: 랫트에서 급성 피부 독성 연구
실시예 3의 컨쥬게이트의 급성 독성을 랫트에 대한 단일 피부 투여량(dermal dose)의 투여 후에 조사하였다.
2000 mg/kg의 단일 투여량을 24시간 동안 5 마리의 수컷 및 5 마리의 암컷 동물으로 이루어진 군에 투여하였다. 예정된 투여의 전날, 전체 신체 표면의 10%의 추정 영역에 걸쳐 몸통의 배면(dorsal surface)으로부터 털을 제거하였다. 피부에 대한 손상이나 찰과상을 방지하도록 주의를 기울였다. 테스트 물질(test item)을 제조 직후 4 ml/kg 신체의 투여량으로 국소로 투여하였다. 제제화된 테스트 물질의 요구되는 분량을 2.5 x 2.5 cm 크기의 거즈 상에 고르게 발랐다. 그 후, 거즈 패치를 동물의 피부 상에 배치하여, 테스트 물질이 피부와 직접 접촉되게 하였다. 합성 필름의 스트립을 치료 부위에 배치하고, 탄성 접착성 붕대로 동물의 몸통을 두르는 것에 의해 전체 조립체(whole assembly)를 고정시켰다.
24시간의 경과 후에, 테이프 드레싱을 제거하였다. 처리된 피부 부위를 미지근한 물로 조심스럽게 세척하여 잔류 테스트 물질을 제거하였다. 연구 동안, 모든 동물을 1일 2회 체크하였다. 동물들을 1일 차에 투여 시, 투여 후 약 30분, 2시간 및 4시간에 및 그 후 총 14일 동안 매일 치료에 대한 반응의 징후에 대해 검사하였다. 각 동물의 체중을 본 연구로의 배정 일, 투여 일(1일차), 및 8일차와 15일차에 측정하였다. 14일의 경과 후, 모든 동물들을 희생시키고 부검 검사를 수행하였다.
연구 동안 수컷이나 암컷 동물에서 사망은 발생하지 않았고, 임상적 징후도 관찰되지 않았다. 연구의 종료 시 동물에서 관찰된 체중의 변화는 동물의 종 및 연령을 고려할 때 예상되는 범위 내에 속했다. 연구의 종료시 동물의 부검에서 내부 이상은 발견되지 않았다. 처리 부위에서 이상은 관찰되지 않았다.
이 결과는 테스트 화합물이 2000 mg/kg의 수준에서 24시간에 걸친 피부 노출 후 랫트에 대한 독성 효과를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 사망의 부재는 LD50이 2000 mg/kg보다 클 것이라는 것을 보여준다.
실시예 8: 랫트에서 13주 피부 독성 연구 및 뒤이은 4주 회복 기간
본 연구의 목적은 13주의 기간 동안 일일 피부 투여(6시간 노출) 후 랫트에서 테스트 물질의 독성을 평가하고 연속 4주의 기간 동안 잠재적인 처리-관련 효과로부터의 가능한 회복을 연구하는 것이었다. 독성역학(toxicokinetic) 프로파일도 평가하였다.
각각 10 마리의 수컷 및 10 마리의 암컷 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 랫트(참조. 표 1: 수컷은 짝수로 번호를 부여하고, 암컷은 홀수로 번호를 부여함)에 연속된 13주 동안 0.5, 2.5 및 5 mg/kg/일의 투여량으로 피부 투여에 의해 테스트 물질을 투여하였다(표 1: 그룹 번호 2-4). 제4의 유사하게 구성된 군은 비히클(정제수)만 투여받았고, 대조군으로 작용하였다(표 1: 그룹 번호 1). 각 성별의 5마리의 추가적인 동물을 회복 평가를 위해 고(high) 수준 그룹 및 대조군에 포함시켰다(표 1: 각각 그룹 번호 4 및 1). 또한, 9 마리의 수컷 및 9 마리의 암컷을 포함하는 3개의 독성역학을 위한 위성 그룹(satellite group)(표 2: 각각 그룹 번호 5 내지 8), 및 3 마리의 수컷 및 3 마리의 암컷을 포함하는 1개의 대조군(표 2: 그룹 번호 5)을 독성역학 평가를 위한 주요 그룹으로 다루었다.
그룹 식별 및 치료에 할당된 동물의 수가 표 1 및 2에 요약된다.:
표 1 (주요 그룹):
랫트 번호
그룹
번호		 처리
(mg/kg/일)		 수준
 주요 기 회복기
M
(짝수)		 F
(홀수)		 M
(짝수)		 F
(홀수)
1
2
3
4		 0
0.5
2.5
5		 대조군
저
중
고		 2 - 20
32 - 50
52 - 70
72 - 90		 1 - 19
31 - 49
51 - 69
71 - 89		 22 - 30


92 - 100		 21 - 29


91 - 99
표 2 (위성 그룹):

그룹 번호
투여량
(mg/kg/일)
처리/수준
랫트 번호
M
(짝수)		 F
(홀수)
5
6
7
8		 0
0.5
2.5
5		 대조군
저
중
고		 102-106
108-124
126-142
144-160		 101-105
107-123
125-141
143-159
처리 부위를 매일, 투여 개시 후 약 3시간 경과시 검사하였다. 주위의 미처리 피부 대비, 처리 부위의 자극(irritation)에 하기 표에 따라 수치 값을 부여했다:
홍반 및 가피 ( eschar ) 형성 값
홍반 없음 0
매우 약한 홍반 (간신히 감지가능함) 1
명확한(well defined) 홍반 2
중등도 내지 중증 홍반(Moderate to severe erythema) 3
중증도 홍반(붉은 무 적색(beet redness)) 내지 홍반의 등급결정을 어렵게 하는 가피 형성
4
부종 형성 값
부종 없음 0
매우 약한 부종(간신히 감지가능함) 1
약한 부종(명백한 돌출(raising)에 의해 부위의 가장자리가 명확하게 한정됨)
2
보통 정도의 부종(약 1 밀리미터 부어오름)
3
중증도의 부종(1 밀리미터 이상 부어오르고 노출 부위를 넘어 확장됨)

4
결과
연구 동안 처리-관련 사망(treatment-related mortality)은 일어나지 않았고(고-투여량 그룹의 1 마리의 암컷이 연구 40일 차에 사망했음) 처리-관련 임상적 징후는 관찰되지 않았다. 체중의 관련된 변화는 기록되지 않았고 처리 동물의 사료 섭취는 연구 내내 대조군과 유사하게 유지되었다.
처리 부위에서 자극의 징후는 관찰되지 않았다(자극 지수(irritation index)는 0이었음).
처리 기간의 종료시 수행된 안과 검사에서 처리-관련 병변은 검출되지 않았다.
혈액학적 관점에서, 고 투여량 그룹의 동물 및 중(medium) 투여량 그룹의 암컷에서 관찰된 백혈구 감소증은 회복기의 종료 시 부분적인 가역성을 보였다. 독성학적 유의성을 갖는 변화는 관찰되지 않았다.
임상 화학 및 뇨분석 모두에서 독성학적 유의성을 갖는 변화는 관찰되지 않았다.
최종 체중(terminal body weight)은 대조군과 처리 그룹 간에 유사했다.
독성학적 유의성을 갖는 절대 기관 중량(organ weight) 및 상대적 기관 중량의 변화는 관찰되지 않았다.
육안 관찰 및 현미경 관찰 후에 처리-관련 변화는 관찰되지 않았다.
독성역학의 경우, 1일 차에, 테스트 물질의 혈장 수준은 0.5, 2.5 및 5 mg/kg/일의 테스트 물질을 투여받은 수컷 및 암컷에서 전반적으로 LLOQ(lower limit of quantification, = 49.9 ng/ml) 미만이었고, 개별 동물들만이 종종 투여 후 2 시간 내지 8시간에 LLOQ보다 약간 높은 값들을 보였다. 측정된 값들은 투여량 수준에 비례하지 않았다.
보다 낮은 흡수율(incidence of absorption)이 검출되는, 4주차 및 13주차에 유사한 결과를 관찰하였다. 이는 5 mg/kg/일의 테스트 물질을 투여받은 동물에서만 투여 후 6 시간 내지 8 시간에 가끔 LLOQ보다 약간 높은 값을 보이는, 수컷에서 4주차 및 암컷(5 mg/kg/일에서만 투여 후 4시간 내지 8시간에 LLOQ보다 약간 높은 값)에서 13주차에 특히 명백했다.
비히클 단독으로 처리된 그룹의 동물에서는 검출가능한 수준이 측정되지 않았다. 전술된 결과에 따르면, 13주의 기간 동안 일일 투여 후 축적은 일어나지 않았다.
결론
조사된 테스트 물질의 투여량 수준 (즉, 0.5, 2.5 및 5 mg/kg/일) 중 어느 것에서도 유해한 효과가 관찰되지 않았다. 대조군 대비 처리된 동물에서 관찰된 약한 백혈구 감소증은 낮은 정도이고, 일반적으로 투여량과 연관되지 않으며, 미시적 변화에 의해 뒷받침되지 않기 때문에, 독성학적 중요성을 갖는 것으로 간주되지 않았다. 따라서, 5 mg/kg/일의 고-투여량은 13주의 기간 동안 랫트에 대한 1일 피부 투여 후 테스트 물질에 대해 무유해작용량(No Observed Adverse Effect Level, NOAEL)로 간주된다.
혈장 시료 분석의 결과는 테스트 물질이 피부 경로를 통해 매우 미량으로만(minimally) 흡수된다는 것을 보여주었다.
실시예 9: 토끼에서의 13주 피부 독성 연구 및 뒤이은 4주 회복 기간
13주의 기간 동안 0.5, 2.5 및 5 mg/동물/일의 투여량 수준에서 일별(daily) 피부 투여 후 토끼에서 테스트 물질의 독성 및 연속된 4주 동안 잠재적인 처리-관련 효과로부터의 회복을 연구하였다.
각각 6 마리의 수컷 및 6 마리의 암컷 뉴질랜드 화이트 SPF(Specific Pathogen Free) 토끼(참조. 표 3: 수컷에는 짝수를 부여하고, 암컷에는 홀수를 부여함)로 구성된 3개의 그룹에 연속 13주 동안 0.5, 2.5 및 5 mg/동물/일의 투여량으로 피부 적용(dermal application)에 의해 테스트 물질을 투여했다(표 3, 각각 그룹 번호 2 내지 4). 제4의 유사하게 구성된 그룹은 비히클(정제수)만 투여받았고 대조군으로 작용했다(표 3, 그룹 번호 1). 대조군 및 고 투여량 그룹(표 3, 각각 그룹 번호 4 및 1)은 회복 평가를 위해 성별당 3마리의 추가적인 동물을 포함했다.
그룹 식별 및 처리는 하기 표 3에 요약된다:
토끼 번호
그룹
번호		 처리
(mg/동물/일)		 수준
 본 단계(main phase) 회복 단계
M
(짝수)		 F
(홀수)		 M
(짝수)		 F
(홀수)
1
2
3
4		 0
0.5
2.5
5		 대조군
저
중
고		 2-12
20-30
32-42
44-54		 1-11
19-29
31-41
43-53		 14-18


56-60		 13-17


55-59
하기의 검사를 수행하였다: 일별 임상 징후(daily clinical sign), 체중, 사료 섭취량, 처리 부위의 육안 관찰, 임상 병리적 검사, 최종 체중(terminal body weight), 기관 중량, 사후 육안 관찰 및 조직병리학적 검사.
독성역학 평가를 위해, 각 동물로부터 1일차 및 13주차에 혈액 시료를 채취하였다.
처리 부위를 매일 투여 개시 후 약 3시간 경과시 검사하였다. 주변의 미처리 피부 대비, 부위의 자극에 하기 표에 따라 수치 값을 부여했다.
홍반 및 가피 ( eschar ) 형성 값
홍반 없음 0
매우 약한 홍반 (간신히 감지가능함) 1
명백한 홍반 2
중등도 내지 중증 홍반 3
중증도 홍반(붉은 무 적색) 내지 홍반의 등급결정을 어렵게 하는 가피 형성
4
부종 형성 값
부종 없음 0
매우 약한 부종(간신히 감지가능함) 1
약한 부종(명백한 돌출에 의해 부위의 가장자리가 명확하게 한정됨)
2
보통 정도의 부종(약 1 밀리미터 부어오름)
3
중증도의 부종(1 밀리미터 이상 부어오르고 노출 부위를 넘어 확장됨)

4
결과
연구 동안 처리-관련 사망은 일어나지 않았고(회복 대조군 그룹의 1 마리의 수컷이 연구 29일 차에 인도적으로 희생되었음) 처리-관련 임상적 징후는 관찰되지 않았다.
처리 부위의 육안 관찰 후, 자극의 징후는 관찰되지 않았다.
연구 동안 체중의 관련된 변화는 기록되지 않았고 처리 동물의 사료 섭취는 대조군과 유사하게 유지되었다.
처리 기간의 종료시 수행된 안과 검사에서 처리-관련 병변은 검출되지 않았다.
혈액학 및 임상 화학의 경우, 독성학적 유의성을 갖는 변화는 기록되지 않았다.
독성역학의 경우, 1주 차에, 2,5 mg/kg/일의 테스트 물질이 투여된 대부분의 수컷 및 5 mg/kg/일이 투여된 암컷에서 테스트 물질의 혈장 수준은 LL0Q(lower limit of quantitation, = 51.30 ng/ml)보다 약간 높았다. 0.5 및 5 mg/kg/일을 투여받은 개별적인 수컷 동물들만 가끔 LLOQ보다 약간 높은 값을 보였다. 흡수율(incidence of absorption)은 암컷에 비해 수컷에서 약간 더 높았다. 흡수는 투여량 수준에 비례하지 않았다.
또한, 13주 차에 매우 낮은 흡수를 관찰했다. LLOQ 보다 높은 값들은 전반적으로 투여 후 2 내지 24 시간에 보고되었다. 흡수는 수컷에서보다 암컷에서 약간 높았다.
비히클 단독으로 처리된 동물에서는 검출가능한 수준이 측정되지 않았다.
전술된 결과에 다르면, 13주 기간 동안 일별 투여 후 축적은 일어나지 않았다.
최종 체중은 대조군과 처리 그룹 간에 유사했고 독성학적 유의성을 갖는 절대 기관 중량 및 상대적 기관 중량의 변화는 관찰되지 않았다.
육안 관찰 및 현미경 관찰 후에, 처리-관련 변화는 관찰되지 않았다.
결론
조사된 테스트 물질의 투여량 수준 (즉, 0.5, 2.5 및 5 mg/동물/일) 중 어느 것에서도 유해한 효과가 관찰되지 않았다. 따라서, 5 mg/kg/일의 고-투여량은 13주의 기간 동안 랫트에 대한 일일 피부 투여 후 테스트 물질에 대해 무유해작용량(No Observed Adverse Effect Level, NOAEL)로 간주된다.
혈장 시료 분석의 결과는 테스트 물질이 피부 경로를 통해 매우 미량으로만 흡수된다는 것을 보여주었다.
실시예 10: 랫트에서 급성 정맥내 독성 연구
스프래그 돌리 랫트에 대한 단일 투여량의 정맥내 투여(생리적 염수 중 10 mg/kg) 후 및 뒤이은 14-일 관찰 기간에 실시예 3의 컨쥬게이트의 급성 독성을 조사하였다.
5 마리의 수컷과 5 마리의 암컷 동물로 구성된 단일 그룹에 2000 mg/kg을 투여했다. 동물들에게 테스트 물질의 제조 직후에, 10 mg/kg 체중의 투여량으로, 적합한 용량의 시린지에 부착된 피하 니들을 이용하여 꼬리 정맥으로의 주사에 의해 선택된 수준으로 제제화된 테스트 물질을 투여했다. 연구 내내, 1일 2회 모든 동물의 상태를 검사하였다.
동물들을 1일 차에 투여시, 투여 후 약 30분, 2시간 및 4시간 및 그 후 총 14일 동안 매일 처리에 대한 반응의 징후에 대해 검사하였다. 각 동물의 체중을 본 연구로의 배정 일, 투여 일(1일차), 및 2일차, 8일차 및 15일차에 측정하였다. 관찰 기간의 종료 후, 모든 동물들을 희생시키고 부검 검사를 수행하였다.
수컷 및 암컷 동물 모두에서 사망은 발생하지 않았다. 투여 당일에 모든 동물에서 관찰된 임상적 징후는 감소된 활동 및 입모(piloerection)였다. 한 마리의 암컷에서, 연구의 2주 차 동안, 등에서 털 빠짐이 관찰되었다.
연구의 종료 시 동물에서 관찰된 체중의 변화는 동물의 종 및 연령을 고려할 때 예상되는 범위 내에 속했다. 동물의 부검 검사에서 내부 이상(internal abnormality)은 검출되지 않았다. 주사 부위에서 이상은 관찰되지 않았다.
이 결과는 상기 컨쥬게이트가 2000 mg/kg 체중의 투여량 수준에서 단일 정맥내 투여 후 랫트에 대해 독성 효과를 갖지 않았다는 것을 나타낸다. 연구에서 사용된 동물에서 중요하지 않은 임상적 징후만이 관찰되었다. 테스트된 투여량 수준으로 꼬리 정맥에 주사되었을 때, 테스트 물질은 국소적으로 내약되었다(tolerate).
실시예 11: L5178Y TK+/- 마우스 림프종 세포의 돌연변이(변동 방법)
변동 방법(fluctuation method)을 이용하여, S9 대사 활성화의 부재 및 존재 하에 인 비트로 처리 후, 마우스 림프종 L5178Y 세포에서 5-트리플루오로티미딘 내성 돌연변이체의 유도에 대해 분석하는 것에 의해 돌연변이유발 활성에 대해 테스트 물질을 조사하였다. 이 방법은 유전자 돌연변이, 구조적 이상(clastrogenic) 및 수적 이상(aneugenic) 효과를 검출할 수 있다.
본 연구에서 사용된 돌연변이 분석 방법은 독성 티미딘 유사체, 트리플루오로티미딘(TFT)에 대해 내성을 갖게 된 L5178Y 콜로니의 식별에 근거한다. 이 유사체는 효소 티미딘 키나아제(TK)에 의해 뉴클레오시드로 대사될 수 있고, 이 뉴클레오시드는 핵산 합성에서 이용되어, TK-수용 세포(TK-competent cell)의 사멸을 초래한다.
TK 유전자의 돌연변이를 통해 발생하는 것으로 추정되는, TK-결함 세포는 트리플루오로티미딘을 대사시킬 수 없고 따라서, 그의 존재 시 생존하고 증식한다.
L5178Y 마우스 림프종 세포에서, TK 효소를 코딩하는 유전자는 11번 염색체 상에 존재한다. TK 유전자 좌에서 이형접합(TK+/-)인 세포들은 TK 활성이 거의 또는 전혀 남아있지 않은 TK-/- 유전형으로의 단일 전진 돌연변이(forward mutation)를 겪을 수 있다.
이용된 세포, L5178Y TK+/-는 메틸콜란트렌(methylcholanthrene)에 의해 DBA/2 마우스에서 유도된 흉선 종양(thymic tumour)으로부터 유래된 두 개의 클론 중 하나로부터 유래된다. L5178Y 마우스 림프종 세포에서 TK 돌연변이 시스템의 이용은 잘 규명되었으며 검증되었고 (Clive D, Johnson KO, Spector JF, Batson AG, Brown MM. Validation and characterization of the L5178Y/TK+/- mouse lymphoma mutagen assay system. Mutat Res. 1979 Jan;59(1):61-108.) 대부분의 규제 당국에의해 허용된다.
마우스 림프종 분석은 종종 소형이나 대형으로 지정된 TFT 내성 콜로니의 바이모달 크기 분포(bimodal size distribution)를 생성한다. 활성 대립인자 내의 점 돌연변이 및 결실(유전자내 사건(intragenic event))은 대형 콜로니를 생성하는 것으로 평가되었다. 소형 콜로니는 부분적으로 활성 TK 대립인자 및 그 발현이 세포의 증식 속도를 조절하는 것인 플랭킹(flanking) 유전자에 영향을 미치는 병변으로부터 기인된다.
테스트 물질은 50.0 mg/ml의 농도로 RPMI 1640 완전 배지 중에서 가용성인 것으로 확인되었다.
예비 세포독성 분석을 수행하였다. 용해도 결과에 근거하여, 테스트 물질을 S9 대사의 부재 및 존재 하에 5000　㎍/ml의 최대 투여량 수준에서 분석하였다. 광범위한 보다 낮은 투여 수준들을 일련의 처리에 포함시켰다: 2500, 1250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 및 19.5 ㎍/ml.
S9 대사 활성화의 부재 시, 짧은 처리 시간을 이용하여, 투여량 관계(dose relationship) 없이 여러 농도에서 상대적 생존율의 작은 감소를 관찰했다. 긴 처리 시간을 이용하여, 두 개의 보다 높은 농도에서 동반된 음성 대조군 값의 약 60%로 상대적 생존율을 감소시키는 독성을 관찰했다.
S9 대사 활성화의 존재 시, 테스트된 농도에서 관련된 독성은 관찰되지 않았다.
예비 시험에서 수득된 독성 결과에 근거하여, 하기의 표 4에 기재된 투여량 수준을 이용하여 5-트리플루오로티미딘 내성으로의 돌연변이를 위한 두 개의 독립적 분석을 수행하였다:
분석 번호 S9 처리 시간(시간) 투여량 수준 (㎍/ml)
1 -/+ 3 5000, 2500, 1250, 625 및 313
2 - 24 5000, 2500, 1250, 625 및 313
2 + 3 5000, 3571, 2551, 1822 및 1302
S9 대사의 부재 또는 존재 하에, 테스트 물질에 의한 처리 후, 돌연변이 빈도의 관련된 증가가 관찰되지 않았다.
S9 대사의 부재 및 존재 하에 각 돌연변이 실험에 용매 및 양성 대조군 처리를 포함시켰다. 용매 대조군 배양물에서 돌연변이 빈도는 정상 범위 내에 속했다. 양성 대조군 처리에서 현저한 증가가 나타났고, 이는 분석 시스템의 올바른 기능을 나타낸다.
테스트 물질은 보고된 실험 조건 하에서, S9 대사 활성화의 부재 또는 존재 하에 인 비트로 처리 후 마우스 림프종 L5178Y 세포에서 돌연변이를 유도하지 않는다는 결론을 내렸다.
실시예 12: 박테리아(살모넬라 티피뮤리움 및 대장균)의 광 돌연변이 유발성 분석
광으로의 노출 후에, 원핵생물 개체, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 대장균(Escherichia coli)에서 원영양성(prototrophy)로의 역 돌연변이에 대해 분석하는 것에 의해 테스트 물질을 광 돌연변이 유발성(photomutagenic activity)에 대해 조사하였다.
3개의 살모넬라 티피뮤리움 테스트 종(tester strain), TA1537, TA98 및 TA100과 대장균 테스트 종, WP2를 이용했다. 소프트-아가 중에 테스트 물질과 함께 플레이팅된 박테리아에 다양한 양의 UV 광을 조사하였다.
이용된 절차는 Ames 등에 의해 1975년 개발되고(Ames et al., 1975), Maron 및 Ames에 의해 1983년에 개조되었다(Maron and Ames, 1983).
테스트 물질은 멸균 증류수 중의 용액으로 이용하였다.
테스트 물질을 5000　㎍/플레이트의 최대 투여량 수준 및 적합한 0.5 로그(half-log) 간격으로 배치된 4개의 보다 낮은 농도로 독성 테스트에서 분석하였다: 1580, 500, 158 및 50.0　㎍/플레이트. 최대 내약 투여량(maximum tolerated dose)에 근거하여, 2개의 넓은 간격으로 떨어진(widely-spaced) UV 투여량을 각각의 박테리아 테스트 종에 대해 선택했다. 테스트 물질이나 UV 조사량 중 어느 것에서도 관련된 독성은 관찰되지 않았다.
플레이트 내포(plate incorporation) 방법을 이용하여 두 개의 독립적인 실험을 수행했다.
테스트 물질을 5000 ㎍/플레이트의 최대 투여량 수준 및 2배 희석 간격의 4개의 보다 낮은 투여량 수준, 2500, 1250, 625 및 313 ㎍/플레이트에서 분석하였다. 준비된 플레이트를 하기의 UVA 및 UVB 투여량에 노출시켰다 (표 5):
테스터 종(tester strain) UVA
(J/cm2)		 UVB
(J/cm2)
TA1537 0.4
0.2
0.1		 -
-
-
TA98 0.2
0.1
0.05		 -
-
-
TA100 0.04
0.02
0.01		 -
-
-
WP2 0.004
0.002
0.001		 0.004
0.002
0.001
결과
테스트 물질은 테스트 종에서 테스트 물질의 투여량 수준, UV 조사량에서 백그라운드 UV 효과 대비 복귀 돌연변이체(revertant) 콜로니의 갯수의 2배 증가를 유도하지 않았다.
결론
테스트 물질은 처리가 UV 광의 존재 하에 수행되는 경우, 살모넬라 티피뮤리움 또는 대장균에서 복귀 돌연변이(reverse mutation)을 유도하지 않는 것으로 결론지었다.
실시예 13: 인 비트로에서 CHO 세포 중 염색체 이상 (광 돌연변이 유발성 분석법)
UVA/UVB 조사의 존재 및 부재 하에 인 비트로 처리 후, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 염색체 손상을 유발하는 능력에 대해 테스트 물질을 분석하였다.
염색체 손상에 대한 하나의 분석은 UV 광의 존재 및 부재 모두에서 5000, 2500, 1250, 625, 313, 156, 78.1 및 39.1 ㎍/ml의 투여량 수준으로 수행하였다.
테스트 물질의 용액을 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) 중에 제조하였다.
UV 광의 존재 및 부재 시, 세포를 3시간 동안 처리하고, 약 1.5 세포 주기에 해당하는, 20시간의 회수 시간(harvest time)을 이용했다.
실험은 적절한 음성 대조군 및 양성 대조군을 포함했다. 각 테스트 시점에 2개의 세포 배양물을 준비하였다.
회수 시에 세포 계수(cell count)의 감소에 의해 결정되는 테스트 물질 처리의 세포 독성에 근거하여 염색체 이상(chromosomal aberration)의 평가를 위한 투여량 수준을 선택했다.
전체 투여량 범위에 걸쳐 현저한 독성은 관찰되지 않았기 때문에, 평가를 위해 선택된 투여량 수준은 UV광의 부재 및 존재시 모두 5000, 2500 및 1250 ㎍/ml였다.
100개의 중기 확산(metaphase spread)을 각 배양물로부터의 염색체 이상에 대해 평가하였다.
결과
테스트 물질의 처리 후, UV 광의 존재 또는 부재 시, 관련된 대조군 값 대비, 갭(gap)을 포함하거나 또는 배제한 이상(aberration)을 갖는 세포 빈도의 통계적으로 유의성 있는 증가가 관찰되지 않았다.
양성 대조군 미토마이신-C 및 8-메톡시소랄렌(8-Methoxypsoralen)에 의한 처리 후, 이상(갭의 포함 및 배제)을 갖는 세포의 갯수의 통계적으로 유의성 있는 증가가 관찰되어, 테스트 시스템의 올바른 기능을 나타냈다.
결론
이 테스트 결과에 근거하여, 보고된 실험 조건 하에서, 테스트 물질은 UV 광의 부재 또는 존재 하에 인 비트로 처리 후 CHO 세포에서 염색체 이상을 유도하지 않는 것으로 결론지었다.
실시예 14: Balb/C 3t3 세포 광독성 분석법 (Neutral Red Uptake)
상이한 투여량의 테스트 물질로 처리하고 UVA 조사에 노출시킨 Balb/c 3T3 세포의 배양물에 대한 세포 독성에 대해 중성 레드 흡수(neutral red uptake)를 측정하는 것에 의해 테스트 물질의 잠재적인 인 비트로 광독성을 평가하였다. 테스트 물질 용액을 EBSS(Earle's Balanced Salt Solution)를 이용하여 제조하였다.
본 분석(main assay)을 위한 적합한 투여량 수준을 결정하기 위해, 광의 존재 (+UVA) 및 부재 (-UVA) 하에 예비 투여량-범위(dose-range) 결정 실험을 수행하였다. 테스트 물질을 1000 ㎍/ml의 최대 투여량 수준 (연구 프로토콜에 표시된 상한) 및 광범위한 낮은 투여량 수준: 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6 및 7.81 ㎍/ml에서 분석하였다. UVA 조사의 존재 및 부재 하에 IC50 값은 계산할 수 없기 때문에, PIF(Photo Irritation Factor) 값도 계산될 수 없었다. 이 경우, 화학물질은 무-광독성(non-phototoxic)인 것으로 간주된다. 동일한 투여량 범위를 본 분석을 위해 이용하였다.
하기 투여량 수준을 이용하여 본 실험을 수행하였다: 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6 및 7.81 ㎍/ml. UV 광의 존재 및 부재 시의 생존율 곡선은 유사한 프로파일을 보여서, 예비 투여량-범위 결정 실험에서 수득된 결과를 확인했다. 두 곡선에 대한 IC50 값이 없었기 때문에, PIF(Photo Irritation Factor) 값을 계산할 수 없었다. 평균 광 효과(mean photo effect, MPE)는 0.089였고, 이는 무-광독성(non-phototoxic) 범위 내에 속한다.
이 실험은 명확하게 음성 결과를 생성했기 때문에, 추가적인 실험을 수행하지 않았다.
양성 대조군 클로르프로마진은 21.9의 PIF 값으로 허용가능한 양성 반응을 유도하여, 상기 분석 시스템의 올바른 기능을 나타냈다.
수득된 결과에 따르면, 계산할 수 없는 PIF 또는 0.1 미만의 MPE는 "무 광독성(no phototoxicity)"을 예측하므로, 테스트 물질은 보고된 실험 조건 하에서 "무 광독성(non-phototoxic)"으로 분류되어야 하는 것으로 결론지었다.
실시예 15: 기니어 피그에서 테스트 물질 0.1% 물질 광자극/감광성 연구
UV 광으로의 노출과 함께 테스트 물질 0.1% 크림이 피부로의 국소 적용 후에, 광알레르기(photoallergic) 및/또는 광자극(photoirritant) 반응을 유발하는 능력을 기니어 피그 모델을 이용하여 평가하였다.
본 연구는 두 단계로 나누었다.
제1 단계(first phase)에서, 테스트 물질의 광자극 특성의 평가를 6개의 그룹의 동물에서 수행하였다. 이들을 감작화 분석(sensitization assay)에서 사용하기 위한 테스트 물질의 적합한 농도를 정립하고 광-유도 자극에 대한 정보를 제공하기 위해 이용했다. 동물들을 하기와 같이 처리하였다 (표 6);
그룹 번호 처리 UV 조사 동물의 수
1 비히클 + 대조군 물질 있음 5
2 비히클 + 대조군 물질 없음 5
3 비히클 + 테스트 물질 있음 5
4 비히클 + 테스트 물질 없음 5
5 비히클 + 8-메톡시솔라렌(methoxypsoralen) 없음 5
6 비히클 + 8-메톡시솔라렌 있음 5
본 연구의 제2 단계는 감작화의 평가였고, 총 5개의 그룹을 하기와 같이 처리하였다 (표 7):
그룹 번호 유도시 처리 챌린지(challenge)시 처리 동물의 수
7 F.C.A.1 + 비히클
비히클 + 테스트 물질
비히클 + 대조군 물질		 10
상기 10 중 5 상기 10 중 5
8 F.C.A. + 대조군 물질 비히클
대조군 물질		 10
9 F.C.A. + 테스트 물질 비히클
테스트 물질		 10
10 F.C.A. + 비히클
 비히클
인공 사향(Musk Ambrette)		 3
11 F.C.A.+
인공 사향		 비히클
인공 사향		 5
1 프로인드 완전 아쥬반트(Freund's Complete Adjuvant)
광자극( photoirritation )
각각 대조군 물질과 테스트 물질, 크림 플라시보(cream placebo) 및 테스트 물질 0.1% 크림으로 처리한 각각 5마리의 동물로 구성된 2개의 (광조사된(irradiated)) 그룹(참조. 표 6, 그룹 1 및 3) 및 동일한 방식으로 처리했으나, 광조사하지 않은 2개의 유사하게 구성된 그룹(참조. 표 6, 그룹 2 및 4)을 이용하여 광자극 테스트를 수행하였다. 희석하지 않은 테스트 또는 대조군 물질(100%), 테스트 및 대조군 물질의 2개의 농도(정제수 중 20% 및 50%), 및 비히클 단독(정제수)의 분량을 동물의 등에 준비된 정해진 피부 부위에 고르게 발랐다. 광조사된 그룹(그룹 1 및 3)의 동물들을 투여 후에 UVA (10 Joules/cm2) 및 UVB (0.1 Joules/cm2) 조사에 노출시켰다. 양성 대조군 기준 물질, 8-메톡시소랄렌을 5 마리의 테스트(광조사) 및 5 마리의 대조군(광조사되지 않음) 동물에서 0.001%, 0.01% 및 0.1%의 농도로 동일한 방법을 이용하여 조사하였다(각각 표 6, 그룹 6 및 5 참조). 대조군, 테스트 물질 또는 기준 물질로의 노출 후 약 1 시간, 4 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간 경과 시, 처리에 대한 자극 반응의 증거에 대해 처리된 부위를 검사하였다.
결과
테스트 물질 0.1% 크림으로 처리하고 UV 조사한 부위에서 약한 자극(slight irritation)이 5마리의 동물 중 1마리(1/5 aninmals)에서 되었다. 테스트 물질로 처리했으나, UV 조사하지 않은 5마리의 동물 중 4마리에서 약한 반응 내지 명확한(slight to well defined) 반응을 관찰하였다.
약한 반응은 또한 대조군 물질(크림 플라시보)로 처리했으나, UV 조사하지 않은 5마리 중 1마리의 동물에서 관찰되었다.
비히클 단독으로 처리된 부위에서는 반응이 관찰되지 않았다.
테스트 물질로 처리한 동물에서 관찰된 자극 반응은 UV-조사한 동물 및 보다 높은 중증도로 UV-조사하지 않은 동물에서 관찰되었기 때문에, 광에 의해 유도된 것이 아니었다.
또한, 대조군 물질로 처리되고, 광이 조사되지 않은 동물에서 약한 간헐성(occasional) 반응을 관찰했다.
양성 대조군 기준 물질, 8-메톡시소랄렌으로 처리하고, 그 후, UV 광에 노출시켰던 동물은 테스트되었던 두 개의 보다 높은 농도, 0.01% 및 0.1%로 처리한 부위에서 명확 내지 중간 정도의(well defined to moderate) 홍반 및 약한 부종을 보였다. 후속 UV 광에 대한 노출 없이, 8-메톡시소랄렌에 노출시킨 동물에서 반응이 관찰되지 않아서, 관찰된 반응은 광에 의해 유도된 것이라는 것을 보여주었다.
광감작( photosensitisation )
대조군 물질 및 테스트 물질로 유도시킨 10 마리의 동물로 구성된 2개의 그룹(표 7, 그룹 8 및 9 참조) 및 선택된 비히클(정제수)로 유도시킨 10 마리의 동물로 구성된 1개의 대조군 그룹(표 7, 그룹 7 참조)을 이용하여 광감작 테스트를 수행하였다. 감작을 유도하기 위해, 동물들에게 프로인드 완전 아쥬반트의 에멀젼을 피내로 주사하였다. 100% 농도의 테스트 및 대조군 물질을 2주의 기간 동안 FCA의 주사 부위 중의 영역에 국소로 총 6회 적용하였다. 동물들을 투여 후에 UVA (10 Joules/cm2) 및 UVB (0.1 Joules/cm2) 조사에 노출시켰다. 대조군 동물을 동일한 방식으로 처리했으나, 테스트 물질 또는 대조군 물질 대신에 선택된 비히클(정제수)를 이용했다. 최종 유도 노출(induction exposure) 후 약 2주 경과시, 모든 동물들에게 비히클 및 각각 20% 및 50% 농도의 테스트 또는 대조군 물질을 국소 적용하여 챌린지(challenge)하였다. 이 농도들은 광자극 테스트에서 수득된 결과에 근거하여, UN 조사와 조합시 피부에 무자극성인 것으로 간주되었기 때문에 선택했다. 2개의 테스트 그룹과 대조군 그룹의 동물들을 투여 후에 UVA (10 Joules/cm2) 및 UVB (0.1 Joule/cm2)에 노출시켰다. 각 동물 상의 추가적인 부위에 비히클 및 테스트 또는 대조군 물질을 국소로 처리하였으나, 후속으로 UV 조사에 노출시키지 않았다. 챌린지 노출 후 약 24, 48 및 72시간 경과시, 처리에 대한 반응의 증거에 대해 처리된 부위들을 조사하였다.
테스트 시스템의 타당성을 입증하기 위해, 동일한 방법을 이용하여, 양성 대조군 기준 물질, 인공 사향(Musk Ambrette)을 조사하였다. 5 마리의 동물로 구성된 하나의 그룹(표 7, 그룹 11 참조)을 아세톤 중 15%의 농도인 이 물질로 유도시켰다. 3 마리의 동물로 구성된 대조군(표 7, 그룹 10 참조)을 비히클(아세톤) 단독으로 동일한 방식으로 처리하였다. 아세톤 중 기준 물질(인공 사향)의 10% 농도를 챌린지를 위해 선택하였다.
결과
50% 농도의 대조군 물질, 크림 플라시보에 의한 챌린지 및 뒤이은 UV 조사는 해당 그룹(그룹 8)의 10마리의 동물 중 10마리(10/10)에서 대조군 물질에 대한 반응을 초래했다. 대조군 물질에 대한 반응은 처리되었으나 광조사되지 않은 부위에서 그룹 8의 10 마리의 동물 중 6 마리에서 관찰되었다. 반응은 또한 대조군 물질에 의한 챌린지에서 처리되고 뒤이어 UV 조사에 노출된 부위에서 5마리의 대조군 그룹(그룹 7)의 5 마리 및 대조군 물질로 처리되었으나 UV 조사되지 않은 부위에서 5마리의 대조군 동물 중 4마리에서 관찰되었다. 비히클 단독에 대한 반응은 관찰되지 않았다.
20% 농도의 테스트 물질 0.1% 크림에 의한 챌린지 및 뒤이은 UV 조사는 해당 그룹(그룹 9)의 10마리의 동물 중 8마리에서 테스트 물질에 대한 반응을 초래했다. 그룹 9의 동물에서 처리되었으나, UV 조사되지 않은 부위에서 테스트 물질에 대한 반응이 관찰되지 않았다. 반응은 또한, 테스트 물질에 의한 챌린지에서 처리되고, 뒤이어 UV 조사된 부위에서 5마리의 대조군(그룹 7) 동물 중 5마리 및 테스트 물질로 처리되었으나, UV 조사되지 않은 부위에서 5마리의 대조군 동물 중 1 마리에서 관찰되었다. 비히클 단독에 대한 반응은 관찰되지 않았다.
전술된 결과에 따르면, 테스트 물질 또는 대조군 물질로 처리된 동물에서 반응을 관찰했다. 대조군 그룹 동물(테스트 물질로 유도되지 않음)에서 관찰된, 반응은 감작에 의한 것이 아니고, 물질의 자극 효과에서 기인했다. 또한, UV-조사되지 않은 부위에서도 반응을 관찰했다.
결과로, 5%의 보다 낮은 농도에서 테스트 물질 및 대조군 물질을 이용하여 제2 챌린지(재-챌린지)를 수행했다.
5% 농도의 테스트 물질 및 대조군 물질을 이용한 재-챌린지 및 뒤이은 UV-조사에서 그룹 8 및 9의 동물들에서는 반응이 관찰되지 않았다. 물질로 처리되었으나, UV 조사되지 않은 부위에서 그룹 8 또는 그룹 9의 동물에서 테스트 물질 또는 대조군 물질에 대한 반응은 관찰되지 않았다. 대조군 물질 또는 테스트 물질에 의한 챌린지시 처리된 대조군 동물(그룹 7)에서는 어느 부위에서도 반응이 관찰되지 않았다. 비히클 단독에 대한 반응은 관찰되지 않았다.
10% 농도의 기준 물질(인공 사향)에 의한 양성 대조군 동물의 챌린지 및 뒤이은 UV 조사는 해당 그룹(그룹 11)의 5 마리의 동물 중 4 마리에서 반응(매우 약한 홍반 내지 약한 홍반)을 생성했다. 기준 물질로 처리되었으나, UV 조사되지 않은 부위에서 그룹 11의 동물에서 기준 물질에 대한 반응은 관찰되지 않았다. 비히클로 유도된 그룹 10의 동물에서 기준 물질에 대한 반응은 관찰되지 않았다. 이는 상기 테스트 시스템이 물질의 광알레르기 특성을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
결론
수득된 결과는 테스트 물질 0.1% 크림이 UV광과 함께 피부 노출 후에 광자극 또는 광알레르기 반응을 유발할 수 있다는 증거(indication)를 제공하지 않는다.

Claims (40)

  1. 하기 식 (I)을 가지며:
    Figure pct00006
    식 (I)
    상기에서,
    R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이한 잔기이고 각각 하기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며:
    (a) 수소, 할로겐, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 히드록시, 저급 알콕시, 카르복시, 저급 알콕시카르보닐, 아실, 니트로, 카르바모일, 저급 알킬아미노카르보닐, R5 및 R6는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, 치환 또는 미치환 아랄킬, 치환 또는 미치환 저급 알킬아미노카르보닐, 치환 또는 미치환 저급 아릴아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 카르바모일, 아실로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R6는 질소 원자와 조합되어 헤테로시클릭기를 형성하는 것인 -NR5R6이거나,
    (b) j는 1 내지 6이고, R4는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것인 -CO(CH2)jR4:
    (i) 수소, 할로겐, -N3,
    (ii) R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같은 것인 -NR5R6,
    (iii) R7은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, 치환 또는 미치환 아랄킬, -(CH2)aCO2R10(식 중에서, a는 1 또는 2이고, R10은 수소 및 치환 또는 미치환 저급 알킬로부터 선택됨), 및 -(CH2)aCO2NR5R6로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 -SR7,
    (iv) R8은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴로부터 선택되는 것인 -OR8, -OCOR8,
    (c) j 및 R4는 앞서 정의된 바와 같은 것인, -CH(OH)(CH2)jR4,
    (d) d는 0 내지 5이고, R11은 수소, -CONR5R6, 또는 R13은 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬인 것인 -CO2R13이고, R12는 수소 또는 치환 또는 미치환 저급 알킬인 것인 -(CH2)dCHR11CO2R12 또는 -(CH2)dCHR11CONR5R6;
    (e) k는 2 내지 6이고, R14는 할로겐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15는 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴 또는 아실임), -SR7(식 중에서, R7은 앞서 정의된 바와 같음), -CONR5R6, -NR5R6 (식 중에서, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같음) 또는 -N3인 것인 -(CH2)kR14;
    (f) m은 O 내지 4이고, R16은 수소, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐, 치환 또는 미치환 아릴, 치환 또는 미치환 헤테로아릴, -COOR15, -OR15(식 중에서, R15은 앞서 정의된 바와 같음), -CONR5R6 또는 -NR5R6(식 중에서, R5 및 R6는 앞서 정의된 바와 같음)인 것인 -CH=CH(CH2)mR16;
    (g) R12는 앞서 정의된 바와 같은 것인 -CH=C(CO2R12)2;
    (h) n은 0 내지 4이고, R16은 앞서 정의된 바와 같은 것인, -C≡C(CH2)nR16;
    (i) R22는 세 개의 저급 알킬기가 동일하거나 또는 상이한 것인 트리-저급 알킬 실릴이거나 또는 R22는 R8와 동일한 의미를 갖는 것인 -CH2OR22;
    (j) R23은 저급 알킬, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐이고, R7은 앞서 정의된 바와 같은 것인 -CH(SR23)2 및 -CH2-SR7;이고, 및
    R3는 수소, 할로겐, 아실, 카르바모일, 치환 또는 미치환 저급 알킬, 치환 또는 미치환 저급 알케닐, 치환 또는 미치환 저급 알키닐 또는 아미노이고; 및
    W1 및 W2는 독립적으로 수소, 히드록시이거나 또는 W1 및 W2는 함께 산소를 나타내고;
    및 X는 중합체 모이어티인 것인 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬게이트를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은 하기 일반 식 (II)를 가지며:
    Figure pct00007
    식 (II)
    X는 앞서 정의된 바와 같은 것인 ω-1H-이미다졸-카르복사미드 중합체 화합물을 하기 일반 식 (III)을 가지며
    Figure pct00008
    식 (III)
    상기에서 R1, R2, R3, W1 및 W2는 앞서 정의된 바와 같고 선택적으로 보호기에 의해 보호되며, Y는 이탈기를 나타내는 것인 인돌로카르바졸 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 식 (I)의 화합물을 수득하기 위해, 선택적으로 작용기 R1, R2, R3, W1 및 W2를 탈보호시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 유기 용매 중 염기의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 염기 대 식 (III)의 화합물의 몰비는 약 1:1 내지 약 4:1이고, 바람직하게는 약 1:1 내지 약 1.5:1이며, 보다 바람직하게는 약 1:1인 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 염기는 알칼리 금속 수소화물(hydride)의 군으로부터 선택되고, 특히, 소디움 수소화물인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 유기 용매, 바람직하게는 디클로로메탄, 클로로포름 및 N,N-디메틸포름아미드의 군으로부터 선택된 무수 유기 용매에서 수행되는 것인 방법. 　
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비활성 기체 대기 하에서, 바람직하게는 질소 또는 아르곤 대기 하에서 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 -10 내지 60℃, 바람직하게는 25℃의 온도, 가장 바람직하게는 0℃에서의 최초 단계 후 실온에서 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (I)의 중합체 컨쥬게이트 화합물은 크로마토그래피 정제에 의해 직접 수득되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식 (I)의 중합체 컨쥬게이트 화합물의 정제는 용매, 바람직하게는 상이한 혼합비의 디클로로메탄, 물, 메탄올, 아세토니트릴, 암모늄 포르메이트 완충 용액으로부터 선택된 용매에서 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (III)의 화합물의 중량 기준으로 약 40 중량% 내지 약 95 중량%, 바람직하게는 약 50 중량% 내지 약 95 중량%의 식 (I)의 화합물의 수율을 가져오는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이탈기 Y는 트리플레이트, 토실레이트, 메실레이트, 술페이트, 할로겐, 히드록시 또는 저급 알콕시기로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 이탈기 Y는 저급 알콕시기, 바람직하게는 메톡시기인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 X는 폴리(알킬렌 옥시드), 특히, (폴리에틸렌)옥시드로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 중합체 X는 (폴리에틸렌)글리콜(PEG), 바람직하게는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(m-PEG)과 같이, 말단 알콕시-치환(terminally alkoxy-substituted) 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 X는 약 100 내지 약 100,000 Da, 바람직하게는 약 200 내지 약 50,000 Da의 분자량을 갖는 것인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 중합체 X는 (폴리에틸렌)글리콜, 예를 들면, 약 500 내지 약 10000 Da의 분자량, 예를 들면, 약 550 Da, 약 1100 Da, 약 2000 Da 또는 약 5000 Da의 평균 분자량을 갖는 mPEG인 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1, R2, R3, W1, 및 W2는 수소인 것인 방법.
  18. 하기 식 (I)을 가지며
    Figure pct00009
    식 (I)
    상기에서,
    R1, R2, R3, W1, W2 및 X는 제1항 또는 제13항 내지 제16항에 정의된 바와 같은 인돌로카르바졸 화합물의 중합체 컨쥬게이트 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염.
  19. 제18항에 있어서, 상기 R1, R2, R3, W1, 및 W2는 수소인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 중합체 X는 (폴리에틸렌)글리콜, 예를 들면, 약 500 내지 약 10000 Da의 분자량, 예를 들면, 약 550 Da, 약 1100 Da, 약 2000 Da 또는 약 5000 Da의 평균 분자량을 갖는 mPEG인 것인 중합체 컨쥬게이트.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약제에서 사용하기 위한 것인 중합체 컨쥬게이트.
  22. 제21항에 있어서, 국소 적용용 약제에서 사용하기 위한 것인 중합체 컨쥬게이트.
  23. 제21항에 있어서, 전신 적용, 예를 들면, 주사, 주입 또는 흡입에 의한 전신 적용용 약제에서 사용하기 위한 것인 중합체 컨쥬게이트.
  24. 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트, 희석제 및/또는 첨가제와 조합된, 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 하나 이상의 중합체 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 진단 및/또는 치료적 적용을 위한 것인 약제학적 조성물.
  26. HMGB1-관련 질환의 예방, 경감, 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 중합체 컨쥬게이트의 용도.
  27. 제26항에 있어서, 상기 HMGB1-관련 질환은 협착, 재협착, 죽상경화증, 류마티스 관절염, 자가면역 질환, 종양, 감염성 질환, 패혈증, 급성 염증성 폐 손상, 홍반성 루푸스, 신경퇴행성 질환, 중추신경계 및 말초신경계 질환 및 다발성 경화증으로부터 선택되는 것인 용도.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 중합체 컨쥬게이트는 의료 장치의 표면상에 가역적으로 고정화되는 것인 용도.
  29. 신경 질환, 신경병증 및 중추신경계와 말초신경계의 신경퇴행성 질환의 예방, 경감, 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 중합체 컨쥬게이트의 용도.
  30. 피부 질환의 예방, 경감, 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 중합체 컨쥬게이트의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 상기 피부 질환은 각질세포의 과다증식을 특징으로 하는 것인 용도.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 피부 질환은 건선, 아토피성 피부염, 만성 습진, 여드름, 홍색 비강진(pitiriasis rubra pilaris), 켈로이드, 비후성 반흔(hypertrophic scar) 및 피부 종양인 것인 용도.
  33. 제32항에 있어서, 상기 피부 질환은 건선인 것인 용도.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 국소 투여용으로 제조되는 것인 용도.
  35. 제34항에 있어서, 상기 투여는 리포좀의 제형으로 이루어지는 것인 용도.
  36. NGF-관련 통증 및 통각과민의 예방, 경감 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 중합체 컨쥬게이트의 용도.
  37. 염증성 질환, 자가면역 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 기관 이식 후 재관류 손상, 심혈관 질환(cardiovascular affection), 산부인과 질환(obstetric and gynecologic disease), 감염성 질환, 알레르기 및 아토피성 질환, 고형 종양 및 액체 종양 질환(solid and liquid tumor pathology), 이식 거부 질환, 선천성 질환, 피부 질환, 신경 질환, 악액질(cachexia), 신장 질환, 의원 중독 상태(iatrogenic intoxication condition), 대사질환 및 특발(idiopathic) 질환, 및 안과 질환의 예방, 경감 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한, 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 중합체 컨쥬게이트의 용도.
  38. 베체트병(Behcet's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 혈관염, 포도막염, 및 망막병증의 예방, 경감 및/또는 치료용 약제의 제조를 위한, 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 중합체 컨쥬게이트의 용도.
  39. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 전신 투여용인 것인 용도.
  40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항염증제와 조합된 것인 용도.
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