PT2247576E - Inibidores para a sinalização de brassinosteróides - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

INIBIDORES PARA A SINALIZAÇÃO DE BRASSINOSTERÓIDES A presente invenção refere-se a inibidores para a sinalização de brassinosteróides.

Os brassinosteróides são hormônios vegetais esteróides envolvidos em vários processos, incluindo a divisão e expansão celular, crescimento do tubo polinico, desenvolvimento do tecido vascular, senescência e modulação da resposta ao stress. Brassinosteróides são formados a partir de precursores dos esteróis. Muitas enzimas envolvidas na biossintese de brassinosteróides foram identificadas por análise de mutantes de Arabidopsis thaliana tal como dwfl, cbbl, dwf4, cpd, det2 e stel/dwf7. Recentemente, a análise da mutação de dx de tomate levou à identificação de uma enzima envolvida na última etapa da biossintese brassinosteróide, a conversão de castasterona de brassinólide, o brassinosteróide mais ativo. Dois homólogos de Arabidopsis thaliana podem ser identificados por uma aproximação do gene candidato. Estas enzimas e DWF4 e CPD pertencem à família de monooxigenases do citocromo P450.

Brassinólide é percepcionado pelo recetor quinase BRI1 e o seu co-receptor BAK1, que, ao contrário dos recetores esteróides animais encontra-se localizado na membrana celular. 0 sinal propaga-se por mecanismos ainda desconhecidos para o núcleo e regula as quinases semelhantes a GSK-3/Shaggy envolvidas na sinalização brassinosteróide: BIN2/UCU1, ASKt ΑΞΚζ, ASK0 (Vert e Chory, 2006). Estes factores de transcrição de quinases fosforilam os que pertencem à família BES1/BZR1 a um motivo conservado consistindo em oito repetições adjacentes da sequência SXXXS. 1 A actividade destes factores de transcrição é, assim, bloqueada uma vez que as suas variantes não fosforiladas podem ligar-se ao ADN e regular a expressão do gene. A desfosforilação é promovida pela proteina nuclear fosfatase BSU1 e os seus homólogos BSL 1 a 3. Além disso, proteínas 14-3-3 podem ligar as fosforiladas BZR1 BES1, o que pode promover a sua relocalização no citoplasma.

Embora um certo número de enzimas envolvidas na síntese de brassinosteróides e de sinalização sejam conhecidos, muito poucos inibidores se encontram disponíveis. 0 primeiro inibidor de síntese brassinosteroide seletivo conhecido foi o KM-01 (Kim et al., 1998). Por causa de sua baixa potência a sua aplicação era muito limitada. As observações de que o inibidor da biossíntese de ácido giberélico uniconazole tinha um ligeiro efeito inibidor sobre a biossíntese brassinosteroide levaram ao desenvolvimento de brassinazole (Min et al., 1999) e Brz2001 (Sekimata et al., 2001). Da mesma forma, um outro inibidor brassionsteroide foi identificado por modificação de propiconazole (Sekimata et al., 2002) . O alvo da ação brassinazole é o ferro heme do citocromo P450 monoxigenase DWF4. Brassinazole tem sido amplamente utilizada para estudar a síntese e os efeitos de brassinosteróides. Além disso, brassinazole foi empregue a rastreios genéticos para isolar mutantes que não respondem a este composto. Isto conduziu à identificação do factor de transcrição BZR1. O ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico é uma monoamida do ácido succínico com 2-amino-5-bromopiridina. O bromo na posição 5 do anel de piridina e o grupo de ácido carboxílico foram reconhecidos como características importantes para a sua atividade. Recentemente, o ácido 4- 2 [(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico foi identificado como um inibidor de sinalização de brassinosteróides por uma abordagem genético química. 0 ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico é um composto não esteróide, que induz respostas brassinosteróides constitutivas em plantas por inibição da maior parte das quinases semelhantes a GSK-3/Shaggy. A. thaliana possui 10 ASKs (A. thaliana quinases semelhantes a GSK-3/Shaggy) que podem ser subdivididas em 4 grupos. Quinases do Grupo I (ASKcx, ASKy e ASKs) e quinases de grupo II (BIN2, Αεκζ e ASKt ) são mais sensíveis a ácido 4-[ (5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico. A quinase do grupo III, ASKQ é moderadamente inibida enquanto o segundo grupo de quinase III, ASKP, não é inibida. A ASKõ de um grupo IV de quinase, também é insensível a ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico. A razão para esta especificidade é desconhecida. Ácido butanóico, 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxo-metiléster tem um registo CAS no. 697231-46-2. Burdulene et al. (Pharm. Chem. J., 30 (1996):680-682) descrevem i.a a reacção de 2-amino-5-bromopiridina com anidrido sucínico para produzir bikinin. A GB 1 162 727 A descreve ácidos âmicos N-substituídos que promovam o crescimento das plantas.

Asami et al. (Capítulo 19, em "Pesticide Chemistry", (2007), Wiley-VCH) relata o conhecimento geral sobre pequenas moléculas em ciência pesticidas. Ostaszewski et al. (J. Molec Struct, 474 (1999):.. 197-206) descrevem estudos sobre a conformação molecular de mono- e di-substituídas amido ésteres piridina. Roma et al. (Bioo. Med. Chem, 8 (2000): 751-768 relatório sobre substituído-pirimidin-4-as, WO 3 2008/049729 AI divulga miméticos brassinosteróides nao esteróides. É um objeto da presente invenção proporcionar inibidores adicionais de sinalização de brassinosteróides, semelhante a ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico. De preferência, a actividade inibidora in vivo dos novos inibidores devem ser mais elevada do que a actividade inibitória do ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino ]-4-oxobutanóico.

Portanto, a presente invento proporciona a utilização de um composto da fórmula (I)

O

em que X é F, Cl, Br, ou I; R1 é CH3, C2H5, C2H4R3, C2H3R3R4, C3H7, C3H6R3 ou C3H5R3 R4; R2 é H, CH3, C2H5, C2H4R3 ou C2H3R3 R4; e R3 e R4 são, independentemente, X, OH ou NH2. para o tratamento de plantas, especialmente para melhorar o crescimento vegetal, o melhoramento do rendimento da cultura e/ou providenciar resistência ao stress.

Nos compostos em que R1 é um resíduo-propilo (ou seja, em que o composto é um éster de-propilo) , C3H7, C3H6R3ou C3H5R3R4 podem ser fixados sobre o átomo-0 ao carbonilo através do átomos-C 4 exteriores (n-propilo) ou através do átomo-C central (i-propilo) . A presente invenção fornece variantes de éster de ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-ácido-4-oxobutanóico, com pequenos álcoois alifáticos, facultativamente substituídos com um halogéneo, OH ou NH2. Os membros destas variantes de éster de ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico (RI = H) , de acordo com a presente invenção têm melhorado as propriedades físico-químicas para administração de planta (manuseio e na absorção in vivo de plantas ou células vegetais). Poderia ser demonstrado com o presente invenção que pelo menos alguns membros deste grupo surpreendentemente mostraram exibir uma melhoria in vivo (ou seja, no curso da administração a plantas ou células vegetais) a actividade inibidora para as quinases envolvidas na sinalização de brassinosteróide em comparação com ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico.

Mais especificamente, o composto tendo a fórmula (II)

O

a saber, ácido 4-[(5-iodopirid-2-il)amino]-4-oxobutanóico éster metílico do ácido, demonstrou uma melhoria significativa no efeito in vivo em comparação com ácido 4- [(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico. Além disso, o Cl 5 e Br-variante de fórmula (II) são especificamente preferidos. Outro composto preferido é a forma de etilato de fórmula (I), isto é, o composto em que R1 é C2H5e R2é H. Nesta forma etilato, o composto I-, Br- e Cl são os preferidos.

Os compostos de acordo com a presente invenção são miméticos brassinosteróides que podem ser utilizados em tecnologia de plantas, por exemplo, para melhorar o crescimento das plantas, resistência ao stress biótico e/ou abiótico ou produtividade da cultura. Com a presente invenção, é possível aumentar o rendimento da biomassa.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição para aumentar o crescimento das plantas e/ou o rendimento da cultura que compreende uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a fórmula (I) ou (II). A "quantidade eficaz" pode ser facilmente ajustada por um técnico na arte através da aplicação da escala de laboratório a configuração para o tratamento de campo. 0 composto de acordo com a presente invenção pode ser aplicado a uma concentração eficaz, conforme apropriado às circunstâncias do respectivo campo. As concentrações adequadas podem estar entre a gama baixa e a média de pmol /1, por exemplo, 1-500 pmol/l, de preferência de 5 a 100 ymol/l. Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser dissolvidos em solventes orgânicos adequados e permissivos na agricultura e tecnologia das plantas, de preferência DMSO ou etanol, e diluída até à concentração desejada com água ou soluções aquosas de tampões e/ou o compostos de promoção de crescimento de planta e/ou agentes de proteção de plantas.

De acordo com a presente invenção, a composição de acordo com a presente invenção é aplicada para o tratamento de plantas. De Acordo com forma de realização especialmente preferida, os 6 compostos de acordo com a fórmula (I) ou (II) são utilizados como herbicidas. Considerando que a utilização para promover o crescimento das plantas é geralmente efectuada numa gama de concentrações de 1-10 microM ou mesmo abaixo, a utilização como herbicida é realizada preferivelmente em concentrações de 50 microM ou mais, por exemplo, entre 50 e 500 microM. A presente invenção também se refere a um método para a preparação de um composto de acordo com a fórmula (II) em que um 2-amino-5-iodo-piridina reage com um halogeneto de metil-succinil, de preferência cloreto de succinil, metilo. 2-amino-5-iodo-piridina é dissolvido num solvente adequado, de preferência tetra-hidrofurano, que também contém uma amina terciária, de preferência, trietilamina (de preferência num excesso molar (em especial 10 a 40%) em comparação com 2-amino-5-iodo-piridina) . Em seguida, um halogeneto de metil-succinil (de preferência no mesmo solvente como 2-amino-5-iodo-piridina) é adicionado (de preferência em ligeiro excesso molar (especialmente 2 a 10%) , de modo a que a temperatura não suba acima de 50°C, de preferência não acima de 45°C, especialmente não superior a 40C. A reacção pode então ser agitada durante mais 5-60 minutos, a uma temperatura entre 20 a 40°C, especialmente à temperatura ambiente (25°C) . Em seguida, é adicionada água e o pH é reduzido (de preferência por meio da adição de ácido hidroclórico) a um pH de 6,5, especialmente a cerca de 6. O produto pode então ser extraído com um solvente de extração adequado, por exemplo, dietiléter e lavado (por exemplo, com um ácido diluído fraco, tais como 1% ácido acético) . A água residual pode ser removida com substâncias higroscópicas, tais como sulfato de sódio anidro, evaporação prévia do éter sob reduzida pressão. A recristalização pode ser realizada, 7 por exemplo a partir de 95% de etanol ou tolueno, para dar um produto quase branco. A presente invenção também se relaciona com um método para a preparação de um composto de acordo com a fórmula (III)

e sua subsequente esterificação ou alquilação para se obter um composto de acordo com a fórmula (II) (X é I e R2 é H) . Este método de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo facto de um 2-amino-5-iodo-piridina reagir com succinico anidrido para obter um composto tendo a fórmula (III) . 0 grupo carboxi deste composto pode ser subsequentemente esterificado ou alquilado para se obter um composto com a fórmula (II).

Com mais pormenor, para se preparar um composto de acordo com a fórmula (III), 2-amino-5-iodo-piridina é dissolvido num solvente adequado, de preferência tetra-hidrofurano. Em seguida, o anidrido succinico (de preferência no mesmo solvente como o 2-amino-5-iodo-piridina) é adicionado (de preferência num excesso molar (especialmente excesso de 10 a 40%) em comparação com 2-amino-5-iodo-piridina) e mistura ao refluxo durante um tempo adequado para permitir que a reacção seja efectuada até ao ponto desejado, de preferência durante 30 min a 5 h, ainda preferencialmente de 1 a 4 h, em especial 2 h. O produto em bruto pode ser obtido por arrefecimento da reação, por exemplo, a 4°C durante várias horas (por exemplo, 1 a 10 horas). O produto bruto pode ser recristalizado a partir de, por exemplo, 95% de etanol. O ácido livre de acordo com a fórmula (III) pode, subsequentemente, ser alquilado usando um halogeneto de metilo, dimetilsulfato ou diazometano ou esterificado com CH3-OH, para se obter uma substância de acordo com a fórmula (II) ·

Na forma de realizaçao preferida da presente invenção, 2-amino-5-iodopiridina reage com metil-succinilcloreto. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos e as figuras dos desenhos.

Fig. 1: Vários derivados piridilamino inibem ASKs in vitro. Proteínas de fusão GST-ASK foram incubadas com MBP como substrato e γ-[32Ρ]-ΑΤΡ como co-substrato, na ausência (-) ou na presença de diferentes derivados (os números correspondem a Tabela 1) . Os compostos 1 a 9 (painel esquerdo) diferem na cadeia lateral alifática. A influência da posição do azoto heterocíclico foi testada com os compostos 3 e 11 (painel do meio; a estrutura molecular mostrado representa o composto 11). O painel da direita mostra o efeito do substituinte halogénio do anel piridina. Os compostos foram usados a uma concentração de 10 μΜ. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e o fosfato radioactivo incorporado detectado com o rastreio de fósforo armazenado.

Fig. 2: Composto 15 mostra a potência mais elevada. GST-BIN2 foi incubado com MBP e γ-[32Ρ]-ΑΤΡ na ausência ou 9 presença de compostos de 3, 14 e 15 a uma concentração de 10 mM. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e fosforilação da MBP foi quantificada com uma rastreio de imagem de fosfo. A actividade residual é expressa em % do controlo. Os meios e desvios padrão foram calculados a partir de 4 ensaios independentes.

Fig. 3: Efeitos sobre o fenótipo dos mutantes brassinosteróides. 7 dias depois as plântulas mutantes da síntese brassinosteroide cpd e sinalização mutante bril-1 foram transferidos para ^ de meio MS contendo 1 μΜ epi-brassinólide (Epi-BL) ou compostos 10 e 15 a uma concentração de 30 μΜ e incubado durante 7 dias sob condições de dias longos. Todas as fotografias foram tiradas com a mesma ampliação. A barra representa 1 mm.

Fig. 4: Compostos 10 e 15 são inibidores potentes in vivo. Protoplastos de A. thaliana, foram co-transformados com as construções de expressão de BZR1-CFP e Myc-tag ΑΞΚζ e tratado com concentrações crescentes de compostos 10 e 15. BES1-CFP e ΑΞΚζ-Μγο foram detectadas por análise Western blot utilizando anticorpo policlonal anti-GFP e anticorpos anti-Myc monoclonais, respetivamente. Um Coomassie R250 é mostrado como um controlo de carregamento. Dependendo do ΑΞΚζ a actividade quinase BZRl-CFP pode ser observada de forma não fosforilada ou fosforilada (indicado por setas). A razão entre as duas bandas Αεκζ-Μγο, indicando as modificações pós-translacionais desta proteína, não foi afetada pela aplicação de inibidores.

Fig. 5: Compostos esterifiçados são rapidamente hidrolisados em plantas. As plântulas A. thaliana foram 10 infiltradas com 1/2 de meio MS contendo 50 μΜ de composto 10. As amostras de controlo foram tomadas antes da infiltração (A) e analisadas por HPLC. Um produto de biotransformação (marcado P) do composto 10 pode ser observado depois de 15 min (B) . Um cromatograma de uma mistura de compostos 10, 15, e 17 (marcados com CIO, C15 e C17, respectivamente) é mostrado para comparação (C). As pequenas caixas inseridos nos cromatogramas mostram os espectros de UV dos picos na gama de 220-360 nm. MAU, unidades de absorção mili registadas em 250 nm.

Fig. 6: A metilação aumenta a permeabilidade do tecido. Plântulas A. thaliana foram incubadas em soluções 50 μΜ de compostos 10 e 15 em ½ de meio MS. As amostras foram colhidas após o tempo indicado e em niveis in situ do composto 15 analisados por HPLC. A linha solida representa os resultados para as plantas incubadas com o composto 10 e o tracejado os resultados para o composto 15. Os meios e desvios padrão foram calculados a partir de 3 ensaios independentes. EXEMPLOS: A importância da configuração esférica e comprimento da cadeia lateral alifática, bem como a posição do azoto heterociclico foi elucidada sintetizando um número de derivados com uma estrutura semelhante à de ácido 4 —[(5 — bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico e variando o comprimento da cadeia lateral alifática de 2 átomos de carbono até 6 . Além disso, a sua estrutura estérica foi modificada através da introdução de uma ligação dupla. A fim de obter um inibidor mais ativo, derivados com flúor, cloro, bromo e iodo substituintes na posição 5 do anel de piridina 11 foram preparados. Os compostos sintetizados foram testados in vitro e in vivo. Além disso, a célula de permeabilidade de compostos selecionados foi determinada.

Materiais e Métodos

Produtos químicos

Os produtos químicos utilizados para a síntese dos compostos foram adquiridos à Fluka (Buchs, Switzerland) ou Aldrich (Steinheim, Alemanha). Solventes para HPLC e TLC eram da Roth (Karlsruhe, Germany). Síntese

Os compostos da reação e produção dos produtos são apresentados na Tabela 1. 12

Tabela 1: Os compostos sintetizados e ensaiados quanto à actividade biológica

X

X

N

H N R 1

Composto 11

Compostos 1-10, 12-17 N2 Compostos Mé- X R Produ- tRa λι: X2b pKac de reação todo tivi— dade 1 2-amino-5- D Cl OH 39% 5.6 254;291 cloropiri-dina cloreto de metiloxa- lilo Ti 0 2 2-Amino-5- D Cl O II 30% 5.9 245;287 cloropiri-dina,metil malonil cloreto II OH 5.4 3 2-Amino-5- A Cl OH 54% 8.6 245;287 cloro- ‘ 11 piridina, anidrido II o sucínico 4 2-Amino-5- cloro- A Cl 0 . II 71% 9.9 245;288 piridina, anidrido glutárico OH 5 2-Amino-5- cloro- D Cl OH f] 20% 11.5 245;288 piridina, cloreto de metilo de adipoil il o 13 (continuação ΝΩ Compostos Mé-de reação todo X R Produ- fcRa λι: X2b pKac tivi— dade 6 2-Amino-5- A cloro-piridina, anidrido maleico Cl H0 22% 75 222;298 w/=0 7 2-Amino-5- A cloro- Cl Η0χ 63% 9 1 249; 289 piridina, anidrido ftálico O 8 2-Amino-5- C cloro- Cl O 41% 14 6 245; 287 II piridina, cloreto de malonil metilo OCH3 9 2-Amino-5- C cloro- Cl OCh 33% 15 7 245; 288 ^ || piridina, cloreto de metil-succinil O lOd 2-Amino-5- C iodopiri-dina,metil L O 30% 17 8 252; 293 V. , ' \ ' í cloreto de succinil 0 11 5-amino-2- A cloropiri-dina, Cl X c 69% 67 248;284 V f anidrido succinico O 12 2-amino- A piridina, anidrido H s < 74% 42 235;276 4.9 '· Y succinico o 14 (continuação)

Na Compostos Mé- X R Produ- fcRa : ^2b PKaC de reação todo tivi- dade 13 2-Amino-5- A F OY 68% 5 7 235; 283

fluoropi- ^ M ridlna, £ anidrldo succinico 14d 2—Amino—5- bromo— piridina, anidrldo succinico A Br 01 65%V s„ 247;289 5.6

O 15d 2-Amino-5- iodopiri- dina, A L 1 35% 10.7 252;292 5.8 anidrldo succinico O 16 2-Amino-5-nitro- B NO 2 Ol ^ N * 'li 29% 9.1 221;350 piridina, anidrido succinico 1! o 17 2-Amino-5- D L OH 28% 17.9 253;293 iodopiri- dina, Y anidrido 0 succinico a Tempo de retenção em minutos b Absorção máxima em nm (a pH 4,8) c 0 pK, (logaritmo negativo decadic da dissociação constante), do grupo de ácido carboxílico foi determinado em 50% (v / v) metanol. d Os compostos, 10, 14, e 15 são também chamados de éster metílico de ácido 4-[(5-iodopirid-2-il)amino]-4-oxobutanóico, ácido 4-[(5 -bromopirid-2-il)amino]-4-oxobutanóico, e ácido 4-[(5-iodopirid-2-il)amino]-4-oxobutanóico, respetivamente. 15 Método A: Uma solução de 25 M de anidrido de ácido carboxilico dissolvido em 15 ml de tetra-hidrofurano (10 ml para anidro ftálico) foi colocado num balão de fundo redondo equipado com um condensador de refluxo e 20 mM de amina dissolvida em 10 ml de tetrahidrofurano foram adicionados. A mistura foi submetida a refluxo durante 2 h. 0 produto começou a cristalizar no final da reação. A cristalização foi concluída por arrefecimento a 4°C durante várias horas. O produto em bruto foi filtrado por sucção e recristalização de 95% de etanol exceto o derivado do ácido ftálico, o qual foi recristalizado a partir de 80% de acetonitrilo. Método B:. Uma solução de 20 mM de 2-amino-5-nitropiridina-dissolvido em 30 ml de tetrahidrofurano foi colocado num balão de fundo redondo e 25 mM de anidrido succinico sólido foi adicionado. Um condensador de refluxo foi adaptado ao balão e aquecida para ferver gentilmente durante 2 h. Subsequentemente, a mistura reaccional foi arrefecida a -20°C durante vários dias. O produto em bruto foi filtrado com sucção e recristalizado a partir de água quente Método C:. Vinte aminas mM foram dissolvidas numa mistura de 40ml de tetra- -hidrofurano e 3, 5 ml (25 mM) trietilamina e colocada num balão de fundo redondo de gargalo triplo, equipado com um condensador de refluxo, um funil de gotejamento e um termómetro. A mistura de reacção foi agitada por agitação magnética. Uma solução de 21 mM de cloreto de ácido dissolvido em 10 ml de tetrahidrofurano adicionou-se lentamente através do funil de gotejamento a uma velocidade que a temperatura não subisse acima de 40°C. Após o cloreto ter sido completamente adicionado, a reação foi agitada durante mais 15 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, a mistura foi adicionada a 200 ml 16 de água fria e o pH ajustado para 6 com ácido clorídrico diluído. 0 produto foi extraído três vezes com 50 ml de éter dietílico de cada vez e os extratos etéreos combinados foram lavados com 50 ml de 1% de ácido acético. A água residual foi removida com sulfato de sódio anidro antes da evaporação do éter sob pressão reduzida. O resíduo amarelado foi recristalizado a partir de 95% de etanol (derivados de cloro) ou tolueno (derivado iodo) para dar um produto quase branco. Método D:. Vinte e um cloreto de ácido mM foram dissolvidos em 10 ml de tetra-hidrofurano e adicionado a uma mistura de 20 mM 2-amino-5-cloropiridina, 3,5 ml (25 mM) de trietilamina e 40 ml de tetra-hidrofurano, tal como descrito no Método C. O mistura foi agitada durante 15 min antes da filtração para remover o cloridrato de trietilamina. O sólido foi lavado com 10 ml tetra-hidrofurano e os filtrados combinados foram evaporados sob pressão reduzida. No caso de o derivado de oxalilo, o resíduo foi dissolvido em 90 ml de etanol a quente a 95% e a solução foi filtrada enquanto ainda quente. A mistura foi agitada e 40 mM de KOH dissolvido em 10 ml de água adicionada a uma taxa que a temperatura não subisse acima de 40°C. A reação foi completada por agitação durante mais 10 min. O produto separado como sal de potássio branco que foi recolhido por sucção. O precipitado foi dissolvido em 100 ml (derivado de iodo: 250 ml) de água quente e filtrou-se. Ácido clorídrico foi adicionado ao filtrado quente até o pH2. O produto separado como ácido livre durante a incubação a 4°C durante a noite. O produto foi adicionalmente purificado por recristalização a partir de 95% de etanol.

No caso de derivados de malonil e de adipoilo, o resíduo foi dissolvido em 200 ml de MeOH e filtrado. A Solução foi colocada num balão de fundo redondo de triplo gargalo, 17 equipado com um condensador de refluxo, um funil de gotejamento e um termómetro e aquecida a 50"C. Enquanto se agitava a a mistura, 40 mM de KOH dissolvido em 40 ml de água foram rapidamente adicionados através do funil de gotejamento e a temperatura mantida a 50°C. A reacção foi completada por agitação à mesma temperatura durante mais 10 min. O excedente de KOH foi neutralizado pela adição de iões de 40 mM NH4C1 dissolvido em 10 ml de água. A maior parte do solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em água (aproximadamente 200 ml) e filtrado. O ácido fórmico foi adicionado ao filtrado límpido até um pH3. O produto separado como cristais brancos durante incubação a 4°C durante a noite. Os derivados de malonil e adipoil foram purificados por recristalização a partir de 95% ou 50% de etanol, respetivamente.

Análise da pureza dos compostos sintetizados

Cromatografia de camada fina (TLC): Os compostos foram dissolvidos em etanol e aplicados a folhas pré-revestidas com gel de sílica 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemanha). As placas foram desenvolvidas numa mistura de acetato de etilo/éter de petróleo/ácido acético/água 100/60/1/1. Extinção de fluorescência foi observada por radiação da placa com ondas curtas de UV (254 nm) . Alguns compostos mostraram autofluorescência, que foi observada sob ondas médias de UV (302 nm).

Cromatografia líquida de alta performance (HPLC): O sistema de HPLC compreendia um cromatógrafo Dionex P680, um mostrador automático ASI-100 e um detector de arranjo de diodos PDA-100. O sistema estava equipado com uma coluna Macherey-Nagel 250 mm x 4 mm Nucleosil 100-5 C18 precedida por um filtro de 18 entrada Valco ym. A taxa de fluxo constante de 1 ml/min, foi mantida com um gradiente de solvente A (20 mM de ácido acético a um pH4.8 com NaOH em 15% de acetonitrilo) e solvente B (20 mM de ácido acético ajustado para pH4.8 com NaOH em 60% de acetonitrilo). A eluição começou com um fluxo isocrático de solvente A para 1 min. A concentração do solvente B foi então linearmente aumentada para 100% em 19 min e mantida isocrática por mais 2 min prévios para reduzi-la a 0% em 1 min. A coluna foi equilibrada durante 5 minutos com solvente A antes da injecção da amostra seguinte. Os espectros de UV foram registados desde 220-400 nm com intervalos de 1 nm. Para a quantificação da absorvância a 250 nm com uma largura de banda de 10 nm foi utilizada.

Determinação de valores pKa

Cinquenta para 100 mg de composto foram pesados e dissolvidos em 50 ml de 50% de metanol a (v/v). A curva de titulação com 50 mM NaOH como solução padrão foi gravada com um medidor electrónico GREISINGER GPHR de pH 1400A. 0 ponto de equivalência foi determinado pelo método do quociente da diferença (ApH/AVNa0H) e o pKa lido a partir da curva de titulação a 50% de neutralização.

In vitro e in vivo em ensaios de quinase ASKs foram expressos como proteínas de fusão GST em E. coli BL21. Ensaios de quinase in vitro foram realizados através de incubação de 50 ng de proteína de fusão GST, 10 yg de proteína básica de mielina (MBP; Sigma, St Louis, MO) como substrato e 0,15MBq γ-[32Ρ]-ΑΤΡ como co-substrato a 25°C durante 30 min. O tampão de reacção consistiu em 20 mM de HEPES pH 7,4, 15 mM MgCl2, 5 mM EGTA e 1 mM DTT. Para 19 experiências iniciais ATP frio foi incluído em concentrações de até 3 μΜ. Os produtos de reação foram separados por SDS-PAGE e a quantidade de radioactividade incorporada no MBP quantificados utilizando um rastreio de imagem de fosforo de armazenamento Amersham e um Biorad Molecular Imager FX. In vivo a actividade quinase foi detectada por ensaios de desvio de banda de fosforilação utilizando BZR1-CFP como substrato.

Testes fisiológicos

Arabidopsis thaliana ColO ou plântulas bril-1 foram cultivadas in vitro em ½ placas MS contendo 1% de sacarose numa curvatura de crescimento sob condições de dia longo (16 h de luz com 50 pE»m-2»s~l, 8 h escuro), durante 7 dias. Subsequentemente, elas foram transferidas para placas suplementadas com inibidores de diferentes concentrações e efeitos sobre o fenótipo foram observadas 7 dias mais tarde. HPLC-análise de extratos de plantas

Duas semanas depois as plântulas ColO de A. thaliana foram vácuo infiltradas com ^ MS ou ½ MS contendo 100 μΜ composto 10 como descrito previamente (Rozhon et al., 2005). Depois de 15 min, e depois de 48 h as amostras foram enxaguadas com água e solo em azoto líquido num pó fino. 100 mg de pó foram pesados nm tubo de reacção e 1 ml de tampão de extração (20 mM de TRIS/HC1 pH6.8 dissolvido em 20% de acetonitrilo) foi adicionado. Após incubação durante 30 min num agitador ajustado às 800 rpm, a mistura foi centrifugada e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,2 ym. Os extratos foram analisados por HPLC com as mesmas definições acima referidas. 20

Ensaio da permeabilidade das células

Duas semanas depois as plântulas ColO de A. thaliana foram transferidas para H de meio MS contendo inibidor 50pm.

Amostras foram removidas após os pontos temporais indicados, lavados com água, secos com papel de filtro e rapidamente congelados em azoto líquido. Para análise o material vegetal foi moído para a um pó fino num almofariz pré-arrefecido com azoto líquido. Aproximadamente lOOmg de pó foram pesados em tubos de reação 1,5 ml e 1 ml de 20 mM TRIS/HC1 pH9.0 adicionados. 50 μΐ de 200 ym de de composto armazenado 4 foi adicionado como padrão interno. A extracção foi realizada a 80 °C durante 30 min num termo misturador Eppendorf a 800 rpm. O extracto foi centrifugado durante 5 min a 15.000 g e o sobrenadante transparente foi recolhido. A solução transparente foi acidificada por adição ácido fosfórico 25 μΐ e 4M e centrifugado durante 2 min a 15.000 g. O sobrenadante foi carregado imediatamente para um PH 100 mg em cartucho de extração de fase sólida (Varian, Lake Forest, CA) condicionado com 1 ml de acetonitrilo e duas vezes 1 ml de 100 mM de ácido fosfórico. As colunas foram lavadas com 1 ml de 100 mM de ácido fosfórico 100 e seco por aplicação de vácuo durante 1 min. Subsequentemente, a eluição foi realizada com 1 ml de 10 mM de TRIS/HC1 pH 9,0 contendo 5% de acetonitrilo. O eluato foi acidificado por adição de 15 μΐ de 4 M de ácido fosfórico utilizado para HPLC como descrito acima.

Resultados Síntese 21 0 ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico e outros derivados foram preparados por formação de amidas de aminopiridinas substituídas e anidridos de ácidos carboxílicos cíclicos ou cloretos de ácido dicarboxílico monometilésteres (Tabela 1). No último caso, o grupo de metilo foi subsequentemente removido por hidrólise alcalina, caso seja necessário. A pureza foi verificada por TLC e HPLC. Apenas um ponto pode ser observado em placas de TLC desenvolvidas e o pico do composto desejado representado, pelo menos, 95% da área total de todos os picos no cromatograma de HPLC. A inibição de ASKs in vitro 0 ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico é um potente inibidor do grupo I e grupo II ASKs. ASKO, um grupo III ASK é moderadamente inibido. A segunda quinase desta classe, ASKP, e o grupo da quinase IV ASKõ não são inibidos. Representantes de todos os grupos foram expressos como proteínas de fusão recombinantes GST em E. coli. A potência dos compostos sintetizados nos ASKs selecionados foram testado por ensaios de quinase in vitro utilizando MBP (proteína básica de mielina) como substrato e γ-[32Ρ]-ΑΤΡ como co-substrato (Fig. 1).

Os compostos 1 a 5 foram sintetizados para estudar o efeito da variação de comprimento da cadeia lateral alifática. 0 composto mais ativo, no. 3, tinha uma corrente consistindo em 4 átomos de carbono (Fig. 1). 0 glutaril (no. 4; 5 carbonos) e o adipoil (n° 5, 4 carbonos) derivados tinham uma potência significativamente inferior, enquanto os derivados mais curtos (no. 1 e 2; 2, ou 3 carbonos, respetivamente) tiveram quase nenhum efeito. Introdução de uma ligação dupla numa 22 cadeia lateral de ótimo comprimento de potência totalmente abolida (Fig. 1, composto 6). Isto indica que a configuração estérica é muito importante. Para testar se o grupo carboxi da cadeia alifática é crucial para a actividade, ou quando um grupo oxo é suficiente, os compostos 9 e 10 foram inclusos, que são variantes de metiladas de compostos 3 e 15, respectivamente. Além disso, o composto 8, que é um isómero estrutural do composto 3, foi testado. Como mostrado na figura 1, as variantes metiladas mostraram dramaticamente efeitos inibitórios reduzidos confirmando que um grupo carboxilo terminal é essencial.

Uma vez identificada a cadeia lateral adequada, o anel heterocíclico foi investigado em maior detalhe. Os compostos 3 e 11 têm ambos uma cadeia lateral de succinil de amido, mas diferem na posição do azoto heterocíclico. In vitro os ensaios de quinase revelaram que o composto 3 é mais potente (Fig. 1), o que demonstra que o azoto heterocíclico deve encontrar-se perto da posição de transporte do substituinte amido ácido succínico. Os dados anteriores indicam que um substituinte bromo na posição 5 do anel de piridina é crítico para a atividade biológica de 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-ácido-4-oxobutanóico. Para testar o efeito de outros substituintes, os compostos 12 al6 foram sintetizados. Tal como indicado na figura 1, o cloro, bromo e especialmente o derivado de iodo eram altamente ativos. Esta ordem de potência pode ser confirmada pela quantificação da atividade de quinase residual de BIN2 (Fig. 2). Em contraste, o composto de flúor exibiu uma potência muito baixa e o não substituído e o derivativo de nitro eram inativos.

Todos os compostos testados apresentaram uma especificidade semelhante para os ASKs. Os derivados ativos inibidos ASKa, 23 ΒΙΝ2 e Α3Κζ fortemente enquanto ASKG foi apenas moderadamente inibida. 0 efeito das substâncias ensaiadas em Α3Κβ e ASKõ negligenciável.

Inibição de ASKs in vivo

Regulação descendente de atividade ASK é crucial na sinalização brassinosteróides. ASKs são constitutivamente ativos em cpd e mutantes bril-1, os quais são defeituosas na biossíntese de brassinosteróides ou de sinalização, respectivamente. Isso leva a plantas severamente ananicadas com folhas enroladas para baixo verdes escuras e hipocótilos encurtados. Aplicação de epi-brassinólide, um sintético brassinosteróides, resgata cpg mas não bril-1, enquanto que ácido 4-[ (5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico resgata ambos os mutantes. Para o rastreio de potência in vivo, os mutantes cpd e bril-1 foram transferidos para meios contendo ácido 4-[(5-bromo-amino derivados]-4-oxobutanóico, a uma concentração de 30 μΜ. As plântulas tratadas com os compostos ativos apresentaram folhas expandidas, aumentaram comprimentos de hipocótilo e eram de verde claro. A potência para resgatar o fenótipo correlado com os resultados do ensaio in vitro. Curiosamente, contudo, o composto 10 foi altamente ativo in vivo, mas mostrou pouca potência in vitro (Fig. 3).

Devido a este resultado inesperado, o efeito das inibições da atividade ASK in vivo foi analisada por um método direto. Vários ASKs têm sido mostrados para fosforilar os factores de transcrição BZRl, BES1 e BEH2 in vivo. Isto conduz a uma mudança de mobilidade electroforética destes factores de transcrição permite a deteção de atividade quinase in vivo. Protoplastos de A. thaliana, foram co- 24 transformados com as construções de CFP-tagged BZR1 e Myc-tag ΑΞΚζ. Estas duas proteínas foram escolhidas porque elas foram bem expressas no sistema de protoplastos. Protoplastos transformados foram incubados com diferentes concentrações de compostos 10 e 15 e BZR1-CFP e ΑΞΚζ-Μγο e subsequentemente analisadas por western blotting. De acordo com os testes fenotípicos, o composto esterificado 10 era altamente ativo tal como o seu livre homólogo o ácido 15 (Fig. 4). Resultados semelhantes também foram obtidos para o par de 3 e 9.

Para investigar esses resultados conflituantes, o destino do composto 10 in vivo, foi investigado. Plântulas foram infiltradas com o composto 10 e extractos de plantas, posteriormente analisadas por HPLC. Apenas vestígios de composto 10 podem ser observados, mas um novo pico, designado P, apareceu (Fig. 5A e 5B) . Este pico pode ser identificado pelo seu tempo de retenção de 10.7 min e o seu espectro UV com absorção máxima a 252 e 292 nm como o composto 15 (Fig. 5B e 5C). 0 composto 10 é, portanto, não estável in vivo, mas rapidamente convertido em altamente ativo 10, explicando a diferente potência do composto 10, in vitro e in vivo. Resultados semelhantes foram obtidos para o par 3 e 9.

Permeabilidade do tecido A permeabilidade de célula de uma substância é uma característica importante que influencia a sua potência in vivo. A captação dos compostos 10 e 15 pelas plantas foi determinada por tratamento das plântulas com soluções destes compostos e posterior quantificação das concentrações de inibidor internalizadas (Fig. 6). Uma vez que o composto 10 é convertido rapidamente em 15, apenas a concentração in situ de 15 foi medida. As concentrações in situ de ambos os 25 compostos aumentaram, nas primeiras 3 horas e depois atingiram um patamar. É importante notar que as concentrações internas da planta excederam as do meio. Enquanto 50 mM estavam presentes no meio, em concentrações de cerca de 90 pm in situ podia ser medido no caso do composto 15 e de até 190 μΜ, no caso de aplicação do composto 10. O composto metilado, portanto, mostrou uma maior permeabilidade do tecido e atingiu uma concentração mais elevada em plantas.

Nos anos mais recentes, tremendos progressos foram feitos na compreensão de sinalização de brassinosteróides em Arabidopsis thaliana pela análise de mutantes. Actualmente, os três receptores de brassinosteróides e um co-receptor são conhecidos. Pelo menos quatro ASKs parecem estar envolvidos na fosforilação de 6 factores de transcrição semelhantes a BESl/BZRl-like e quatro fosfatasessão são competentes para convertê-los de volta à sua forma não fosforilada. Estas proteínas são todas alvos para potenciais inibidores. Uma vantagem notável de inibidores comparados com mutantes é a sua aplicabilidade imediata a origens genéticas diferentes e espécies. Além disso, os mutantes simples muitas vezes mostram nenhuns ou fracos fenótipos, devido à redundância funcional. Uma vez que as proteínas homólogas são frequentemente alvo dos mesmos compostos, a redundância funcional pode ser superada por estudos inibidores.

Um número de inibidores está disponível para a GSK-3oí e GSK-3β, os homólogos humanos de ASKs No entanto, tentativas de utilização destes compostos para quinases semelhantes a GSK-3/Shaggy em plantas não foram bem sucedidas. Num rastreio genético químico, ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico, foi recentemente identificado como a primeira substância que especificamente interfere com a sinalização de 26 brassinosteróides. Abordagens genéticas e bioquímicas revelaram que ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico actua em sinalização brassinosteroide por inibição de ASKs. Quinases semelhantes a GSK3/Shaggy são reguladores chave de sinais hormonais e tolerância modular ao stress, uma melhor compreensão da ação do ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico é altamente desejável.

Para resolver esta questão e para identificar inibidores de potência aumentada, um número de compostos com ácido 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico como estruturas foram sintetizados e a sua potência inibidora de quinases semelhantes a GSK3/Shaggy investigada in vitro e in vivo. Além disso, a reação fenotípica de plantas para este compostos foi estudada. Em primeiro lugar, o efeito do comprimento da cadeia lateral alifática contendo o grupo carboxílico foi analisada. Uma vez que os resultados preliminares mostraram que o derivado de cloro pode ser um tanto mais potente do que o derivado de bromo, 2-amino-5-cloropiridina foi utilizado para sintetizar uma série de compostos que diferem apenas no comprimento na cadeia lateral alifática. Ensaios de quinase in vitro revelaram que a potência inibidora destes compostos foi maior com uma cadeia lateral de 4 átomos. Além disso, a configuração estérica foi crucial. Introdução de uma ligação dupla cis numa cadeia lateral consistindo em 4 átomos, que é o número óptimo, resultou num composto inativo (no. 6). Uma ligação dupla cis provoca uma curvatura na cadeia alifática que conduz a um outro posicionamento do grupo carboxilo terminal. Este e os resultados a partir de compostos com diferentes comprimentos de cadeias laterais indicam que o grupo carboxilo deve ter uma configuração geométrica exata em relação ao anel heterocíclico para interação com os ASKs. 27 A evidência para o significado do grupo carboxilo terminal vem originalmente de um derivado com uma cadeia lateral não substituída. No entanto, isto não exclui que um grupo carboxi esterifiçado, o qual poderia ainda participar em interações de hidrogénio, o pode ser suficiente. Portanto, os compostos 8, 9, e 10, que foram incluídos são variantes de metilados de compostos 2, 3 e 15, respectivamente. Todas as três substâncias mostraram pouca ou nenhuma actividade in vitro para a testada ASKs confirmando que um grupo carboxi terminal deve estar presente na cadeia alifática. In vivo, os compostos 9 e 10 estavam ativos porque o grupo metilo foi rapidamente clivado, provavelmente por esterases, e o grupo carboxi assim reconstituído. Uma vez que o grupo carboxilo da cadeia alifática é carregado em pH intracelular, pode ser envolvido em interacções iónicas com os ASKs, por exemplo, com um resíduo de lisina ou arginina. Como alternativa, ele pode estar envolvido numa ligação de hidrogénio. Da mesma forma, o azoto do anel de piridina pode também ser envolvido numa ligação de hidrogénio ou uma interacção iónica com a proteína. Tem sido mostrado que a substituição do anel de piridina por um anel de benzeno reduz dramaticamente a potência inibidora. Para investigar o significado do anel heterocíclico com mais pormenor, o composto 11 foi sintetizado, o qual difere do composto altamente ativo 3 apenas na posição do azoto heterocíclico. Em testes in vitro revelaram que 11 está inactivo indicando que o azoto heterocíclico deve ser posicionado ao lado da cadeia lateral amido succinil para se obter um potente inibidor. Curiosamente, os resultados da presente invenção indicaram que a actividade dos compostos com maior número atómico do substituinte halogénio na posição do anel piridina 5, embora os dados preliminares sugeriram o efeito oposto. O derivado de iodo (n 0 15) teve a maior atividade, enquanto o 28 derivado flúor (n° 13), pelo menos foi potente. Devido à sua hidrofobicidade, esta parte estrutural do inibidor pode estar envolvido nas interacções de van der Waalscom com a quinase. Para as atracções de van der Waals, a distância entre os átomos que interagem é crucial. Eles diminuem rapidamente com distâncias cada vez maiores e só são eficazes quando os átomos são muito próximos um do outro. 0 raio van der Waals, que descreve a distância óptima para uma interacção, aumenta com o período de um grupo da tabela periódica dos elementos. Por exemplo, o raio de van der Waals são 0,22 nm para o iodo e 0,14 nm para átomos de flúor. Além disso, o comprimento da ligação covalente entre o carbono do anel de piridina e o iodo é também maior do que a dos outros halogéneos. A estrutura do derivado de iodo pode, por conseguinte, ter propriedades ideais para ligar a uma bolsa hidrofóbica do ASKs. Além disso, a hidrofobicidade dos compostos aumenta com o número atómico do substituinte halogénio, tal como indicado pelo aumento de tempos de retenção em RP-HPLC (Tabela 1), o que pode facilitar ainda mais as interacções hidrofóbicas.

Os ensaios de permeabilidade de tecido revelaram que a absorção dos compostos, especialmente os esterifiçados, foi rápida. De modo interessante, as concentrações in situ excederam a do meio circundante várias vezes. Isto pode ser explicado pelos valores pKa dos compostos (Tabela 1). Por exemplo, o derivado 15 tem um valor pKa de 5,8, o que significa que a um pH 5,8, o pH do meio utilizado, 50% do composto é dissociado e, por conseguinte, carregado negativamente, enquanto 50% é indissociável. A um pH de 7,4 intracelular menos que 3% do composto é indissociável. Uma vez que apenas a indissociável forma lipofílico pode passar biomembranas de forma eficiente, os compostos são presos na 29 célula e acumulam-se em concentrações que excedem o meio envolvente. Esta absorção dependente do pH semelhante ao hormônio vegetal auxina, onde pH difusão orientado contribui para o transporte para dentro da célula. Os compostos esterifiçados, por exemplo, n. 10, são independentes do pH, altamente lipofilico e pode passar membranas. Na célula, eles são rapidamente hidrolisados para os ácidos correspondentes que desprotonam para o anião hidrofilico. É interessante notar que a taxa de absorção do composto 10 foi de aproximadamente o dobro do composto 15, que se correlaciona com as porções capazes de difusão através da membrana. Embora 100% do composto 10 é lipofilico, e apenas 50% do composto 15 é indissociável e, por conseguinte, suficientemente lipofilico. Isso poderia explicar as taxas de absorção diferentes. Tidos em conjunto, o composto 15, também chamado de iodo-4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico, foi o composto mais potente in vitro e mostrou actividade inibidora elevada in vivo. Sua variante metilada, ácido metil-iodo- 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico (composto 10), mostrou absorção muito rápida e, por conseguinte, o inibidor de ASK de escolha para estudos in vivo. Várias quinases semelhantes a GSK3/Shaggy são conhecidas por serem rapidamente ativados em resposta ao stress. Devido à sua excelente e rápida permeabilidade celular, ácido metil-iodo 4-[(5-bromo-2-piridinil)amino]-4-oxobutanóico e compostos relacionados serão valiosos para investigar o papel desta familia quinase na sinalização do stress inicial.

Referências:

Kim et al. , Bioorg Med Chem 6 (1998), 1975-1982.

Min et al., Bioorg Med Chem Lett 9 (1999), 425-430.

Rozhon et al., Anal Bioanal Chem 382 (2005), 1620-1627. 30

Sekimata et al., J Agric Food Chem 50 (2002), 3486-3490. Sekimata et al., Planta 213 (2001), 716-721

Vert et al., Nature 441 (2006), 96-100. 26-10-2012 31

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uso de um composto com a fórmula (I)

   X em que X é F, Cl, Br, ou I; R1 é CH3, C2H5, C2H4R 3, C2H3R3R4, C3H7, C3H6R3 ou C3H5R3R4; R2 é H, CH3, C2H5, C2H4R 3 ou C2H3R3R4; e R3 e R4 são, independentemente, X, OH ou NH2 para o tratamento de plantas, especialmente para melhorar o crescimento vegetal, o melhoramento do rendimento da cultura e/ou providenciar resistência ao stress.
2. 2. Uso de acordo com a reivindicação, caracterizado por R1 ser CH3, R2 é H e X é 1.
3. 3. composição, que compreende um composto com a fórmula (I) ,

   (D em que X é F, Cl, Br, ou I; 1 R1 é CH3, C2H5, C2H4R3, C2H3R3R4, C3H7, C3H6R3 ou C3H5R3R4; R2 é H, CH3, C2H5, C2H4R3 ou C2H3R3R4, e R3 e R4 são, independentemente, X, OH ou NH2.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por R1 é CH3, R2 é H e X é I.
5. 5. Composto com a fórmula (II)

   (II).
6. 6. Método para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o 2-amino-5-iodopiridina reagir com cloreto de succinil metilo.
7. 7. Método para a preparaçao de um composto com a fórmula (III)

   em que X é I, e R2 é H, caracterizado por a 2-amino-5-iodopiridina é feito reagir com anidrido succinico. 2
8. 8. Método para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por um composto que tem a fórmula (III)

   (III). / 2 / / i em que X é I, e R e H, e alquilado com um halogeneto de metilo, de um sulfato de dimetilo ou diazometano ou é esterificado com CH3OH.
9. 9. Utilização de um composto tendo a fórmula (I)

   (D. em que X é F, Cl, Br, ou I; R1 é ch3, c2h5, c2h4r3, c2h3r3r4, c3h7, c3h6r3 ou c3h5r3r4; R2 é H, CH3, C2H5, C2H4R3 ou C2H3R3R4, e R3 e R4 são, independentemente, X, OH ou NH2, como um herbicida.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por R1 que é CH3, R2 é H e X é I. 3 26-10-2012 4