JP2012193196A - 癌免疫療法組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するための細胞組成物および方法の提供。
【解決手段】この細胞組成物は、腫瘍抗原および細胞を含み、この細胞は、サイトカイン、ならびに腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体、およびさらなるサイトカインの１つ以上を発現するように改変された細胞を含む。この細胞組成物は、癌を処置するための方法において有用である。ヒト被験体への細胞ベースの免疫療法組成物の投与後、腫瘍抗原に対する免疫応答が検出され、ここで、この免疫応答は、細胞組成物を投与する前にヒト被験体において検出されない。
【選択図】図１

Description

（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／７８８，２９６号（２００６年３月３１日出願）に基づく優先権の利益を主張する。この先の出願は、明確に、その全体が本明細書に参考として援用される。

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するための細胞組成物および方法に関する。この細胞組成物は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）抗体およびサイトカインを発現するように遺伝的に改変された細胞を含み、それによって、免疫化部位における局所的な細胞ベースの抗ＣＴＬＡ−４抗体の持続発現が、全身投与と比較して、治療濃度を顕著に減少させる。

（背景技術）
癌に対する１つの治療的アプローチは、抗腫瘍免疫を増強するためのワクチンとしての自己由来または同種異系の癌細胞の使用である（非特許文献１；非特許文献２ならびに非特許文献３）。このアプローチの拡張は、免疫療法部位において局所的にサイトカインを発現する遺伝的に改変された腫瘍細胞の使用を伴う。

多数のサイトカインが、腫瘍に対する免疫応答の制御において役割を果たしていることが示されてきた。例えば特許文献１は、既存の腫瘍に対抗するための相乗的な有効量のＴＮＦ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−βの組み合わせの使用を記載している。特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５は、腫瘍の処置のためのＧＭ−ＣＳＦの使用を記載している。非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４、および非特許文献１５にそれぞれ記載されているように、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦを含む種々の免疫調節サイトカインを使用する腫瘍モデルにおいて活性が実証されてきた。ＧＭ−ＣＳＦを発現する自己由来または同種異系の細胞ワクチン（ＧＶＡＸ（登録商標））を使用する臨床試験は、前立腺癌、黒色腫、肺癌、膵臓癌、腎臓癌および多発性骨髄腫の処置のために開始されている（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；および非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。

ＧＭ−ＣＳＦを発現する自己由来または同種異系細胞の癌免疫療法は、以前に記載されている（例えば、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１を参照のこと）。しかし、癌の処置のための改善されたＧＶＡＸ（登録商標）ベースの免疫療法ストラテジーの需要が依然として存在する。

細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４；ＣＤ１５２）は、活性化Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のサブセット上で発現される免疫抑制分子である。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の周知の調節因子である（非特許文献２４）。ＣＴＬＡ−４シグナル伝達は、ＩＬ−２転写のレベルと細胞周期のＩＬ−２非依存性事象のレベルの両方でＴ細胞活性化の初期の事象を阻害することが示されてきた（非特許文献２５）。

Ｂ７−１／２に結合するＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションのために必須である。ｃｔｌａ−４^−／−マウスは、制御されないＴ細胞増殖によって開始される致死的なリンパ球増殖性応答の難点があることが観察されてきた。従って、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞応答の初期段階を制御する際に決定的な役割を果たしている。ＣＴＬＡ−４はまた、マウスにおける実験的な自己免疫疾患の発生と重篤度の両方を制御することが示されてきた（非特許文献２６）。

ヒトＣＴＬＡ−４に対する完全なヒトモノクローナル抗体は、第Ｉ／ＩＩ相試験および第ＩＩ相試験において抗腫瘍活性を示した（Ｍｅｄａｒｅｘ）。黒色腫ペプチドワクチンと組み合わせた、完全なヒトのＣＴＬＡ−４遮断モノクローナル抗体（ＭＤＸ−０１０）の投与を伴う第Ｉ相研究において、ＭＤＸ−０１０の反復用量を服薬した第ＩＩＩ期または第ＩＶ期の転移性黒色腫を切除した１９例の患者のうちで８例が、顕著な自己免疫毒性を発生した。徴候としては、ブドウ膜炎、発疹、および胃腸反応（下痢および腹痛）があった。例えば非特許文献２４を参照のこと。

別の研究において、転移性黒色腫を有する１４例の患者が、完全なヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体（ＭＤＸ−０１０）の静脈内投与を３週間毎に３ｍｇ／ｋｇで受け、２つの改変ＨＬＡ−Ａ ０２０１−制限ｇｐ１００ペプチドを用いる皮下ワクチン投与とともに耐容性を示した。これらの結果は、３例の患者が目標の癌の退縮を有したのに対して、６例の患者（４３％）が自己免疫事象を発症したことを示した。これには、皮膚炎を有する３例の患者、大腸炎／全腸炎を有する２例、および肝炎を有する１例が含まれ、これらのすべてが自己限定的であるか、または全身ステロイドに対して応答性であった（非特許文献２７）。これらのデータは、ＣＴＬＡ−４が、治療的利点を有し得るが、臨床的な状況における効力を達成するために十分な抗ＣＴＬＡ４抗体の全身的な投与は関連する毒性を有し得ることを示唆する。従って、低下した全身レベルでありかつ有効な抗ＣＴＬＡ４抗体を準備することによって、潜在的な毒性を克服する組成物を開発する必要性がある。

米国特許第５，０９８，７０２号明細書 米国特許第５，０７８，９９６号明細書 米国特許第５，６３７，４８３号明細書 米国特許第５，９０４，９２０号明細書 米国特許第６，３５０，４４５号明細書 米国特許第６，４６４，９７３号明細書 米国特許第６，３５０，４４５号明細書 米国特許第６，１８７，３０６号明細書 米国特許第６，０３３，６７４号明細書 米国特許第５，９８５，２９０号明細書 米国特許第５，６３７，４８３号明細書

Ｏｅｔｔｇｅｎら、「Ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｄｅｖｉｔａら（編）Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｃｏ．、８７−１９９頁所収、１９９１年 Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＴＤおよびＪａｆｆｅｅ ＥＭ、Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎ Ａｍ．１１（３）：６８１−９６、２００２年 Ｂｏｄｅｙ Ｂら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０（４）：２６６５−７６、２０００年 Ｇｏｌｕｍｂｅｃｋ ＰＴら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１３−７１６、１９９１年 Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４、１９９０年 Ｆｅａｒｏｎ ＥＲら、Ｃｅｌｌ ６０：３９７−４０３、１９９０年 Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ Ｂら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７８２０−２５、１９９０年 Ｔｅｎｇ Ｍら、ＰＮＡＳ ８８：３５３５−３５３９、１９９１年 Ｃｏｌｕｍｂｏ ＭＰら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２９１−１２９８、１９９１年 Ａｏｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９（９）：３８５０−４、１９９２年 Ｐｏｒｇａｄｏｒ Ａら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ．１３（２−３）：１１３−３０、１９９４年 Ｄｒａｎｏｆｆ Ｇら、ＰＮＡＳ ９０：３５３９−３５４３、１９９３年 Ｌｅｅ ＣＴら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１８７−１９３、１９９７年 Ｎａｇａｉ Ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｏｎｔｈｅｒ．４７：２−８０、１９９８年 Ｃｈａｎｇ Ａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：８３９−８５０、２０００年 Ｄｕｍｍｅｒ Ｒ．、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ２（６）：８４４−８、２００１年 Ｓｉｍｏｎｓ Ｊら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５；５９（２０）：５１６０−８、１９９９年 Ｓｏｉｆｆｅｒ Ｒら、ＰＮＡＳ ９５：１３１４１−１３１４６、１９９８年 Ｓｉｍｏｎｓ Ｊら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５；５７：１５３７−１５４６、１９９７年 Ｊａｆｆｅｅ Ｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９：１４５−１５６、２００１年 Ｓａｌｇｉａ Ｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２１：６２４−６３０、２００３年 Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３年 ２１：３３４３Ｂ５０ Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００４年２月１８日 ９６（４）：３２６−３１ Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ Ｋ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：７４１−７５０、２００５年 Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９年、１６２：５８１３−５８２０ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ．５ 補遺１、ｐ．９；６ ２００５年４月 Ｇ．Ｑ．Ｐｈａｎら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：８５２頁、２００３年、Ａｂｓｔｒ ３４２４

（発明の要旨）
本発明は、ヒト被験体における癌に対する免疫応答を生成するための細胞免疫療法組成物および患者における癌の処置のためにその組成物を使用する方法を提供し、ここで、細胞ベースの免疫療法組成物は、腫瘍抗原および細胞の１つ以上の集団を含み、この細胞は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）抗体およびサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝的に改変されている。ヒト被験体への細胞ベースの免疫療法組成物の投与後、腫瘍抗原に対する免疫応答が検出され、ここで、この免疫応答は、細胞組成物を投与する前にヒト被験体において検出されない。

１つの局面において、腫瘍抗原は細胞によって発現され、細胞は遺伝的に改変されている。

細胞の同じかまたは異なる集団は、サイトカインまたは抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されてもよい。

１つの局面において、腫瘍抗原発現細胞集団は、サイトカインと抗ＣＴＬＡ４抗体の両方のコード配列を発現するように遺伝的に改変される。

遺伝的に改変された細胞は、自己由来細胞、同種異系細胞、またはバイスタンダー細胞であり、腫瘍抗原を発現してもよいし、発現しなくてもよい。

１つの実施形態において、自己由来細胞、同種異系細胞、またはバイスタンダー細胞である、腫瘍抗原発現細胞集団は、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインのコード配列を発現するように遺伝的に改変されている。

別の実施形態において、自己由来細胞、同種異系細胞、またはバイスタンダー細胞である、腫瘍抗原発現細胞集団は、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン、および抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている。

なお別の実施形態において、自己由来細胞、同種異系細胞、またはバイスタンダー細胞である、腫瘍抗原発現細胞集団は、抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト被験体における癌に対する免疫応答を生成するための細胞組成物であって、腫瘍抗原、ならびにサイトカインのコード配列および抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変された細胞の１つ以上の集団を含む、細胞組成物。
（項目２）
前記腫瘍抗原が細胞によって発現される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
細胞の同じ集団が、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ４抗体についてのコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
細胞の２つの異なる集団が、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ４抗体についてのコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記遺伝的に改変された細胞の１つ以上の集団の少なくとも１つが腫瘍細胞である、項目１または４に記載の組成物。
（項目６）
前記腫瘍抗原発現細胞集団が、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７）
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、
５’から３’方向に、抗ＣＴＬＡ４抗体の第１鎖のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、タンパク質分解的切断部位、自己プロセシング切断部位をコードする配列、および抗ＣＴＬＡ４抗体の第２鎖のコード配列
を含むベクターを使用して発現され、ここで、該自己プロセシング切断部位をコードする配列が、該抗ＣＴＬＡ４抗体の第１鎖のコード配列と第２鎖のコード配列との間に挿入される、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記腫瘍抗原発現細胞集団が、サイトカインのコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目９）
前記腫瘍抗原発現細胞集団が、抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１０）
項目９に記載の組成物であって、前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、
５’から３’方向に、抗ＣＴＬＡ４抗体の第１鎖のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、タンパク質分解的切断部位、自己プロセシング切断部位をコードする配列、および抗ＣＴＬＡ４抗体の第２鎖のコード配列
を含むベクターを使用して発現され、ここで、該自己プロセシング切断部位をコードする配列が、該抗ＣＴＬＡ４抗体の第１鎖のコード配列と第２鎖のコード配列との間に挿入される、組成物。
（項目１１）
前記細胞の少なくとも１つの集団が自己由来である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１２）
前記細胞の少なくとも１つの集団が同種異系である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３）
前記細胞の少なくとも１つの集団がバイスタンダー細胞である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４）
前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである、項目１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５）
癌に対する免疫応答を生成するための医薬の製造における項目１〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用であって、腫瘍抗原、ならびにサイトカインのコード配列および抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ４）抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変された細胞の１つ以上の集団を含み、ここで、被験体への該組成物の投与が、腫瘍抗原およびサイトカインのコード配列のみを発現するように遺伝的に改変された細胞の集団の投与と比較して、免疫応答の増強をもたらす、使用。
（項目１６）
前記腫瘍抗原が細胞によって発現される、項目１５に記載の使用。
（項目１７）
細胞の同じ集団が、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１５または１６に記載の使用。
（項目１８）
細胞の２つの異なる集団が、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１５に記載の使用。
（項目１９）
前記遺伝的に改変された細胞の１つ以上の集団の少なくとも１つが腫瘍細胞である、項目１５または１８に記載の使用。
（項目２０）
前記腫瘍抗原発現細胞集団が、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１５または１８に記載の使用。
（項目２１）
前記腫瘍抗原発現細胞集団が、サイトカインのコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。
（項目２２）
前記腫瘍抗原発現細胞集団が、抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を発現するように遺伝的に改変されている、項目１５〜２０のいずれか１項に記載の使用。
（項目２３）
項目１５または２２のいずれか１項に記載の使用であって、前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、
５’から３’方向に、抗ＣＴＬＡ４抗体の第１鎖のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、タンパク質分解的切断部位、自己プロセシング切断部位をコードする配列、および抗ＣＴＬＡ４抗体の第２鎖のコード配列
を含むベクターを使用して発現され、ここで、該自己プロセシング切断部位をコードする配列が、該抗ＣＴＬＡ４抗体の第１鎖のコード配列と第２鎖のコード配列との間に挿入される、使用。
（項目２４）
前記細胞が自己由来である、項目１５〜２３のいずれか１項に記載の使用。
（項目２５）
前記細胞が同種異系である、項目１５〜２３のいずれか１項に記載の使用。
（項目２６）
前記細胞がバイスタンダー細胞である、項目１５〜２３のいずれか１項に記載の使用。

図１は、その構成が実施例１に記載されている、抗ＣＴＬＡ４導入ベクターと名付けられたレトロウイルスベクターを示す。 図２Ａおよび２Ｂは、研究の概略（図２Ａ）および結果（図２Ｂ）を図示し、これらは、レトロウイルスによって形質導入されるサイトカイン発現癌免疫療法組成物によって発現される抗ＣＴＬＡ４抗体が機能的であり、かつ精製オボアルブミンを用いる免疫化の際に、養子免疫伝達トランスジェニックＴ細胞の拡大を増強することを実証する。−２日目に、ＯＶＡ_{３２３−３３９}ペプチドに特異的なＴ細胞を産生する、ＤＯ１１．０１トランスジェニックマウス由来の１〜３×１０^６個の脾細胞を、静脈内投与によってレシピエントＢａｌｂ／ｃマウスに養子免疫伝達した。０日目に、代理抗原であるオボアルブミン５００μｇをマウスに注射し、次に、０日目および１日目に、対照ＩｇＧ２ｂ対照抗体（アイソタイプ）；９Ｄ９発現ハイブリドーマから精製した抗ＣＴＬＡ−４抗体（ハイブリドーマ）；レトロウイルスで形質導入したＢ１６Ｆ１０を発現した抗ＣＴＬＡ−４抗体から精製した抗ＣＴＬＡ−４抗体（２Ａ−抗ＣＴＬＡ−４）；またはビヒクル（ＮＡＩＶＥ）の１００μｇを、背部に皮下（ＳＣ）投与した。４日目に、マウスを安楽死させ、脾臓およびリンパ節を収集し、トランスジェニックＤＯ１１．０１の数を、ＤＯ１１．０１特異的モノクローナル抗体ＫＪ１２６を使用して決定した。脾臓におけるオボアルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の絶対数を示す（図２Ｂ）。 図３Ａおよび３Ｂは、抗ＣＴＬＡ抗体もまた局所的に発現するサイトカイン発現癌免疫療法の投与が、長期的で持続性である抗ＣＴＬＡ−４抗体のインビボ発現をもたらすことを実証する、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける研究の結果を示す。０日目に、マウスに、２×１０^５個の生きているＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）接種した。１日目に、マウスを、５つの別々の群に分けた：１つのセットは、各々が、それぞれ１５μｇ、５０μｇまたは１５０μｇの精製抗ＣＴＬＡ４抗体の単回腹腔内（ｉｐ）投与を受け；１つのセットは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように操作された１×１０^６個の照射されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を用いて免疫化し（ＳＣ）；最後のセットは、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現するように操作された１×１０^６個の照射されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を用いて免疫化し（ＳＣ）（図３Ｂ）、抗ＣＴＬＡ−４抗体の血中濃度を１８日間の期間、追跡した。 図４Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける研究の結果のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフを示し、これは、抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現する、レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現癌免疫療法が、低い全身抗体濃度で、腫瘍を有する動物の生存を改善することを実証する。０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０^５個の生きているＣＴ２６腫瘍細胞を皮下接種した。３日後、マウスを、１×１０^６個の照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌ＣＴ−２６を用いて、またはＧＭ−ＣＳＦと抗ＣＴＬＡ−４抗体の両方を分泌する同じ数の照射されたＣＴ−２６細胞を用いて免疫化した。対照群は、３日目に、１×１０^６個の照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌ＣＴ−２６腫瘍細胞、および組換え抗ＣＴＬＡ−４抗体の全身投与（腹腔内−１５０μｇ、１０μｇ）または局所的投与（サイトカイン発現癌免疫療法と混合−１０μｇ ＳＣ）を用いて免疫化した。マウスを、１３日目および２７日目に、免疫化および抗体注射の反復に供した。マウスを、明白な腫瘍の形成について週２回モニターし、腫瘍が壊死性になるか、サイズが１５００ｍｍ^３を超えると屠殺した。図４Ｂおよび４Ｃは、図４Ａにおける抗体投与の３日後に収集した動物からの血清中に存在する抗ＣＴＬＡ−４抗体の濃度を示す。 図５Ａは、レトロウイルスによって形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞からの抗ＣＴＬＡ−４抗体の局所的発現が、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおける腫瘍保有動物の生存を改善したことを図示するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフを示す。０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２×１０^５個の生きているＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞でチャレンジした。マウスを、１日目に、３×１０^６個の照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を用いるか、またはＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ４抗体の両方を分泌する、同じ数の照射されたＢ１６Ｆ１０細胞を用いて免疫化した。別個の群を、照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍細胞、および組換え抗体の全身（腹腔内）の投与で、２日目（１５０μｇ）および５日目（１００μｇ）に免疫化した。免疫化および抗体注射の第２のラウンドを１４日目に開始して投与した。腫瘍量をモニターし、マウスを、チャレンジ腫瘍が１５００ｍｍ^３に達し、または重篤な潰瘍が発生したときに屠殺した。図５Ｂおよび５Ｃは、図５Ａにおける全身的または局所的に発現された抗体投与後の特定の日において収集した動物からの血清中に存在している抗ＣＴＬＡ−４抗体の濃度を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、レトロウイルスによって形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞からの抗ＣＴＬＡ−４抗体の局所的発現が、Ｔ細胞応答の増強をもたらすことを実証する研究の結果を示す。図５に記載されたように治療した群からのサテライトマウスを２１日目に収集した。抗原特異的応答は、製造業者の指示書に従って、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって列挙された。赤血球欠損脾細胞（５×１０^５）をプレートし、ＴＲＰ２（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）（配列番号１１；図６Ａ）に由来する１μＭのＫｂ結合ペプチド、または５×１０^３個の照射されたＢ１６Ｆ１０細胞（図６ｂ）とともに、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ポジティブスポットを、自動プレート走査サービスを使用して列挙した。 図７Ａおよび７Ｂは、Ｆ２Ａ抗ＣＴＬＡ抗体もまた局所的に発現するサイトカイン発現癌免疫療法の適用が、長期的で持続性である抗ＣＴＬＡ−４抗体のインビボ発現をもたらすことを実証する、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける研究の結果を示す。０日目に、マウスに、２×１０^５個の生きているＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）接種した。１日目に、マウスを４つの別々の群に分けた：１つのセットは、各々が、ＨＢＳＳの単回腹腔内（ｉｐ）投与（白丸）；ＧＭを発現するように操作された３×１０^６個の照射されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（Ｂ１６ＧＭ；黒丸）；３×１０^６個の照射されたＢ１６ＧＭプラスＣＴＬＡ−４の全身注射（Ｂ１６ＧＭ全身α−ＣＴＬＡ−４；白三角）；またはＦ２Ａカセットを使用する、抗ＣＴＬＡ−４を分泌するように操作された３×１０^６個の照射されたＢ１６ＧＭ（白ひし形）の投与を受けた。示された時点で血清を収集し、ＥＬＩＳＡによって、抗核抗体（図７Ａ）、ｓｓＤＮＡ抗体（図７Ｂ）、およびｄｓＤＮＡ抗体（図７Ｃ）のレベルについて評価した。

定義
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、およびトランスジェニック生物学の従来の技術を採用する。例えば、以下を参照のこと：Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、定期的な更新を含む）；Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５年、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ、１９９２年、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、１９９１年、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ）；ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ、１９７９年；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８年；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６年）。

他に示されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、当業者が有するものと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技術を使用する。

本発明の説明において、以下の用語が使用され、以下に示すように定義されることが意図される。

「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドならびにそのポリマー（ポリヌクレオチド）をいう。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同じ結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に示されない限り、特定のアミノ酸分子／ポリヌクレオチドはまた、黙示的にその保存的に修飾された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明示的に示される配列を包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択した（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合した塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成されてもよい（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４年））。ヌクレオチドは、それらの塩基によって、以下の標準的な略号：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）によって示される。

「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」、「核酸ベクター構築物」、および「ベクター構築物」という用語は、当業者によって理解されるように、遺伝子導入のための任意の核酸構築物を意味するために、本明細書で交換可能に使用される。

１つのアプローチにおいて、ベクターはウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、その分野で認識されている意味に従って使用される。これは、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされてもよい核酸ベクター構築物をいう。ウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を細胞に導入する目的のために利用されてもよい。

「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」、および「ビリオン」という用語は交換可能に使用され、例えば、本発明のウイルスベクターが、感染性粒子の生成のために適切な細胞または細胞株に形質導入される場合に形成される感染性ウイルス粒子を意味するものとして広く理解されるべきである。本発明によるウイルス粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、ＤＮＡを導入する目的のために使用されてもよい。本発明において使用されるベクターは、任意に選択可能なマーカーをコードしてもよい。

「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルス性ベクター」（交換可能に使用される）は、本明細書で使用される場合、アデノウイルスビリオンにパッケージング可能であるポリヌクレオチド構築物である。本発明の例示的なアデノウイルスベクターには以下が含まれるが、これらに限定されない：ＤＮＡ、アデノウイルス被膜に封入されたＤＮＡ、別のウイルスまたはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペスおよびＡＡＶ）にパッケージングされたアデノウイルスＤＮＡ、リポソームに封入されたアデノウイルスＤＮＡ、ポリリジンと複合体化されたアデノウイルスＤＮＡ、合成ポリカチオン性分子と複合体化されるか、トランスフェリンと結合体化されるか、もしくはＰＥＧなどの化合物と複合体化されて、抗原性を免疫学的に「マスク」し、そして／もしくは半減期を増大させたアデノウイルスＤＮＡ、または非ウイルスタンパク質に結合体化されたアデノウイルスＤＮＡ。

「選択可能なマーカー」は、細胞内でのその発現が細胞に選択的な利点を与えるタンパク質である。形質転換していない細胞の成長と比較した、選択可能なマーカーを用いて形質転換された細胞によって保有される選択的な利点は、抗生物質などのネガティブ選択剤の存在下で増殖するそれらの能力に起因し得る。形質転換していない細胞と比較した、形質転換細胞によって保有される選択的な利点は、栄養、成長因子またはエネルギー源として加えられた化合物を利用するための、それらの増強されたかまたは新規な能力にも起因し得る。選択マーカータンパク質には、形質導入した細胞の検出、およびおそらく、形質導入していない細胞からのそれらの分離を可能にするものが含まれる。任意の選択可能なマーカーが使用可能であるが、このような発現ベクターにおける使用のための選択可能なマーカーは、一般に当該分野において公知であり、適切な選択可能なマーカーの選択は、宿主細胞および用途に依存する。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は選択可能なマーカーとして使用することができる。抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択可能なマーカー遺伝子の例には、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．、Ｊ Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．１９８２；１（４）：３２７ ４１（１９８２年））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２ ７（１９８０年））、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（２）：４１０ ３（１９８５年））、またはＧ４１８が含まれる。

「形質導入」という用語は、感染、内在化、トランスフェクション、または任意の他の手段を経由する、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞への核酸分子の送達をいう。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および遺伝子銃を含む、当該分野において公知である種々の手段によって達成されてもよい。Ｇｒａｈａｍら（１９７３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら、（１９８６年）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ １３：１９７、１９８１年を参照のこと。このような技術は、１種以上の外因性ＤＮＡ部分、例えばプラスミドベクターおよび他の核酸分子を適切な宿主細胞に導入するために使用することができる。この用語は、遺伝物質の安定的かつ一過性である取り込みをいう。

「組換え」という用語は、核酸分子に関連して本明細書において使用される場合、組換えＤＮＡ技術を使用して子孫の核酸分子に一緒に結合されている核酸分子の組み合わせをいう。ウイルス、細胞および生物に関して本明細書で使用される場合、「組換え」、「形質転換」、および「トランスジェニック」という用語は、異種核酸分子が導入されるか、またはネイティブ核酸配列が欠失もしくは改変されている宿主ウイルス、細胞もしくは生物をいう。異種核酸分子を導入する場合において、核酸分子は、宿主のゲノムに安定的に組み込むことができ、または核酸分子は、染色体外分子としてもまた存在し得る。このような染色体外分子は自己複製性であり得る。組換えウイルス、細胞および生物は、形質転換プロセスの最終生成物のみならず、その組換え子孫もまた含むと理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」または「非組換え」宿主とは、異種核酸分子を含まない野生型のウイルス、細胞、または生物をいう。

「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与する配列である。調節エレメントには、プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルが含まれる。これらはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要とされる配列を含む。

「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのために結合部位を含み、ＤＮＡの転写を開始する、通常はコード領域の上流に位置する非翻訳ＤＮＡ配列をいう。プロモーター領域はまた、遺伝子発現の制御因子として機能する他のエレメントを含んでもよい。「最小プロモーター」という用語は、上流の活性化エレメントの非存在下で不活性であるか、またはプロモーター活性が大きく減少しているプロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントをいう。

本発明の意味の範囲内における「エンハンサー」という用語は、コード配列に作動可能に連結されたときに、プロモーターそれ自体によってもたらされる転写活性化よりも高い程度まで、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列の転写を増加させる任意の遺伝子エレメント、例えばヌクレオチド配列であり得、すなわち、エンハンサーは、プロモーターからの転写を増大する。

ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列との機能的な関連性に置かれるときに、「作動可能に連結」または「機能的に連結」（交換可能に使用）される。例えば、プロモーターまたは制御ＤＮＡ配列は、プロモーターまたは制御ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列または構造的ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を与えるように２つの配列が配置される場合、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」といわれる。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、典型的には連続しているが、必ずしもその必要はない。

「発現」という用語は、細胞内での内因性遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の転写および／または翻訳をいう。アンチセンス構築物の場合、発現は、アンチセンスＤＮＡのみの転写をいうことがある。本発明のベクターは、タンパク質またはその断片のコード配列（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、腫瘍抗原、ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。コード配列は、タンパク質の転写および翻訳のために必要である他の制御エレメントおよびポリＡ配列とともに、標的細胞内で構成的または誘導的に活性である異種プロモーターに作動可能に連結される。抗原の発現のためにベクターを操作する場合、発現ベクターは、抗原の細胞内局在化を指示する配列を含み得る。例えば、抗原発現は細胞質性であり得；分泌のためのシグナル配列、または細胞外膜との安定的な結合のための配列が使用されてもよい。後者の実施形態について、ベクターは、同じオープンリーディングフレーム中に抗原および膜貫通領域をコードし、この膜貫通領域は、抗原コード領域から上流または下流のいずれかであり得、インフレームのスペーサー領域によって必要に応じて離されていてもよい。膜貫通領域は、他の公知の膜貫通領域上でモデル化されてもよく、高度な親油性を有する人工的に設計したポリペプチドセグメントであってもよい。いくつかの実施形態において、発現パターンの組み合わせが、同じ細胞または別個の細胞集団のいずれかによって使用されてもよい。このように構成された発現カセットは、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性リポソームを使用する挿入などの当該分野において公知である任意の方法によってか、または細胞にとって向性であるウイルスベクターを使用することによって細胞に導入される。

「腫瘍選択性プロモーター活性」という用語は、本明細書で使用される場合、プロモーター断片のプロモーター活性が、非腫瘍細胞型におけるよりも腫瘍細胞において活性が高いことを意味する。

「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」とは、本明細書で言及される場合、翻訳に際して、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの迅速な分子内（シス）切断が起こり、別個の成熟タンパク質またはポリペプチド産物の発現をもたらす、ＤＮＡまたはアミノ酸配列である。自己プロセシング切断部位は、リボソームの活性を修飾してエステル結合の加水分解を促進し、それによって、別個の下流の翻訳産物の合成が進行することを可能にするように、翻訳複合体からポリペプチドを遊離させることによって翻訳の効果を実証する（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００１年５月；８２（Ｐｔ ５）：１０１３−２５）。あるいは、２Ａ部位、配列またはドメインは、一次切断産物を産生するために、シスでそれ自体のＣ末端を切断することによって「自己タンパク質分解」または「切断」を実証する（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０年））。

本明細書で使用される場合、「付加的なタンパク質分解的切断部位」という用語は、２Ａまたは２Ａ様配列などの自己プロセシング切断部位に隣接し、自己プロセシング切断配列による切断後に残っている付加的なアミノ酸配列を除去するための手段を提供する、本発明の発現構築物に組み込まれた配列をいう。例示的な「付加的なタンパク質分解的切断部位」は本明細書に記載され、これにはコンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有するフリン切断部位が含まれるが、これに限定されない。このようなフリン切断部位は、タンパク質分泌経路内のフリンおよび他のセリンプロテアーゼなどの内因性サブチリシン様プロテアーゼによって切断され得る。

本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は交換可能に使用されてもよく、完全な免疫グロブリンまたは抗体分子、ならびに、抗原決定基に結合可能であるその断片、例えば、Ｆａ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖをいう。このような「免疫グロブリン」および「抗体」は、分子量約２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドから構成される。これらの４つの鎖はジスルフィド結合によって結合されて「Ｙ」配置になっている。重鎖は、γ（ＩｇＧ）、μ（ＩｇＭ）、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、またはε（ＩｇＥ）に分類され、免疫グロブリンの種類指定の基礎であり、これが所定の抗体のエフェクター機能を決定する。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。本明細書において「免疫グロブリンまたはその断片」をいう場合、このような「その断片」は、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片であることが理解される。

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体の抗原結合領域の１つ以上のアミノ酸が、ヒト抗体に一層近似するように置換されているが、元の非ヒト抗体の結合活性を保持している抗体分子をいう。例えば、米国特許第６，６０２，５０３号を参照のこと。

「抗原決定基」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体と接触する分子の断片（すなわち、エピトープ）をいう。タンパク質またはタンパク質の断片の多数の領域が、タンパク質の三次元構造の所与の領域に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る。これらの領域または構造は、抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体の結合のための完全な抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために使用される免疫原）と競合し得る。

「断片」という用語は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドに言及する場合、対応する全長タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが一部と同じアミノ酸配列を有し、かつ対応する全長タンパク質またはポリペプチドの機能または活性の少なくとも１つを保持しているポリペプチドを意味する。断片は、好ましくは、全長タンパク質またはポリペプチドの連続するアミノ酸残基を少なくとも２０〜１００個含む。

「マルチシストロン性転写物」とは、２つ以上のタンパク質コード領域すなわちシストロンを含むｍＲＮＡ分子をいう。２つのコード領域を含むｍＲＮＡを、「バイシストロン性転写物」と呼ぶ。「５’−近位」のコード領域すなわちシストロンは、その翻訳開始コドン（通常はＡＵＧ）がマルチシストロン性ｍＲＮＡ分子の５’末端に最も近いコード領域である。「５’−遠位」のコード領域すなわちシストロンは、その翻訳開始コドン（通常はＡＵＧ）がｍＲＮＡ分子の５’末端に最も近い開始コドンではないものである。「５’−遠位」および「下流」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に隣接していないコード領域をいうために同義語的に使用される。

本明細書で使用される場合、「同時転写された」とは、２つ（以上）のコード領域またはポリヌクレオチドが、単一の転写制御エレメントまたは調節エレメントの転写制御下にあることを意味する。

本明細書で使用される場合、「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン、例えばＡＴＧへの直接的な内部リボソームの進入を促進し、それによって、遺伝子のキャップ非依存的翻訳に導くエレメントをいう。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒ Ｊ、Ｈｏｗｅｌｌ Ｍ Ｔ、Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ａ（１９９０年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−８３）ならびにＪａｃｋｓｏｎ Ｒ ＪおよびＫａｍｉｎｓｋｉ，Ａ．（１９９５年）ＲＮＡ １（１０）：９８５−１０００）。本発明は、シストロンの開始コドンへの直接的な内部リボソームの進入を促進することが可能である、任意のＩＲＥＳエレメントの使用を含む。「ＩＲＥＳの翻訳制御下」とは、本明細書で使用される場合、翻訳がＩＲＥＳに付随し、キャップ非依存的な様式で進行することを意味する。当該分野において公知である「ＩＲＥＳ」の例には、ピコルナウイルスから入手可能であるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−４８３）；ならびに、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚら（１９９８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２、およびインスリン様成長因子、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４などのウイルスまたは細胞のｍＲＮＡ供給源から入手可能であるＩＲＥＳが含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳ配列の機能的バリエーションがシストロンの開始コドンの直接的な内部リボソーム進入を促進可能である限り、ＩＲＥＳ配列の機能的バリエーションを含む。好ましい実施形態において、ＩＲＥＳは哺乳動物性である。他の実施形態において、ＩＲＥＳはウイルス性または原生動物性である。ＩＲＥＳ配列の例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されている。

「コード配列」および「コード領域」という用語は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡに転写される核酸配列をいう。１つの実施形態において、ＲＮＡは、次いで、細胞内で翻訳されてタンパク質を産生する。

「腫瘍成長を阻害する」または「腫瘍成長の阻害」という用語は、腫瘍の質量、腫瘍の体積、腫瘍細胞の量、または腫瘍の成長速度の任意の測定可能な減少をいう。この定義は、既存の腫瘍のサイズ、能力または成長速度の任意の減少を含むことを意図する。これは、既存の腫瘍の抑制、退行、または部分的もしくは完全な消失を含む。また、この定義の中には、腫瘍サイズもしくは腫瘍細胞数の増加の阻害もしくは遅延、または腫瘍細胞数、腫瘍サイズ、もしくは腫瘍の数の減少が含まれる。

「腫瘍細胞からの抗原」という用語またはその文法的な等価物は、本明細書では、免疫応答を誘発可能である腫瘍細胞からの任意のタンパク質、炭水化物、または他の成分を意味する。この定義は、抗原としてのその関連抗原のすべてを有する腫瘍細胞の全体、ならびに細胞本体から分離された細胞の任意の成分、例えば、原形質膜、細胞質タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞表面もしくは膜から精製されたタンパク質、または細胞表面に付随する独特な炭水化物部分を使用することを含むが、これに限定されないことを意図する。この定義はまた、入手するために細胞の特別な処理を必要とする細胞の表面からの抗原を含む。免疫学的エピトープを依然として含むタンパク質の断片が含まれる。当業者は、本明細書に記載されるようなタンパク質の免疫原性断片を決定することができる。

「遺伝的に改変された腫瘍細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、導入遺伝子を発現するように遺伝的に改変されており、癌処置レジメンの一部として患者に投与される細胞の集団を含む組成物をいう。遺伝的に改変された腫瘍細胞癌免疫療法は、処置を受けている患者に対して「自己由来」または「同種異系」である腫瘍細胞、あるいは患者から採取された腫瘍細胞と混合された「バイスタンダー細胞」を含む。ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝的に改変された腫瘍細胞癌免疫療法はまた、「ＧＶＡＸ（登録商標）」と呼ばれている。

「全身性免疫応答」という用語またはその文法的な等価物は、本明細書では、局在化せずに全体として個体に影響を与え、従って、同じ刺激に対する特定の次なる応答を可能にする免疫応答を意味する。

「原発性腫瘍細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物における腫瘍から単離され、インビトロで広範に培養されてはいない癌細胞である。

「発現の増強」または発現するように「改変された」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する細胞またはそれが由来する親の細胞において産生されるよりも高いレベルの特定のタンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡまたは抗原（例えば、抗原性タンパク質、腫瘍抗原またはサイトカイン）を産生する細胞をいう。細胞は、当該分野において公知である任意の方法、例えば、ゲノム配列のプロモーター領域を遺伝的に改変すること、タンパク質もしくはｍＲＮＡの産生を増大するように細胞シグナル伝達経路を遺伝的に改変すること、または目的のタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド（例えば、腫瘍抗原、抗原性タンパク質またはサイトカイン）をコードするベクターを用いる形質導入を使用して、内因性タンパク質またはｍＲＮＡの発現を増大するように遺伝的に改変されてもよい。「サイトカイン」または「サイトカイン群」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫系の細胞に影響を与える生物学的分子の一般的な種類をいう。この定義は、局所的に作用し、または血液中を循環してもよく、本発明の組成物または方法において使用されるとき、癌に対する個体の免疫応答を制御または調節するように機能する生物学的分子を含むことを意図するが、これに限定されない。本発明を実施する際に使用される例示的なサイトカインには、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−２９、特にＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＭＩＰ３ａ、ＩＣＡＭ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。

「免疫応答の増加」は、本明細書で使用される場合、特定の免疫活性化の検出可能な増加が検出可能であることを意味する（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞応答の増加）。免疫応答の増加の例は、腫瘍細胞の抗原に結合する抗体の量の増加である。別の例は、細胞免疫応答の増加である。細胞の免疫応答はＴ細胞を含み、インビトロ（例えば、クロム遊離アッセイによって測定される）またはインビボで観察することができる。免疫応答の増加には、典型的には、免疫細胞の特定の集団の増加が付随する。

「投与された」という用語は、本発明の細胞（例えば、癌ワクチン）を哺乳動物に導入する任意の方法をいう。これには、経口、非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、静脈内（留置カテーテルを介することを含む）、腫瘍内、輸入リンパ管を介すること、または処置される腫瘍および哺乳動物の状態を考慮して適切である別の経路が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、任意の部位において被験体に投与されてよい。例えば、これらは、原発性腫瘍から「遠位」であるかまたはそこから「遠い」部位に送達することができる。

「処置」、「治療用途」、または「医療用途」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患状態もしくは症状を治療するか、または疾患もしくは他の望ましくない症状の進行を、多少なりとも予防、妨害、遅延もしくは逆転する、特許請求された組成物の任意のおよびすべての使用をいうものとする。

「確立された腫瘍の逆転」という用語または文法的な等価物は、本明細書において、既存の腫瘍の抑制、退行、または部分的もしくは完全な消失を意味する。この定義は、既存腫瘍のサイズ、能力または成長速度の任意の減少を含むことを意図する。

「治療有効量」という用語または文法的等価物は、個体の全身性免疫応答を調節するために十分であるか、または腫瘍成長を阻害するために十分な量である調製物の量をいう。この量は、異なる個体、異なる腫瘍型、および異なる調製物について異なってもよい。「治療有効量」は、「治療結果の改善」がもたらされるように、当業者によって慣用的に使用される手順を使用して決定される。

本明細書で使用される場合、「治療結果の改善」および「治療効力の増強」という用語は、癌に関連して、癌細胞もしくは固形腫瘍の成長の遅延もしくは減少、または癌細胞の総数もしくは全腫瘍量の減少をいう。「治療結果の改善」または「治療効力の増強」は、それゆえに、任意の臨床的に許容される判断基準に従って、個体の状態の改善が存在することを意味し、これには、確立された腫瘍の逆転、平均余命の増加、または生活の質の改善が含まれる。

「個体」、「被験体」、「哺乳動物被験体」という用語またはその文法的等価物は、任意の個々の哺乳動物を意味する。

本発明の組成物および方法
本発明は、腫瘍抗原ならびに抗ＣＴＬＡ−４抗体およびサイトカインの一方または両方を含む、細胞ベースの癌免疫療法組成物を提供する。本発明の細胞ベースの癌免疫療法組成物は、インビボでの免疫療法の投与後に、腫瘍抗原（癌）に対する免疫応答を刺激するため、および／または癌患者のための治療的結果を改善するために、被験体に投与される。１つの実施形態において、細胞ベースの腫瘍免疫療法組成物は、腫瘍細胞、および単一の細胞からの抗ＣＴＬＡ−４抗体に対して、免疫応答を誘発するタンパク質を発現する。被験体は哺乳動物であり、典型的には、ヒト癌患者である。

その機序は本発明の一部をなすものではないが、本発明の細胞ベースの癌免疫療法の効力は、癌免疫療法を受けている被験体における１つ以上の腫瘍抗原に対する免疫応答の増強、および／またはＴ細胞増殖のＣＴＬＡ−４依存性阻害の遮断に起因する可能性がある。

望ましくは、本発明の細胞ベースの癌免疫療法の投与は、癌に対する全身性免疫応答、すなわちＴ細胞応答および／またはＢ細胞応答をもたらす。１つの実施形態において、この方法は、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびサイトカインの少なくとも１つを発現するように細胞を遺伝的に改変すること；ならびに被験体にこの遺伝的に改変された細胞を投与することを包含し、ここで、この細胞は、細胞が投与された被験体に存在する癌細胞によって保有される腫瘍細胞によって発現される少なくとも１種の抗原を発現する。遺伝的に改変された細胞は、腫瘍細胞または癌細胞であり得る。遺伝的に改変された細胞は、投与の前に、典型的には照射によって増殖不能にされるが、細胞を増殖不能にする任意の公知のまたは後に発見される方法が採用されてもよい。被験体への遺伝的に改変された細胞の投与の際に、癌細胞または腫瘍細胞に対する免疫応答および／またはＴ細胞応答の増強がもたらされる。

本発明は、さらに抗ＣＴＬＡ−４抗体を局所的に発現する、ＧＭ−ＣＳＦを発現する腫瘍細胞から構成されるサイトカイン発現癌免疫療法の適用が、単独療法としてのいずれかと比較した場合に、腫瘍を有する動物の生存の延長を示し、有意に低い全身レベルの抗ＣＴＬＡ−４抗体で生存の延長を示すという観察に基づいている（例えば、実施例５および６を参照のこと）。

遺伝的に改変されたサイトカイン発現細胞
１つの局面において、本発明は、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびサイトカインを含む細胞ベースの癌免疫療法組成物を提供する。腫瘍抗原およびサイトカインは、典型的には、細胞によってか、または細胞から発現される。これらは、同じ細胞または異なる細胞によって発現され得、一方は細胞によって発現され得るが、他方はネイティブなタンパク質またはその生物学的に活性な断片もしくは改変体の形態で提供される。

１つの実施形態において、腫瘍細胞は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）および抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現するように遺伝的に改変されている。腫瘍細胞は、自己由来腫瘍細胞、同種異系腫瘍細胞および腫瘍細胞株からなる群より選択される。腫瘍細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで形質導入されてもよい。本発明を実施する際に、腫瘍細胞は、典型的には処置される腫瘍または癌と同じ型の原発性腫瘍細胞または腫瘍細胞株であり得る。一般には、ヒト細胞およびヒト細胞株が、ヒト患者への投与のために使用される。

サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝的に改変され、次いで癌の処置のために個体に投与される自己由来癌細胞および同種異系癌細胞は、米国特許第５，６３７，４８３号、同第５，９０４，９２０号および同第６，３５０，４４５号に記載されている。ＧＭ−ＣＳＦを発現する癌免疫療法（ＧＶＡＸ）を使用する臨床試験が、前立腺癌、黒色腫、肺癌、膵臓癌、腎臓癌および多発性骨髄腫の処置のために着手されている。これらの免疫療法を使用する多数の臨床試験が記載されており、黒色腫、ならびに前立腺、腎臓、および膵臓の癌において最も顕著である（Ｓｉｍｏｎｓ ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．１９９９年；５９：５１６０−５１６８；Ｓｉｍｏｎｓ ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７年；５７：１５３７−１５４６；Ｓｏｉｆｆｅｒ Ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８年；９５：１３１４１−１３１４６；Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００１年；１９：１４５−１５６；Ｓａｌｇｉａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３年 ２１：６２４Ｂ３０；Ｓｏｉｆｆｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３年 ２１：３３４３Ｂ５０；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００４年２月１８日 ９６（４）：３２６−３１）。一般的な免疫調節性の遺伝的に改変されたバイスタンダー細胞株は、米国特許第６，４６４，９７３号に記載されている。

形質導入後、細胞は、増殖不能にするために照射される。次いで、増殖不能サイトカイン発現細胞は患者に再投与され（例えば、皮内経路または皮下経路によって）、それによって、癌免疫療法として機能する。

１つのアプローチにおいて、遺伝的に改変された腫瘍細胞は、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現するように改変された細胞の単一集団を含み、処置レジメンの一部として被験体に投与される。別のアプローチにおいて、遺伝的に改変された腫瘍細胞の同じ集団または２つ以上の集団は、異なる導入遺伝子（例えば、異なるサイトカインまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体）を発現するように改変され、被験体に投与される。処置レジメンは、１つ以上のさらなる癌治療剤または処置を含んでもよい。

一般に、本発明を実施する際に使用される遺伝的に改変された腫瘍細胞には、自己由来腫瘍細胞、同種異系腫瘍細胞および腫瘍細胞株（すなわち、バイスタンダー細胞）の１つ以上が含まれる。本発明の細胞ベースの腫瘍免疫療法は、サイトカインを発現する自己由来腫瘍細胞、同種異系腫瘍細胞またはバイスタンダー細胞とともに、異なるサイトカインおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現する自己由来腫瘍細胞、同種異系腫瘍細胞またはバイスタンダー細胞を任意の組み合わせで含んでもよい。

処置される腫瘍の型は以下からなる群より選択される：膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膵臓癌、直腸癌、前立腺癌、胃癌、表皮癌；リンパまたは骨髄細胞系列の造血器腫瘍；線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍；黒色腫、奇形癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、腺癌、および非小細胞肺癌などの他の腫瘍型。処置される腫瘍細胞の型が前立腺癌である場合、前立腺腫瘍細胞株は、ＤＵ１４５、ＰＣ−３およびＬｎＣａＰからなる群より選択されてもよい。

自己由来
自己由来サイトカイン発現腫瘍細胞の使用は、各々の患者の腫瘍が、別の患者からの組織学的に類似する、ＭＨＣが一致する腫瘍細胞上で見出されるものとは異なり得る腫瘍抗原の独特のセットを発現するので、利点を提供する。例えば、Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８、６３８−６４３（１９９２年）；Ｄａｒｒｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２、３３２９−３３３５（１９８９年）；およびＨｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１０、１５３−１６４（１９９１年）を参照のこと。対照的に、異なる供給源由来のＭＨＣが一致する腫瘍細胞は、本発明の細胞ベースの癌免疫療法を調製するために、患者を外科手術に供してその腫瘍のサンプルを入手する必要がない、という利点を提供する。

自己由来サイトカイン発現腫瘍細胞の使用は、各々の患者の腫瘍が、別の患者からの組織学的に類似する、ＭＨＣが適合する腫瘍細胞上で見出されるものとは異なり得る腫瘍抗原の独特のセットを発現するので、利点を提供する。例えば、Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８、６３８−６４３（１９９２年）；Ｄａｒｒｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２、３３２９−３３３５（１９８９年）；およびＨｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１０、１５３−１６４（１９９１年）を参照のこと。対照的に、異なる供給源由来のＭＨＣが一致する腫瘍細胞は、本発明の細胞ベースの腫瘍ワクチンを調製するために、患者を外科手術に供してその腫瘍のサンプルを入手する必要がない、という利点を提供する。

１つの好ましい局面において、本発明は、以下の工程：（ａ）腫瘍を有する哺乳動物被験体から腫瘍細胞を入手する工程；（ｂ）腫瘍細胞を改変して該細胞を抗ＣＴＬＡ−４抗体およびサイトカインを発現可能にする工程；（ｃ）改変した腫瘍細胞を増殖不能にする工程；および（ｄ）腫瘍細胞の入手源である哺乳動物被験体、または腫瘍細胞の入手源である哺乳動物被験体と同じＭＨＣ型を有する哺乳動物に、改変した腫瘍細胞を再投与する工程を実施することによって癌を処置する方法を包含する。投与される腫瘍細胞は自己由来であり、宿主に対してＭＨＣが一致する。好ましくは、本発明の組成物は、哺乳動物被験体に、皮下、皮内または腫瘍内に投与される。単一の自己由来腫瘍細胞は、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびサイトカインのコード配列を発現してもよく、または抗ＣＴＬＡ−４抗体およびサイトカインは、異なる自己由来腫瘍細胞によって発現されてもよい。本発明の１つの局面において、自己由来腫瘍細胞は、その発現のために必要であるプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結された、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸を含む１つ以上のベクターの導入によって改変される。別の局面において、同じ自己由来腫瘍細胞または異なる自己由来腫瘍細胞は、その発現のために必要であるプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結された、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはサイトカインをコードする核酸を含むベクターの導入によって改変される。抗ＣＴＬＡ−４抗体またはサイトカインをコードする核酸は、同じかまたは異なるベクターを使用して、同じかまたは異なる自己由来腫瘍細胞に導入される。望ましくは、自己由来腫瘍細胞は、高レベルのサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現する。

同種異系
研究者らは、Ｊａｆｆｅｅら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２２、８１−９１（１９９５年）によって概説されているように、腫瘍ワクチンとしての自己由来でかつＭＨＣが一致している細胞に対する代替物を探索してきた。初期の腫瘍免疫療法のストラテジーは、腫瘍細胞をワクチン接種することが、それらのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子上に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能し、免疫系のＴ細胞アームを直接的に活性化するとの理解に基づいている。Ｈｕａｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、９６１−９６５、１９９４年）の結果は、腫瘍細胞をワクチン接種することではなく、宿主の専門的なＡＰＣが、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインを分泌することによって免疫系のＴ細胞アームを初回刺激し、それによって、骨髄由来のＡＰＣが腫瘍の領域に補充されることを示す。骨髄由来のＡＰＣは、プロセシングのために腫瘍の全細胞タンパク質を取り込み、次いで、それらのＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子上に抗原性ペプチドを提示し、それによって、免疫系のＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞アームを初回刺激して、全身性腫瘍特異的抗腫瘍免疫応答をもたらす。これらの結果は、抗癌免疫応答を誘発するために自己由来またはＭＨＣが一致する腫瘍細胞を使用することが必要ではないか、または最適ではない可能性があること、および同種異系ＭＨＣ遺伝子の（同じ種の遺伝的に異なる個体からの）導入が腫瘍の免疫原性を増強し得ることを示唆する。より具体的には、Ｊａｆｆｅｅら、前出、およびＨｕａｎｇら、前出によって概説されているように、特定の場合において、同種異系ＭＨＣクラスＩ分子を発現する腫瘍の拒絶は、改変されていない親の腫瘍を用いたその後のチャレンジに対して、全身性免疫応答の増強をもたらした。

本明細書に記載するように、「腫瘍細胞株」は、元々は腫瘍に由来する細胞を含む。このような細胞は、典型的には形質転換される（すなわち、培養中に無限の成長を示す）。１つの好ましい局面において、本発明は、以下の工程：（ａ）腫瘍細胞株を入手する工程；（ｂ）腫瘍細胞株を改変して細胞が抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカインを発現可能にする工程；（ｃ）改変した腫瘍細胞株を増殖不能にする工程；および（ｄ）腫瘍細胞株が入手源である腫瘍と同じ型である少なくとも１種の腫瘍を有する哺乳動物被験体（宿主）に腫瘍細胞株を投与する工程を実施することによって癌を処置する方法を提供する。投与される腫瘍細胞株は同種異系であり、宿主に対してＭＨＣが一致しない。このような同種異系株は、これらが前もって調製され、特徴付けされ、公知の数の導入遺伝子発現細胞を含むバイアル中でアリコートとされ、保存され（すなわち、凍結され）、その結果、十分に特徴付けされた細胞が患者への投与のために利用可能であるという利点を提供する。遺伝的に改変された同種異系細胞の産生のための方法は、例えばＷＯ００／７２６８６Ａ１に記載されている。

遺伝的に改変された同種異系細胞を調製するための１つのアプローチにおいて、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカインの２つ以上のコード配列が、同種異系腫瘍細胞株である（すなわち、処置される個体以外の個体に由来する）細胞株に導入される。別のアプローチにおいて、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカインの２つ以上のコード配列は、別々の同種異系腫瘍細胞株に導入される。腫瘍抗原は、遺伝子改変の前に、同種異系細胞株によって発現されてもよく、そして／または腫瘍抗原をコードする核酸は、遺伝子改変によって同種異系細胞株に導入されてもよい。一般に、同種異系細胞は、処置される腫瘍または癌と同じ型の腫瘍細胞株由来であり、その例は上記に提供される。

本発明の１つの局面において、同種異系腫瘍細胞集団は、その発現のために必要であるプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結された、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦの２つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターの導入によって改変される。別の局面において、自己由来細胞、バイスタンダー細胞または異なる同種異系腫瘍細胞集団を含む第２の細胞集団は、その発現のために必要であるプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結された、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列を含むベクターの導入によって改変される。腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインをコードするヌクレオチド配列は、同じかまたは異なるベクターを使用して、同じかまたは異なる自己由来細胞、同種異系細胞またはバイスタンダー細胞の集団に導入されてもよい。望ましくは、集団中の細胞は、高レベルのサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現する。

本発明を実施する際に、１種以上の遺伝的に改変された自己由来細胞株、同種異系細胞株またはバイスタンダー細胞株が、自己由来癌抗原、例えば自己由来腫瘍細胞の供給源（これは、同種異系細胞株組成物を一緒に含む）とともにインキュベートされ、その後患者に投与してもよい。典型的には、癌抗原は、処置下にある癌と同じ型の自己由来腫瘍細胞、すなわち同種異系癌細胞によって（同種異系癌細胞上に）提供される。このような場合において、本発明の組成物は、典型的には照射によって増殖不能にされ、ここで、遺伝的に改変された細胞および癌細胞は、組織培養プレートに配置され、以下に詳述されるように、Ｃｓ線源を使用して、室温で照射される。所定の投与における同種異系癌細胞に対する自己由来細胞の比率は、組み合わせに依存して変化する。

同種異系細胞株組成物を患者に導入するために、任意の適切な投与経路を使用することができ、好ましくは、本発明の組成物は、皮下、皮内または腫瘍内に投与される。

本発明を実施する際の同種異系細胞株の使用は、各患者のための自己由来腫瘍細胞を培養および形質導入する必要性をなくす。

バイスタンダー細胞
１つのさらなる局面において、本発明は、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカインの２つ以上を発現する、一般的な免疫調節的に遺伝的に改変されたバイスタンダー細胞を提供する。同じ一般的なバイスタンダー細胞株が、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカインの２つ以上を発現してもよく、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカインは、異なる一般的なバイスタンダー細胞株によって発現されてもよい。腫瘍抗原は、遺伝子改変の前にバイスタンダー細胞によって発現されてもよく、そして／または腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子改変によってバイスタンダー細胞に導入されてもよい。一般に、バイスタンダー細胞は、処置される腫瘍または癌と同じ型の腫瘍抗原を発現し、その例は上記に提供されている。

一般的なバイスタンダー細胞株は、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）抗原および主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）抗原を天然に欠いているか、またはこれらの細胞株がＭＨＣ−Ｉ抗原およびＭＨＣ−ＩＩ抗原を欠くように改変されているかのいずれかである細胞を含む。本発明の１つの局面において、一般的なバイスタンダー細胞株は、その発現のために必要であるプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結された、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦの２つ以上をコードする核酸配列を含むベクターの導入によって改変される。別の局面において、一般的なバイスタンダー細胞株は、その発現のために必要であるプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結された、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦの少なくとも１つをコードする核酸配列を含むベクターの導入によって改変され、同種異系細胞株、自己由来細胞株または第２の一般的バイスタンダー細胞株は、その発現のために必要であるプロモーターおよび発現／制御配列に作動可能に連結された、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦの核酸配列を含むベクターの導入によって改変され、次いで、２つの細胞組成物が、細胞ワクチンとして一緒に使用される。腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインをコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクターを使用して、同じかまたは異なる自己由来細胞、同種異系細胞またはバイスタンダー細胞の集団に導入されてもよい。

好ましい一般的バイスタンダー細胞株の例は、Ｋ５６２（（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３；Ｌｏｚｚｉｏら、Ｂｌｏｏｄ ４５（３）：３２１−３３４（１９７５年）；Ｋｌｅｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １８：４２１−４３１（１９７６年））である。ヒトバイスタンダー細胞株の生成の詳細な説明は、例えば、米国特許第６，４６４，９７３号に記載されている。

望ましくは、一般的バイスタンダー細胞株は、高レベルのサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦを発現する。

本発明を実施する際に、１種以上の一般的バイスタンダー細胞株は、自己由来癌抗原、例えば自己由来腫瘍細胞（これは、一般的バイスタンダー細胞株組成物を一緒に含む）とともにインキュベートされ、その後一般的バイスタンダー細胞株組成物を患者に投与してもよい。一般的バイスタンダー細胞株組成物を患者に導入するために、任意の適切な投与経路を使用することができる。好ましくは、本発明の組成物は、皮下、皮内または腫瘍内に投与される。

典型的には、癌抗原は、処置される癌の細胞、すなわち自己由来癌細胞によって（自己由来癌細胞上に）提供される。このような場合において、本発明の組成物は、照射によって増殖不能にされ、ここで、バイスタンダー細胞および癌細胞は組織培養プレートに配置され、以下に詳述されるように、Ｃｓ線源を使用して、室温で照射される。

所定の投与における同種異系癌細胞に対するバイスタンダー細胞の比率は、組み合わせに依存して変化する。ＧＭ−ＣＳＦ産生バイスタンダー細胞に関しては、所定の投与における自己由来癌細胞に対するバイスタンダー細胞の比率は、治療有効レベルのＧＭ−ＣＳＦが産生されるレベルであるべきである。ＧＭ−ＣＳＦの閾値に加えて、自己由来癌細胞に対するバイスタンダー細胞の比率は、１：１より大きくなるべきではない。腫瘍細胞または腫瘍抗原に対するバイスタンダー細胞の適切な比率は、当該分野において公知である慣用的な方法を使用して決定することができる。

本発明を実施する際のバイスタンダー細胞株の使用は、各患者のための自己由来腫瘍細胞を培養および形質導入する必要性をなくす。

本発明の癌免疫療法の一般的特徴
本発明の細胞ベースの癌免疫療法は、非修飾の腫瘍細胞、サイトカインおよび抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように修飾された腫瘍細胞または非腫瘍細胞、抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように修飾された腫瘍細胞または非腫瘍細胞、サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦなどを発現するように修飾された腫瘍細胞または非腫瘍細胞から選択される１つ以上の異なる細胞集団を含み得る。本発明の細胞ベースの癌免疫療法は、被験体への投与の前に増殖不能にされる。本明細書で使用される場合、「増殖不能」または「不活性化された」という用語は、複数ラウンドの有糸分裂を受けることが不可能であるが、サイトカイン、腫瘍抗原または抗原性タンパク質などのタンパク質を発現する能力をなお保持している細胞をいう。このことは、当業者に公知である多数の方法を通して達成されてもよい。被験体への投与の前に、本発明の細胞ベースの癌免疫療法は、典型的には、約５０〜約２００ラド／分、または約１２０〜約１４０ラド／分の線量で、被験体への投与の前に照射される。典型的には、照射を使用する場合に、必要とされる合計レベルは、２，５００ラド、５，０００ラド、１０，０００ラド、１５，０００ラド、または２０，０００ラドである。好ましくは、細胞は、実質的に１００％の細胞を、さらなる増殖から阻害するために十分な合計線量で照射される。

腫瘍抗原発現細胞集団またはサイトカイン発現細胞集団の細胞の数に対する、抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように修飾された細胞の数の比率は、約１：１００〜１００：１、２５：１〜１：２５、１：１０〜１０：１、または３：１〜１：３の間である。異なる集団が、同じ投与の経路および／またはほぼ同じ部位において送達され、同じかまたは異なる時点で送達されてもよい。本発明の１つの実施形態において、免疫療法は、複数のドナー／個体からの同種異系細胞の混合物を含む。

遺伝的に改変された細胞は、１回、２回、または複数回投与されてもよい。異なる細胞の集団を含む組成物について、典型的には、各集団の約１×１０^６〜１×１０^９細胞が使用される。１つの実施形態において、単位用量あたり１×１０^７〜１×１０^９の間のサイトカイン産生細胞が存在する。１つの実施形態において、１×１０^８〜５×１０^８の間で存在する。複数用量を用いると、第１の免疫化用量は、引き続く免疫化用量よりも高くてもよい。例えば、５×１０^８初回刺激用量に続き、数回の１×１０^８〜３×１０^８ブースター用量のＧＭ−ＣＳＦ産生細胞であり得る。本発明の１つの局面において、免疫療法の遺伝的に改変された細胞が調製され、想定される処置の全過程のために十分な細胞を提供するように組み合わせて一括化される。この混合物を凍結して保存し、各投与のためにアリコートを順次解凍する。

本発明の１つの実施形態において、癌免疫療法は、百万個の細胞につき２４時間あたりに少なくとも５００ｎｇまたは少なくとも３６ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを発現する細胞を含む。１つの実施形態において、癌免疫療法は、百万個の細胞につき２４時間あたりに少なくとも１０００ｎｇのＧＭ−ＣＳＦを発現する細胞を含む。しばしば、使用されるサイトカイン産生細胞の実際の数よりも重要なことは、細胞の生物合成能力、例えば時間とともに産生されるサイトカイン、抗ＣＴＬＡ４抗体または腫瘍抗原の量である。従って、生合成能力が高い場合、必要とされる細胞は少ない。本発明の実施形態には、生理学的条件下で、１時間のインキュベーションの間に、少なくとも約０．１ｎｇ、約０．５ｎｇ、少なくとも約２ｎｇ、または少なくとも約１０ｎｇの目的のサイトカインを合成することが可能である免疫療法の用量が含まれるが、これに限定されない。最適な細胞投薬量および比率の決定は、以下の実施例の節において記載されるように、慣用的な決定の問題であり、本明細書に提供される指示に鑑みて、当業者の技術の範囲内である。

典型的には、培養後、遺伝的に改変された本発明の細胞は、癌免疫療法としてのそれらの使用の前に、細胞を調製する際に使用される大部分の付加的な成分を除去するために処理される。特に、ウシ胎仔血清、ウシ血清成分、または培養培地中の他の生物学的補充物が除去される。１つの実施形態において、例えば、反復的な穏やかな遠心分離によって、細胞は、適切な薬理学的に適合可能な賦形剤へと洗浄される。適合可能な賦形剤には、リン酸またはＨｅｐｅｓのような生理学的に適合性である緩衝液、およびデキストロースのような栄養素、生理学的に適合可能なイオン、またはアミノ酸、および種々の培養培地、特に、他の免疫原性成分を欠いている培地を含むかまたは含まない、等張性生理食塩水が含まれる。キャリア試薬、例えばアルブミンおよび血漿画分および非活性増粘剤もまた、使用されてもよい。１つの実施形態において、非活性生物学的成分は、薬理学的調製物中に存在する限り、ヒト由来であり、処置される被験体から事前に入手されていてもよい。

本発明の遺伝的に改変された細胞組成物は、１つ以上の癌免疫療法として被験体に投与することによって、被験体における癌を処置するために使用することができる。本発明の薬学的組成物はまた、例えば、生理食塩水溶液、硫酸プロタミン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｊ．）、水、リン酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液などの水系緩衝液、またはポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、または局在化剤、例えばカルシトニンゲル、ヒアルロナン溶液、またはトロンビンによるフィブリノーゲンの活性化に由来するフィブリン栓（米国特許第６，１１７，４２５号）などの許容される薬学的キャリアとともに投与されてもよい。適切な薬学的キャリアの選択は、本明細書に含まれる教示から、当業者に明らかであるとみなされる。

本発明の薬学的組成物は、被験体における免疫応答を生成することおよび癌を処置することに関連する他の治療の後、その前、その代わりに与えられても、またはこれらと組み合わせて与えられてもよい。例えば、被験体は、本発明の細胞組成物を使用して、処置下にある癌の型を処置するために一般的に使用される処置様式を使用して、先または同時に、化学療法、放射線療法および他の型の免疫療法によって処置されてもよい。例えば、本発明の組成物は、シスプラチンのような化学療法剤との組み合わせ、シスプラチン／シクロホスファミド、タキソールまたはシスプラチン／シクロホスファミド／ドキソルビシン、免疫調節剤、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＮＦ−α、ＣｐＧ配列、イニキモッド（Ｉｎｉｑｕｉｍｏｄ）または抗ＣＴＬＡ４抗体などと組み合わせて使用されてもよい。このような様式が使用される場合、これらは、本発明の組成物の効力と干渉しない方法または時点で使用される。

サイトカイン
細胞ベースの癌免疫療法は、１つ以上のサイトカインのコード配列を含んでもよい。「サイトカイン」は、非限定的に、局所的に作用して血液中を循環せず、本発明に従って使用される場合、個体の免疫応答の変化をもたらすホルモンを含む。典型的には、サイトカインはヒトサイトカインである。

本発明の細胞ベースの癌免疫療法によって発現され得るサイトカインには以下が含まれるが、これらに限定されない：ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−２９、特に、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＭＩＰ３ａ、ＩＣＡＭ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）。１つの好ましい実施形態において、サイトカインはＧＭ−ＣＳＦであり、細胞ベースの免疫療法はＧＶＡＸ（登録商標）の形態である。

腫瘍抗原
本発明の細胞ベースの癌免疫療法において、少なくとも１つの腫瘍抗原が発現される。この腫瘍抗原は、遺伝子改変の前に、自己由来細胞、同種異系細胞またはバイスタンダー細胞集団によってか、または腫瘍抗原をコードするベクターからのネイティブなコード配列の発現によって発現させることができる。本発明を実施する際の目的の腫瘍抗原は、処置下にある癌と関連し、免疫応答の増強が所望される腫瘍抗原である。本発明の組成物および方法を使用する処置のための例示的な癌標的には以下が含まれるが、これらに限定されない：膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膵臓癌、直腸癌、前立腺癌、胃癌、表皮癌；リンパまたは骨髄細胞系列の造血器腫瘍；線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍；黒色腫、奇形癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、腺癌、および非小細胞肺癌などの他の腫瘍型。処置される腫瘍細胞の型が前立腺癌である場合、前立腺腫瘍細胞株は、ＤＵ１４５、ＰＣ−３およびＬｎＣａＰからなる群より選択されてもよい。

例示的な腫瘍抗原コード配列には、以下からの免疫原性配列が含まれるが、これらに限定されない：ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００（ｐｍｅｌ−１７）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質２、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、βカテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ８、ＫＩＡ ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２Ｒ１７０１、ａ−フェトタンパク質、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、癌胎児タンパク質（ＣＥＡ）、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、テロメラーゼ逆転写酵素、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、Ｂ細胞リンパ腫のＩｇイディオタイプ、黒色腫の変異型サイクリン依存性キナーゼ４、Ｐｍｅｌ−１７（ｇｐ １００）、ＰＳＭＡ、黒色腫のｐ１５タンパク質、黒色腫のｇｐ７５、黒色腫の腫瘍胎児抗原；黒色腫のＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド；癌腫の変異型ｐ５３などの腫瘍遺伝子、結腸癌の変異型ｒａｓ、ならびに頚部および食道の扁平上皮癌のヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物。

１つの実施形態において、腫瘍細胞は、腫瘍を有する哺乳動物、例えばヒト由来である。

抗ＣＴＬＡ４抗体
ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）は、種々のモデル系において、抗原提示細胞上のＢ７分子（ＡＰＣ：Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６））との相互作用によって、Ｔ細胞活性化をネガティブに調節する、Ｔ細胞によって発現される免疫調節分子である（例えば、Ｋｏｒｍａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ６：５８２−５９１（２００５年）を参照のこと）。ＣＴＬＡ４ノックアウトマウスは、４週間未満で死亡をもたらす大量のリンパ球増殖を示す。ＣＴＬＡ４は広範に研究されてきたが、Ｔ細胞増殖を減少させる際のその作用の機序は完全に理解されてはいない。この機序には、ＡＰＣおよびＴ細胞界面におけるＢ７リガンドの競合；ＩＬ−２をダウンレギュレートするシグナル伝達事象；ＡＰＣによるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの誘導；およびネガティブ調節サイトカインの誘導が含まれると考えられている。

従って、抗ＣＴＬＡ４抗体は、単独療法としての治療的利点を有し得るが、臨床的状況において効力を観察するために必要である抗ＣＴＬＡ４抗体の全身レベルは、最大耐量の近傍であり、関連する毒性を有することが報告されてきた（例えば、Ｋｏｒｍａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ６：５８２−５９１（２００５年）を参照のこと）。それゆえに、等価な効力を有する抗ＣＴＬＡ４抗体のより低い全身レベルを可能にすることによって、潜在的な関連毒性の克服を可能にする組成物を開発する必要性が存在する。

免疫グロブリンおよびその断片
抗体は、重鎖および軽鎖のヘテロ二量体である免疫グロブリンタンパク質であり、哺乳動物培養発現系において単一のベクターから全長で発現させることは困難であることが判明している。３つの方法が、脊椎動物抗体の産生のために現在使用されている。「ポリクローナル」抗体を産生するための動物のインビボ免疫化、モノクローナル抗体を産生するためのＢ細胞ハイブリドーマのインビトロ細胞培養（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１、１９７６；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）、および組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第６，３３１，４１５号に記載されている）である。

免疫グロブリンポリペプチドの基本分子構造は、約２３，０００ダルトンの分子量を有する２つの同一の軽鎖、および５３，０００〜７０，０００の分子量を有する２つの同一の重鎖を含み、ここで、４つの鎖がジスルフィド結合によって結合され、「Ｙ」配置をとることが周知である。アミノ酸配列は、Ｙの上端のＮ末端から、各鎖の底部のＣ末端まで連続している。Ｎ末端には、抗原結合の特異性を提供する可変領域（約１００アミノ酸長）がある。

ベクターは、すべての型の抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリンの産生を可能にし、これには以下が含まれるが、これらに限定されない：ネイティブ配列（すなわち、抗原による刺激に応答して産生される配列）を有する全長抗体および抗体断片、単一の安定的に折りたたまれたポリペプチド鎖の中の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合可変領域を合わせた一本鎖抗体；一価抗体（これは、第２の重鎖のＦｃ領域に結合した重鎖／軽鎖二量体を含む）；免疫グロブリン分子の全「Ｙ」領域、すなわち「Ｙ」の分枝、軽鎖もしくは重鎖いずれか単独またはその一部を含む「Ｆａｂ断片」（すなわち、１つの重鎖および１つの軽鎖の集合体、一般には、Ｆａｂ’として知られる）；２つ以上の異なる抗原についての特異性を有する「ハイブリッド免疫グロブリン」（例えば、米国特許第６，６２３，９４０号において記載されているような、クアドローマまたは二重特異性抗体）；重鎖および軽鎖が異なる種または特異性の鎖を模倣する「複合免疫グロブリン」；ならびに重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の各々の部分が２つ以上の種から誘導される（すなわち、可変領域がマウス抗体などの１つの供給源に由来するが、定常領域がヒト抗体などの別の供給源に由来する）「キメラ抗体」。

ベクターは、抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリンまたはその断片の産生において有用であり、ここで、重鎖または軽鎖は「哺乳動物性」であるか、「キメラ」であるか、またはその効力を増強するように改変されている。改変された抗体は、非改変型と同じ生物活性を保持しているアミノ酸とヌクレオチドの両方の配列改変体、および活性が変化するように改変されているもの（すなわち、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能を改善する定常領域の変化、ならびに抗原結合特性を改善する可変領域の変化）を含む。本発明の組成物および方法は、触媒性免疫グロブリンまたはその断片をさらに含む。

「改変体」免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列は、参照ポリペプチド配列から１つ以上のアミノ酸が変化している「改変体」抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし得る。改変体ポリヌクレオチド配列は、「保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードしてもよく、ここで、置換アミノ酸は、これが置き換えるアミノ酸と類似した構造特性または化学特性を有する。さらに、または代替的に、改変体ポリヌクレオチド配列は、「非保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードしてもよく、ここで、置換アミノ酸は、これが置き換えるアミノ酸とは異なる構造特性または化学特性を有する。改変体抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリンコードポリヌクレオチドはまた、アミノ酸の挿入、または欠失、またはその両方を含む改変体アミノ酸配列をコードしてもよい。さらに、改変体抗ＣＴＬＡ−４免疫グロブリンコードポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と同じポリペプチドをコードしてもよいが、遺伝暗号の縮重に起因して、参照ポリヌクレオチド配列から１つ以上の塩基が変化しているポリヌクレオチド配列を有する。

「断片」という用語は、本発明の組換え抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリンに言及する場合、対応する全長タンパク質と本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているか、対応する全長タンパク質の機能または活性の少なくとも１つを保持しているかのいずれかである、対応する全長免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸配列の全部ではないが一部と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。断片は、好ましくは、全長免疫グロブリンの連続するアミノ酸残基を少なくとも２０〜１００個含む。

好ましい実施形態において、２つ以上のコード配列の発現および送達を可能にする免疫グロブリン発現系、すなわち、単一のベクター由来の二重特異性または多重特異性を有する免疫グロブリンが使用される。この免疫グロブリン発現系は、任意の抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリン（すなわち、抗体）またはその断片に適用可能であり、これには、本明細書中でさらに詳述するように、操作された抗体、例えば一本鎖抗体、全長抗体または抗体断片が含まれる。

免疫グロブリン発現系は、単一の制御プロモーターを使用する抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の発現に依存し、ここで、重鎖および軽鎖は、実質的に等しい比率で発現される。ポリタンパク質の型でのタンパク質の結合は、ピコルナウイルスを含む多くのウイルスの複製において採用されているストラテジーである。翻訳に際して、ウイルスがコードする自己プロセシングペプチドが、ポリタンパク質の迅速な分子内（シス）切断を媒介して別個の成熟タンパク質産物を生じ、タンパク質分解的切断部位におけるその後の切断が、残っている自己プロセシング配列の大部分を除去する。免疫グロブリン発現系は、単一の制御プロモーターを使用する免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のコード配列の発現を容易にし、ここで、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のコード配列が実質的に等モル比で発現される自己プロセシングペプチド（本明細書では２Ａペプチドによって例示される）を含む組換え免疫グロブリンの発現のためのベクターが提供されるという点で、ＩＲＥＳの使用を超えた利点を提供する。実質的に等モル比での抗ＣＴＬＡ４重鎖および抗ＣＴＬＡ４軽鎖の発現は、例えば、ウェスタンブロット分析によって示されてもよく、ここで、重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体または抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を使用してプローブされ、製造業者の指示書に従って市販のキットを使用して可視化される。

自己プロセシング切断部位または配列
先に定義した「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列をいい、ここで、翻訳の際に、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの迅速な分子内（シス）切断が起こり、別個の成熟タンパク質産物を生じる。このような「自己プロセシング切断部位」はまた、２Ａ部位、２Ａ配列または２Ａドメインによって本明細書に例示される、翻訳後または翻訳と同時にプロセシングを行う切断部位とも呼ばれる。２Ａ部位、配列またはドメインは、リボソームの活性を修飾してエステル結合の加水分解を促進することによって翻訳効果を示し、それによって、別個の下流の翻訳産物の合成が進行することを可能にする様式で、翻訳複合体からポリペプチドを遊離する（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ、２００１年）。あるいは、２Ａ部位または２Ａドメインは、それ自体のＣ末端をシスで切断することによって「自己タンパク質分解」または「切断」を示し、一次切断産物を産生する（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０年））。

２Ａの活性は、ペプチド結合の形成を妨害するコドン間のリボソームのスキッピングを伴い得るが（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１９２１−１９３１（２０００年）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３−１０２５（２００１年））、このドメインはむしろ自己分解酵素のように作用すると考えられてきた（Ｒｙａｎら、Ｖｉｒｏｌ．１７３：３５−４５（１９８９年））。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域を発現ベクターにクローニングし、標的細胞にトランスフェクトする研究によって、人工レポーターポリタンパク質のＦＭＤＶ ２Ａ切断が、広範な異種発現系において効率的であることが確立された（コムギ胚芽ライセートおよびトランスジェニックタバコ（Ｈａｌｐｉｎら、米国特許第５，８４６，７６７号（１９９８年）およびＨａｌｐｉｎら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １７：４５３−４５９（１９９９年））；Ｈｓ ６８３ヒトグリオーマ細胞株（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１９８−２０８（１９９９年）；本明細書以後では「ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ＩＩ」と称する）；ウサギ網状赤血球ライセートおよびヒトＨＴＫ−１４３細胞（Ｒｙａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：９２８−９３３（１９９４年））；および昆虫細胞（Ｒｏｏｓｉｅｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１７０３−１７１１（１９９０年）））。異種ポリタンパク質のＦＭＤＶ ２Ａ媒介切断は、ＩＬ−１２について示されてきた（ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体；Ｃｈａｐｌｉｎら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９：２３５−２４１（１９９９年））。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞において、ＦＭＤＶ ２Ａは、ｐ４０−２Ａ−ｐ３５ポリタンパク質の、ＩＬ−１２と関連する活性を有する生物学的に機能的なサブユニットｐ４０およびｐ３５への切断を媒介した。

ＦＭＤＶ ２Ａ配列は、レトロウイルスベクターに、単独か、または様々なＩＲＥＳ配列と組み合わせて組み込まれ、バイシストロン性、トリシストロン性およびテトラシストロン性のベクターを構築した。動物における２Ａ媒介遺伝子発現の効率は、ａ−シヌクレインおよびＥＧＦＰ、またはＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）およびＦＭＤＶ ２Ａ配列によって連結しているＥＧＦＰをコードする組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｆｕｒｌｅｒ（２００１年）によって実証された。ＥＧＦＰおよびａ−シヌクレインは、対応するＩＲＥＳベースのベクターと比較して、２Ａ配列を含んだベクターから実質的に高いレベルで発現されたのに対して、ＳＯＤ−１は、匹敵するかわずかに高いレベルで発現された。Ｆｕｒｌｅｒはまた、ラット黒質への２Ａ含有ＡＡＶベクターの注射後、２Ａ配列が、インビボでのバイシストロン性遺伝子発現をもたらすことを示した。近年、２Ａペプチドおよび２Ａ様配列は、レトロウイルスベクターを使用する４つのシストロンの効率的な翻訳において有効であることが実証された（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年５月２２日（５）：５８９−９４）。

自己プロセシング切断部位をコードするＤＮＡ配列は、エンテロウイルス、ライノウイルス、カーディオウイルス、アフトウイルスまたは口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）を含むが、これらに限定されない、ピコルナウイルスに由来するウイルス配列によって例示される。好ましい実施形態において、自己プロセシング切断部位コード配列は、ＦＭＤＶに由来する。自己プロセシング切断部位には、２Ａドメインおよび２Ａ様ドメインが含まれるが、これらに限定されない（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１年）。

ＦＭＤＶ ２Ａは、ＦＭＤＶゲノム中で、それ自体のＣ末端において単一の切断を指示するように機能し、従って、シスで機能するポリタンパク質領域である。ＦＭＤＶ ２Ａドメインは、典型的には、約１９アミノ酸長であるように報告されているが（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号１）；（ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号２；Ｒｙａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２７２７−２７３２（１９９１年））、１４個の短いアミノ酸残基のオリゴペプチド（ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号３）は、ネイティブなＦＭＤＶポリタンパク質プロセシングにおけるその役割と類似の様式で、２ＡのＣ末端において切断を媒介することが示されてきた。

２Ａ配列のバリエーションは、ポリタンパク質の効率的なプロセシングを媒介するそれらの能力について研究されてきた（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ＭＬら、２００１年）。２Ａ配列のホモログおよび改変体が、本発明の範囲内に含まれ、限定されないが、以下の表１に提示する配列が挙げられる。

表１．例示的な２Ａ配列の表

２Ａコード配列の小さなサイズは、ＡＡＶなどのコード配列について、限定されたパッケージング能を有するベクターにおけるその使用をさらに可能にする。２Ａ配列は２つのプロモーターの必要性を排除するので、ＡＡＶベクターの有用性はさらに拡大され得る。２Ａとともに３つ以上のコード配列を含む単一のオープンリーディングフレームを駆動するプロモーターからの個々のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現レベルは、ＩＲＥＳ配列または２つのプロモーターを使用して達成可能である発現レベルと比較した場合に、等モルに近づいている。２つのプロモーターの排除はまた、各コード配列についての発現のレベルの減少および／または低下をもたらし得るプロモーター干渉を減少させる。

１つの好ましい実施形態において、本発明によるベクターに含まれるＦＭＤＶ ２Ａ配列は、ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）を含むアミノ酸残基をコードする。あるいは、本発明によるベクターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１年）において説明されているような他の２Ａ様領域のアミノ酸残基をコードし得、これには、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列または細菌のＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａからの２Ａ様ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

自己プロセシングペプチド配列の除去
２Ａ配列または２Ａ様配列などの自己プロセシングペプチドの使用に関連する１つの懸念は、第１の抗ＣＴＬＡ４抗体鎖のＮ末端が、自己プロセシングペプチドに由来するアミノ酸、すなわち２Ａ由来のアミノ酸残基を含むことである。これらのアミノ酸残基は、宿主に対して「異種」であり、組換えタンパク質が発現され、またはインビボで送達されるときに（すなわち、遺伝子治療の状況においてウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターから発現されるか、またはインビトロ産生された組換えタンパク質として投与されるときに）、免疫応答を誘発し得る。さらに、除去されない場合、２Ａ由来のアミノ酸残基は、サイトカイン発現腫瘍細胞におけるタンパク質分泌に干渉し、そして／またはタンパク質構造を変化させ、抗ＣＴＬＡ４抗体の最適よりも少ない発現レベルおよび／もしくは生物活性の減少をもたらす可能性がある。免疫グロブリン発現系は、切断後に残っている自己プロセシング切断部位由来のアミノ酸残基を除去するための手段として、タンパク質分解的切断部位がポリペプチドコード配列と自己プロセシング切断部位（例えば、２Ａ配列）との間に提供されるように操作された遺伝子発現構築物を含む。

タンパク質分解的切断部位の例は、タンパク質分泌経路の中のフリンおよび他のセリンプロテアーゼなどの内因性サブチリシン様プロテアーゼによって切断可能である、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有するフリン切断部位である。ＵＳＳＮ １０／８３１３０２に示されるように、第１のタンパク質のＮ末端における２Ａ残基は、第１のタンパク質と２Ａ配列との間にフリン切断部位ＲＡＫＲ（配列番号１５）を導入することによって効率的に除去することができる。さらに、２Ａ配列および２Ａ部位に隣接したフリン切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドの使用は、２Ａ配列を単独で含むプラスミドよりも高いレベルのタンパク質発現をもたらすことが示された。この改善は、２Ａ残基がタンパク質のＮ末端から除去され、より長い２Ａ配列または２Ａ様配列または他の自己プロセシング配列が使用可能であるという点で、さらなる利点を提供する。２Ａ配列または２Ａ様配列などの、このようなより長い自己プロセシング配列は、単一のプロモーターによって２つ以上のポリペプチドのより良好な等モル発現を容易にする可能性がある。

完全なヒトの特徴を有する抗ＣＴＬＡ４抗体またはそのアナログを使用することが有利である。これらの試薬は、非ヒト種由来の抗体またはアナログによって誘導される望ましくない免疫応答を回避する。自己プロセシングペプチドに由来するアミノ酸残基に対して起こり得る宿主免疫応答に対処するために、タンパク質分解的切断部位のコード配列を、発現したポリペプチド、すなわち抗体から自己プロセシングペプチド配列を除去するために第１のタンパク質のコード配列と自己プロセシングペプチドのコード配列との間に挿入してもよい（当該分野において公知である標準的な方法論を使用する）。このことは、インビボで使用するための治療用または診断用の抗体において特に有用である。

組換えＤＮＡ技術のベクターを使用して発現可能である当該分野において公知である任意の付加的なタンパク質分解的切断部位が、本発明の実施の際に使用されてもよい。抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖または軽鎖と、自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ配列など）との間に挿入可能である、例示的な付加的なタンパク質分解的切断部位には以下が含まれるが、これらに限定されない：
ａ）フリン切断部位：ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）；
ｂ）ファクターＸａ切断部位：ＩＥ（Ｄ）ＧＲ（配列番号１２）；
ｃ）シグナルペプチダーゼＩ切断部位：例えば、ＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号１３）；および
ｄ）トロンビン切断部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１４）。

２Ａペプチド配列は、翻訳プロセスの間に抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリンの両方の鎖の生成を容易にする「切断」部位を提供する。１つの局面において、抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリン重鎖のＣ末端は、２Ａ配列それ自体に由来する約１３アミノ酸残基を含む。残存するアミノ酸の数は、使用する２Ａ配列に依存する。フリン切断部位配列、例えばＲＡＫＲが第１のタンパク質と２Ａ配列との間に挿入される場合、２Ａ残基は第１のタンパク質のＣ末端から除去される。しかし、質量スペクトルデータは、ＲＡＫＲ−２Ａ構築物から発現される抗体重鎖のＣ末端がフリン切断部位ＲＡＫＲに由来する２個の付加的なアミノ酸残基ＲＡを含むことを示している。

これらの残存するアミノ酸は、例えばカルボキシペプチダーゼを使用して除去される可能性がある。フリンの切断は、コンセンサス配列ＲＸＲ（Ｋ）Ｒ（配列番号１６）を有する切断部位のＣ末端で起こり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。１つの局面において、本発明は、カルボキシペプチダーゼＤ、ＥおよびＨ（ＣＰＤ、ＣＰＥ、ＣＰＨ）を含むカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）と呼ばれる酵素の群から選択される酵素の使用によって、タンパク質のＣ末端からの新たに露出した塩基性アミノ酸残基ＲまたはＫの除去のための手段を提供する。ＣＰはタンパク質のＣ末端の塩基性アミノ酸残基を除去可能であるので、ＲＫＫＲ（配列番号１７）、ＲＫＲＲ（配列番号１８）、ＲＲＫＲ（配列番号１９）、ＲＲＲＲ（配列番号２０）などのような塩基性アミノ酸のみを含むフリン切断部位に由来するすべてのアミノ酸残基が、ＣＰによって除去可能である。２Ａ配列およびフリン切断部位を含み、Ｃ末端に塩基性アミノ酸残基を有する抗ＣＴＬＡ４免疫グロブリン発現構築物が、切断および残基の除去の効率を評価するために構築されてもよい。例示的な構築物の設計は以下の通りである：Ｈ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ、ＲＫＲＲ、ＲＲＫＲまたはＲＲＲＲ）−２Ａ−Ｌ鎖またはＬ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ、ＲＫＲＲ、ＲＲＫＲまたはＲＲＲＲ）−２Ａ−Ｈ鎖。

当業者には明らかであるように、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖のＣ末端には塩基性アミノ酸残基（Ｋ）が存在する（カルボキシペプチダーゼを用いる切断を受けるようにする）のに対して、免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖は、非塩基性アミノ酸Ｃが末端である。

配列改変体
本発明の１つの実施形態において、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインをコードするヌクレオチド配列は、ネイティブタンパク質のネイティブ配列、その生物学的に活性な断片または免疫原性の断片である。さらに、コード配列は、「再コード化」されてもよい。「再コード化」される遺伝子は、核酸によってコードされたポリペプチドは変更されていない配列と同じままであるが、ポリペプチドをコードする核酸配列は変化しているように、変更されたコード配列をいう。遺伝暗号の縮重に起因して、同じアミノ酸翻訳産物をコードし得る複数のＤＮＡコドンおよびＲＮＡコドンが存在することが、当該分野において公知である。さらに、アミノ酸を合成するために、異なる生物が、特定のコドンの利用について異なる優先度を有することもまた公知である。

腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインの生物学的に活性な型または免疫原性型をコードする配列改変体を含む、遺伝的に改変された細胞もまた、本発明の範囲内に含まれる。

本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、配列アラインメントプログラムを使用して整列したときに、２つ以上の整列した配列中での核酸またはアミノ酸配列の同一性を意味する。「相同性％」という用語は、本明細書中の「同一性％」という用語と本明細書中で交換可能に使用され、配列アラインメントプログラムを使用して整列したときに、２つ以上の整列した配列間の核酸またはアミノ酸の配列の同一性のレベルをいう。例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性は、規定されたアルゴリズムによって決定される８０％の配列同一性と同じことを意味し、従って、所定の配列のホモログは、所定の配列の長さにわたって、８０％よりも高い配列同一性を有する。

比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）のローカルホモロジーアルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８年）の同一性法によってか、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施によってか（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）によってか、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能であるソフトウェアを用いてか、または目視検査によって（一般には、Ａｕｓｕｂｅｌら、下記を参照のこと）、行うことができる。本発明の目的のために、比較のための最適な配列のアラインメントは、最も好ましくは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）のローカルホモロジーアルゴリズムによって行われる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年もまた参照のこと。

「同一」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸配列またはタンパク質配列について、本明細書に記載される配列比較アルゴリズムの１つ、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムまたは目視検査を使用して測定される場合、最大限の一致のために比較および整列されるとき、同一であるか、または同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する２つ以上の配列または部分配列をいう。

本発明に従って、ネイティブ配列に対して、８０％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはサイトカインをコードする配列改変体もまた、含まれる。

核酸配列は、２つの配列が中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると見なされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの溶融温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃下）で起こり；「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃下で起こり；「中程度のストリンジェンシー」はプローブのＴｍの約１０〜２０℃下で起こり；「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃下で起こる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件が、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使用されてもよいのに対して；高ストリンジェンシー条件は、プローブとの約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために使用される。

中程度のストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、第９章および第１１章、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９３年を参照のこと）。高ストリンジェンシー条件の例には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中の約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、２×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ中の室温での２回の洗浄、ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ中の４２℃でのさらなる２回の洗浄が含まれる。本明細書で使用される場合、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインのヌクレオチドコード配列には、本明細書に記載される腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインのポリペプチドと同じ生物活性を有し、中程度のストリンジェンシーから高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするポリペプチドをコードする配列改変体が含まれ、これは本発明の範囲内にあると見なされる。

遺伝暗号の縮重の結果として、同じ腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインのポリペプチドをコードする多数のコード配列が、産生され得る。例えば、トリプレットＣＧＴはアミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、あるいは、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧによってコードされる。それゆえに、コード領域におけるこのような置換は、本発明によって網羅される配列改変体の中に含まれることが認識される。

このような配列改変体は、高ストリンジェンシーの条件下で親の配列にハイブリダイズしてもよいし、ハイブリダイズしなくてもよいことがさらに理解される。このことは、例えば、配列改変体が、親のヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の各々について、異なるコドンを含む場合に起こり得る。このような改変体は、それにも関わらず、本発明によって明確に意図され、本発明によって包含される。

細胞への導入遺伝子の導入
腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインのコード配列は、細胞による発現をもたらすために有効である任意の方法を使用して、細胞に導入されてもよい。典型的には、目的のコード配列を含むベクターは、当業者によって慣用的に使用される慣用的な分子生物学的技術を使用して調製される。

本発明は、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはサイトカインのコード配列の細胞への導入のための任意の利用可能なベクターの使用を意図する。例示的なベクターには、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

ウイルスベクター粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞に導入する目的のために利用されてもよい。ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの多数の型が、当該分野で公知である。本発明を実施するために使用され得る例示的なベクターには以下が含まれるが、これらに限定されない：例えば、ＭｏＭＬＶ、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来）；レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来））；ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ）、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター、パピローマウイルスベクター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）ベクター、シンドビスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、ファージベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、複製成分を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、その複製欠損型および脆弱型、バキュロウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ならびに非ウイルスプラスミドベクター。

腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインの発現のためのベクターおよび構築物は、標準的な方法論を使用して細胞に導入されてもよい。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は、当業者に周知である。「形質導入」という用語は、感染、内在化、トランスフェクション、または任意の他の手段によって、インビボまたはインビトロのいずれかで、レシピエント細胞へ核酸分子を送達することをいう。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃を含む、当該分野において公知である種々の手段によって達成されてもよい。Ｇｒａｈａｍら、（１９７３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら、（１９８６年）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ １３：１９７、１９８１年を参照のこと。このような技術は、プラスミドベクターおよび他の核酸分子などの１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を、適切な宿主細胞に導入するために使用できる。この用語は、遺伝物質の安定的な取り込みと一過性の取り込みの両方をいう。

本発明を実施する際に利用されるベクターは、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンテターゼ、またはＡＤＡなどの選択可能なマーカーを必要に応じてコードしてもよく、続いて、適切な薬物の存在下での選択およびクローンの単離を行う。２つ以上のベクターを使用して、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体のコード配列を細胞に導入し得る。本発明は、形質導入のための任意の連続的な順序に限定されない。換言すれば、２つ以上のベクターは、細胞に形質導入するために、本質的に同時かまたは任意の順序で連続して使用されてもよい。

腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体またはサイトカインの２つ以上のコード配列が単一のベクターを使用して細胞に導入される場合、コード配列は、例えば、ＵＳ０４／１２７９３およびＵＳ０４／１２８０７に記載されるように、別個のプロモーターの制御下におかれるか、同じプロモーターに作動可能に連結されて、ＩＲＥＳ、２Ａ、または２Ａ様配列の翻訳制御下におかれてもよい。

ＡＡＶベクター
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、ヘルパー依存性ヒトパルボウイルスである。ＡＡＶベクターは、非病原性性質、優れた臨床的安全性プロフィール、および有意な量の導入遺伝子発現をインビボで指示する能力に起因して、遺伝子導入ベクターとしての顕著な潜在能力を有する。組換えＡＡＶベクターは、これらが、標的化された細胞における選択された導入遺伝子産物の発現および産生を指示することが可能であるという点に特徴を有する。従って、組換えベクターは、キャプシド形成のために必須であるＡＡＶの配列のすべておよび標的細胞の感染のための物理的構造を、少なくとも含む。ウイルス粒子に組み込まれたＡＡＶウイルスベクターを用いる細胞の感染は、典型的には、宿主細胞ゲノムへのウイルスベクターの組み込みをもたらす。それゆえに、ＡＡＶベクターは、細胞からの長期的な発現のための潜在能力、および細胞分裂の結果である「娘細胞」を提供する。

本発明を実施する際に使用される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、当業者に公知である標準的な方法論を使用して産生されてもよく、これらは、転写の方向において作動可能に連結される成分として、転写開始配列および終結配列を含む制御配列、ならびに導入遺伝子のコード配列を含むように構築される。これらの成分は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって、５’および３’末端上で結合される。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」は、ＡＡＶビリオンの放出、複製およびパッケージングのために、意図されるようにＩＴＲ配列が機能することを意味する。それゆえに、本発明のベクターにおける使用のためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変更されてもよく、またはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかから誘導されてもよい。ＡＡＶベクターは、アデノ関連ウイルス血清型から誘導されたベクターであり、そのアデノ関連ウイルス血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、全体としてかまたは部分的に欠失した野生型ＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子を有するが、機能的な隣接するＩＴＲ配列を保持している。

典型的には、ＡＡＶ発現ベクターは、産生細胞に導入され、続いてＡＡＶヘルパー構築物の導入が行われ、ここで、このヘルパー構築物は、産生細胞で発現可能であるＡＡＶコード領域を含み、これがＡＡＶベクター中に存在しないＡＡＶヘルパー機能を補う。このヘルパー構築物は、米国特許第６，５４８，２８６号に記載されるように、典型的には、ｐ５の後の開始コドンをＡＴＧからＡＣＧに変異させることによって、巨大ＲＥＰタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現をダウンレギュレートするように設計されてもよい。これに続いて、産生細胞へのヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターの導入を行い、ここで、ヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターは、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支援することができる補助的機能を提供する。次いで、産生細胞は、ｒＡＡＶを産生するために培養される。これらの工程は、標準的な方法論を使用して実施される。本発明の組換えＡＡＶベクターを封入している複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を使用する、当該分野において公知である標準的な技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号；同第５，７５３，５００号；同第６，０４０，１８３号；同第６，０９３，５７０号；および同第６，５４８，２８６号において見出され得る。パッケージングのためのさらなる組成物および方法は、Ｗａｎｇら（ＵＳ２００２／０１６８３４２）において記載され、当業者の知識の範囲内にあるものが含まれる。

約４０種のＡＡＶの血清型が現在公知であるが、新規な血清型および既存の血清型の改変体が、今日でも同定されており、本発明の範囲内にあると見なされている。Ｇａｏら（２００２年）、ＰＮＡＳ ９９（１８）：１１８５４ ６；Ｇａｏら（２００３年）、ＰＮＡＳ １００（１０）：６０８１ ６；ＢｏｓｓｉｓおよびＣｈｉｏｒｉｎｉ（２００３年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１２）：６７９９ ８１０を参照のこと。異なるＡＡＶ血清型が、特定の標的細胞の形質導入を最適化するため、および特定の標的組織の中での特定の細胞型を標的化するために使用される。特定のＡＡＶ血清型は、標的組織または細胞内でより効率的に標的化および／または複製し得る。単一の自己相補的ＡＡＶベクターは、形質導入効率を増大させ、結果として導入遺伝子発現の開始を早めるために、本発明を実施する際に使用することができる（ＭｃＣａｒｔｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１年８月；８（１６）：１２４８ ５４）。

ｒＡＡＶビリオンを産生するための適切な宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、微生物細胞、および酵母が含まれる。宿主細胞はまた、ＡＡＶのＲＥＰ遺伝子およびＣＡＰ遺伝子が宿主細胞内に安定的に維持されたパッケージング細胞でもあり得るか、または代替的に、宿主細胞は、ＡＡＶベクターゲノムが安定的に維持されている産生細胞であり得る。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当該分野において公知である標準的な技術を使用して、精製および処方される。

レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５ ４６０）。レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターは、本発明を実施する際に使用されてもよい。レトロウイルスベクターは、試験され、広範な標的細胞のゲノムＤＮＡに、種々の目的の遺伝子を安定的に導入するための適切な送達ビヒクルであることが見出された。レトロウイルスベクターが導入遺伝子を細胞に送達する能力により、レトロウイルスベクターは細胞に遺伝子を導入するのに十分に適するようになる。さらに、レトロウイルスは、宿主細胞上の特定の細胞表面レセプターへのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合によって、宿主細胞に進入する。結果的に、コードされたネイティブなエンベロープタンパク質が、ネイティブなエンベロープタンパク質とは異なる細胞特異性を有する異種エンベロープタンパク質（例えば、ネイティブなエンベロープタンパク質と比較して、異なる細胞表面レセプターに結合する）によって置き換えられている偽型レトロウイルスベクターもまた、本発明を実施する際に有用であり得る。

本発明は、例えば、１つ以上の導入遺伝子配列を含むレトロウイルス導入ベクター、および１つ以上のパッケージングエレメントを含むレトロウイルスパッケージングベクターを含むレトロウイルスベクターを提供する。特に、本発明は、偽型レトロウイルスを産生するための、異種エンベロープタンパク質または機能的に改変されたエンベロープタンパク質をコードする偽型レトロウイルスベクターを提供する。

本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルスならびにスプマウイルスおよびレンチウイルスを含む広範な種々のレトロウイルスから容易に誘導され得る（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５年を参照のこと）。本発明の組成物および方法における使用のために適切なレトロウイルスの例には、レンチウイルスが含まれるが、これに限定されない。本発明の組成物および方法における使用のために適切な他のレトロウイルスの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス。特に好ましいものは、４０７０Ａおよび１５０４Ａを含むマウス白血病ウイルス（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：１９ ２５、１９７６年）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ ９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ ２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ ５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、ハーベイ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ ９９８）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ １９０）である。このようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）のような寄託機関または集積機関から容易に入手され得るか、または一般に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離され得る。

好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチウイルス由来である。好ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス、例えば１型または２型（すなわち、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２、ここで、ＨＩＶ１は、以前にはリンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた）、または同定され、ＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ様疾患と関連付けられた、ＨＩＶ１もしくはＨＩＶ２と関連する別のウイルスである。本発明の実施する際に使用され得る他のレンチウイルスベクターには、ヒツジビスナ／マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス（例えば、ＢＩＶ；ＷＯ２００３６６８１０）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が含まれる。

本発明の組成物および方法における使用のために適切である種々の属および系統のレトロウイルスが、当該分野において周知である（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６年）を参照のこと、例えば、第５８章、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１７６８ １７７１頁、表１を含む、を参照のこと）。

レトロウイルスを産生する産生細胞および産生細胞株を生成するためのレトロウイルスパッケージング系、ならびにこのようなパッケージング系を作製するための方法は公知である。細胞株を生成する際に使用されるレトロウイルスパッケージング系は、少なくとも２つのパッケージングベクター：ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングベクター；ならびに異種エンベロープ遺伝子または機能的に改変されたエンベロープ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングベクターを含む。１つの実施形態において、レトロウイルスエレメントは、ＨＩＶなどのレンチウイルス由来である。好ましくは、これらのベクターは、機能的なｔａｔ遺伝子および／または機能的なアクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）を欠いている。別の実施形態において、この系は、ｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む第３のパッケージングベクターをさらに含む。このパッケージング系は、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および必要に応じて第３のヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞の形態で提供され得る。

当業者は、種々のレトロウイルス系、およびレトロウイルスの異なるグループにわたって共有されている共通エレメントが適用可能であることを認識する。本明細書の記載は、代表的な例としてレンチウイルス系を使用する。しかし、すべてのレトロウイルスが、表面突出を伴う封入されたビリオンの特徴を共有し、１つの分子の直鎖状、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ、二量体からなるゲノム、ならびに共通タンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。

１つの実施形態において、レンチウイルスベクターパッケージング系は、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖについての別々のパッケージング構築物を提供し、典型的には、異種エンベロープタンパク質または機能的に改変されたエンベロープタンパク質（例えば、ＶＳＶＧエンベロープ）を使用する。さらなる実施形態において、レンチウイルスベクター系は、欠失したかまたは不活性化されたアクセサリー遺伝子、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを有する。さらなる実施形態において、レンチウイルスベクター系は、欠失したか、もしくは不活性化された（例えば、変異によって）ｔａｔ遺伝子を有する。別の実施形態において、ｇａｇコード配列およびｐｏｌコード配列は、当該分野において公知であるように、２つの別々のコード配列またはオープンリーディングフレームに「分裂（ｓｐｌｉｔ）」される。典型的には、分裂したｇａｇコード配列およびｐｏｌコード配列は作動可能に連結されて、異種プロモーターを分離し、異なる核酸分子上に配置され得る。

通常はｔａｔによって提供される転写の制御のための補償は、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ＨＣＭＶ ＩＥ）エンハンサー／プロモーターなどの強力な構成的プロモーターの使用によって提供することができる。他のプロモーター／エンハンサーは、当該分野において理解されているように、構成的プロモーター活性の強さ、標的組織の特異性（例えば、肝臓特異的プロモーター）、または発現に対する所望の制御に関連する他の因子に基づいて選択することができる。例えば、いくつかの実施形態において、制御発現を達成するために、ｔｅｔなどの誘導プロモーターを使用することが望ましい。ｒｅｖをコードする遺伝子は、好ましくは、レンチウイルスベクター系が４つの構築物：ｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖ、エンベロープおよび導入ベクターについて各１つ（例えば、プラスミド）を含むように、別々の発現構築物上に提供される。利用されるパッケージング系の生成にかかわらず、ｇａｇおよびｐｏｌは、単一の構築物上か、または別々の構築物上に提供することができる。

典型的には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞内に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は、当業者に周知である。本発明のレトロウイルス導入ベクターは、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞株に導入し、産生細胞または細胞株を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む標準的な方法によって、ヒト細胞またはヒト細胞株に導入することができる。いくつかの実施形態において、パッケージングベクターは、優性の選択可能なマーカー、例えば、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンテターゼまたはＡＤＡと一緒に細胞に導入され、続いて、適切な薬物の存在下での選択およびクローンの単離が行われる。選択可能なマーカーの遺伝子は、パッケージングベクターによってコードされる遺伝子に物理的に連結することができるか、またはパッケージングベクターとともに同時導入（同時トランスフェクト）されてもよい。

パッケージング機能が、適切なパッケージング細胞によって発現されるように構成されている安定的な細胞株が公知である。例えば、パッケージング細胞を記載している、米国特許第５，６８６，２７９号；およびＯｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６年）９３：１１４００ １１４０６を参照のこと。安定的な細胞株産生のさらなる記載は、Ｄｕｌｌら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３ ８４７１；およびＺｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１２）：９８７３ ９８８０において見出され得る。

目的のパッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質発現を増強するため、および安全性を増強するための、パッケージング機能に対するさらなる変化を含み得る。例えば、ｇａｇの上流のすべてのＨＩＶ配列を除去することができる。また、エンベロープの下流の配列を除去することができる。さらに、ＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を増強するために、ベクターを改変するための工程を採用することができる。

必要に応じて、Ｄｕｌｌら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３ ８４７１によって記載されているような条件付きパッケージング系が使用される。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１２）：９８７３ ９８８０によって記載されているような、ＨＩＶ１長末端反復（ＬＴＲ）の欠失によってベクターの生物学的安全性を改善する、自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）の使用もまた好ましい。誘導性ベクターもまた、例えば、ｔｅｔ誘導性ＬＴＲを通して、使用することができる。

アデノウイルスベクター
本明細書に開示するアデノウイルスベクターが、腫瘍抗原、ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその任意の組み合わせを発現するために使用されてもよい。

本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」という用語は、すべての群、亜群、および血清型を含む、ヒトまたは動物に感染するあらゆるアデノウイルスを含む、アデノウイルスとして分類され得るあらゆるウイルスをいう。従って、本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」とは、ウイルスそれ自体またはその派生物をいい、他に示される場合を除外して、すべての血清型およびサブタイプ、ならびに天然に存在する型と組換え型の両方を網羅する。このようなアデノウイルスは野生型であっても、当該分野において公知であるかもしくは本明細書に記載されるような種々の方法で改変されてもよい。このような改変は、感染性ウイルスを作製するために粒子中にパッケージングされるアデノウイルスゲノムに対する改変を含む。このような改変には、当該分野において公知である欠失、例えばＥ１ａコード領域、Ｅ１ｂコード領域、Ｅ２ａコード領域、Ｅ２ｂコード領域、Ｅ３コード領域またはＥ４コード領域の１つ以上における欠失が含まれる。この用語はまた、複製特異的なアデノウイルス；すなわち、特定の型の細胞または組織中で優先的に複製するが、他の型では複製の程度が低いかまたは全く複製しないウイルスを含む。このようなウイルスは、「細胞溶解性」ウイルス（またはベクター）または「細胞変性」ウイルス（またはベクター）と呼ばれることがあり、新生物細胞に対してこのような効果を有する場合には、「腫瘍溶解性」ウイルス（またはベクター）と呼ばれる。

本発明は、本発明によるアデノウイルスベクターおよびウイルス粒子を構築するための、あらゆるアデノウイルス血清型の使用を意図する。本発明に従って使用され得るアデノウイルスストックは、任意のアデノウイルス血清型を含む。アデノウイルス血清型１〜５１は、現在、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能であり、本発明は、任意の供給源から入手可能であるアデノウイルスの任意の他の血清型を含む。本発明に従って使用可能であるアデノウイルスは、ヒト、またはウシ、ブタ、イヌ、サル、トリなどの非ヒト起源のものであり得る。例えば、アデノウイルスは、亜群Ａ（例えば、血清型１２、１８、３１）、亜群Ｂ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０）、亜群Ｃ（例えば、血清型１、２、５、６）、亜群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、４２〜４７、４９、５１）、亜群Ｅ（血清型４）、亜群Ｆ（血清型４０、４１）、または任意の他のアデノウイルス血清型であり得る。ヒトおよび動物のアデノウイルスの多数の例が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにおいて入手可能であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ．において見出される。

アデノウイルスベクターは、それらのゲノムのサイズによって限定される（Ｂｅｔｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：５９１１−５９２１、１９９３年）。

本発明のアデノウイルスベクターは、複製不能ベクターおよび複製可能ベクターを含む。複製不能ベクターは、標的細胞内で複製しないか、または非常に低レベルで複製する。１つの局面において、複製不能ベクターは、通常、コード領域の一部またはすべてを欠失させるかまたは変異させることによって不活性化されたＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂまたはＥ４の中に少なくとも１つのコード領域を有する。これらのベクターを増殖させるための方法は、当該分野において周知である。

例示的なアデノウイルスベクターは以下を含むが、これらに限定されない：ＤＮＡ、アデノウイルス外被に封入されたＤＮＡ、別のウイルス型もしくはウイルス様型（例えば、単純ヘルペスおよびＡＡＶ）にパッケージされたアデノウイルスＤＮＡ、リポソームに封入されたアデノウイルスＤＮＡ、ポリリジンと複合体化されたアデノウイルスＤＮＡ、合成ポリカチオン性分子と複合体化されるか、トランスフェリンと結合体化されるか、もしくはＰＥＧなどの化合物と複合体化されて、抗原性を免疫学的に「マスク」し、そして／もしくは半減期を増加させたアデノウイルスＤＮＡ、または非ウイルスタンパク質に結合体化されたアデノウイルスＤＮＡ。

アデノウイルスベクター粒子はまた、以下に記載されるような線維タンパク質へのさらなる改変を含んでもよい。１つの実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、粒子のキャプシドタンパク質中に含まれる標的化リガンドをさらに含む。標的化アデノウイルスの例については、例えば、ＷＯ００／６７５７６、ＷＯ９９／３９７３４、米国特許第６，６８３，１７０号、同第６，５５５，３６８号、同第５，９２２，３１５号、同第５，５４３，３２８号、同第５，７７０，４４２号、および同第５，８４６，７８２号を参照のこと。

さらに、本発明のアデノウイルスベクターはまた、他のウイルスキャプシドタンパク質に対する改変も含んでもよい。これらの変異の例には、米国特許第５，７３１，１９０号、同第６，１２７，５２５号、および同第５，９２２，３１５号に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。他の改変されたアデノウイルスは、米国特許第６，０５７，１５５号、同第５，５４３，３２８号、および同第５，７５６，０８６号に記載されている。

挿入された配列の発現のためのアデノウイルスベクターを生成するための標準的な系は当該分野において公知であり、商業的な供給源から入手可能であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ）からのＡｄｅｎｏ−Ｘ？発現系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０００年１月）１０−１２頁）、両方ともＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）からであるＡｄｅｎｏｖａｔｏｒ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍおよびＡｄＥａｓｙがある。

細胞株
腫瘍細胞は、インビトロで増殖および維持される確立された腫瘍細胞株であり得る。確立された腫瘍細胞株には以下が含まれるが、これらに限定されない：ＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４３５）、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２）、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）、ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７４０）、Ｈ１５７細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８０２）、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４３）、Ｐａｎｃ １０．０５細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２５４７；（Ｊａｆｆｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９８年；９：１９５１−１９７１；Ｊａｆｆｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｓｃｉ Ａｍ １９９８年；４（３）：１９４−２０３）、Ｐａｎｃ ６．０３細胞、ＣＧ ８０２０細胞、ＣＧ ２５０５細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３０；Ｆｏｇｈら、１９７７年）、Ｔ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３３；Ｋｅｙｄａｒら、１９７９年）、３ＳＫＢＲ３−７細胞（Ｅｍｅｎｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００４３月；１５（３）：３１３−３７）、２Ｔ４７ＤＶ細胞（Ｅｍｅｎｓら、２００４年）、ＭＣＦ−７細胞、ＢＴ−４７４細胞、ＨＣＣ−１９３７細胞、またはＨ１３５９細胞。別の実施形態において、抗ＣＴＬＡ４抗体の発現を増強するように操作された細胞株は、哺乳動物から単離され、抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現の増強を引き起こすベクターで形質導入した腫瘍細胞である。次いで、操作された腫瘍細胞は、癌免疫療法の一部として、同じかまたは異なる哺乳動物に投与によって戻され得る。細胞の子孫が親の細胞に対して（形態学的に、遺伝子型的にまたは表現型的に）完全に同一でなくてもよいことが理解される。さらに、細胞は、選択していない細胞の集団または特定の細胞のクローンのいずれかであり得る。例えば、細胞は、遺伝的に改変されるか、高発現レベルの抗ＣＴＬＡ４抗体、サイトカイン、腫瘍抗原、またはその任意の組み合わせについてスクリーニングすることができる。本発明の１つの実施形態において、細胞はヒト細胞である。１つの実施形態において、細胞は前立腺細胞である。１つの実施形態において、細胞は、被験体への投与の前に冷凍保存される。１つの実施形態において、細胞は増殖不能である。

１つの実施形態において、細胞は多数の複製にわたって培養中で維持され、必要な場合に遺伝的に変化させることができる。１つの実施形態において、細胞は、新生物細胞、悪性形質転換細胞、またはこのような細胞の子孫である。細胞は、任意の方法によって長寿命細胞株に意図的に形質転換され得、その方法には、他の細胞株との融合、化学発癌性物質での処理、エプスタイン−バーウイルスもしくは発癌ウイルスなどの適切なウイルスを用いる感染、または連続的な増殖を可能にするタンパク質（例えば、ＳＶ４０からの巨大Ｔ抗原）をコードするコード領域を用いた形質導入が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、細胞は、エクスビボ培養において確立された原発性前立腺腫瘍の子孫である。

本発明を実施する際に使用される細胞は、本明細書に詳述されるように遺伝的に改変されている腫瘍細胞であり得る。例示的な腫瘍細胞型は、頭頸部癌細胞、前新生物病巣由来の細胞、癌性ポリープ細胞、白血病細胞、膀胱細胞、乳房細胞、結腸細胞、腎臓細胞（腎細胞）、肝臓細胞、肺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膵臓細胞、直腸細胞、前立腺細胞、胃細胞、表皮細胞、リンパまたは骨髄性系統の造血細胞；間葉起源の細胞、黒色腫細胞、奇形癌細胞、神経芽細胞腫細胞、神経膠腫細胞、腺癌細胞、および非小細胞肺癌細胞からなる群より選択される。

本発明の有用性
本発明は、このようなワクチンの使用に基づいて腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するための細胞免疫療法組成物および方法を提供する。これらの細胞組成物は、腫瘍抗原、抗ＣＴＬＡ４抗体およびサイトカインの１つ以上を発現するように改変された細胞を含む。

本発明の１つの実施形態は、２Ａ免疫グロブリン発現系を使用して抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように改変される細胞ベースの癌免疫療法である。典型的には、細胞は、被験体における腫瘍細胞と同じ型である。例えば、被験体が前立腺癌を有する場合、本明細書中先に詳述されるように、前立腺細胞に由来する細胞が操作されて１種以上の導入遺伝子を発現する。別の例において、被験体が肺癌を有する場合、本明細書中先に詳述されるように、肺に由来する細胞が操作されて１種以上の導入遺伝子を発現する。

本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞、腫瘍抗原、血管形成に関与する細胞、または任意の組み合わせに対する免疫応答を増加させる方法である。免疫応答の増加は、体液性、細胞性（Ｔ細胞）または体液性と細胞性の両方であり得、好ましくは全身的である。好ましくは、腫瘍に対する全身性免疫応答は、腫瘍の退行または腫瘍の成長の阻害をもたらし、それによって、被験体に対する治療結果の改善をもたらす。

治療効力を評価する方法
本発明の組成物はまた、検出可能な腫瘍を有する可能性があるか、またはその可能性がない被験体を処置するために使用することができる。被験体は、以前に診断および処置されていても、癌を発症する実質的なリスクを有しても、別の様式の療法で以前に処置されていてもよい。以前の療法は、外科的切除、放射線療法、従来の化学療法、および他の様式の免疫療法を含んでいてもよい（しかしこれらに限定されない）。

腫瘍または疾患状態をモニターするために適切な手段は、腫瘍の特性に依存して変化する。腫瘍質量の測定可能な減少は、当業者に公知である多数の方法によって検出することができる。これらには、接近可能な腫瘍の直接測定、腫瘍細胞（例えば、血液中に存在する）の計数、腫瘍抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、αフェトタンパク質（ＡＦＰ））の測定および種々の可視化技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、およびＸ線）が含まれる。以下は腫瘍の成長速度の減少の例である：血清中のＡＦＰレベルの減少、腫瘍サイズの減少および／または腫瘍のサイズもしくは細胞数が増加している速度の減少。腫瘍成長速度の減少は、癌を有する哺乳動物についての長い生存期間と相関し得る。

一般的な細胞免疫応答は、免疫療法の投与後に被験体からサンプリングされる細胞、特にＰＢＬ中のＴ細胞増殖活性として測定されてもよい。処置された哺乳動物もしくは免疫療法が基礎にある哺乳動物のいずれか由来の不活性化された腫瘍細胞、または同じ腫瘍型の腫瘍細胞が、刺激因子として使用される。ＰＨＡなどの非特異的マイトジェンはポジティブ対照として機能する；関連性のない刺激因子細胞とのインキュベーションはネガティブ対照として機能する。適切な期間（例えば、５日間）にわたる刺激因子とのＰＢＭＣのインキュベーション後、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定する。所望される場合、増殖しているＴ細胞のサブセットの決定は、フローサイトメトリーを使用して実施することができる。Ｔ細胞の細胞毒性（ＣＴＬ）もまた測定できる。この試験において、被験体からのＴ細胞集団は、標準５１Ｃｒ遊離アッセイにおいてエフェクターとして使用される。腫瘍細胞は、標的として、約２００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４とともに、６０分間、３７１℃で放射性標識され、続いて洗浄される。次いで、Ｔ細胞および標的細胞（約１×１０４個／ウェル）を、９６ウェルのＵ底プレート中で、種々のエフェクター対標的比率で合わせる。このプレートを１００×ｇで５分間遠心分離して細胞接触を開始し、５％ＣＯ２とともに３７１℃で４〜１６時間インキュベートする。５１Ｃｒの遊離は上清中で決定され、Ｔ細胞の非存在下でインキュベートした標的（ネガティブ対照）または０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００（ポジティブ対照）と比較される。免疫応答の増加を測定するための他の方法には、抗体ベースのアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット）、抗原特異的細胞アッセイ、増殖アッセイ、細胞溶解細胞アッセイ、および組換え腫瘍関連抗原または免疫原性断片または抗原由来のペプチドを用いて試験するインビボ遅延型過感受性試験が含まれるが、これらに限定されない。免疫応答の増加を測定するためのさらなる方法には、Ｔ細胞応答を測定するために現在使用されているアッセイが含まれ、これには以下が含まれるが、これらに限定されない：遅延型過感受性試験、ペプチド主要組織適合性複合体テトラマーを使用するフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、酵素結合免疫スポットアッセイ、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞傷害性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインｍＲＮＡの測定、および限界希釈分析。例えば、Ｌｙｅｒｌｙ ＨＫ、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３年６月；３０（３ 補遺８）：９−１６を参照のこと。

これらの試験から得られた情報は、患者が本発明の遺伝的に改変された細胞ワクチンの投与後にどのようにして応答しているかを決定する際に有用である。この試験結果は、個々の被験体に対して処置を最適化する際に補助になり得る。遺伝的に改変された細胞の免疫療法のさらなる用量は、適切な場合、治療結果の改善が検出されるまで、典型的には、１ヶ月１回、１ヶ月に２回、または１週間に１回を基本として、与えられてもよい。その後、そして特に、免疫学的または臨床的な利益が鎮静化したように思われた場合に、さらなるブースター用量または維持用量が、必要に応じて与えられてもよい。

本発明を以下の実施例を参照して説明するが、この実施例は、例示の目的で提供され、本発明を限定することを何ら意図しない。当該分野において周知の標準的な技術または以下に詳細に記載される技術が使用される。当業者は、単に慣用的な実験を使用して、本明細書に具体的に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の中に含まれることが意図される。

（実施例１：ベクターのクローニングおよび産生）
マウス抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の全長の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターを、標準的な分子生物学技術を使用して生成した。フリン切断部位および自己プロセシング２Ａ配列によって連結されたマウス抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の全長の重鎖および軽鎖をコードしたレトロウイルスベクター導入ベクターおよびレンチウイルスベクター導入ベクターを構築した。マウス抗ＣＴＬＡ−４ ＤＮＡ配列をクローニングするために、マウス抗マウスＩｇＧ２ｂ抗ＣＴＬＡ−４抗体をコードするハイブリドーマ細胞株（９Ｄ９と名付けた）から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡを、従来のＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞株から精製し、ｃＤＮＡを９Ｄ９細胞全ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域および定常領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ｃＤＮＡからクローニングした。全長モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列を、自動配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析し、コンセンサス可変領域配列を、複数の独立したＰＣＲ反応に由来する配列決定データから得た。

全長抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列および全長抗体軽鎖をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ伸長によって一緒に連結した。ＦＭＤＶ ２Ａ配列の人工オリゴヌクレオチドを、２Ａペプチド配列ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号６）に基づいて合成した。ＰＣＲの間に、ＥｃｏＲＩ部位を重鎖の５’末端に付加し、軽鎖の３’末端にＮｏｔＩ部位を付加した。これらの制限酵素部位を使用して、融合した重鎖−フリン２Ａ−軽鎖ＤＮＡ断片を、レトロウイルス導入ベクタープラスミドおよびレンチウイルス導入ベクタープラスミドにクローニングした。

これらの研究のために使用されるレトロウイルス導入ベクタープラスミド（ｒｋａｔ３Ｆ３）は以前に記載されており（Ｆｉｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８３：４３−５０（１９９４年））、続いて、ヒトＣＤ４（Ｆ３）の細胞外ドメインに隣接するさらなる制限酵素部位を含むように改変された。レトロウイルスベクターを、以前に記載されたように一過性トランスフェクションによって生成した（Ｆｉｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８３：４３−５０（１９９４年）；Ｄｕｌｌら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：８４６３−８４７１（１９９８年））。

第３世代のレンチウイルスベクター系は、以前に記載されている（Ｄｕｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、１９９８年）。簡潔に述べると、導入ベクターは５’キメラＲＳＶ／ＬＴＲプロモーター、ｃＰＰＴ（Ｚｅｎｎｏｕら、Ｃｅｌｌ １０１：１７３−１８５、２０００年）、ＣＡＧプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｇｅｎｅ
７９：２６９−２７７、１９８９年）、およびＳＩＮ ＬＴＲ（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、１９９８年）を含む。これらの研究のために、抗体の発現を駆動するプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーターおよびスプライシングドナー、ならびにウサギβグロビンスプライシングアクセプター（ＣＡＧ）から構成される。ベクター産生、濃度、ｐ２４分析、および力価分析を、以前に記載されたように実施した（Ｄｕｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、１９９８年）。簡潔に述べると、ベクターを、６．５μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、２．５μｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、３．５μｇのｐＭＤ２．ＶＳＶＧ−Ｅｎｖ、および１０μｇの導入ベクターを有する１０ｃｍのディッシュ中での一過性トランスフェクションによって調製した。

レトロウイルスベクター粒子およびレンチウイルスベクター粒子を、２４時間後に収集し、プールし、０．２μｍ酢酸セルロースフィルターを通し、ＳＷ２８スイングバケットローター中で、２時間２０分にわたって１９，５００ｒｐｍ（５０，０００ｇ）の超遠心分離によって濃縮した。ペレットを、４０ｍｇ／ｍｌラクトースを含むＰＢＳ中に再懸濁し、アリコートで−８０℃で保存した。ｇａｇ ｐ２４タンパク質の検出を、Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して評価した。

（実施例２：種々のＢ１６Ｆ１０免疫療法細胞株およびＣＴ２６免疫療法細胞株の構築）
マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから市販されている（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−６４７５）。レトロウイルスによって形質導入されたＧＭ−ＣＳＦ分泌Ｂ１６．ＧＭ細胞株は、以前に記載されている（Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３５３９−４３（１９９３年））。この細胞株は、１５０ｎｇ／１０^６細胞／２４時間のマウスＧＭ−ＣＳＦを生成する。細胞を、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃で、１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌグルタミン、および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＪＲＨ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で維持する。

マウス結腸癌腫ＣＴ２６細胞株もまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから市販されている（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２６３８）。ＣＴ２６．ＧＭ細胞株を、Ｂ１６．ＧＭの構築において使用したＧＭ−ＣＳＦをコードするレトロウイルス構築物を使用して生成した（Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３５３９−４３（１９９３年））。この細胞株は、８０ｎｇ／１０^６細胞／２４時間のマウスＧＭ−ＣＳＦを生成する。細胞を、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃で、１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌグルタミン、および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ＪＲＨ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で維持する。

親のＢ１６．ＧＭ細胞株およびＣＴ２６．ＧＭ細胞株を、１００：１の濃縮ウイルス上清を使用して、以前に記載されたように（Ｄｕｌｌら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：８４６３−８４７１（１９９８年））、抗ＣＴＬＡ４抗体をコードするレトロウイルスベクターで形質導入する。抗ＣＴＬＡ４抗体を発現する細胞を、単回のラウンドの形質導入によって生成し、抗ＣＴＬＡ４タンパク質の発現を、製造業者の指示書に従って、市販の抗ＩｇＧキットを使用して、ＥＬＩＳＡによって確認する。

（実施例３：レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞から産生された組換え抗ＣＴＬＡ４抗体は、機能的でありかつＴ細胞増殖を増強する）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける以下の研究は、レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞から産生された組換え抗ＣＴＬＡ４抗体が機能的でありかつＴ細胞増殖を増強することを実証する。−２日目に、Ｉ−Ａ^ｄクラスＩＩ ＭＨＣの状況においてＯＶＡ_{３２３−３３９}ペプチドに特異的なＴ細胞を産生するＤＯ１１．０１トランスジェニックマウス由来の１〜３×１０^６個の脾細胞を、レシピエントＢＡＬＢ／Ｃマウスに対して静脈内に養子免疫伝達した。０日目に、マウスに代理抗原である５００μｇのオボアルブミンを注射し、０日目および１日目に、以下の精製抗体１００μｇを背部に皮下投与した：ＩｇＧ２ｂ対照（アイソタイプ）；マウス９Ｄ９ハイブリドーマから発現された抗ＣＴＬＡ４抗体（ハイブリドーマ）；ＧＭ−ＣＳＦおよび９Ｄ９ハイブリドーマによって産生される抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように操作されたＢ１６Ｆ１０細胞から発現される抗ＣＴＬＡ４抗体（２Ａ−抗ＣＴＬＡ−４）；または対照ビヒクル（未処理）。４日目に、マウスを安楽死させ、脾臓およびリンパ節を収集し、ＯＶＡ発現Ｔ細胞を、ＤＯ１１．０１トランスジェニックＴ細胞を検出可能であるＫＪ１２６モノクローナル特異的抗体を使用して同定し、ＦＡＣｓ分析によって評価した。脾臓におけるオボアルブミン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の絶対数を示す。

図３に示すように、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように操作されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞から発現された抗ＣＴＬＡ４抗体、ならびに親のハイブリドーマ細胞株によって発現される抗ＣＴＬＡ４抗体は、本質的に同一の濃度において本質的に同じレベルまでＴ細胞増殖を増強する。

（実施例４：レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞からインビボで産生された組換え抗ＣＴＬＡ４抗体は、機能的でありかつＴ細胞増殖を増強する）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける以下の研究は、抗ＣＴＬＡ抗体を局所的にもまた発現するサイトカイン発現癌免疫療法の投与が、抗ＣＴＬＡ−４抗体の持続可能な全身的なインビボ発現をもたらすことを実証する。０日目に、マウスに、２×１０^５個の生きているＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）接種した。１日目に、マウスを５つの別々の群に分けた：１つのセットは、それぞれ１５μｇ、５０μｇまたは１５０μｇの精製抗ＣＴＬＡ４抗体の単回腹腔内（ｉｐ）投与を各々受け；１つのセットは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように操作された１×１０^６個の照射されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を用いて免疫化し（ＳＣ）；最後のセットは、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように操作された１×１０^６個の照射されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を用いて免疫化し（ＳＣ）、抗ＣＴＬＡ４抗体の血中濃度を１８日間の期間、追跡した。

図３に示すように、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するように操作されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞からの免疫化部位において発現される抗ＣＴＬＡ４抗体は、癌免疫療法の単回投与の後、少なくとも１８日間の間、血清中で、低いが持続可能なレベルで検出され得る。

（実施例５：レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞からの抗ＣＴＬＡ４抗体の局所的発現は、より低い全身抗体濃度で、腫瘍保有動物の生存を改善する）
ＢＡＬＢ／ｃマウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける以下の研究は、抗ＣＴＬＡ４抗体を発現する、レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現癌免疫療法が、より低い全身抗体濃度で、腫瘍保有動物の生存を改善することを実証する。０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０^５個の生きているＣＴ２６腫瘍細胞を皮下接種した。３日後、マウスを、１×１０^６個の照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌ＣＴ−２６を用いてか、またはＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ４抗体の両方を分泌する同じ数の照射されたＣＴ−２６細胞を用いて免疫化した。対照群は、３日目に、１×１０^６個の照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌ＣＴ−２６腫瘍細胞、および組換え抗ＣＴＬＡ４抗体の全身投与（腹腔内−１５０μｇ、１０μｇ）または局所的皮下投与（サイトカイン発現癌免疫療法と混合−１０μｇ）を用いて免疫化した。マウスを、明白な腫瘍の形成について週に２回モニターし、腫瘍が壊死性になるか、サイズが１５００ｍｍ^３を超える場合、屠殺した。

生存しているマウスのＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線（ｎ＝１０／群）を図４Ａに示す。ＣＴ２６腫瘍保有マウスにおいて、ＧＭ−ＣＳＦのみを分泌するＣＴ２６ワクチン細胞での処置は、４２日目に２０％生存をもたらしたのに対して、免疫化部位で局所的にＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ４抗体を分泌したＣＴ２６腫瘍細胞で免疫化したマウスの１００％が生存した。抗体投与後３日目に、動物からの血清を、収集し、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗ＣＴＬＡ４抗体レベルについて評価した（図４Ｂおよび４Ｃ）。ＧＭ−ＣＳＦ分泌ＣＴ−２６腫瘍細胞癌免疫療法＋抗ＣＴＬＡ４抗体の全身投与を用いて処置された動物の１００％が生存したが、この群における抗ＣＴＬＡ４血中濃度は、局所的に抗体を分泌するワクチンの投与を受けた群におけるものよりも７倍高かった。さらに、分泌細胞からの抗体の局所的送達は、５０％の生存しかもたらさなかった組換え抗体の局所的送達よりも強力である。これらのデータは、抗体分泌細胞からの抗ＣＴＬＡ４の局所的送達が、低い全身性抗体曝露において癌免疫療法の効力を改善することを示す。

（実施例６：レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞からの抗ＣＴＬＡ４抗体の局所的発現は、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおいて腫瘍保有動物の生存を改善する）
異なる腫瘍モデルにおける抗ＣＴＬＡ４抗体の局所的送達を評価するために、上記のＧＭ−ＣＳＦに加えて抗ＣＴＬＡ４抗体を分泌するＢ１６Ｆ１０細胞を試験した。０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２×１０^５個の生きているＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞でチャレンジした。マウスを、１日目に、３×１０^６個の照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を用いてか、またはＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＣＴＬＡ４抗体の両方を分泌する同じ数の照射されたＢ１６Ｆ１０細胞を用いて免疫化した。別個の群を、照射されたＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍細胞、および組換え抗体の全身（腹腔内）の投与で、２日目（１５０μｇ）および５日目（１００μｇ）に免疫化した。免疫化および抗体注射の第２のラウンドを、１４日目に開始して投与した。腫瘍量をモニターし、マウスを、チャレンジ腫瘍が１５００ｍｍ^３に達するか、または重篤な潰瘍が発生した場合に、屠殺した。

生存しているマウスのＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線（ｎ＝１０／群）を図５Ａに示す。照射されたＧＭ−ＣＳＦ発現細胞のみを用いて処置したマウスはいずれも生存しなかったが、癌免疫療法細胞から局所的に発現された抗ＣＴＬＡ４で処置した群においては４０％のマウスが生存した。ＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍細胞および全身性抗ＣＴＬＡ４抗体を用いて免疫化した群において、６０％のマウスが生存した。血清を、２日目、３日目、４日目、７日目、９日目、１１日目、１５日目、１６日目、１７日目、２３日目および２５日目に収集し、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗ＣＴＬＡ４抗体レベルについて評価した（図５Ｂおよび５Ｃ）。これらのデータは、癌免疫療法細胞からの抗ＣＴＬＡ４の局所的送達が高い全身の抗体レベルに宿主を曝露することなく抗腫瘍効力を生じ、それによって、高い全身濃度において報告されている付随する抗ＣＴＬＡ４抗体の毒性を回避することを示す。

（実施例７：レトロウイルスで形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞からの抗ＣＴＬＡ４抗体の局所的発現は、Ｔ細胞応答の増強をもたらす）
実施例５において処置した群からのサテライトマウスを、２１日目に収集した。抗原特異的応答を、製造業者の指示書に従って、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｒ＆Ｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって列挙した。赤血球欠損脾細胞（５×１０^５個）をプレートし、ＴＲＰ２（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ；配列番号１１）に由来する１μＭのＫｂ結合ペプチド、または５×１０^３個の照射されたＢ１６Ｆ１０細胞とともに、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ポジティブスポットを、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．から得られる自動プレート走査サービス（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｌａｔｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｓｅｒｖｉｃｅ）を使用して列挙した。ＴＲＰ２および照射されたＢ１６Ｆ１０刺激因子を使用するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、抗体分泌細胞の投与を受けた動物で、全身性抗ＣＴＬＡ４投与を伴うか伴わずに、照射されたＧＭ−ＣＳＦで処置された動物と比較して、活性化Ｔ細胞の数が増加したことを明らかにした（例えば、図６Ａおよび６Ｂを参照のこと）。

（実施例８：Ｆ２Ａカセットを使用する抗ＣＴＬＡ４抗体の局所的発現は、自己免疫抗体応答の減少をもたらす）
２Ａ構築物を使用して発現した抗ＣＴＬＡ−４の局所的送達を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて評価した。０日目に、マウスに、２×１０^５個の生きているＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）接種した。１日目に、マウスを４つの別々の群に分けた：１つのセットは、各々が、ＨＢＳＳの単回腹腔内（ｉｐ）投与；ＧＭを発現するように操作された３×１０^６個の照射されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（Ｂ１６ＧＭ）；３×１０^６個の照射されたＢ１６ＧＭ＋ＣＴＬＡ４の全身注射（Ｂ１６ＧＭ全身抗−ＣＴＬＡ−４）；またはＦ２Ａカセットを使用する、抗ＣＴＬＡ４を分泌するように操作された３×１０^６個の照射されたＢ１６ＧＭ（Ｂ１６ＧＭ Ｆ２Ａ抗ＣＴＬＡ４）の投与を受けた。この処置レジメンを２週間に一度反復した。種々の時点で血清を収集し、ＥＬＩＳＡによって、抗核抗体（図７Ａ）、ｓｓ−ＤＮＡ抗体（図７Ｂ）、およびｄｓ−ＤＮＡ抗体（図７Ｃ）のレベルについて評価した。自己免疫抗体のレベルの減少は、全身的（注射）抗ＣＴＬＡ４で処置したマウスと比較して、Ｆ２Ａ抗ＣＴＬＡ４で処置したマウスにおいて観察された。

本明細書に記載する実施例および実施形態は例示目的のみのためであること、およびそれらに鑑みた種々の改変または変更が当業者に示唆され、本願の技術思想および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。

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