MX2010008559A - Inhibidores para señalizacion de brasinoesteroides. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto que tiene la fórmula (I), en donde X es F, Cl, Br, o I; R1 es CH3, C2H5, C2H4R3, C2H3R3R4, C3H7, C3H6R3 o C3H5R3R4; R2 es H, CH3, C2H5, C2H4R3 o C2H3R3R4; y R3 y R4 son, independientemente, X, OH o NH2, para el tratamiento de plantas, para incrementar el crecimiento de la planta.

Description

INHIBIDORES PARA SEÑALIZACIÓN DE BRASINOESTEROIDES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a inhibidores para la señalización de brasinoesteroides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los brasinoesteroides son hormonas esteroides vegetales involucradas en muchos procesos que incluyen, expansión y división celular, crecimiento del tubo de polen, desarrollo de tejido vascular, senescencia y modulación de respuestas a estrés. Los brasinoesteroides se forman de precursores esteróles. Muchas enzimas involucradas en la biosintesis de brasinoesteroides se identificaron por análisis de mutantes de Arabidopsis thaliana, tales como dwfl, cbbl, dwf4, cpd, det2 y stel/dwf7. Recientemente, e análisis de la mutación de tomate dx conduce a identificación de una enzima involucrada en la última etapa de la biosintesis de brasinoesteroide, la conversión de castasterona a brasinoesteroide, el brasinoesteroide más activo. Dos homólogos de Arabidopsis thaliana pueden ser identificados por un procedimiento de gen candidato. Estas enzimas y DWF4 y CPD, pertenecen a la familia de monooxigenasas del citocromo P450.

El brasinólido se percibe por el receptor de cinasa BRI1 y su co-receptor BAK1, el cual, distinto de receptores esteroides animales, localiza a la membrana celular. La señal es traducida por mecanismos aún desconocidos al núcleo y regula las cinasas similares a GSK-3/Shaggy involucradas en la señalización de brasinoesteroides : BIN2/UCU1, ASKD, ?d?? y ASKD (Vert and Chory, 2006) . Estos factores de transcripción fosforilan las cinasas que pertenecen a la familia BES1/BZR1, en una porción conservada que consiste de ocho repeticiones adyacentes de la secuencia SXXXS. La actividad de estos factores de transcripción es por este medio bloqueada, puesto que solamente sus variantes no fosforiladas pueden enlazarse al ADN y regular la expresión del gen. La desfosforilación se promueve por la fosfatasa BSU1 de la proteina nuclear y sus homólogos BSL1 a 3. Además, las proteínas 14-3-3 pueden enlazarse a BZR1 y BES1 fosforilados, lo cual podría promover su relocalización en el citoplasma.

Aunque un número de enzimas involucradas en la síntesis de brasinoesteroides y señalización se conocen, están disponibles muy pocos inhibidores. El primer inhibidor de síntesis de brasinoesteroide selectivo conocido fue KM-01 (Kim et al., 1998). Debido a su baja potencia, su aplicación fue muy limitada. Las observaciones de que el inhibidor de la biosíntesis del ácido giberélico, uniconazol, tiene un efecto ligeramente inhibitorio en la síntesis de brasinoesteroide, conduce al desarrollo de brasinazol (Min et al., 1999) y Brz2001 (Sekimata et al . , 2001) . De manera similar, otro inhibidor brasinoesteroide se identificó por modificación de propiconazol (Sekimata et al., 2002). El objetivo de la acción de brasinazol es el hierro heme de la monooxigenasa DWF4 del citocromo P450. El brasinazol ha sido usado ampliamente para estudiar la síntesis y efectos de brasinoesteroides . Además, el brasinazol se empleó para tamices genéticos para aislar mutantes que no responden a este compuesto. Esto conduce a la identificación del factor de transcripción BZRl.

El ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico es una monoamida de ácido succínico con 2-amino-5-bromopiridina . El bromo en la posición 5 del anillo piridina y el grupo de ácido carboxílico, se reconocieron como factores importantes por su actividad. Recientemente, se identificó el ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino ] -4-oxobutanoico como un inhibidor de la señalización de brasinoesteroide por procedimientos genéticos químicos. El ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico es un compuesto no esferoidal que induce las respuestas brasinoesteroides constitutivas en plantas, inhibiendo la mayoría de las cinasas similares a GSK-3/Shaggy . La A. thaliana posee 10 ASKs (cinasas similares a GSK-3/Shaggy de A. thaliana), que pueden ser subdivididas en 4 grupos. Las cinasas del Grupo I (ASKa, ASKD y ASKD) y cinasas del grupo II (BIN2, ???? y ASKD) son más sensibles al ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico . La cinasa del grupo III ASKD es moderadamente inhibida, mientras la cinasa del segundo grupo III, ASK3, no es inhibida. La ASKD, una cinasa del grupo IV, también es sensible al ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico . La razón para esta especificidad se desconoce.

El 4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxo-metiléster del ácido butanoico tiene un registro CAS no. 697231-46-2. Burdulene et al. (Pharm. Chem. J., 30 ( 1996) : 680-682 ) , describe i. a. la reacción de 2-amino-5-bromopiridina con anhídrido succínico para proporciona biquinina. El documento GB 1162 727 A, describe ácido ámicos N-sustituidos los cuales promueven el crecimiento de plantas.

Asami et al. (Capítulo 19 en "Pesticide Chemistry", (2007) , WILEY-VCH) , reporta el conocimiento general acerca de moléculas pequeñas en ciencia pesticida. Ostaszewski et al. (J. Molec. Struct., 474 (1999): 197-206), describe estudios en la conformación molecular de amidoésteres de piridina mono y di-sustituidos . Roma et al. (Bioo. Med. Chem., 8 (2000) : 751-768) , reporta acerca de pirimidin-4-onas sustituidas. El documento WO 2008/049729 Al describe miméticos brasinoesteroides no esteroidales .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar inhibidores adicionales de la señalización de brasinoesteroide, similar al ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico . Preferiblemente, la actividad inhibidora in vivo de los nuevos inhibidores, debe ser superior que la actividad inhibidora del ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico .

Por lo tanto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I) en donde X es F, Cl, Br, o I; R1 es CH3, C2H5, C2H4R3, C2H3R3R4, C3H7, C3H6R3 O C3H5R3R4 ; R2 es H, CH3, C2H5, C2H4R3 o C2H3R3R4; y R3 y R4 son, independientemente, X, OH o NH2, para el tratamiento de plantas, especialmente para incrementar el crecimiento de la planta, incrementar el rendimiento del cultivo y/o proporcionar resistencia al estrés .

En los compuestos en donde R1 es un residuo propilo (es decir, en donde el compuesto es un éster propilo) , C3H7, C3H6R3 o C3H5R3R4 pueden ser unidos sobre el átomo de 0 al carbonilo vía los átomos de C externos (n-propilo) o via el átomo de C central (i-propilo) .

La presente invención proporciona variantes de éster del ácido 4- [ ( 5-bromo-2- piridinil ) amino] -4-oxobutanoico, con alcoholes alifáticos menores, opcionalmente sustituido con halógeno, OH o NH2. Los miembros de estas variantes de éster de ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico (Rl = H) de conformidad con la presente invención, tienen propiedades fisicoquímicas mejoradas para administración a plantas (manejo y absorción in vivo por plantas o células vegetales) . Podrá mostrarse con la presente invención, que al menos algunos elementos de este grupo han mostrado de manera sorprendente, exhibir una actividad inhibidora in vivo mejora (es decir, en el curso de la administración a plantas o células vegetales) , para las cinasas involucradas en la señalización de brasinoesteroide, comparada con el ácido 4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico .

Específicamente, el compuesto tiene la fórmula (II) es decir, el éster metílico del ácido 4- [(5-yodopirid-2-il) amino] -4-oxobutanoico, ha mostrado un efecto in vivo significantemente mejorado comparado con el ácido 4-[( 5-bromo-2-piridinil ) amino ] -4-oxobutanoico . También, las variantes Cl y Br de la fórmula (II), son específicamente preferidas. Otro compuesto preferido es la forma etilada de fórmula (I), es decir, el compuesto en donde R1 es C2H5 y R2 es H. En esta forma etilada, se prefiere el compuesto I, Br y Cl.

Los compuestos de conformidad con la presente invención, son miméticos brasinoesteroides los cuales pueden ser usados en tecnología vegetal, por ejemplo, para intensificar el crecimiento de las plantas, resistencia al antibiótico y/o estrés abiótico o rendimiento del cultivo. Con la presente invención, es posible incrementar los rendimientos de la biomasa.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición para incrementar el crecimiento de la planta y/o rendimiento del cultivo, gue comprende una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con la fórmula (I) o (II). La "cantidad efectiva" puede ser fácilmente ajustada por un experto- en la técnica aplicando el ajuste de escala de laboratorio al tratamiento de campo. El compuesto de conformidad con la presente invención, puede ser aplicado a una concentración efectiva como sea apropiada por las circunstancias en el campo respectivo. Las concentraciones adecuadas pueden estar en el intervalo bajo a medio de µ????/?, por ejemplo, desde 1 hasta 500 µp???/?, preferiblemente desde 5 hasta 100 µp???/?. Los compuestos de conformidad con la presente invención, pueden ser disueltos en solventes orgánicos adecuados y permisibles en la tecnología vegetal y agricultura, preferiblemente DMSO o etanol, y diluidos a la concentración deseada con agua o soluciones acuosas de amortiguadores y/o compuestos que promueven el crecimiento vegetal y/o agentes protectores de plantas .

De conformidad con la presente invención, la composición de conformidad con la presente invención se aplica para el tratamiento de plantas. De conformidad con una modalidad específicamente preferida, los compuestos de conformidad con la fórmula (I) o (II) se usan como herbicidas. Mientras el uso para promover el crecimiento vegetal es usualmente efectuado en el rango de concentración de 1 a 10 microM o aún por debajo, el uso como herbicida es preferiblemente realizado a concentraciones de 50 microM o más, por ejemplo, entre 50 y 500 microM.

La presente invención también se refiere a un método para la preparación de un compuesto de conformidad con la fórmula (II), en donde una 2-amino-5-yodo-piridina se hace reaccionar con un metil succinil halogenuro, preferiblemente cloruro de metil succinilo. La 2-amino-5-yodo-piridina se disuelve en un solvente adecuado, preferiblemente tetrahidrofurano, que contiene también una amina terciaria, preferiblemente trietilamina (preferiblemente en un exceso molar (especialmente 10 a 40%) comparada con 2-amino-5-yodo-piridina) . Entonces, se agrega un metil succinil halogenuro (preferiblemente en el mismo solvente como 2-amino-5-yodo-piridina) (preferiblemente en exceso ligeramente molar (especialmente 2 a 10%) , de manera que la temperatura no se eleva arriba de 50°C, preferiblemente no arriba de 45°C, especialmente no arriba de 40°C. La reacción puede entonces ser además agitada por 5 a 60 minutos a una temperatura entre 20 hasta 40°C, especialmente a temperatura ambiente (25°C) . Se agrega entonces agua y el pH se reduce (preferiblemente por la adición de ácido clorhídrico) a un pH de por debajo de 6.5, especialmente a aproximadamente 6. El producto puede entonces ser extraído con un solvente de extracción adecuado, por ejemplo, dietiléter y se lava (por ejemplo, con un ácido débil diluido, tal como ácido acético al 1%) . El agua residual puede ser removida con sustancias higroscópicas, tales como sulfato de sodio anhidro, previo a la evaporación del éter bajo presión reducida. La recristalización puede ser realizada por ejemplo, desde 95% de etanol o tolueno para dar un producto casi blanco.

La presente invención también se refiere a un método para la preparación de un compuesto de conformidad con la fórmula (III) Y su esterificación subsecuente o alquilación para obtener un compuesto de conformidad con la fórmula (II) (X es I y R2 es H) . Este método de conformidad con la presente invención, se caracteriza en que se hace reaccionar 2-amino-5-yodo-piridina con anhídrido succínico para obtener un compuesto que tiene la fórmula (III) . El grupo carboxi de este compuesto puede ser subsecuentemente esterificado o alquilado para obtener un compuesto que tiene la fórmula (II) - En más detalle, para preparar un compuesto de conformidad con la fórmula (III), se disuelve 2-amino-5-yodo- piridina en un solvente adecuado, preferiblemente tetrahidrofurano . Después, se agrega anhídrido succínico (preferiblemente en el mismo solvente como 2-amino-5-yodo-piridina) (preferiblemente en exceso molar (especialmente 10 hasta 40% de exceso) , comparado con 2-amino-5-yodo-piridina) , y la mezcla se somete a reflujo por un tiempo apropiado para permitir a la reacción ser realizada en la extensión deseada, preferiblemente por 30 min hasta 5 h, más preferido por 1 hasta 4 h, especialmente 2 h. El producto crudo se puede obtener enfriando la reacción, por ejemplo, a 4°C por varias horas (por ejemplo, 1 a 10 horas) . El producto crudo puede ser recristalizado, por ejemplo, de 95% de etanol.

El ácido libre de conformidad con la fórmula (III), puede ser subsecuentemente alquilado usando metil halogenuro, sulfato de dimetilo o diazo-metano o esterificado con CH3-OH para obtener una sustancia de conformidad con la fórmula (II) .

En la modalidad preferida de la presente invención, se hace reaccionar 2-amino-5-yodopiridina con cloruro de metil succinilo.

La invención además se ilustra por los siguientes ejemplos y las figuras de dibujo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1: Varios derivados de piridilamino inhiben ASKs in vitro. Se incubaron proteínas de fusión GST-ASK con MBP como sustrato y D-[32P]-ATP como co-sustrato en la ausencia (-) o presencia de diferentes derivados (los números corresponden a la Tabla 1) . Los compuestos 1 a 9 (panel izquierdo), difieren en la cadena lateral alifática. La influencia de la posición del nitrógeno heterocíclico se probó con los compuestos 3 y 11 (panel de en medio; la estructura molecular mostrada representa el compuesto 11) . El panel derecho muestra el efecto del sustituyente halógeno del anillo piridina. Los compuestos se usaron a una concentración de 10 uM. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y el fosfato radioactivo incorporado detectado con una pantalla phosphorimager de almacenamiento.

Fig. 2: El compuesto 15 muestra la potencia más alta. Se incubó GST-BIN2 con MBP y D-[32P]-ATP en la ausencia o presencia de compuestos 3, 14 y 15 a una concentración de 10 uM. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y la fosforilación de MBP se cuantificó con una pantalla phosphorimager. La actividad residual se expresa en % del control. Las medias y desviaciones estándares se calcularon a partir de 4 ensayos independientes.

Fig. 3: Efectos en el fenotipo de mutantes brasinoesteroides . Plántulas de 7 días de edad del mutante de síntesis brasinoesteroide cpd y mutante de señalización bril-1, se transfirieron a medio 1/2 MS que contiene 1 uM de epi- brasinólido (Epi-BL) o compuestos 10 y 15 a una concentración de 30 uM y se incubaron por 7 días bajo condiciones de día largo. Todas las fotografías se tomaron a la misma amplificación. La barra representa 1 mm.

Fig. 4: Los compuestos 10 y 15 son potentes inhibidores in vivo. Se co-transfectaron protoplastos de A. thaliana con constructos de expresión de BZR1-CFP y ???? etiquetado con Myc y se trataron con concentraciones incrementadas de los compuestos 10 y 15. Se detectaron BES1-CFP y ????-??? por análisis de manchado western usando anticuerpos anti-Myc monoclonales y anti-GFP policlonales, respectivamente. El manchado R250 Coomassie se muestra como un control de carga. Dependiendo de la actividad de cinasa ????, se puede observar BZR1-CFP en una forma fosforilada o no fosforilada (indicada por flechas) . La relación de las dos bandas ASí^-Myc, que indica modificación post-traduccional de esta proteína, no fueron afectadas por la aplicación del inhibidor .

Fig. 5: Los compuestos esterificados fueron rápidamente hidrolizados en la planta. Las plántulas de A. thaliana se infiltraron con medio 1/2 MS que contiene 50 uM del compuesto 10. Las muestras de control se tomaron antes de la infiltración (A) y se analizaron por HPLC . Un producto de biotransformación (marcado P) del compuesto 10, puede ser observado después de 15 minutos (B) . Un cronograma de una mezcla de compuestos 10, 15, y 17 (etiquetado con CIO, C15 y C17, respectivamente), se muestra por comparación. Los cuadros pequeños insertados en los cromatogramas muestran el espectro UV de los picos en el intervalo de 220 a 360 nm. Las unidades de miliabsorción mAU, se registraron a 250 nm Fig. 6: La metilación incrementa la permeabilidad el tejido. Se incubaron plántulas de A. thaliana en 50 µ? de soluciones de los compuestos 10 y 15 en 1/2 de medio MS . Las muestras se tomaron después del tiempo indicado y los niveles in situ del compuesto 15 se analizaron por HPLC. La linea sólida representa los resultados para las plantas incubadas con el compuesto 10 y la linea punteada los resultados para el compuesto 15. Las desviaciones estándares y medias se calcularon a partir de 3 ensayos independientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLOS: La importancia de la longitud y configuración J estérica de la cadena lateral alifática, asi como también la posición del nitrógeno heterocíclico se puso en evidencia sintetizando un número de derivados con una estructura similar al ácido 4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico y variando la longitud de la cadena lateral alifática a partir de 2 átomos de carbono a 6. Además, su estructura estérica se modificó introduciendo un doble enlace. Para obtener un inhibidor más activo, se prepararon los derivados con sustituyentes fluoro, cloro, bromo y yodo en la posición 5 del anillo piridina. Los compuestos sintetizados se probaron in vitro e in vivo. Además, se determinó la permeabilidad celular de los compuestos seleccionados .

Materiales y Métodos Químicos Los químicos usados para la síntesis de los compuestos se adquirieron de Fluka (Buchs, Switzerland) o Aldrich (Steinheim, Germany) . Los solventes para HPLC y TLC fueron de Roth (Karlsruhe, Germany) .

Síntesis Los compuestos de reacción y rendimientos de los productos se listan en la Tabla 1.

Tabla 1: Compuestos sintetizados y sometidos a ensayo por actividad biológica Compuestos 1-10, 12-17 Compuesto No. Compuestos de reacción Método X R Rendim. IR , ,; ?2" pKac Cloruro de metil oxalilo de D Cl ""d?G 39% 5.6 254; 291 2-amino-5-c l orop iri di n a Cloruro de metil malonilo D Cl 30% 5.9 245; 287 de 2-amino-5-cloropiridina Anhídrido succiiiico de A Cl 54% 8.6 245; 287 2-amino-5-eloropiridina Anliídrido glutárico de A Cl 71% 9.9 245; 288 2-araino-5-cloropii'idin<i Cloruro de metil adipoilo D Cl 20% 11.5 245; 288 de 2-amino-5-cloropiridiiia Anhídrido ma eico de. A Cl 22% 15 222; 298 2-amino-5-cloropiridina Anhídrido itálico de A Cl 63% 9.1 249; 289 2~ i¡no-5-cloropir¡di 8 Cloruro de metil malonilo C Cl 41% 14.6 245; 287 de 2-amino-5-clorop:iridina 9 Cloruro de metil succinilo C Cl 33% 1.5.7 245; 288 de l-amino-S-clorapiriclina 10d Cloruro de metil succinilo 1 OCHA 30% 17.8 252; 293 de 2-amino-5-yodopiridina Y 11 Anliídrido succinico de A Cl 248; 284 5-aniino-2-cloropiridma 12 Anliídrido succinico A H 235; 276 4.9 de 2-aminopiridiiia 13 Anliídrido succinico de A F OH 68% 5.7 235; 283 2-ammo-5-íluoropiridina 14d Anhídrido succinico de A Br ,OH 65% 9.6 247;289 5.6 2-aniino-5-bromopiridina 15d Anliídrido succinico de A l 35% JO.7 252; 292 5,8 2-amino-5-yodopiridina 16 Anliídrido succinico de B NO2. 29% 9.1 221; 350 2-anmo-S-a ropitvdma O 17 Anhídrido succinico de D i OH 28% 1.7.9 253; 293 2-aniino-5-yodopiridina ? T iempo de retención en minutos b 7Absorción máxima en nm ( a pH 4 . 8 ) Se determina el pKa ( logaritmo decimal negativo de la constante de disociación) del grupo de ácido carboxilico en 50% (v/v) de metaño1.

Los compuestos 10, 14 y 15 son también llamados éster metílico del ácido 4- [ (5-yodopirid-2-il) amino] -4- oxobutanoico, ácido 4- [ ( 5-bromopirid-2-il ) amino] -4- oxobutanoico y ácido 4- [ (5-yodopirid-2-il) amino] -4- oxobutanoico, respectivamente Método A: Una solución de 25 mM de anhídrido de ácido dicarboxílico disuelto en 15 mi de tetrahidrofurano (10 mi para anhídrido itálico) , se colocó en un matraz de fondo redondo equipado con un condensador a reflujo y se agregaron 20 mM de amina disuelta en 10 mi de tetrahidrofurano . La mezcla se sometió a reflujo por 2 h. El producto comenzó a cristalizar al final de la reacción. La cristalización de completó por enfriamiento a 4°C por varias horas. El producto crudo se filtró con succión y se recristalizó de 95% de etanol, excepto el derivado de .ácido ftálico, el cual se recristalizó de 80% de acetonitrilo .

Método B: Una solución de 20 mM de 2-amino-5-nitropiridina disuelta en 30 mi de tetrahidrofurano, se colocó en un matraz de fondo redondo y se agregaron 25 mM de anhídrido succínico sólido. Un condensador a reflujo se ajustó al matraz y la mezcla se calentó a suave ebullición por 2h. Subsecuentemente, la mezcla de reacción se enfrió a - 20°C por varios días. El producto crudo se filtró con succión y se recristalizó de agua caliente. I Método C: Veinte inM de amina se disolvieron en una mezcla de 40 mi de tetrahidrofurano y 3.5 mi (25 mM) de ! trietilamina y se colocaron en un matraz de fondo redondo de triple cuello equipado con un condensador a reflujo, un ¡ embudo de goteo y un termómetro. La mezcla de reacción se ; agitó por agitación magnética. Una solución de 21 mM de cloruro de ácido disuelto en 10 mi de tetrahidrofurano se agregó lentamente a través del embudo de goteo a una velocidad que la temperatura no se eleva arriba de 40°C.

Después que el cloruro ha sido agregado completamente, la reacción se agitó por 15 min adicionales a temperatura ambiente. Subsecuentemente, la mezcla se agregó a 200 mi de agua fría y el pH se ajustó a 6 con ácido clorhídrico diluido. El producto se extrajo tres veces con 50 mi de éter dietílico cada uno, y los extractos etéreos combinados se lavaron con 50 mi de ácido acético al 1%. El agua residual se removió con sulfato de sodio anhidro previo a la evaporación del éter bajo presión reducida. El residuo amarillento se recristalizó de 95% de etanol (derivados de cloro) o tolueno (derivado de yodo), para dar un producto casi blanco.

Método D: Veintiún mM de cloruro de ácido se disolvieron en 10 mi de tetrahidrofurano y se agregaron a una mezcla de 20 mM de 2-amino-5-cloropiridina, 3.5 mi (25 mM) de trietilamina y 40 mi de tetrahidrofurano como se describe en el método C. La mezcla se agitó por 15 min previo a la filtración para remover el clorhidrato de trietilamina. Lo sólido se lavó con 10 mi de tetrahidrofurano y los filtrados combinados se evaporaron bajo presión reducida. En el caso del derivado oxalilo, el residuo se disolvió en 90 mi de etanol caliente al 95% y la solución se filtró mientras todavía está caliente. La mezcla se agitó y se agregaron 40 mM de KOH disuelto en 10 mi de agua a una velocidad que la temperatura no se eleva por arriba de 40°C. La reacción se completó por agitación por unos 10 minutos adicionales. El producto se separó como sal potásica blanca la cual se recolectó por succión. Los precipitado se disolvió en 100 mi (derivado de yodo: 250 mi) de agua caliente y se filtró. Se agregó ácido clorhídrico a lo filtrado hasta el pH 2. El producto se separó como el ácido libre durante la incubación a 4°C durante la noche. El producto además se purificó por recristalización de 95% de etanol.

En el caso de derivados de malonilo y adipoilo, el residuo se disolvió en 200 mi de MeOH y se filtró. La solución se colocó en un matraz de fondo redondo de triple cuello equipado con un condensador a reflujo, un embudo de goteo y un termómetro y se calentó a 50°C. Mientras se agita la mezcla, 40 mM de KOH disuelto en 40 mi de agua fueron rápidamente agregados a través del embudo de goteo y la temperatura se mantuvo a 50°C. La reacción se completó agitando a la misma temperatura por unos 10 minutos adicionales. El exceso de KOH se neutralizó por adición de 40 mM de NH4C1 disuelto en 10 mi de agua. La mayoría del solvente se removió bajo presión reducida y el residuo se disolvió en agua (aproximadamente 200 mi) y se filtró. Se agregó ácido fórmico a lo filtrado transparente hasta pH 3. El producto se separó como cristales blancos durante la incubación a 4°C durante la noche. Los derivados de malonilo y adipoilo se purificaron por recristalización de 95% o 50% de etanol, respectivamente.

Análisis de pureza de los compuestos sintetizados Cromatografía de capa delgada (TLC) : Los compuestos se disolvieron en etanol y se mancharon en laminillas pre-recubiertas con gel de sílice 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemania) . Las placas se desarrollaron en una mezcla de acetato de etilo/éter de petróleo/ácido acético/agua = 100/60/1/1. El apagado de fluorescencia se observó por radiación de la placa con UV de onda corta (254 nm) . Algunos compuestos mostraron autofluorescencia, la cual se observó bajo UV de onda media (302 nm) .

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) : El sistema de HPLC comprende una bomba Dionex P680, un automuestreador ASI-100 y un detector de arreglo de fotodiodo PDA-100. El sistema se equipó con una columna C18 acherey-Nagel 250 mm x 4 mm Nucleosil 100-5 precedida por un filtro en linea de 2 um Valco. Una velocidad de flujo constante de 1 ml/min se mantiene con un gradiente de solvente A (20 mM de ácido acético ajustado a pH 4.8 con NaOH en 15% de acetonitrilo) y solvente B (20 mM de ácido acético ajustado a pH 4.8 con NaOH en 60% de acetonitrilo) . La elución comenzó con un flujo isocrático de solvente A por 1 min. La concentración del. solvente B fue entonces linealmente elevada a 100% en 19 min y se mantuvo isocrática por otros 2 minutos previo a reducirla a 0% dentro de 1 min. La columna se equilibró por 5 min con el solvente A antes de la inyección de la siguiente muestra. Se registraron los espectros UV de 220 a 400 nm con intervalos de 1 nía. Para cuantificación, se usó la absorbancia a 250 nm con una amplitud de banda para 10 nm.

Determinación de valores pKa Se pesaron cincuenta a 100 mg de compuesto y se disolvieron en 50 mi 50% (v/v) de metanol. Se registró una curva de titulación con 50 mM de NaOH como solución estándar con un medidor de pH GPHR 1400A de Greisinger electronics. El punto de equivalencia se determinó por el método de cociente de diferencia (ApH/AVNaoH) Y después se leyó el pKa de la curva de titulación a 50% de neutralización.

Ensayos de cinasa in vitro e in vivo Se expresaron ASKs como proteínas de fusión GST en E. coli. Se realizaron ensayos de cinasa in vitro incubando 50 ng de proteína de fusión GST, 10 µg de proteína básica de mielina (MBP; Sigma, St Louis, MO) como sustrato y 0.15 MBg de D-[32P]-ATP como co-sustrato a 25°C por 30 min. El amortiguador de reacción consistió de 20 mM de HEPES pH7.4, 15 mM de MgCl2, 5 mM de EGTA y 1 mM de DTT. Para experimentos iniciales, se incluyó ATP frío a concentraciones hasta 3 uM. Los productos de reacción se separaron por SDS-PAGE y la cantidad de radioactividad incorporada en MBP se cuantificó usando una pantalla de phosphorimager de almacenaje de Amersham y un Biorad Molecular Imager FX. La actividad de cinasa in vivo se detectó por ensayos de cambio de banda de fosforilación usando BZR1-CFP como sustrato.

Pruebas Fisiológicas Plántulas ColO o bril-1 de Arabidopsis thaliana se hicieron crecer en placas 1/2 MES in vitro que contienen 1% de sacarosa en una cámara de crecimiento bajo condiciones de día largo (16 h de luz con 50 µ?'??"2^"1, 8 h de oscuridad) por 7 días. Subsecuentemente, se transfirieron a placas suplementadas con inhibidores a diferentes concentraciones y se observaron los efectos en el fenotipo 7 días después.

Análisis de HPLC de extractos vegetales : Plántulas ColO de A. thaliana de dos semanas se ¦ infiltraron a vacio con 1/2 MS o 1/2 MS que contiene 100 uM ; de compuesto 10 como se describe previamente (Rozhon et al . , 2005) . Después de 15 minutos y después de 48 h, se tomaron j muestras, se enjuagaron con agua y se trituraron en nitrógeno i liquido a un polvo fino. 100 mg de polvo se pesaron en un tubo de reacción y se agregó 1 mi de amortiguador de \ extracción (20 mM de TRIS/HC1 pH 6.8 disuelto en 20% de ¡ acetonitrilo) . Después de la incubación por 30 min en un j sacudidor ajustado a 800 rpm, la mezcla se centrifugó y el j sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0.2 uní. Los extractos se analizaron por HPLC con los mismos ajustes como se menciona anteriormente.

Ensayo de permeabilidad celular Plántulas ColO de A. thaliana de dos semanas, se transfirieron a medio 1/2 MS que contiene 50 µ? de inhibidor.

Las muestras se removieron después de los puntos de tiempo indicados, se enjuagaron con agua, secaron con papel filtro y congelaron en nitrógeno liquido. Para análisis, el material vegetal se trituró a un polvo fino en un mortero, pre-congelado con nitrógeno liquido. Se pesaron aproximadamente 100 mg de polvo en tubos de reacción de 1.5 mi y se agregó 1 mi de 20 mM de TRIS/HC1 pH. Se agregaron 50 µ? de una solución base de 200 uM del compuesto 4 como estándar interno. La extracción se realizó a 80°C por 30 min en un mezclador térmico Eppendorf ajustado a 800 rpm. El extracto se centrifugó por 5 min a 15, 000 g y el sobrenadante transparente se recolectó. La solución transparente se acidificó por adición de 25 µ? de ácido fosfórico 4M y se centrifugó por 2 min a 15, 000 g. El sobrenadante se cargó inmediatamente en un cartucho de extracción de fase sólida PH de 100 mg (Varían, Lake Forest, CA) acondicionado con 1 mi de acetonitrilo y dos veces 1 mi de ácido fosfórico 100 mM. Las columnas se lavaron con 1 mi de ácido fosfórico 100 mM y se secaron aplicando vacío por 1 minutos. Subsecuentemente, se realizó elución con 1 mi de TRIS/HC1 100 mM a pH 9.0 que contiene 5% de acetonitrilo. Lo eluido se acidificó por adición de 15 µ? de ácido fosfórico 4 M y se usó para HPLC como se describe anteriormente.

Resultados Síntesis Se prepararon ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil) amino] - 4-oxobutanoico y otros derivados por formación de amida a partir de aminopiridinas sustituidas y anhídridos del ácido carboxílico cíclico o cloruros de monometil ésteres del ácido dicarboxílico (Tabla 1) . En el último caso, el grupo metilo subsecuentemente se removió por hidrólisis alcalina, si se requiere. La pureza se verificó por TLC y HPLC. Únicamente un punto se puede observar en placas de TLC desarrolladas y el pico del compuesto deseado representó al menos 95% del área total de todos los picos en el cromatograma HPLC.

¦Inhibición de ASKs in vitro El ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico es un inhibidor potente de ASKs del grupo I y grupo II. RSKQ, un ASK del grupo III es moderadamente inhibido. La segunda cinasa de esta clase, ?=?ß, y la cinasa ASK5 del grupo IV no se inhiben. Representantes de todos los grupos se expresan como proteínas de fusión GST recombinantes en E. coli. La potencia de los compuestos sintetizados en los ASKs seleccionados se someten a ensayo por ensayos de cinasa in vitro usando MBP (proteína mielina básica) como un sustrato y G-[32P]-ATP como co-sustrato (Figura 1) .

Los compuestos 1 y 5 se sintetizan para investigar el efecto de variación de longitud de la cadena lateral alifática. El compuesto más activo, no. 3) tiene una cadena que consiste de 4 carbonos (Figura 1) . Los derivados de glutarilo (no. 4; 5 carbonos) y el adipoilo (no. 5; 4 carbonos) tienen una potencia significantemente inferior mientras los derivados más cortos (no. 1 y 2; 2 ó 3 carbonos, respectivamente) al menos no tienen efecto. La introducción de un enlace doble en una cadena lateral de longitud óptima invalida completamente la potencia (Figura 1, Compuesto 6) . Esto indica que la configuración estérica es muy importante. Para probar si el grupo carboxi de la cadena alifática es crucial para actividad o so un grupo oxo es suficiente, se incluyen los compuestos 9 y 10, los cuales con variantes metilados de los compuestos 3 y 15, respectivamente. Además, se probó el compuesto 8, el cual es un isómero estructural del compuesto 3. Como se muestra en la figura 1, los variantes metilados mostrados, dramáticamente reducen efectos inhibitorios confirmando que un grupo carboxi terminal es esencial .

Teniendo identificada la cadena lateral óptima, el anillo heterociclico es investigado en mayor detalle. Los compuestos 3 y 11 ambos tienen una cadena lateral de amino succinilo pero difieren en la posición del nitrógeno heterociclico. Ensayos de cinasa in vitro relevan que el compuesto 3 es más potente (Figura 1), demostrando que el nitrógeno heterociclico debe ser el siguiente a la posición que lleva a cabo el sustituyente de ácido succinico. Datos previos indican que un sustituyente de bromo en posición 5 del anillo piridina es critico para actividad biológica de ácido 4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico. Para probar el efecto de otros sustituyentes, se sintetizan los compuestos 12 hasta 16. Como se indica en la figura 1, el derivado de cloro, bromo y especialmente yodo son muy activos. Este orden de potencia se puede confirmar por cuantificación de la actividad de cinasa residual de BIN2 (Figura 2) . En contraste, el compuesto de fluoro exhibe una potencia muy baja y el derivado insustituido y nitro son inactivos.

Todos los compuestos probados tienen una especificidad similar hacia los ASKs . Los derivados activos inhiben AS?a, BIN2 y ???? fuertemente mientras ASK9 es únicamente moderadamente inhibido. El efecto de las sustancias probadas en ???ß y ASK5 es insignificante.

Inhibición de ASKs in vivo La regulación baja de la actividad de ASK es crucial en señalización brasinoesteroide. Los ASKs están constitutivamente activos en mutantes cpd y bril-1, los cuales son defectuosos en la biosintesis brasinoesteroide o señalización, respectivamente. Esto conduce a plantas severamente empequeñecidas con hojas enchinadas hacia abajo verde oscuras e hipocótilos más cortos. La aplicación de epi-brasinólido, un brasinoesteroide sintético, rescata cpd pero no bril-1 mientras el ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico rescata ambos mutantes. Para seleccionar la potencia in vivo, los mutantes cpd y bril-1 se transfieren al medio que contiene derivados de ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico a una concentración de 30 uM.

Las plántulas tratadas con compuestos activos muestran hojas expandidas, longitudes de hipocótilo incrementadas y son verde claro. La potencia para rescatar el fenotipo correlacionado con los resultados del ensayo in vitro. De forma interesante, sin embargo, el compuesto 10 es muy activo un vivo pero muestra poca potencia in vitro (Figura 3) .

Debido a este resultado inesperado, el efecto de las inhibiciones en la actividad de ASK in vivo se analiza por un método directo. Varios ASKs se han mostrado por fosforilar los factores de transcripción BZRl, BES1 y BEH2 in vivo. Esto conduce a un cambio de movilidad electroforética de estos factores de transcripción que permite la detección de actividad cinasa in vivo. Se co-transforman protoplastos de A. thaliana con constructos de BARI etiquetado con CFP y ???? etiquetado con Myc . Estas dos proteínas se eligen debido a que son bien expresadas en el sistema del protoplasto. Los protoplastos transformados se incuban con diferentes concentraciones de los compuestos 10 y 15 y BZR1-CFP y ?ß??-Myc y subsecuentemente se analizan por manchado Western. De acuerdo a las pruebas fenotípicas, el compuesto esterificado 10 es muy activo similar a su contraparte de ácido libre 15 (Figura 4) . También se obtienen resultados similares para el par 3 y 9.

Para investigar estos resultados contradictorios, el destino del compuesto 10 in vivo es investigado. Las plántulas se infiltran con el compuesto 10 y los extractos de plantas subsecuentemente se analizan por HPLC. Se pueden observar únicamente rastros de cantidades del compuesto 10, pero un nuevo pico, designado P, aparece (Figura 5A y 5B) . Este pico puede ser identificado por su tiempo de retención de 10.7 min y su espectro UV con absorción máxima a 252 y 292 nm como el compuesto 15 (Figura 5B y 5C) . El compuesto 10 por lo tanto no es estable in vivo pero rápidamente se convierte a muy activo 10, lo que explica la potencia diferente del compuesto 10 in vitro e in vivo. Se obtienen resultados similares para el par 3 y 9.

Permeabilidad de Tejido La permeabilidad celular de una sustancia es una característica importante que tiene influencia en su potencia in vivo. La recuperación de los compuestos 10 y 15 por plantas se determina por tratamiento de plántulas con las soluciones de estos compuestos y subsecuente cuantificación de las concentraciones del inhibidor internalizadas (Figura 6) . Ya que el compuesto 10 es rápidamente convertido al 15, únicamente la concentración in situ de 15 se mide. Las concentraciones in situ de ambos compuestos se incrementan en los primeros 3 y después alcanzan una estabilidad. Es importante notar que las concentraciones internas de la planta exceden más de la mitad. Mientras están presentes 50uM en la mitad, las concentraciones in situ de aproximadamente 90 uM se deben medir en el caso del compuesto 15 y hasta 190 uM en el caso de la aplicación del compuesto 10. El compuesto metilado por lo tanto muestra una permeabilidad del tejido mayor y alcanza una concentración elevada en plantas.

En años recientes, se han hecho enormes progresos en el entendimiento de la señalización brasinoesteroide en Arabidopsis thaliana por el análisis de mutantes. Actualmente, se conocen tres receptores brasinoesteroides y un co-receptor. Al menos cuatro ASKs parecen estar involucrados en la fosforilación de seis factores de transcripción similares a BES1/BZR1 y cuatro fosfatasas son competentes para convertirlos posteriormente a su forma no fosforilada. Estas proteínas son todas objetivos potenciales para inhibidores. Una ventaja remarcada para inhibidores comparados a mutantes es su aplicabilidad inmediata a diferentes antecedentes y especies genéticas. Además, mutantes únicos a menudo no muestran fenotipos o débiles debido a la redundancia funcional. Ya que las proteínas homologas son a menudo dirigidas por los mismos compuestos, la redundancia funcional puede ser superada por estudios del inhibidor.

Están disponibles un número de inhibidores para GSK-3a y GSK-3P, los homólogos humanos de ASKs. Sin embargo, intentos para usar estos compuestos para cinasas similares a GSK-3/Shaggy de plantas no han sido exitosos. En una selección genética química, el ácido 4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico recientemente se ha identificado como la primera sustancia que específicamente interfiere con la señalización brasinoesteroide . Procedimientos genéticos y bioquímicos revelan que el ácido 4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico actúa en señalización brasinoesteroide por inhibición de ASKs. Las cinasas similares a GSK3/Shaggy son reguladores clave de señalización de hormona y modula la tolerancia al estrés, un mejor entendimiento de la acción del ácido 4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico es muy deseable.

Para hacer frente esta cuestión y para identificar los inhibidores con potencia mejorada, se sintetizan un número de compuestos con estructuras similares al ácido 4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico y su potencia inhibidora en cinasas similares a GSK-3/Shaggy investigada in vitro e in vivo. Sin embargo, se estudia la reacción fenotípica de plantas de estos compuestos. Primero, se analiza el efecto de la longitud de la cadena lateral alifática que contiene el grupo carboxílico. Ya que resultados preliminares han mostrado que el derivado de cloro puede ser algunas veces más potente que el derivado de bromo, se usa 2-amino-5-cloropiridina para sintetizar una serie de compuestos que difieren únicamente de la longitud de la cadena lateral alifática. Ensayos de cinasa in vitro revelan que la potencia inhibitoria de estos compuestos es mayor con una cadena lateral de 4 átomos de carbono. Sin embargo, la configuración estérica es crucial. La introducción de un enlace doble cis en una cadena lateral que consiste de 4 átomos de carbono, el cual es el número óptimo, resultado en un compuesto inactivo (no. 6). Un enlace doble cis provoca una mezcla en la cadena alifática que conduce a otro posicionamiento del grupo carboxi terminal. Esto y los resultados de compuestos con diferentes longitudes de cadena lateral indican que el grupo carboxi puede tener una configuración geométrica exacta con respecto al anillo heterocíclico para interacción con los ASKs.

Evidencias para la significancia del grupo carboxi terminal viene originalmente de un derivado con una cadena lateral insustituida . Sin embargo, esto no es una regla que un grupo carboxi esterificado, el cual puede aún participar en interacciones de hidrógeno, puede ser suficiente. Por lo tanto, los compuestos 8, 9 y 10 se incluyen, los cuales son variantes metiladas de compuestos 2, 3 y 15, respectivamente. Todas las tres sustancias muestran poca o nada de actividad in vitro hacia los ASKs probados confirmando que un grupo carboxi terminal puede estar presente en la cadena alifática. Los compuestos 9 y 10 in vivo son activos debido a que el grupo metilo es rápidamente desdoblado, igualmente por esterasas y el grupo carboxi con ello es reconstituido. Ya que el grupo de la cadena alifética se carga a pH intracelular se puede involucrar en interacciones con los ASKs, por ejemplo, con un residuo de lisina o arginina. Alternativamente, puede ser involucrado en un enlace de hidrógeno. Similarmente, el nitrógeno del anillo de piridina también puede ser involucrado en un enlace de hidrógeno o una interacción iónica con la proteina. Se ha mostrado que el reemplazo del anillo de piridina por un anillo benceno reduce la potencia inhibitoria drásticamente. Para investigar la significancia del anillo heterociclico en más detalle, se sintetiza el compuesto 11, el cual difiere del compuesto 3 muy activo únicamente en la posición del nitrógeno heterociclico. Las pruebas in vitro revelan que 11 es inactivo lo que indica que el nitrógeno heterociclico puede ser colocado después de la cadena lateral de amino succinilo para obtener un inhibidor potente. Interesantemente, los resultados de la presente invención indican que la actividad de los compuestos incrementados con el número atómico del sustituyente de halógeno en la posición 5 del anillo piridina, a pesar que los datos han sugerido el efecto opuesto. El derivado de yodo (no. 15) tiene una mayor actividad mientras el derivado fluoro (no. 13) es menos potente. Debido a su hidrofobicidad, esta parte estructural del inhibidor puede ser involucrada en interacciones van der Waals con la cinasa. Para atracciones van der Waals, la distancia entre los átomos que interactúan es crucial. Estos rápidamente disminuyen con las distancias incrementadas y son efectivas únicamente cuando los átomos están muy cercanos entre si. Los radios van der Waals, que describen la distancia óptima para una interacción, se elevan con el periodo dentro de un grupo de la tabla periódica de elementos. Por ejemplo, los radios van der Waals son 0.22 nm para átomos de yodo y 0.14 nm para átomos de flúor. Además, la longitud del enlace covalente entre el carbono y el anillo de piridina y yodo también es más largo que de otros halógenos. La estructura del derivado de yodo puede por lo tanto tener propiedades ideales para enlazarse a un paquete hidrofóbico de los ASKs . Además, la hidrofobicidad de los compuestos se eleva con el número atómico del sustituyente de halógeno como se indica por los tiempos de retención incrementados en RP-HPLC (Tabla 1), lo cual puede además facilitar las interacciones hidrofóbicas .

Ensayos de permeabilidad del tejido revelan que la recuperación de los compuestos, especialmente onas esterificadas, es rápida. Interesantemente, las concentraciones in situ exceden el medio circundante varias veces. Esto se puede explicar por los valores pK, de los compuestos (Tabla 1) . Por ejemplo, el derivado 15 tiene un valor pK4 de 5.8, lo cual significa que a pH 5.8, el pH del medio usado, 50% del compuesto es disociado y por lo tanto negativamente cargado mientras el 50% no es disociado. A pH intracelular de 7.4 menos del 3% del compuesto no es disociado. Ya que únicamente la forma lipofilica, no disociada puede pasar eficientemente las biomembranas, los compuestos son atrapados en la célula y se acumulan a concentraciones que exceden el medio circundante. Este pH depende de la recuperación se asemeja a la hormona auxina de la planta, en donde la difusión conducida por el pH contribuye para transporte en la célula. Los compuestos esterificados, por ejemplo, no. 10, son, independientes del pH, muy lipofilicos y pueden pasar membranas. En la célula, son rápidamente hidrolizadas a ácido correspondiente lo cual desprotona al anión hidrofilico. Es interesante notar que la velocidad de recuperación del compuesto 10 es aproximadamente el doble que del compuesto 15, lo cual se correlaciona con las porciones capaces de la difusión a través de la membrana. Mientras el 100% del compuesto 10 es lipofilico, únicamente el 50% del compuesto 15 no es disociado y por lo tanto suficientemente lipofilico. Esto puede explicar las diferentes velocidades de recuperación. Tomado junto, el compuesto 15, también llamado ácido yodo-4- [ ( 5-bromo-2-piridinil ) amino] -4-oxobutanoico, es el compuesto más potente in vitro y puede mostrar actividad inhibitoria in vivo. Su variante metilada, ácido metilyodo-4- [ ( 5-bromo-2- piridinil) amino] -4-oxobutanoico (compuesto 10), muestra muy rápida recuperación y es por lo tanto el inhibidor ASK de elección para estudios in vivo. Se conocen varias cinasas similares a GSK3/Shaggy por ser rápidamente activadas en respuesta al estrés. Debido a su excelente y rápida permeabilidad celular, el ácido metilyodo-4- [ (5-bromo-2-piridinil) amino] -4-oxobutanoico y compuestos relacionados serán valiosos para investigar el papel de esta familia cinasa en señalización de estrés temprano.

Referencias: Kim et al., Bioorg Med Chem 6 (1998), 1975-1982.

Min et al., Bioorg Med Chem Lett 9 (1999), 425-430.

Rozhon et al., Anal Bioanal Chem 382 (2005), 1620-1627.

Sekimata et al., J Agrie Food Chem 50 (2002), 3486-3490.

Sekimata et al., Planta 213 (2001), 716-721.

Vert et al., Nature 441 (2006), 96-100.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : Uso de un compuesto que tiene la fórmula en donde X es F, Cl, Br, o I; R1 es CH3, C2H5, C2H4R3, C2H3RR,j , C3H7, C3HSR3 C3H5R3R , R2 es H, CH3, C2H5, C2H4R3 o C2H3R3R4; y R y R4 son, independientemente, X, OH o NH2, para el tratamiento de plantas, especialmente para incrementar el crecimiento de la planta, incrementar el rendimiento del cultivo y/o proporcionar resistencia al estrés .
2. 2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde Ri es CH3, R2 es H y X es I.
3. 3. Una composición para incrementar el crecimiento de la planta y/o rendimiento del cultivo y/o resistencia al estrés, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (I), preferiblemente formula (II).
4. 4. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula (II)
5. 5. Método para la preparación de un compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se hace reaccionar 2-amino-5-yodopiridina con cloruro de metil succinilo .
6. 6. Método para la preparación de un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula (III) en donde X es I, y R2 es H, en donde se hace reaccionar 2-amino-5-I-piridina con anhídrido succínico.
7. 7. Método para la preparación de un compuesto que tiene la fórmula (II), caracterizado porque compuesto que tiene la fórmula (III), en donde X es I y R2 es H es alquilado con un halogenuro de metilo, un sulfato de dimetilo o diazometano o esterificado con CH3OH.
8. 8. Uso de un compuesto que tiene la fórmula (I) o (II), como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 4, como un herbicida.