JP2011513362A

JP2011513362A - ブラシノステロイドのシグナル伝達阻害剤

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Publication number: JP2011513362A
Application number: JP2010549123A
Authority: JP
Inventors: ジョナッククラウディア; ロゾンウィルフリード
Original assignee: GMI Gregor Mendel Institut fur Molekulare Pflanzenbiologie GmbH
Current assignee: GMI Gregor Mendel Institut fur Molekulare Pflanzenbiologie GmbH
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2011-04-28
Also published as: WO2009109570A1; CN101939299A; UA101490C2; ES2392514T3; RU2010136738A; AU2009221128B2; CN101939299B; EP2098510A1; CA2712589A1; PL2247576T3; US20100317526A1; PT2247576E; BRPI0906062A2; EP2247576A1; AU2009221128A1; DK2247576T3; MX2010008559A; US8642510B2; RU2489424C2; EP2247576B1

Abstract

本発明は、植物の処理のための、植物の成長を増大させるための、式（Ｉ）

（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり；Ｒ^１は、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_２Ｈ_４Ｒ^３、Ｃ_２Ｈ_３Ｒ^３Ｒ^４、Ｃ_３Ｈ_７、Ｃ_３Ｈ_６Ｒ^３、またはＣ_３Ｈ_５Ｒ^３Ｒ^４であり；Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_２Ｈ_４Ｒ^３、またはＣ_２Ｈ_３Ｒ^３Ｒ^４であり；Ｒ^３およびＲ^４は、それぞれ、Ｘ、ＯＨまたはＮＨ_２である）を有する化合物に関する。

Description

本発明は、ブラシノステロイドのシグナル伝達阻害剤に関する。

ブラシノステロイドは、細胞の増殖および分裂、花粉管伸長、維管束組織発達、老化およびストレス反応の調節を含めた多くの過程に関与する植物ステロイドホルモンである。ブラシノステロイドは、ステロール前駆体から形成される。ブラシノステロイド生合成に関与する多くの酵素は、ｄｗｆ１、ｃｂｂ１、ｄｗｆ４、ｃｐｄ、ｄｅｔ２、およびｓｔｅｌ／ｄｗｆ７等のシロイヌナズナの突然変異体の分析によって特定された。近年、トマトｄｘ突然変異の分析によって、ブラシノステロイド生合成の最後のステップである、最も活性の高いブラシノステロイドであるブラシノライドへのカスタステロンの転換に関与する酵素が特定された。２個のシロイヌナズナの相同体は、候補遺伝子アプローチによって特定できた。これらの酵素およびＤＷＦ４およびＣＰＤは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのファミリーに属する。

ブラシライドは、動物ステロイド受容体と異なり、細胞膜に局在している、受容体キナーゼＢＲＩ１およびその共受容体ＢＡＫ１によって認識される。シグナルは、未知の機構によって核に伝達され、ブラシノステロイドのシグナル伝達に関与するＧＳＫ−３／Ｓｈａｇｇｙ様キナーゼ：ＢＩＮ２／ＵＣＵ１、ＡＳＫι、ＡＳＫζ、ＡＳＫθを制御する（ＶｅｒｔおよびＣｈｏｒｙ，２００６：非特許文献１）。これらのキナーゼリン酸化転写因子は、配列ＳＸＸＸＳの８個の隣接した繰り返しからなる保存モチーフでＢＥＳ１／ＢＺＲ１ファミリーに属する。したがって、これらの転写因子の活性は、それらの非リン酸化変異体のみＤＮＡに結合することができ、遺伝子発現を制御することができるため、阻害される。脱リン酸化は、核タンパク質ホスファターゼＢＳＵ１およびその相同体のＢＳＬ１〜３によって促進される。さらに、１４−３−３タンパク質は、リン酸化されたＢＺＲ１およびＢＥＳ１に結合し、それらの細胞質への再局在化を促進する。

ブラシノステロイドの合成およびシグナル伝達に関与する多くの酵素は既知であるが、利用できる阻害剤は非常に少ない。第１の既知の選択性ブラシノステロイド合成阻害剤は、ＫＭ−０１である（Ｋｉｍら，１９９８：非特許文献２）。低い効果のため、該阻害剤の利用は非常に限定されていた。ジベレリン酸生合成阻害剤であるウニコナゾールは、ブラシナゾール（Ｍｉｎら，１９９９：非特許文献３）およびＢｒｚ２００１（Ｓｅｋｉｍａｔａら，２００１：非特許文献４）の進展をもたらすブラシノステロイド生合成に非常に小さな阻害効果を有した。同様に、他のブラシノステロイド阻害剤は、プロピコナゾールの修飾によって特定された（Ｓｅｋｉｍａｔａら、２００２：非特許文献５）。ブラシナゾールの作用の標的は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＤＷＦ４のヘム鉄である。ブラシナゾールは、ブラシノステロイドの合成および効果の研究に広く用いられている。さらに、ブラシナゾールは、この化合物に反応しない突然変異体を単離するための遺伝子選別に使用された。これによって、転写因子ＢＺＲ１が特定された。

４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸は、２−アミノ−５−ブロモピリジンとコハク酸のモノアミドである。ピリジン環の５位の臭素およびカルボン酸基は、その活性にとって重要な特徴として認識された。近年、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸は、化学遺伝学アプローチによってブラシノステロイドのシグナル伝達阻害剤として同定された。４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸は、ほとんどのＧＳＫ−３／Ｓｈａｇｇｙ様キナーゼを阻害することによって植物において構成的なブラシノステロイド反応を誘導する非ステロイド化合物である。シロイヌナズナは、４群に細分できる１０個のＡＳＫ（シロイヌナズナＧＳＫ−３／Ｓｈａｇｇｙ様キナーゼ）を有する。群Ｉのキナーゼ（ＡＳＫα、ＡＳＫγおよびＡＳＫε）および群IIのキナーゼ（ＢＩＮ２、ＡＳＫζおよびＡＳＫι）は、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸に対して最も感受性が高い。群IIIのキナーゼＡＳＫθは中程度に阻害されるが、第２の群IIIのキナーゼであるＡＳＫβは阻害されない。群IＶのキナーゼであるＡＳＫδも、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸に対して非感受性である。この特異性の理由は未知である。

ブタン酸、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソ−メチルエステルは、ＣＡＳ登録番号６９７２３１−４６−２を有する。Ｂｕｒｄｕｌｅｎｅら（非特許文献６）は、とりわけ、ビキニンを生成する２−アミノ−５−ブロモピリジンの無水コハク酸との反応について説明している。特許文献１は、植物の成長を促進するＮ−置換アミノ酸を開示している。

Ａｓａｍｉら（非特許文献７）は、農薬科学における小分子に関する一般知識を報告している。Ｏｓｔａｓｚｅｗｓｋｉら（非特許文献８）は、一および二置換のピリジンアミドエステルの分子配座に関する研究を開示している。Ｒｏｍｅら（非特許文献９）は、置換ピリジン４−オンに関して報告しており、特許文献２は、非ステロイドブラシノステロイド模倣体を開示している。

英国特許第１１６２７２７号明細書国際公開２００８／０４９７２９号パンフレット

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本発明の目的は、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸に類似した、ブラシノステロイドのシグナル伝達の更なる阻害剤を提供することである。好ましくは、新規の阻害剤の生体内の阻害活性は、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸の阻害活性よりも高い。

したがって、本発明は、式（Ｉ）

（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、
Ｒ^１は、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_２Ｈ_４Ｒ^３、Ｃ_２Ｈ_３Ｒ^３Ｒ^４、Ｃ_３Ｈ_７、Ｃ_３Ｈ_６Ｒ^３、またはＣ_３Ｈ_５Ｒ^３Ｒ^４であり、
Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_２Ｈ_４Ｒ^３、またはＣ_２Ｈ_３Ｒ^３Ｒ^４であり、
Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｘ、ＯＨまたはＮＨ_２である）
の化合物を植物の処理のために、特に、植物の成長を増大させるために、収穫量を増加させるために、および／またはストレスに対する抵抗性を与えるために使用する方法を提供する。

Ｒ^１が、プロピル残基（すなわち、化合物がプロピル−エステルである）、である化合物において、Ｃ_３Ｈ_７、Ｃ_３Ｈ_６Ｒ^３、又はＣ_３Ｈ_６Ｒ^３Ｒ^４は、外側のＣ原子を介して（ｎ−プロピル）または中央のＣ原子を介して（ｉ−プロピル）カルボニルにＯ原子を越えて結合していてもよい。

本発明は、任意選択的にハロゲン、ＯＨまたはＮＨ_２で置換した、低分子脂肪族アルコールとの４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸のエステル改変体を提供する。本発明に従う４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸のこれらのエステル改変体（Ｒ１＝Ｈ）のメンバーは、植物投与（取扱い及び植物または植物細胞による生体内での取り込み）に関して改良した物理化学特性を有する。この群の少なくともいくつかのメンバーは、驚くべきことに、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸と比較して、ブラシノステロイドのシグナル伝達に関与するキナーゼに対する生体内での（すなわち、植物または植物細胞への投与の過程において）向上した阻害活性を示すことが示されたことを本発明によって示すことができる。

特に、式（II）

を有する化合物、すなわち、４−［（５−ヨードピリド−２−イル）アミノ］−４−オキソブタン酸メチルエステルは、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸と比較して生体内において大きく改善した効果を示した。また、式（II）のＣｌおよびＢｒ改変体も、特に好ましい。他の好ましい化合物は、式（Ｉ）のエチル化した形であり、すなわち、Ｒ^１がＣ_２Ｈ_５であり、Ｒ^２がＨである化合物である。このエチル化した形において、Ｉ−、Ｂｒ−およびＣｌ−化合物が好ましい。

本発明に従う化合物は、例えば、植物の成長、生物的および／もしくは非生物的ストレスへの抵抗性または収穫量を増進させるための植物技術において用いることができるブラシノステロイド模倣体である。本発明を用いて、バイオマス収量を増加させることができる。

本発明の他の態様は、有効量の式（Ｉ）または（II）に従う化合物を含む、植物の成長および／または収穫量を増進させる組成物に関する。「有効量」は、実験室規模の設定を現場処理に応用することによって、当業者によって容易に調節できる。本発明に従う化合物は、それぞれの分野における状況によって適切に有効な濃度で用いることができる。適切な濃度は、低〜中程度のμｍｏｌ／ｌの範囲、例えば、１〜５００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜１００μｍｏｌ／ｌである。本発明に従う化合物は、植物技術および農業において適切および許容できる有機溶媒、好ましくはＤＭＳＯまたはエタノールに溶解し、水または、緩衝液および／もしくは植物成長促進化合物および／もしくは植物保護剤の水溶液で所定の濃度に希釈する。

本発明によると、本発明に従う組成物は、植物の処理に適用される。特に好ましい実施形態によると、式（Ｉ）または（II）に従う化合物は、除草剤として用いられる。植物の成長を促進するための使用は、１〜１０マイクロＭの濃度範囲またはそれ未満において通常達成されるが、除草剤としての使用を、好ましくは、５０マイクロＭまたはそれより多い、例えば、５０〜５００マイクロＭの濃度で行う。

また、本発明は、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンを、ハロゲン化メチルスクシニル、好ましくはメチルスクシニルクロリドと反応させる、式（II）に従う化合物の製造方法にも関する。２−アミノ−５−ヨード−ピリジンを、第３級アミン、好ましくはトリエチルアミンも（好ましくは、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンと比較してモル過剰（特に１０〜４０％）で）含有する適切な溶媒、好ましくはテトラヒドロフランに溶解させる。その後、ハロゲン化メチルスクシニル（好ましくは、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンと同じ溶媒中の）を加え（好ましくは、少ないモル過剰（特に２〜１０％）で）、温度が５０℃を越えて、好ましくは４５℃を越えて、特に４０℃を越えて上がらないようにする。反応物を、その後、さらに５〜６０分間、２０〜４０℃、特に室温（２５℃）で撹拌してもよい。その後水を加え、ｐＨを、６．５未満、特に約６に下げる（好ましくは、塩酸を加えることによって）。次に、生成物を、適切な抽出溶媒、例えばジエチルエーテルで抽出し、洗浄する（例えば、１％酢酸等の希釈した弱酸で）。残留する水を、減圧下でエーテルを蒸発させる前に、無水硫酸ナトリウム等の吸湿性物質で除去する。再結晶は、例えば、９５％エタノールまたはトルエンから行うことができ、ほぼ白色の生成物を得ることができる。

また、本発明は、式（III）

に従う化合物を製造し、その後エステル化またはアルキル化して、式（II）に従う化合物（ＸはＩであり、Ｒ^２はＨである）を得る方法にも関する。本発明に従うこの方法は、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンを無水コハク酸と反応させて、式（III）を有する化合物を得ることを特徴とする。この化合物のカルボキシル基を、その後、エステル化またはアルキル化して、式（II）を有する化合物を得ることができる。

より詳細には、式（III）に従う化合物を製造するには、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンを、適切な溶媒、好ましくはテトラヒドロフランに溶解させる。その後、無水コハク酸（好ましくは、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンと同じ溶媒中の）を加え（好ましくは、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンと比較してモル過剰（特に１０〜４０％過剰）で）、混合物を、望ましい程度まで反応を行うのに適切な時間、好ましくは３０分〜５時間、より好ましくは１〜４時間、特に２時間還流する。粗生成物を、反応物を例えば４℃に数時間（例えば１〜１０時間）冷却することによって得てもよい。粗生成物を、例えば９５％エタノールから再結晶してもよい。

式（III）に従う遊離酸を、その後、ハロゲン化メチル、硫酸ジメチルもしくはジアゾメタンを用いてアルキル化するか、または、ＣＨ_３−ＯＨでエステル化して、式（II）に従う物質を得てもよい。

本発明の好ましい実施形態において、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンを、メチルスクシニルクロリドと反応させる。

本発明を、さらに、以下の実施例および図面によって説明する。

図１は、いくつかのピリジルアミノ誘導体が生体外でＡＳＫを阻害することを示す図である。ＧＳＴ−ＡＳＫ融合タンパク質を、基質としてＭＢＰを、補助基質としてγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰを用いて、異なる誘導体（表１に対応する番号）の非存在下（−）または存在下でインキュベートした。化合物１〜９（左パネル）は、脂肪族側鎖において異なる。複素環の窒素の位置の影響を、化合物３〜１１（中央パネル；示した分子構造は化合物１１を示す）を用いて試験した。右のパネルは、ピリジン環のハロゲン置換の効果を示す。化合物を、１０μＭの濃度で用いた。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、取り込まれた放射性リン酸をストレージ・フォスファー・イメージャー・スクリーン（ｓｔｏｒａｇｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒｓｃｒｅｅｎ）で検出した。図２は、化合物１５が、最も高い効力を示すことを示す図である。ＧＳＴ−ＢＩＮ２を、ＭＢＰおよびγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰで、１０μＭの濃度の化合物３、１４および１５の非存在下または存在下でインキュベートした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＭＢＰのリン酸化をホスホ・イメージャー・スクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒｓｃｒｅｅｎ）で定量化した。残留する活性を、対照の％で表す。平均および標準偏差を４個の独立したアッセイから計算した。図３は、ブラシノステロイド突然変異体の表現型への影響を示す図である。ブラシノステロイド合成変異体ｃｐｄおよびシグナル伝達変異体ｂｒｉｌ−１の７日齢の苗を、１μＭエピブラシノライド（Ｅｐｉ−ＢＬ）または３０μＭの濃度の化合物１０および１５を含む１／２ＭＳ培地に移動させ、長日条件下で７日間インキュベートした。すべての写真は同じ倍率で撮影した。バーは１ｍｍを示す。図４は、化合物１０および１５が、生体内での強力な阻害剤であることを示す図である。シロイヌナズナのプロトプラストを、ＢＺＲ１−ＣＦＰおよびＭｙｃタグを付けたＡＳＫζの発現コンストラクトで同時形質転換し、化合物１０および１５の濃度を上昇させて処理した。ＢＥＳ１−ＣＦＰおよびＡＳＫζ−Ｍｙｃを、それぞれポリクローナル抗ＧＦＰ抗体およびモノクローナル抗Ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロット分析によって検出した。クマシーＲ２５０染色を、負荷対照として示す。ＡＳＫζキナーゼ活性に依存して、ＢＺＲ１−ＣＦＰが、リン酸化または非リン酸化形態において観察できる（矢印で示す）。このタンパク質の翻訳後修飾を示す２つのＡＳＫζ−Ｍｙｃバンドの比は、阻害剤の投与によって影響されなかった。図５は、エステル化化合物が、植物体においてすばやく加水分解されることを示す図である。シロイヌナズナの苗に、５０μＭの化合物１０を含む１／２ＭＳ培地を染みこませた。対照のサンプルを、染みこませる前に取り（Ａ）、ＨＰＬＣで分析した。化合物１０の生体内変換生成物（Ｐの印を付す）を１５分後に観察することができた（Ｂ）。化合物１０、１５、および１７（それぞれＣ１０、Ｃ１５およびＣ１７とラベル付けした）の混合物のクロマトグラムを比較のために示す（Ｃ）。クロマトグラム内に入れた小さい囲みは、２２０〜３６０ｎｍの範囲におけるピークのＵＶスペクトルを示す。ｍＡＵ、すなわちミリ吸収単位は、２５０ｎｍで記録した。図６は、メチル化が、組織透過性を増加させることを示す図である。シロイヌナズナの苗を、１／２ＭＳ培地中の化合物１０および１５の５０μＭ溶液においてインキュベートした。示した時間の後にサンプルを取り、化合物１５の原位置での値をＨＰＬＣによって分析した。直線は化合物１０でインキュベートした植物についての結果を示し、点線は化合物１５についての結果を示す。平均および標準偏差は、独立した３個のアッセイから計算した。

脂肪族側鎖の長さおよび立体配置に加えて、複素環の窒素の位置の重要性を、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸と類似の構造を有する多くの誘導体を合成し、２〜６個の炭素原子の間で脂肪族側鎖の長さを変化させることによって解明した。さらに、その立体構造を、二重結合を誘起することによって変化させた。より高活性な阻害剤を得るため、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードの置換基をピリジン環の５位に有する誘導体を調製した。合成した化合物を生体外および生体内で試験した。さらに、選択した化合物の細胞透過性を決定した。

材料および方法
化学物質
化合物の合成に用いた化学物質は、フルカ（Ｆｌｕｋａ）社（ブックス，スイス）またはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社（シュタインハイム，ドイツ）から購入した。ＨＰＬＣおよびＴＬＣの溶媒は、ロス（Ｒｏｔｈ）社（カールスルーエ，ドイツ）から購入した。

合成
反応化合物および生成物の収率を表１に記載する。

方法Ａ：１５ｍｌのテトラヒドロフラン（無水フタル酸については１０ｍｌ）に溶解した２５ｍＭのジカルボン酸溶液を、還流冷却器を備えた丸底フラスコに入れ、１０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した２０ｍＭのアミンを加えた。混合物を２時間還流した。反応の最後に生成物の結晶化を開始した。結晶化を、数時間４℃に冷却することによって完了させた。粗生成物を吸引濾過し、フタル酸誘導体以外は９５％エタノールから再結晶化し、フタル酸誘導体は８０％アセトニトリルから再結晶した。

方法Ｂ：３０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した２０ｍＭの２−アミノ−５−ニトロピリジンの溶液を丸底フラスコに入れ、２５ｍＭの固体の無水コハク酸を加えた。還流冷却器をフラスコに取り付け、混合物を２時間穏やかに沸騰するように加熱した。その後、反応混合物を数日間−２０℃に冷却した。粗生成物を吸引濾過し、熱水から再結晶化した。

方法Ｃ：２０ｍＭのアミンを、４０ｍｌのテトラヒドロフランおよび３．５ｍｌの（２５ｍＭ）トリエチルアミンの混合物に溶解し、還流冷却器、滴下漏斗および温度計を備えた三首丸底フラスコに入れた。反応混合物を磁性撹拌によって撹拌した。１０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解した２１ｍＭの酸塩化物の溶液を、滴下漏斗を通して、温度が４０℃を越えて上昇しない速度でゆっくり加えた。塩化物を完全に加えた後、反応物をさらに１５分間室温で撹拌した。その後、混合物を２００ｍｌの冷水に加え、希釈塩酸を用いてｐＨを６とした。生成物を、各回５０ｍｌのジエチルエーテルで３回抽出し、合わせたエーテル抽出物を５０ｍｌの１％酢酸で洗浄した。残りの水を、減圧下でエーテルを蒸発させる前に無水硫酸ナトリウムで除去した。黄色がかった残留物を９５％エタノール（クロロ誘導体）またはトルエン（ヨード誘導体）から再結晶化して、ほぼ白色の生成物を得た。

方法Ｄ：２１ｍＭの酸塩化物を１０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、方法Ｃに記載した２０ｍＭの２−アミノ−５−クロロピリジン、３．５ｍｌの（２５ｍＭ）トリエチルアミンおよび４０ｍｌのテトラヒドロフランの混合物に加えた。混合物を、１５分間撹拌した後、濾過してトリエチルアミン塩酸塩を除去した。固体を１０ｍｌのテトラヒドロフランで洗浄し、合わせた濾液を減圧下で蒸発させた。オキサリル誘導体の場合、残留物を９０ｍｌの９５％熱エタノールに溶解し、溶液をまだ熱いうちに濾過した。混合物を撹拌し、１０ｍｌの水に溶解した４０ｍＭのＫＯＨを、温度が４０℃を越えて上昇しないような速度で加えた。反応を、さらに１０分間撹拌することによって完了させた。生成物は、吸引で収集した白色カリウム塩として分離した。沈殿物を１００ｍｌ（ヨード誘導体：２５０ｍｌ）の熱水に溶解し、濾過した。塩酸を熱い濾液にｐＨ２となるまで加えた。生成物を、４℃で一晩のインキュベーションにおいて遊離酸として分離した。生成物を、さらに９５％エタノールから再結晶化することによって精製した。

マロニルおよびアジポイル誘導体の場合、残留物を２００ｍｌのＭｅＯＨに溶解し濾過した。溶液を、還流冷却器、滴下漏斗および温度計を備えた三首丸底フラスコに入れ、５０℃に加熱した。混合物を撹拌する間、４０ｍｌの水に溶解した４０ｍＭのＫＯＨを滴下漏斗を通してすばやく加え、温度を５０℃に維持した。反応を、同じ温度でさらに１０分間撹拌することによって完了させた。余剰のＫＯＨを、１０ｍｌの水に溶解した４０ｍＭのＮＨ_４Ｃｌを加えることによって中和した。ほとんどの溶媒を、減圧下で除去し、残留物を水（約２００ｍｌ）に溶解し濾過した。ギ酸を透明な濾液にｐＨ３になるまで加えた。生成物を、４℃で一晩のインキュベーションにおいて白色結晶として分離した。マロニルおよびアジポイル誘導体を、それぞれ９５％または５０％のエタノールからの再結晶化によって精製した。

合成化合物の純度分析
薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）：化合物をエタノールに溶解し、ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｆ２５４ｐｒｅ−ｃｏａｔｅｄｓｈｅｅｔ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社，ダルムシュタット，ドイツ）上にスポットした。プレートを、酢酸エチル／石油エーテル／酢酸／水＝１００／６０／１／１の混合物で展開させた。蛍光消失が、短波長ＵＶ（２５４ｎｍ）でプレートを照射することによって観察した。いくつかの化合物は、中波長ＵＶ（３０２ｎｍ）下で観察された自己蛍光を示した。

高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇａｒｐｈｙ，ＨＰＬＣ）：ＨＰＬＣシステムは、ＤｉｏｎｅｘＰ６８０ポンプ、ＡＳＩ−１自動サンプラーおよびＰＤＡ−１００フォトダイオードアレイ検出器を有するものであった。このシステムは、Ｖａｌｃｏ２μｍインラインフィルターの前にＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ２５０ｍｍ×４ｍｍＮｕｃｌｅｏｓｉｌ１００−５Ｃ１８カラムを備えていた。１ｍｌ／分の一定流速を、溶媒Ａ（２０ｍＭ酢酸をＮａＯＨでｐＨ４．８に設定した１５％アセトニトリル溶液）および溶媒Ｂ（２０ｍＭ酢酸をＮａＯＨでｐＨ４．８に設定した６０％アセトニトリル溶液）の勾配で維持した。溶出は、１分間の溶媒Ａの定組成流で始めた。その後、溶媒Ｂの濃度を１９分で１００％に直線的に上昇させ、さらに２分間定組成を維持した後、１分以内に０％に減少させた。カラムを、次のサンプルを注入する前に溶媒Ａで５分間平衡化した。ＵＶスペクトルを２２０〜４００ｎｍで１ｎｍ間隔で記録した。定量化のため、１０ｎｍのバンド幅を有する２５０ｎｍでの吸光度を用いた。

ｐＫ_ａ値の決定
５０〜１００ｍｇの化合物の重量を測定し、５０ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）メタノールに溶解した。標準溶液として５０ｍＭのＮａＯＨを用いた滴定曲線を、グライジンガー・エレクトロニクス社の（Ｇｒｅｉｓｉｎｇｅｒｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）ＧＰＨＲ１４００ＡｐＨメーターを用いて記録した。当量点を、差の商（ΔｐＨ／ΔＶ_ＮａＯＨ）によって決定し、ｐＫ_ａを５０％中和での滴定曲線から読み取った。

生体外および生体内でのキナーゼ分析
ＡＳＫを、大腸菌ＢＬ２１におけるＧＳＴ融合タンパク質として表した。生体外でのキナーゼアッセイは、５０ｎｇのＧＳＴ融合タンパク質、基質として１０μｇのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；シグマ社，セントルイス，ミズーリ州）、および補助基質として０．１５ＭＢｑのγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰを２５℃で３０分間インキュベートすることによって行った。反応緩衝液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭＥＧＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴから構成されていた。最初の実験のため、コールドのＡＴＰを最高３μＭの濃度でインキュベートした。反応生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＭＢＰに入った放射能量を、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社のストレージ・フォスファー・イメージャー・スクリーンおよびバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）社のＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸを用いて定量化した。生体内のキナーゼ活性を、基質としてＢＺＲ１−ＣＦＰを用いてリン酸化のバンドシフトによって検出した。

生理学的試験
シロイヌナズナのＣｏ１０またはｂｒｉｌ−１の苗を、成長キャンバにおいて１％スクロースを含む１／２ＭＳプレート上で生体外で長日条件下（１６時間の５０μＥ・ｍ^−２・ｓ^−１による明期、８時間の暗期）で７日間成長させた。その後、異なる濃度の阻害剤を追加したプレートに移動し、表現型への影響を７日後に観察した。

植物の抽出物のＨＰＬＣ−分析
２週齢のシロイヌナズナのＣｏ１０の苗に、以前説明したように（Ｒｏｚｈｏｎら、２００５）、１／２ＭＳまたは１００μＭの化合物１０を含む１／２ＭＳを真空で染みこませた。１５分後および４８時間後にサンプルを取り、水で洗って、液体窒素中で砕いて微粉にした。１００ｍｇの粉末を反応管に量りとり、１ｍｌの抽出緩衝液（２０％のアセトニトリルに溶解した２０ｍＭＴＲＩＳ／ＨＣｌｐＨ６．８）を加えた。３０分間、８００ｒｐｍに設定したシェーカーにおいてのインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上澄みを０．２μｍのフィルターを通して濾過した。抽出物を、上述と同じ設定でのＨＰＬＣによって分析した。

細胞透過性分析
２週齢のシロイヌナズナのＣｏ１０の苗を、５０μＭの阻害剤を含む１／２ＭＳ培地に移動した。表示の時点後にサンプルを除去し、水で洗い、濾紙で乾燥して液体窒素にて凍結した。分析のため、植物材料を液体窒素で予め冷却した乳鉢で砕いて微粉にした。約１００ｍｇの粉末を１．５ｍｌの反応管に量り取り、１ｍｌの２０ｍＭＴＲＩＳ／ＨＣｌｐＨ９．０を加えた。化合物４の２００μＭのストックの５０μｌを内部標準として加えた。抽出を、８００ｒｐｍに設定したエッペンドルフ社のサーモミキサーにおいて８０℃で３０分間行った。抽出物を、５分間、１５，０００ｇで遠心分離し、透明な上澄みを収集した。透明な溶液を、２５μｌの４Ｍリン酸を加えることによって酸性にし、２分間、１５，０００ｇで遠心分離した。上澄みを、１ｍｌのアセトニトリルおよび２回の１ｍｌの１００ｍＭのリン酸で条件設定したＰＨ１００ｍｇ固相抽出カートリッジ（バリアン（Varian）社，レイクフォレスト，カリフォルニア州）上にすぐに負荷した。カラムを１ｍｌの１００ｍＭリン酸で洗浄し、１分間真空にすることによって乾燥した。その後、溶出を５％のアセトニトリルを含む１ｍｌの１００ｍＭＴＲＩＳ／ＨＣｌｐＨ９．０で行った。溶出液を、１５μｌの４Ｍリン酸を加えることによって酸性にし、上述したようにＨＰＬＣに用いた。

結果
合成
４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸および他の誘導体を、置換アミノピリジンおよび環状カルボン酸無水物またはジカルボン酸モノメチルエステルの塩化物からアミドを形成することによって調製した（表１）。最後の場合、その後、必要があればメチル基をアルカリ加水分解によって除去した。純度をＴＬＣおよびＨＰＬＣによって確認した。１個のスポットのみを展開したＴＬＣプレート上で観察することができ、所望の化合物のピークは、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるすべてのピークの全面積の少なくとも９５％を示した。

生体外でのＡＳＫの阻害
４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸は、群Ｉおよび群IIのＡＳＫの強力な阻害剤である。群IIIのＡＳＫであるＡＳＫθは、中程度に阻害される。このクラスの第２キナーゼであるＡＳＫβおよび群IＶのキナーゼＡＳＫδは阻害されない。すべての群の代表例を、大腸菌における組み換えＧＳＴ融合タンパク質として表した。選択したＡＳＫ上の合成化合物の効力を、基質としてＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）および補助基質としてγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰを用いて生体外でのキナーゼアッセイによってアッセイした（図１）。

化合物１〜５を合成して、脂肪族側鎖の長さの変化の効果を調べた。最も活性の高い化合物であるｎｏ．３は、４個の炭素からなる鎖を有していた（図１）。グルタリル（ｎｏ．４；５個の炭素）およびアジポイル（ｎｏ．５；４個の炭素）の誘導体は非常に低い効力を有していたが、より短い誘導体（ｎｏ．１および２；それぞれ２個または３個の炭素）は、ほとんど効果がなかった。二重結合を最適な長さの側鎖に導入すると、完全に効力をなくした（図１、化合物６）。これは、立体配置が非常に重要であることを示す。脂肪族鎖のカルボキシル基が活性に重要であるかどうか、またはオキソ基が十分であるかどうかを試験するため、それぞれ、化合物３および１５のメチル化改変体である化合物９および１０を含めた。さらに、化合物３の構造異性体である化合物８を試験した。図１において示すように、メチル化改変体は、阻害効果を非常に小さくし、末端カルボキシル基が重要であることを確認した。

最適な側鎖を特定すべく、複素環をより詳細に調べた。化合物３および１１は、共にアミドスクシニル側鎖を有するが、複素環の窒素の位置において異なる。生体外でのキナーゼアッセイは、化合物３がより強力であることを明らかにし（図１）、複素環の窒素は、アミドのコハク酸の置換基を持つ位置の隣でなければならないことを示した。これまでのデータは、ピリジン環の５位の臭素置換基が、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸の生物活性に重要であることを示した。他の置換基の効果を試験するため、化合物１２〜１６を合成した。図１に示すように、クロロ誘導体、ブロモ誘導体および特にヨード誘導体は、非常に活性が高かった。この効力の順は、ＢＩＮ２の残留キナーゼ活性の定量化によって確認できた（図２）。逆に、フルオロ化合物は非常に低い効力を示し、未置換およびニトロ誘導体は不活性であった。

すべての試験した化合物は、ＡＳＫに対して類似した特異性を有していた。活性誘導体は、ＡＳＫα、ＢＩＮ２、ＡＳＫζを強く阻害したが、ＡＳＫθは中程度にしか阻害されなかった。ＡＳＫβおよびＡＳＫδへの試験物質の効果はごくわずかであった。

生体内でのＡＳＫの阻害
ＡＳＫ活性の下方制御は、ブラシノステロイドのシグナル伝達において重要である。ＡＳＫは、それぞれ、ブラシノステロイド生合成またはシグナル伝達において欠陥があるｃｐｄおよびｂｒｉｌ−１変異体において構成的に活性である。これは、暗緑色の下向きに巻かれた葉および短縮された胚軸を有する重度に矮化した植物をもたらすものである。エピ−ブラシノライド、合成ブラシノステロイドを与えるとｃｐｄを救うがｂｒｉｌ−１を救わず、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸は両方の変異体を救う。生体内での効力をスクリーニングするため、ｃｐｄおよびｂｒｉｌ−１変異体を、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸誘導体を３０μＭの濃度で含む培地に移動した。活性化合物で処理した苗は、広がった葉、胚軸の長さの増加を示し、明るい緑色であった。表現型を助けるための効力は、生体外分析の結果と関連していた。しかしながら、興味深いことに、化合物１０は、生体内では高い活性を有するが、生体外ではほんの少しの効力を示した（図３）。

この予想外の結果のために、生体内でのＡＳＫ活性への阻害剤の効果を、直接的な方法によって分析した。いくつかのＡＳＫは、転写因子ＢＺＲ１、ＢＥＳ１およびＢＥＨ２を生体内でリン酸化することが示されている。これによって、これらの転写因子の電気泳動の移動度のシフトをもたらし、該シフトによって生体内でのキナーゼ活性を検出することが可能となる。シロイヌナズナのプロトプラストを、ＣＦＰタグを付したＢＺＲ１およびＭｙｃタグを付したＡＳＫζのコンストラクトで同時形質転換した。これらの２つのタンパク質を、プロトプラスト系においてよく発現することから選択した。形質転換したプロトプラストを、異なる濃度の化合物１０および１５並びにＢＺＲ１−ＣＦＰ並びにＡＳＫζ−Ｍｙｃでインキュベートし、その後、ウエスタンブロッティングによって分析した。表現型試験に従って、エステル化した化合物１０は、その遊離酸の対応するもの１５と同様に高い活性を有していた（図４）。同様の結果が対の３および９についても得られた。

３つの矛盾する結果を調べるため、化合物１０の生体内での運命を調べた。苗に化合物１０を染みこませ、植物抽出物をその後ＨＰＬＣによって分析した。微量の化合物１０のみ観察できたが、Ｐで示した新規のピークが現れた（図５Ａおよび５Ｂ）。このピークは、１０．７分の保持時間および２５２および２９２ｎｍでの吸収最大を有するＵＶスペクトルによって化合物１５と特定できた（図５Ａおよび５Ｂ）。したがって、化合物１０は生体内で安定でないが、非常に高い活性の１０に迅速に変換され、化合物１０の生体外および生体内での異なる効力を説明するものであった。同様の結果が対の３および９について得られた。

組織透過性
物質の細胞透過性は、その生体内での効力に影響を与える重要な特性である。化合物１０および１５の植物による取り込みを、これらの化合物の溶液での苗の処理およびその後の内在した阻害剤の濃度の定量化によって決定した（図６）。化合物１０は迅速に１５に変換されるため、１５の原位置での濃度のみを測定した。両方の化合物の原位置での濃度は最初の３時間で増加し、その後水平状態に達した。重要なのは、植物内部の濃度が培地の濃度を超過したことに注目することである。５０μＭが培地に存在したが、化合物１５の場合は約９０μＭの原位置での濃度が測定でき、化合物１０を与えた場合は最高１９０μＭであった。したがって、メチル化した化合物はより高い組織透過性を示し、植物中でより高い濃度に達した。

近年、変異体の分析によってシロイヌナズナにおけるブラシノステロイドのシグナル伝達の理解が著しく発展した。現在、３個のブラシノステロイド受容体および１個の共受容体が知られている。少なくとも４個のＡＳＫは、６個のＢＥＳ１／ＢＺＲ１様転写因子のリン酸化に関与すると思われ、４個のホスファターゼが、それらを非リン酸化の形態に変換して戻すこと能力がある。これらのタンパク質はすべて阻害剤の可能性のある標的である。変異体と比較して阻害剤の注目すべき利点は、異なる遺伝的な背景および種にすぐに適用できる点である。さらに、単一の変異体は、多くの場合、機能的冗長性のために表現型を示さないか、または弱い表現型を示す。相同タンパク質は多くの場合同じ化合物によって標的とされるため、機能的冗長性は阻害剤の研究によって克服できる。

多くの阻害剤は、ＡＳＫのヒトの相同体であるＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３βに利用可能である。しかしながら、これらの化合物を植物のＧＳＫ−３／Ｓｈａｇｇｙ様キナーゼに用いる試みは成功していなかった。化学遺伝学スクリーンにおいて、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸が、近年、ブラシノステロイドのシグナル伝達を特異的に妨げる第１の物質として同定された。遺伝子学的および生化学的アプローチによって、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］４−オキソブタン酸が、ＡＳＫの阻害によってブラシノステロイドのシグナル伝達において作用することが明らかとなった。ＧＳＫ−３／Ｓｈａｇｇｙ様キナーゼは、ホルモンのシグナル伝達の鍵となる制御因子であり、ストレス耐性を調節し、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸の作用をより理解することが非常に望ましい。

この問題に対処し、向上した効力を有する阻害剤を特定するため、４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］４−オキソブタン酸様の構造を有する多くの化合物を合成し、ＧＳＫ−３／Ｓｈａｇｇｙ様キナーゼに対するそれらの阻害効力を生体外および生体内で調べた。さらに、植物のこれらの化合物に対する表現型の反応を研究した。まず、カルボキシル基を含む脂肪族側鎖の長さの効果を分析した。予備結果が、クロロ誘導体がブロモ誘導体よりもいくらか強力であると示したため、２−アミノ−５−クロロピリジンを脂肪族側鎖の長さだけ異なる一連の化合物を合成するのに用いた。生体外でのキナーゼ分析によって、これらの化合物の阻害効力が４個の炭素原子の側鎖で最も高くなることが明らかとなった。さらに、立体配置が重要であった。シス二重結合を最適な数である４個の炭素原子から成る側鎖に導入すると、不活性な化合物となった（Ｎｏ．６）。シス二重結合によって、脂肪族鎖が曲げられ、末端カルボキシル基を別の位置に置く。このことおよび異なる側鎖の長さを有する化合物からの結果は、カルボキシル基が、ＡＳＫとの相互作用のための複素環についての正確な幾何学的な配置を有さなければならないことを示す。

末端カルボキシル基の重要性に関する証拠は、未置換の側鎖を有する誘導体から最初はもたらされた。しかしながら、これは、まだ水素の相互作用に関与する可能性があるエステル化カルボキシル基が十分であることを除外するものではない。したがって、それぞれ化合物２、３および１５のメチル化改変体である化合物８、９および１０を用いた。３個すべての物質は、試験したＡＳＫに対して生体外で活性をほとんど示さないか、または全く示さず、それによって、末端カルボキシル基は脂肪族鎖状に存在しなければならないことが確認された。メチル基はおそらくエステラーゼによってすばやく切り離されるため、生体内で化合物９および１０は活性を有し、したがって、カルボキシル基が再構成された。脂肪族鎖のカルボキシル基は細胞内のｐＨで荷電するため、ＡＳＫ、例えば、リジンまたはアルギニンの残基とのイオン性相互作用に関与する可能性がある。その代案として、水素結合に関与する可能性がある。同様に、ピリジン環の窒素も水素結合またはタンパク質とのイオン性相互作用に関与する可能性がある。ピリジン環のベンゼン環による置換によって劇的に阻害効力が減少することが示された。複素環の重要性をより詳細に調べるため、複素環の窒素の位置のみ高い活性の化合物３と異なる化合物１１を合成した。生体外での試験によって、１１が不活性であり、高い効力の阻害剤を得るためには複素環の窒素がアミドスクシニル側鎖の隣に位置しなければならないことが明らかとなった。興味深いことに、予備のデータが反対の効果を示唆していたが、本発明の結果は、化合物の活性が、ピリジン環の５位でのハロゲン置換基の原子の数とともに増大したことを示した。ヨード誘導体（ｎｏ．１５）は、最も高い活性を有していたが、フルオロ誘導体（ｎｏ．１３）は、最も低い効力を有していた。その疎水性のために、阻害剤のこの構造部分は、キナーゼとのファンデルワールス相互作用に関与する可能性がある。ファンデルワールス力に関して、相互作用する原子間の距離が重要である。距離が増加するとともにファンデルワールス力は急速に減少し、原子がもう一方の原子にかなり近いときのみ有効である。相互作用に最適な距離を表現するファンデルワールス半径は、元素周期表の群内の周期とともに増す。例えば、ファンデルワールス半径は、ヨウ素原子では０．２２ｎｍであり、フッ素原子では０．１４ｎｍである。その上、ピリジン環の炭素とヨウ素との間の共有結合の長さも他のハロゲンのものよりも長い。したがって、ヨード誘導体の構造は、ＡＳＫの疎水ポケットに結合するのに理想的な特性を有する。さらに、化合物の疎水性は、ＲＰ−ＨＰＬＣにおける保持時間の増加によって示したように（表１）、ハロゲン置換基の原子数とともに増大し、さらに疎水性相互作用を増強する。

組織透過性アッセイによって、化合物、特にエステル化した化合物の取り込みが早いことが明らかとなった。興味深いことに、原位置での濃度は、周囲の培地のものを数倍越えていた。これは、化合物のｐＫ_ａ値によって説明できる。例えば、誘導体１５は、５．８のｐＫａ値を有し、これは、用いた培地のｐＨであるｐＨ５．８において化合物の５０％が解離し、それ故に、負に荷電している一方で５０％が非解離であることを意味する。７．４の細胞内のｐＨで、化合物の３％未満が非解離である。非解離の親油性の形態は生体膜を効率的に通過するので、化合物は細胞において捕捉され、周りの培地の濃度を越える濃度に蓄積する。このｐＨ依存性の取り込みは、ｐＨが駆動する拡散が細胞内への輸送に寄与する、植物ホルモンのオーキシンに類似している。エステル化された化合物、例えばｎｏ．１０は、ｐＨに独立であり、高い親油性であり、膜を通過することができる。細胞において、該化合物は、親水性アニオンに脱プロトン化する対応する酸に迅速に加水分解される。興味深いことに、化合物１０の取り込みの速度は、化合物１５のものの約２倍であって、膜を通過して拡散することができる部分に相互に関連することに注目すべきである。化合物１０の１００％が親油性である一方で、化合物１５の５０％のみが非解離であり、それ故に十分に親油性である。これによって異なる取り込みの速度が説明できる。一緒に取り込むと、ヨード−４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸とも呼ぶ化合物１５は、生体外で最も効力が高い化合物であり、生体内で高い阻害活性を示した。そのメチル化改変体である、メチルヨード−４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ］−４−オキソブタン酸（化合物１０）は、非常に早い取り込みを示し、したがって、生体内の研究に最適なＡＳＫ阻害である。いくつかのＧＳＫ−３／Ｓｈａｇｇｙ様キナーゼがストレスに応じて迅速に活性化することが知られている。その優れた迅速な細胞透過異性により、メチルヨード−４−［（５−ブロモ−２−ピリジニル）アミノ−４−オキソブタン酸および関連する化合物は、早いストレスのシグナル伝達においてこのキナーゼのファミリーの役割を調べるのに役立つだろう。

（参考文献）
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Rozhon et al . , Anal Bioanal Chem 382 (2005), 1620-1627
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Sekimata et al . , Planta 213 (2001), 716-721
Vert et al . , Nature 441 (2006), 96-100

Claims

式（Ｉ）

（式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、
Ｒ^１は、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_２Ｈ_４Ｒ^３、Ｃ_２Ｈ_３Ｒ^３Ｒ^４、Ｃ_３Ｈ_７、Ｃ_３Ｈ_６Ｒ^３、またはＣ_３Ｈ_５Ｒ^３Ｒ^４であり、
Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_２Ｈ_４Ｒ^３、またはＣ_２Ｈ_３Ｒ^３Ｒ^４であり、
Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｘ、ＯＨまたはＮＨ_２である）を有する化合物を、植物の処理のために、特に、植物の成長を増大させるために、収穫量を増加させるために、および／またはストレスに対する抵抗性を与えるために使用する方法。
Ｒ^１はＣＨ_３であり、Ｒ^２はＨであり、ＸはＩであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
式（Ｉ）、好ましくは式（II）を有する化合物の有効量を含む、植物の成長および／または収穫量および／またはストレスに対する抵抗性を増大させるための化合物。
式（II）

を有する化合物。
２−アミノ−５−ヨードピリジンをメチルスクシニルクロリドと反応させることを特徴とする請求項４に記載の化合物の製造方法。
式（III）

（式中、ＸはＩであり、Ｒ^２はＨである）
を有する化合物の製造方法であって、２−アミノ−５−ヨード−ピリジンを無水コハク酸と反応させることを特徴とする、前記化合物の製造方法。
ＸはＩであり、Ｒ^２はＨである式（III）を有する化合物を、ハロゲン化メチル、硫酸ジメチルもしくはジアゾメタンを用いてアルキル化するか、または、ＣＨ_３ＯＨでエステル化する、式（II）を有する化合物の製造方法。
請求項１又は４に記載の式（Ｉ）または（II）を有する化合物を除草剤として使用する方法。