JP2012503202A - 単一分子アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
試料中の、分析、臨床、予後、及び/又は診断の対象の種の単一分子を検出するための本発明の方法の例を本明細書に開示する。様々な実施形態において、試料は対象から採取する。アッセイは、疾患のマーカー、炎症のマーカー、及び/又はサイトカインの測定など、生物学的試料中の分析物の測定を含むことができ、分析物のレベルは疾患の存在又は重症度を示す。
本明細書で用いられる「分析物」及び「結合パートナー」の語は、結合の相互作用に関与する分子を意味する。例示によると、分析物及び結合剤は、あらゆる有機の、無機の、又は生物学的な薬剤を含むことができる。このような薬剤の非限定的な例には、DNA又はRNAフラグメント(例えば、オリゴヌクレオチド)、アプタマー、ペプチド、及びタンパク質(例えば、抗体)、抗原、及び有機小分子(例えば、薬剤、戦争物質、殺虫剤、除草剤、農業用肥料)が含まれる。特定の一アッセイにおいて、リガンドと受容体の間の結合の相互作用を分析する。例示的一アッセイにおいて、分析物と結合パートナーの結合は、検出可能種の提供におけるステップであり、その1つ又は複数の分子を本発明のアッセイにおいて検出することができる。したがって、検出可能種は分析物の代理であり、検出可能種の分子は分析物の分子に相関し、対応する。相関は、1対1である必要はないが、推定することができ、又は実験的に決定することができる。分析物は、動物(例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、トリ、サカナなど)、植物、酵母菌、細菌、ウイルス、原虫などを含めたあらゆる原核生物又は真核生物の個体に由来する。本発明は、分析物の起源又は分析物を含む試料の起源に関して限定されない。
第1の態様において、本発明は、検出可能種が特異的に結合する分析物の分析物分子に相関する検出可能種の分析物分子を検出するアッセイを行う方法を提供する。本発明のこの方法及び他の方法において、分析物に特異的に結合していない本質的に全ての検出可能種がアッセイ混合物から除去された後に検出可能種が検出され、測定され、且つ/又は定量されるのが一般的に好ましい。
様々な実施形態において、本発明のアッセイ方法を用いて検出される分析物分子は、免疫応答の調節に関与する分泌されるタンパク質であるサイトカインなどの炎症マーカーを含む。サイトカインには、インターロイキン(IL)、インターフェロン(IFN)、ケモカイン、腫瘍壊死因子(TNF)、及び様々なコロニー刺激因子(CSF)が含まれる。研究及び診断の両方に対して、サイトカインは、数々の状態、疾患、病理などのマーカーとして有用であり、いくつかの異なるパネルにおいて含まれていてよい。現在、その協調的な又は不調和な調節が臨床的に注目されているサイトカイン/ケモカインは100種を超えて存在する。現在マーカーのパネルにおいて用いられ、本発明の方法及び組成物において用いられるパネルにおいて用いることができる例示的サイトカインには、それだけには限定されないが、BDNF、CREB pS133、CREB Total、DR−5、EGF、ENA−78、エオタキシン、脂肪酸結合性タンパク質、FGF−basic、G−CSF、GCP−2、GM−CSF、GRO−KC、HGF、ICAM−1、IFN−α、IFN−γ、IL−10、IL−11、IL−12、IL−12p40、IL−12 p40/p70、IL−12p70、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−1α、IL−1β、IL−1ra、IL−1ra/IL−IF3、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IP−10、JE/MCP−1、KC、KC/GROa、LIF、リンホタシン(Lymphotacin)、M−CSF、MCP−1、MCP−1(MCAF)、MCP−3、MCP−5、MDC、MIG、MIP−1α、MIP−1β、MIP−1γ、MIP−2、MIP−3β、OSM、PDGF−BB、RANTES、Rb(pT821)、Rb(total)、RbPSpT249/252、Tau(pS214)、Tau(pS396)、Tau(total)、組織因子、TNF−α、TNF−β、TNF−RI、TNF−RII、VCAM−I、VEGFが含まれる。本発明で用いられるサイトカインの語には、可溶性サイトカイン受容体も含まれる。
本発明の様々な実施形態は、ある試料パラメータは、感度及びダイナミックレンジの増強したアッセイをもたらすという認識に基づくものである。一般的に、先行技術は、小体積のアッセイ試料を調製し、それによってアッセイ感度の損失の一因となる移動損失を最小にすることからの利点を認めている。本発明は、当技術分野において有用であると一般に認められている体積より大きい体積を用いることによってアッセイの感度が増大する方法を提供する。より大きな液体体積の使用によって変化するアッセイの特徴の中には、アッセイ混合物内の非分析物種の非特異的なマトリックス効果の結合による、感度に対する有害作用がある。例示的一実施形態において、本発明は、低体積の同一のアッセイ混合物よりも低い規模のマトリックス結合効果を提供するのに十分な体積のアッセイ混合物を提供する。
本明細書に記載の方法により、単一分子がインタロゲーション空間を通過するときに、それらを1つずつ数え上げることができる。試料の濃度は、設定された時間の長さにおいて計数された単一分子の数及びインタロゲーション空間を通過する試料の体積から決定することができる。インタロゲーション空間が試料の流れの横断面全体を包含する場合、試料の濃度を算出するためには、設定された時間の長さにおいて計数された単一分子の数及び試料の流れの横断面を通過する体積のみが必要である。インタロゲーション空間が試料の流れよりも小さい場合、単一分子の濃度は、標準濃度の対照試料を用いて生成した標準曲線から、補間によって決定することができる。種々の実施形態では、単一分子の濃度は、測定された単一分子を内部の単一分子の標準と比較することによって決定することができる。濃度は、計数された単一分子の数から推定することができる。例えば、試料の希釈度が分かると、出発試料中の単一分子の濃度を算出することができる。
試料中の単一分子の検出データを収集した後、種々の実施形態では、データを、同じ実験条件下で取得した参照セットデータと比較して、分析的、診断的又は予後的な値の差異の特徴を示す変動が分析物の単一分子の検出において存在するかどうかを決定する。例示的な実施形態では、試験データと参照データの差異は、疾患の状態、疾患の状態の進行、疾患の状態の期、又は疾患の状態に対する治療モダリティの有効性を示している。この比較を行ういくつもの手段が有効である。ある例示的な実施形態では、多変量解析を使用する。
本発明は、本発明の分析を行うためのキットも提供する。ある例示的な実施形態では、キットは、1つ又は複数の捕獲種、検出可能種、及び磁性粒子を含む。キットは、本発明の方法を行うのに使用する1つ又は複数の試薬も含む。本発明のアッセイを行うための説明書も提供される。IL−6の検出における例示的なキット及びその使用を例2に記載する。
材料と方法
材料
抗体及び分析物(組換え)は、R&D Systems(Minneapolis,MN)から入手した。抗体の対応対については製造者の推奨に従った。抗体の標識に使用した蛍光色素及びビオチンサクシニミジルエステルは、Invitrogen(Carlsbad,CA)から入手した。ラット、イヌ及びサルのcTnIは、天然源から精製されたものであり、Hytest(Sweden)から入手した。ヒトクエン酸リチウム血漿検体は、Interstate blood bank(St.Louis,MO)から購入した。ストレプトアビジンで被覆した常磁性微粒子(MP)は、Invitrogenから入手した(MyOne,#650−01)。抗体は、製造者の推奨を活用して蛍光色素(検出抗体、通常ポリクローナル)及びビオチン(捕獲抗体、通常モノクローナル)で標識した。MPは、飽和条件下でビオチン標識した抗体で被覆し(製造者の推奨に従って)、洗浄し、アッセイバッファー中に保存した。アッセイバッファーは、1%BSA、トリス緩衝生理食塩水、pH7.4、0.05%TritonX−100及び異種親和性/HAMA抗体遮断試薬(Scantibodies Laboratories,Roche Life Sciencesから購入)からなり、製造者の推奨に従って使用した。
他に明記しない限り、典型的なErennaイムノアッセイは、以下の通り行った。試料又は標準物質(例えば50μL〜100μL)を捕獲抗体で被覆したMP(例えば150μL)を含有するアッセイバッファーで希釈し、96ウェルプレート中、25℃で1〜2時間、振とうしながらインキュベートした。全ての血漿試料又は血清試料を前処理なしでそのまま試験した。磁気ベッド(Ambion,Texas)を使用してMPを分離した。上清を除去し、MPを1回洗浄し、次いで検出抗体(アッセイバッファー中に希釈、50〜500μg/mL)20μLを加え、25℃で60分、振とうしながらインキュベートした。MPを再度磁気的に分離し、トリス緩衝食塩水+0.05%TritonX−100を使用して6回洗浄した。残った洗浄バッファーを除去した後、溶出バッファー(4Mの尿素)20μLを加えた。この試薬は、抗体−分析物相互作用を破壊し、MPから検出抗体を遊離させる。次いで、各96ウェル中の溶液を384ウェルの濾過プレート(0.2ミクロン、AcroPrep,East Hills NY)に移し、3,000RPMで3分遠心分離して溶出バッファー中の検出抗体をMPから分離した。次いで、溶出、濾過された384ウェルプレート中の材料をErennaイムノアッセイシステム(Singulex,Inc.)に置いた。
Erennaイムノアッセイシステムは、単一分子計数技術に基づいている。(直径100マイクロメートルの)キャピラリーフローセルによって、384ウェルプレートの各ウェルから液体を少しずつ吸い上げ、汲み出す。液体は、キャピラリー内部のインタロゲーション空間を通過する。図1に示すように、レーザーから発生する光線は二色性ミラー及び共焦点顕微鏡レンズを経由してインタロゲーション空間内に向けられる。色素標識した抗体がこのインタロゲーション空間を通過すると、その抗体は、共焦点顕微鏡レンズ及び光子検出器を経由して測定される蛍光光線を放射する。検出器からの出力は、パルスの列であり、各パルスが検出された光子1つを表している。これらのパルスは、計数用電子機器に送られ、そこでパルスは1ミリ秒ビンで計数される。出力シグナルの組合せを使用することによって4.5+logダイナミックレポートレンジを得る。最初に、バックグラウンドレベルを決定し、このレベルに基づいて、バックグラウンドを超える5標準偏差閾値を作成する。この閾値より大きい光線の閃光のみを計数する。これらの個々のピーク(シグナル強度ではない)を1分の間隔又は1,000ピークが得られるまでのいずれかにわたって合計する。最後のシグナルは、それらの測定された事象全ての合計であり、検出事象(DE)と称される。第2の出力は事象光子(EP)と称され、全検出事象において計数された全光子の合計である。2つの分子が同じ1ms計数ビンの検出器を通過する確率がかなりある場合、この測定を高濃度で使用する。分析物の濃度が最も高いところでは、EP事象は飽和し始め、全光子事象の合計である総光子(TP)を使用する。DE、EP及びTPシグナルを使用して、各シグナル種について加重した4パラメータロジスティック曲線のあてはめを生成する。未知の濃度を見積もるために、DEシグナル、EPシグナル及びTPシグナルをそれぞれの標準曲線から離して補間して3つの別々の濃度の見積もりを得る。これら3つの濃度を、標準曲線の傾きに基づく加重平均を使用して組み合わせる。これにより、>4.5log線形レポートレンジがもたらされる。
本節は、Erennaイムノアッセイシステムの性能についての全体的な見通しをもたらす目的で、異なる分析物を使用した一連の異なる実験からの例示的なデータを提示する。
ヒトIL−17アッセイを用いて生成した典型的なシグナルデータの例を表1に示す。標準曲線を構築するために使用するDEシグナル、EPシグナル及びTPシグナルを太字フォントで示す。曲線のあてはめの正確度を決定するために、表1のシグナル値を、曲線のあてはめアルゴリズムを使用して逆補間し、結果を測定pg/mL対予測pg/mLとして示す。
Erennaイムノアッセイシステムについての検出の分析的な感度又は限界(LoD;DEシグナルの線形部分の傾きで割ったゼロ分析物「バックグラウンド」からのシグナルの2つの標準偏差として定義される;バックグラウンドシグナルから95%の信頼度で区別することができる分析物濃度の最低レベルを表す)は、分析物によって変動し、使用した試料(標準物質)の体積に左右された。表3は、各アッセイについて2つの異なる試料体積を使用した10回の異なるErennaヒトイムノアッセイについてのLoDを示す。
材料と方法
96ウェルポリプロピレンプレートの各ウェルに捕獲試薬(100μL)、その後標準物質/試料75μLを加えた。プレートに蓋をし、室温で2時間インキュベート/振とうした。蓋を除去し、MPが定着/集積するのに十分な時間、プレートを磁石の上に置いた。上清を除去した。プレートを磁石に置いたまま、洗浄バッファー(250μL)を加えた。2分後、バッファーを除去した。プレートを磁石から除去し、IL−6検出試薬(20μL)を加えた。プレートを120×gでパルス遠心分離し、次いで蓋をし、室温で1時間インキュベート/振とうした。プレートを、MPが集積する間、約2分間磁石上に置いた。上清を除去した。洗浄バッファー(250μL)を加え、磁石の近くに磁気的に集積したMPを回収した(3×)。各サイクルの間、バッファーを吸引する前に、粒子を適用したそれぞれの洗浄バッファーと一緒に2分間インキュベートした。磁石を除去し、洗浄バッファー(250μL)を加え、プレートを10秒間振とうしてMPを再懸濁させた。プレートの全内容物を新しい96ウェルプレートに移した。移動させた後、プレートを磁石の上に置き、2分後に上清を除去した。プレートを磁石から除去し、洗浄バッファー(250μL)を加えた。プレートを10秒間振とうした。洗浄ステップを繰り返した。プレートを磁石から除去し、各ウェルに溶出バッファー(20μL)を加えた。プレートを120×gでパルス遠心分離した。プレートに蓋をし、室温で30分間インキュベート/振とうした。濾過プレートを、384ウェルプレートを覆って置き、96ウェルプレートの内容物を384ウェルプレートに移した。濾過プレートコンボに蓋をし、1,200×gで1時間遠心分離した。一番上の濾過プレートを除去し、廃棄した。一番上の濾過プレートを除去し、384ウェルプレートに蓋をし、穴開け可能なプレートシールカバーで蓋をし、アッセイ混合物を光学リーダーに移した(例えば、Erenna System,Singulex)。
以下は、例示的な曲線標準IL−6曲線である。
Claims (52)
- 検出可能種が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、前記検出可能種の単一分子を検出するアッセイを行う方法であって、
(a)第1の容器中における、
(i)前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する、磁性粒子に固定化された捕獲種との複合体を形成するステップと、
(ii)(i)の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
(b)前記固定化複合体を、前記検出可能種を含まない第2の容器に移すステップと、
(c)前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップと、
(d)前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。 - 前記捕獲種が、共有結合的相互作用及び非共有結合的相互作用から選択される1種である相互作用によって前記磁性粒子に固定化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記捕獲種が、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって前記磁性粒子に固定化されている、請求項2に記載の方法。
- (a)(i)の前に、前記分析物の前記単一分子を、脂質上層、前記分析物の前記単一分子を含む中間層、及びフィブリン凝塊下層を含む3層の血漿試料の前記中間層から採取し、前記分析物の前記単一分子を、前記試料の前記中間層からアリコートで採取する、請求項1に記載の方法。
- 前記捕獲種が、核酸、ポリペプチド、脂質、及び糖類から選択される1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕獲種が抗体である、請求項5に記載の方法。
- 前記検出可能種が、核酸、ポリペプチド、脂質、及び糖類から選択される1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能種が抗体である、請求項7に記載の方法。
- 前記分析物がサイトカイン及び増殖因子から選択される1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記サイトカインがインターロイキンである、請求項9に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−8、IL−12、IL−21、G−CSF、GM−CSF、hTNFα、mTNFα、IFNγ、及びhVEGFから選択される1種である、請求項9に記載の方法。
- 2pg/mL以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項11に記載の方法。
- 0.5pg/mL以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項12に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IL−1α、IL−1β、IL−8、IL−12、IL−21、G−CSF、GM−CSF、hTNFα、mTNFα、IFNγ、及びhVEGFから選択される1種であり、前記方法が0.4pg/mL以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項13に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IL−1α、IL−1β、IL−8、IL−12、IL−21、G−CSF、GM−CSF、hTNFα、IFNγ、及びhVEGFから選択される1種であり、前記方法が0.3pg/mL以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項14に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IL−1β、IL−21、G−CSF、hTNFα、及びhVEGFから選択される1種であり、前記方法が0.2pg/mL以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項15に記載の方法。
- 前記サイトカインが、G−CSF、hTNFα、及びhVEGFから選択される1種であり、前記方法が0.1pg/mL以下の量の前記サイトカインを検出することができるアッセイを提供する、請求項16に記載の方法。
- 前記アッセイが2logを超えるダイナミックレンジを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記アッセイが少なくとも3logのダイナミックレンジを有する、請求項15に記載の方法。
- 前記アッセイが少なくとも4logのダイナミックレンジを有する、請求項16に記載の方法。
- 前記複合体が、25μLから約1000μLまでの体積のバッファー溶液中に形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記複合体が、少なくとも25μLの体積のバッファー溶液中に形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記磁性粒子が、前記第1の容器中に0.1μgから40μgまでの量で存在する複数種の磁性粒子の1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記磁性粒子が、前記第1の容器中に少なくとも0.1μgの量で存在する複数種の磁性粒子の1種である、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能種が、それに共有結合しているフルオロフォアを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複合体が、
25μLから約1000μLまでのバッファー溶液に対して0.1μgから40μgまでの複数種の磁性粒子
を含む混合物中の前記磁性粒子に形成される、請求項1に記載の方法。 - 前記複合体が、0.5μgから25μgまでの前記複数の前記磁性粒子を、100μLから1000μLまでの血漿試料と接触させることによって形成される、請求項25に記載の方法。
- (e)前記単一の検出可能種分子の集団の濃度を決定するステップ
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - (f)前記単一の検出可能種の前記濃度を、前記分析物の前記単一分子の集団の濃度と相関させるステップ
をさらに含む、請求項27に記載の方法。 - (g)前記単一の検出可能種分子の集団の個々のメンバーを計数することにより、前記単一の検出可能種分子の数を決定するステップ
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - (h)前記単一の検出可能種分子の前記数を前記分析物の前記単一分子の数と相関させるステップ
をさらに含む、請求項15に記載の方法。 - 前記検出ステップが、
(a)
i.電磁放射線を放射するための電磁放射線源、
ii.電磁放射線源から放射される電磁放射線を受けるように配置された第1のインタロゲーション空間、
iii.前記検出可能種の前記単一分子の第1の電磁波の特徴を測定するために、第1のインタロゲーション空間に作動可能に接続されている第1の電磁放射線検出器
を含む、前記検出可能種の前記単一分子を検出することができる分析器システム
を含む単一分子分析器を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記分析器システムが、
(b)少なくとも1つの試料を自動的にサンプリングし、試料コンテナと前記第1のインタロゲーション空間の間に液体の連絡を提供することができるサンプリングシステム
をさらに含んでいる、請求項32に記載の方法。 - 分析器システムが、実質的に全試料の回収が可能である第1のインタロゲーション空間との液体の連絡中に試料回収システムをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 分析器システムが試料調製システムをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 電磁放射線源が連続波電磁放射線源である、請求項32に記載の方法。
- 第1のインタロゲーション空間が0.02pLと300pLの間の体積を有する、請求項32に記載の方法。
- 第1のインタロゲーション空間が0.05pLと50pLの間の体積を有する、請求項37に記載の方法。
- 第1のインタロゲーション空間が0.1pLと25pLの間の体積を有する、請求項38に記載の方法。
- 前記第1のインタロゲーション空間の体積が調節可能である、請求項37に記載の方法。
- 検出可能な抗体が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、前記検出可能な抗体の単一分子を検出するアッセイを行う方法であって、
(a)第1の容器中における、
(i)前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する捕獲抗体とのハプテン−抗体複合体を形成するステップであって、前記捕獲抗体がビオチンを含み、ストレプトアビジンを含む磁性粒子に前記ビオチンと前記ストレプトアビジンの間の相互作用によって固定化されている、ステップと、
(ii)(i)の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能な抗体と接触させることにより、前記検出可能な抗体の固定化複合体を形成するステップと、
(b)前記固定化複合体を、前記検出可能な抗体を含まない第2の容器に移すステップと、
(c)前記検出可能な抗体を前記固定化複合体から溶出するステップと、
(d)前記検出可能な抗体の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。 - (a)(i)の前に、前記分析物の前記単一分子を、脂質上層、前記分析物の前記単一分子を含む中間層、及びフィブリン凝塊下層を含む3層の血漿試料の前記中間層から採取し、前記分析物の前記単一分子を、前記試料の前記中間層からアリコートで採取する、請求項41に記載の方法。
- 前記ビオチンが、前記捕獲抗体の、アミン部分及びヒンジのサッカリル(saccharyl)部分から選択される1種である部位に結合している、請求項41に記載の方法。
- 検出可能種が特異的に結合するサイトカイン及び増殖因子から選択される1種である分析物の単一分子に相関する、前記検出可能種の単一分子を検出する試料のアッセイを行う方法であって、前記アッセイは5pg/mL以下の量の前記検出可能種を検出することができ、前記アッセイは少なくともlog2のダイナミックレンジを有し、
(a)第1の容器中における、
(i)前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する捕獲種との複合体を形成するステップであって、前記捕獲種がビオチンを含み、ストレプトアビジンを含む磁性粒子に、前記ビオチンと前記ストレプトアビジンの間の相互作用によって固定化されている、ステップと、
(ii)(i)の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
(b)前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。 - (b)の前に、
(c)前記固定化複合体を、前記検出可能種を含まない第2の容器に移すステップ
をさらに含む、請求項44に記載の方法。 - ステップ(b)の前に、
(d)前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップ
をさらに含む、請求項44に記載の方法。 - 前記アッセイが、対象の臨床上健康な非疾患状態に相関する範囲の前記分析物の検出を可能にするように設計されている、請求項44に記載の方法。
- 単一分子アッセイの結果に基づいて診断、予後、治療の状態、及び治療の方法から選択される1種を決定する方法であって、
(a)第1の容器中における、
(i)捕獲種が磁性粒子に固定化されており、前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する前記捕獲種との間に複合体を形成するステップと、
(ii)(i)の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
(b)前記固定化複合体を、前記検出可能種を含まない第2の容器に移すステップと、
(c)前記検出可能種を、前記固定化複合体から溶出するステップと、
(d)前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと、
(e)複数の前記単一分子を定量することにより、前記単一分子の濃度を決定するステップと、
(f)前記単一分子の前記濃度を、前記診断、予後、治療の状態、及び治療の方法から選択される1種と相関させるステップと
を含む上記方法。 - アッセイから得られるデータセットであって、前記データセットが、
分析物の単一分子に対するアッセイから収集した前記分析物からのシグナルに対応する少なくとも1つのデータ点を含み、前記アッセイが0.5pg/mL未満の検出限界及び少なくとも2.5logのダイナミックレンジを有する、上記データセット。 - 検出可能種が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、前記検出可能種の単一分子を検出するアッセイを行う方法であって、
(a)前記分析物と、前記分析物に特異的に結合する、磁性粒子に固定化された捕獲種との複合体を形成するステップと、
(b)(a)の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
(c)前記検出可能種の前記固定化複合体を、前記検出可能種の前記固定化複合体に結合していない本質的に全ての検出可能種から分離するステップと、
(d)前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップと、
(e)前記検出可能種の前記単一分子を検出するステップと
を含む上記方法。 - 前記検出可能種が特異的に結合する分析物の単一分子に相関する、検出可能種を検出するアッセイを行う方法であって、
(a)分析物と、前記分析物に特異的に結合する、磁性粒子に固定化された捕獲種との複合体を形成するステップと、
(b)(a)の後、前記複合体を、前記分析物に特異的に結合する前記検出可能種と接触させることにより、前記検出可能種の固定化複合体を形成するステップと、
(c)前記検出可能種の前記固定化複合体を、前記検出可能種の前記固定化複合体に結合していない本質的に全ての検出可能種から分離するステップと、
(d)前記検出可能種を前記固定化複合体から溶出するステップと、
(e)前記検出可能種の単一分子に対応する光子、前記検出可能種の複数コピーに対応する事象光子、前記検出可能種の複数コピーに対応する全光子、及びこれらの組合せから選択される1種を検出するステップと
を含む上記方法。 - 前記分析物が試料体積の範囲内にあり、前記検出可能種が、前記試料体積より小さい溶出体積中に溶出される、請求項1、50、又は51に記載の方法。
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