KR100859745B1

KR100859745B1 - 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 및 이를 함유하는 허혈성질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100859745B1
Application number: KR1020070007036A
Authority: KR
Inventors: 양은경; 조현주; 김수년; 박현성
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2007-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2008-09-23
Also published as: US20100004325A1; KR20080069384A

Abstract

본 발명은 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 억제하는 스크리닝 방법으로 선정된 프롤릴 하이드록실라제 2(HIF-1α specific prolyl hydroxylase 2) 억제제, 바람직하게는 바이칼레인(Baicalein), 및 이를 함유하는 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 혈관생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

프롤릴 하이드록실라제 2, 억제제, 바이칼레인, 허혈성 질환, 혈관생성

Description

프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 및 이를 함유하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{HIF-1α SPECIFIC PROLYL HYDROXYLASE 2 INHIBITORS AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF ISCHEMIC DISEASES CONTAINING THE SAME}

도 1은 HIF-1α의 아미노산 서열 중 556 내지 575번째의 아미노산 서열을 갖고, 564번째 위치에 프롤릴 하이드록실라제 2에 의하여 수산화되는 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 형광표지된 펩타이드(F-P564)의 수산화 반응이 생물학적 활성을 가진 화합물(NINDS Custom Collection II, MicroSource Discovery System)에 의해 억제되는 정도를 형광편광 값의 비(%)로 측정하여 나타낸 도면이고,

도 2a는 HIF-1α의 아미노산 서열 중 556 내지 575번째의 아미노산 서열을 갖고, 564번째 위치에 이미 수산화된 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 형광표지된 펩타이드(F-HyP564)의 수산화 반응이 바이칼레인에 의해 억제되는 정도를 형광편광 값(FP)으로 측정하여 이를 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 프로그램을 이용하여 효소활성을 50% 저해하는 바이칼레인의 농도(IC₅₀)를 구한 그래프이고, 도 2b는 바이칼레인이 HIF-1α의 아미노산 서열 중 556 내지 575번째의 아미노 산 서열을 갖고, 564번째 위치에 이미 수산화된 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 형광표지된 펩타이드(F-HyP564)와 VBC의 결합에 미치는 영향을 형광편광 값(FP)으로 분석한 그래프이고,

도 3a는 바이칼레인이 효소의 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 바이칼레인 존재 또는 부재하에 biotin이 부착된 B-P564 펩타이드와 프롤릴 하이드록실라제 2를, 도 3b는 HIF-1α 아미노산 서열 중 C-말단 부위에 존재하며 전사활성에 영향을 주는 803번째에 위치한 아스파라긴 잔기를 포함하는 펩타이드인 F-N803 펩타이드(인간 HIF-1α의 아미노산 서열 중 788 내지 822번째 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드)와 아스파라긴 하이드록실라제(FIH-1, Factor-inhibiting FIH-1)를 각각 반응시킨 후, 바이칼레인의 존재 여부에 따른 상기 펩타이드의 수산화 반응 정도를 질량분석기(mass spectrometry)로 측정하여 나타낸 그래프이고,

도 4a및 4b는 바이칼레인의 농도에 따른 HepG2 및 SH-SY5Y 세포내의 HIF-1α 단백질량 변화를 각각 웨스턴 블랏으로 측정하여 나타낸 사진으로, Clioquinol(CQ, 50 μM) 및/또는 저산소 상태(hypoxia, H)는 바이칼레인의 양성 대조군으로 사용한 것이고,

도 5a 및 5b는 바이칼레인, DFO(Deferoxamine), 및 CoCl₂를 각각 HeLa 세포에 처리한 후 안정화된 HIF-1α가 HeLa 세포내에서 저산소 반응인자(HRE)와 결합하는 정도를 리포터 분석으로 측정하여 얻어진 값을 β-갈락토시다제(도 5a), 및 총 단백질량(도 5b)으로 보정하여 나타낸 그래프이고,

도 6a는 바이칼레인의 농도에 따른 HepG2 세포내의 VEGF mRNA 발현량 변화를 RT-PCR로 측정하여 나타낸 사진이고, 도 6b는 바이칼레인의 농도에 따른 HepG2 세포에서 분비되는 VEGF 단백질량 변화를 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정하여 나타낸 사진이고,

도 7은 생체내 유정란에서 바이칼레인에 의해 유도된 혈관생성효과를 Chick Chorioallantoic Membrane(CAM) 분석으로 측정하여 나타낸 사진이다.

본 발명은 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 억제하는 스크리닝 방법으로 선정된 프롤릴 하이드록실라제 2(HIF-1α specific prolyl hydroxylase 2) 억제제, 바람직하게는 바이칼레인(Baicalein) 및, 이를 함유하는 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 혈관생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

HIF-1(hypoxia inducible factor-1; 저산소 유도인자)은 에너지 대사, 혈관운동 제어, 신생혈관 형성, 세포사멸(apoptosis)과 관련된 유전자의 발현조절 및 저산소 상태에 있는 다양한 세포반응에서 중요한 역할을 하는 단백질이다. 특히, HIF-1의 이형질복합체(heterodimer) 중 HIF-1α는 저산소 상태(hypoxia)에서는 안정화되어 다양한 유전자의 발현에 영향을 주지만, 정상산소 상태(normoxia)에서는 수분내에 프로테오솜(proteasome)에 의해 분해되는 특징을 가지고 있다. 저산소 상태에서 안정화된 HIF-1α는 표적 유전자의 프로모터상에 존재하는 저산소 반응인자(hypoxia-response element, HRE)와 결합하여 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다고 알려져 있다(Lando, D., et al., Genes Dev., 16, 1466-1471). 저산소 상태에서 HIF-1α는 신생혈관 형성에 중요한 역할을 하는 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 촉진시켜 국소빈혈과 같은 질환에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라(Semenza, G. L.,　Curr. Opin. Genet. Dev., 8, 588-594, 1998), 세포주기 촉진, 혈관형성의 항진, 또는 세포의 생존기능을 항진시킬 수 있기 때문에 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 정상산소 상태에서 HIF-1α는 혈관형성 억제를 통하여 암조직의 성장을 저해할 수 있기 때문에 암 또는 염증(inflammation)을 치료하는데도 유용하게 사용될 수 있다고 보고되었다(Amato, G., et al., Nature Reviews, 2, 1-9, 2003).

정상산소 상태에서 HIF-1α의 분해는 VHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor) 단백질과의 결합으로 촉진되는데, 이 두 단백질간의 결합은 HIF-1α의 아미노산 서열 중 402 또는 564번째에 있는 하이드록시프롤린 잔기에 의해 이루어진다. 특히, 프롤릴 하이드록실라제(prolyl hydroxylase, PHD) 효소는 HIF-1α 단백질의 특정 프롤린 잔기를 수산화시켜 VHL 단백질과의 상호작용을 조절하는데, 이때 산소, 철, 아스코르브산염(ascorbate) 및 보조인자(cofactor)인 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate) 등을 필요로 한다(Masson, N. & Ratcliffe, P. J., Journal of Cell Science, 116, 3041-3049, 2003). 상기 효소 중 프롤릴 하이드록실라제 2(PHD2)는 정상산소 상태에서 HIF-1α의 프롤린 잔기를 수산화시켜 지속적으로 제거하는데 매우 중요한 역할을 하는 효소로 알려져 있다(Berra, E., EMBO J., 22, 4082-4090, 2003). 따라서, 이러한 효소의 인위적 저해는 저산소 상태와 유사한 환경(hypoxia-mimic condition)을 만들어 주기 때문에 정상산소 상태에서 HIF-1α의 활성을 촉진시킬 수 있는 약물을 탐색하는데 많은 도움을 준다.

현재까지 VHL 단백질과 HIF-1α의 상호작용을 관찰하기 위한 방법으로는 2종-혼성화 분석법(two-hybrid assay), 리포터 분석법(reporter assay), 전기영동법(SDS-PAGE), 면역침강법 및 자기방상법 등과 같은　많은 생화학적 또는 면역학적 방법들이 사용되고 있으며(US 6,787,326 B1), HIF-1α와 VHL 단백질간의 결합 및 수산화 반응 유무를 관찰할 수 있는 아비딘(avidin)이 코팅된 96-웰 플레이트를 이용한 분석법이 사용되고 있다(Oehme, F., et al., Analytical Biochemistry, 330, 74-80, 2004). 그러나, 상기 방법들은 대량의 시료를 요구하고, 과정이 복잡하며, 실험 소요시간이 길고, 방사성 동위원소를 사용하며, 아비딘(avidin)과 같은 고가의 단백질이 코팅된 플레이트를 사용한다는 단점을 가지고 있다.

이러한 단점을 보완하고자, 본 발명자들은 앞선 발명에서 하이드록시프롤린 잔기를 포함하는 HIF-1α에서 유래된 펩타이드에 형광물질을 부착한 프로브와 VHL단백질을 포함하는VBC 복합체간의 상호작용 여부를 형광편광도의 변화를 이용하여 간단하게 정량적으로 분석하는 방법을 개발한 바 있다(국내특허출원번호 제2005-0066881호). 이러한 분석방법은 결합체를 따로 분리하지 않아 기존의 방법들에 비해 과정이 단순하고 웰 프레이트를 이용한 자동화가 가능하여 분석비용을 절감할 수 있기 때문에 HIF-1α와 VBC 단백질의 상호작용을 저해하는 물질을 스크리닝하거나 또는 HIF-1α를 수산화시키는 프롤린 하이드록실라제 2의 활성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제를 스크리닝하는 것이 가능하다.

또한, 상기 스크리닝 방법으로 선정된 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제가 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는지를 입증하는 것이 필요하다.

본 발명의 목적은 형광물질을 부착한 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 형광편광으로 분석하는 스크리닝 방법을 이용하여 프롤릴 하이드록실라제 2(HIF-1α specific prolyl hydroxylase 2) 억제제로서 선정된 화합물, 바람직하게는 바이칼레인(Baicalein)을 함유하는 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제를 유효성분으로 함유하는, 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

이러한 요구에 부응하기 위하여 상기 개발된 형광물질을 부착한 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 분석하는 스크리닝 방법을 이용하여 생물 학적 활성을 가진 1040개의 화합물 라이브러리에 대하여 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제를 스크리닝하는 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 화합물, 바람직하게는 바이칼레인 및 시클로피록스(ciclopirox) 등을 선정하였고, 이 중 바이칼레인이 프롤릴 하이드록실라제 2를 효과적으로 저해함으로써 유사 저산소 상태(hypoxia-mimic condition) 유도, 정상산소 상태에서의 HIF-1α 안정화, 및 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 혈관생성촉진용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 화합물을 스크리닝하는 방법은 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 이전 출원한 국내특허출원번호 제2005-0066881호 (본 명세서에 참조로서 포함된다)에 기재된 형광물질을 부착한 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 이용하여 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 화합물을 스크리닝 할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법 중 하나를 예로 들어 하기와 같이 기재하였다:

즉, 본 발명은 형광물질을 부착한 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 있어서,

1) HIF-1α의 아미노산 서열 중 적어도 564번째에 위치하는 수산화되지 않은 프롤린 잔기를 포함하는 형광표지된 펩타이드(F-P564, 서열번호 1)를 프롤릴 하이드록실라제 2(HIF-1α specific prolyl hydroxylase 2, PHD2) 및 저해제 후보물질과 혼합하여 반응시킨 후, VBC(von Hippel-Lindau-Elongin B-Elongin C)를 추가하 여 형광편광 값을 측정하는 단계;

2) HIF-1α의 아미노산 서열 중 적어도 564 번째에 위치하는 이미 수산화된 프롤린 잔기를 포함하는 형광표지된 펩타이드(F-HyP564, 서열번호 2)를 VBC 및 프롤릴 하이드록실라제 2 와 혼합한 후, 형광편광 값을 측정하는 단계 및

3) 상기 단계 1) 및 2)에서 측정된 형광편광 값을 비교하여 단계 2)의 값을 기준으로 단계 1)의 값이 감소할 경우, 상기 후보물질을 HIF-1α 펩타이드의 수산화 반응을 유도하는 프롤릴 하이드록실라제 2의 활성에 대한 억제제로 판정하는 단계를 포함하는,

스크리닝 방법에 의하여 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제로서 선정된 화합물을 함유하는 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 조성물을 제공한다.

상기 화합물은 바이칼레인 및 시클로피록스(ciclopirox)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물, 보다 바람직하게는 바이칼레인을 포함하는 것일 수 있다. 상기 바이칼레인은 특히, 항암(anti-cancer), 항산화(anti-oxidant), 항염증(anti-inflammation), 및 항라디칼(anti-radical) 등의 효능을 가지고 있고(Zhang, D. Y., et al., Cancer Research, 63, 4037-4043, 2003; Shen, Y-C, Eur J Pharmacol, 465, 171-181, 2003; Huang, W-H, Biosci. Biotechnol. Biochem, 70, 2371-2380, 2006; 대한민국특허공고 제1992-0002285호; 및 JP 제1995-196490호), 본 발명의 구체예에 있어서 프롤릴 하이드록실라제 2를 억제하여 HIF-1α를 활성화시키고, 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현을 증가시켜 최종적으로 혈관생성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 또 다른 측면에서 상기 바이칼레인은 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과 뇌졸중 및 말초혈관질환 등을 포함하는 허혈성 심혈관 질환, 보다 바람직하게는 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 허혈성 질환에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 화합물, 보다 바람직하게는 바이칼레인을 유효성분으로 함유하는, 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 형광물질을 부착한 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 이용하여 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 화합물을 스크리닝하였다.

구체적으로, 본 발명은

1) HIF-1α의 아미노산 서열 중 적어도 564번째에 위치하는 수산화되지 않은 프롤린 잔기를 포함하는 형광표지된 펩타이드(F-P564, 서열번호 1)를, 프롤릴 하이드록실라제 2(HIF-1α specific prolyl hydroxylase 2, PHD2) 및 저해제 후보물질과 혼합하여 반응시킨 후, VBC(von Hippel-Lindau-Elongin B-Elongin C)를 추가하여 형광편광 값을 측정하는 단계;

상기 저해제 후보물질로는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, HIF-1α 펩타이드의 프롤린 잔기를 수산화 반응시키는 프롤릴 하이드록실라제 2의 활성을 억제하는 모든 항체, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 및 합성 화합물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 생물학적 활성을 가진 1040개의 화합물(NINDS Custom Collection II, MicroSource Discovery Systems)중에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 스크리닝 방법에 의하여 상기 1040개의 화합물 중 25개의 프롤릴 하이드록실라제 2의 활성 억제제를 선별하였고, 이 중에서 바이칼레인 및 시클로피록스(ciclopirox) 등이 프롤릴 하이드록실라제2의 활성을 특이적으로 저해하여 HIF-1α의 양을 세포수준에서 증가시킴을 확인하였다.

특히, 바이칼레인은 황금(Scutellaria baicalensis)의 뿌리로부터 추출된 플라보노이드(flavonoid)의 일종으로서 중국 약초로 널리 이용되어져 왔으며, 항 암(anti-cancer), 항산화(anti-oxidant), 항염증(anti-inflammation), 및 항라디칼(anti-radical) 등의 효능을 가지고 있다고 알려져 있다(Zhang, D. Y., et al., Cancer Research, 63, 4037-4043, 2003; Shen, Y-C, Eur J Pharmacol, 465, 171-181, 2003; Huang, W-H, Biosci. Biotechnol. Biochem, 70, 2371-2380, 2006; 대한민국특허공고 제1992-0002285호; 및 JP 제1995-196490호).

또한, 최근에는 전립선암 및 유방암 등의 종양 조직에 과량으로 발현되는 12-lipoxygenase의 활성을 특이적으로 억제한다고 보고되었다(Daotai, N, et al., J.Biol.Chem., 281, 18601-18609, 2003).

따라서, 상기 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제는 바이칼레인 및 시클로피록스(ciclopirox)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물, 보다 바람직하게는 바이칼레인을 포함하는 것일 수 있다.

상기 단계 1)의 형광표지된 펩타이드(F-P564)는 HIF-1α 전장 아미노산 서열(GeneBank 등재번호: U22431) 중 적어도 564번째에 위치한 수산화되지 않은 프롤린 잔기를 포함하고, 형광물질이 부착되어 형광표지된 펩타이드로서, 본 명세서에서는 'F-P564 펩타이드'로도 표현된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 F-P564 펩타이드는, 적어도 HIF-1α 전장 아미노산 서열(등재번호: U22431) 중 564번째에 위치하는 수산화되지 않은 프롤린 잔기를 포함하고 상기 프롤린 잔기의 수산화 반응을 유도할 수 있는 HIF-1α의 VBC 단백질과의 결합 부위인 556 내지 575번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 단계 1)의 F-P564 펩타이드를 형광표지하는 형광물질은 특별히 한정되는 것은 아니나, 피코에리스린(phycoerythrin, PE), 텍사스 레드(Texas Red, TR) 및 로다민(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC), 플루오레신카복실산(fluorescein carboxylic acid, FCA), 플루오레신 티오우레아(fluorescein thiourea, FTH), 7-아세톡시쿠마린(acethocycoumarin)-3-1, 플루오레신-5-1, 플루오레신-6-1, 2',7'-디클로로플루오레신(dichlorofluorescein)-5-1, 2',7'-디클로로플루오레신-6-1, 디하이드로테트라메틸로사민(dehydrotetramethylosamine)-4-1, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine)-5-1, 및 테트라메틸로다민-6-1로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 단계 1)의 F-P564 펩타이드는 펩타이드와 형광물질을 연결시켜주는 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 링커는 형광물질이 부착된 HIF-1α 펩타이드가 VBC 단백질과 결합시에 유발될 수 있는 형광세기 변화를 최소화하여 형광편광 측정을 용이하게 하는 역할을 하는 것으로, 이러한 효과를 갖는 어떠한 물질도 링커로서 사용가능하며, 예컨대, 아미노카프로산 등을 링커로 사용할 수 있다.

본 발명의 구체예에 있어서, 상기 단계 1)의 F-P564 펩타이드는 HIF-1α의 아미노산 서열(등재번호: U22431) 중 556 내지 575번째 아미노산 서열을 갖고, 상기 아미노산 서열의 N-말단에 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)가 연결되고, 그 끝에 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 부착된 서열번호 1(DLDLEALAPYIPADDDFQLR)로 표현되는 것일 수 있다.

상기 단계 2)의 형광표지된 펩타이드(F-HyP564)는 HIF-1α의 전장 아미노산 서열(등재번호: U22431) 중 적어도 564번째에 위치한 이미 수산화된 프롤린 잔기를 포함하고, 형광물질이 부착되어 형광표지된 펩타이드로서, 본 명세서에서는 'F-HyP564 펩타이드'로도 표현된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 F-HyP564 펩타이드는 적어도 HIF-1α 전장 아미노산 서열(등재번호: U22431) 중 564번째에 위치하는 이미 수산화된 프롤린 잔기를 포함하고, 상기 프롤린 잔기의 수산화 반응을 유도할 수 있는 HIF-1α의 VBC 단백질과의 결합 부위인 556 내지 575번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 단계 2)의 F-HyP564 펩타이드는 링커를 통하거나 통하지 않고 형광물질이 부착되어 형광표지된 것이다. 이 때, 형광물질과 링커는 상기 단계 1)에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 구체예에 있어서, 상기 단계 2)의 F-HyP564 펩타이드는 HIF-1α의 556 내지 575번째 아미노산 서열을 갖고, 상기 아미노산 서열의 N-말단에 아미노카프로산 링커가 연결되고, 그 끝에 FITC가 부착된 서열번호 2(DLDLEALAHyPYIPADDDFQLR)로 표현되는 것일 수 있다.

상기 VBC 단백질은 정상산소 상태에서 HIF-1α와 결합하여 최종적으로 HIF-1α를 비활성화시키는 매개 단백질로서 인간을 포함하는 동물에 존재한다. 상기 VBC 단백질은 VHL, Elongin B 및 Elongin C 단백질로 구성되어 있으며, 통상적으로 VHL 단백질의 β 영역에 Elongin C가 결합하여 복합체를 형성하고, 이후 Elongin C 부분에 Elongin B가 결합하는 형태로 이루어져 있으나, 상기 단백질들의 결합 순서에 한정되는 것은 아니며, 상기 세 개의 단백질로 이루어진 어떤 단백질 복합체도 이용가능하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 Human von Hippel-Lindau 유전자(GeneBank 등재번호: NM000551)의 54 내지 213번째 아미노산 코딩 서열과 Human Elongin B 유전자(GeneBank 등재번호: NM007108)의 1 내지 118번째 아미노산 코딩 서열을 순차적으로 발현벡터에 클로닝하고, Human Elongin C 유전자(GeneBank 등재번호: NM005648)의 17 내지 112번째 아미노산 코딩 서열을 발현벡터에 클로닝하여 제조한 후 BL21(DE3) 균주에 동시에 형질도입하여 숙주세포내에서 VHL, Elongin B, 및 Elongin C 단백질이 발현되어 서로 결합된 복합체 형태인 VBC 단백질을 분리 및 정제하였다.

상기 프롤릴 하이드록실라제 2는 Human PHD2 유전자(GeneBank 등재번호: AJ310543)의 184 내지 426번째 아미노산 코딩 서열을 발현벡터에 클로닝하여 제조한 후 상기와 같은 방법으로 BL21(DE3) 균주에 형질도입하여 수득한 후 분리 및 정제하였다.

상기 VBC 또는 프롤릴 하이드록실라제 2의 분리 및 정제방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 투석, 한외여과, 및 이온-교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하 차이를 이용하는 방법 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성 차이를 이용하는 방법을 이용할 수 있다.

후술하는 본 발명의 실시예에서는, 상기의 스크리닝 방법을 이용하여, 도 1에 나타낸 바와 같이 프롤릴 하이드록실라제 2의 활성을 저해하는 25개의 억제제를 선별하였고, 선정된 억제제 중에서도 특히 바이칼레인은 농도-의존적으로 프롤릴 하이드록실라제2의 활성을 저해시켰으며 IC₅₀ 농도가 14.98 μM 정도로 매우 효과적인 저해활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다(도 2a 참조).

바이칼레인은 HIF-1α와 VBC간의 결합을 직접적으로 저해하지 않은 반면(도 2b 참조), 프롤릴 하이드록실라제 2에 의한 HIF-1α 펩타이드 내 프롤린 잔기의 수산화 반응이 바이칼레인에 의해 억제되었고(도 3a 참조), HIF-1α의 803번째 아스파라진긴 잔기를 수산화 반응시킴으로써 전사보조단백질인 CBP(cAMP-response element-binding protein) 또는 p300 단백질과의 결합을 저해하는 중요인자인 FIH-1(Factor-inhibiting HIF-1) 활성 또한 유사하게 억제됨을 확인할 수 있었다(도 3b 참조).

따라서, 상기 스크리닝 방법에 의하여 선정된 화합물 중 바이칼레인은 프롤릴 하이드록실라제 2 활성 억제제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이에 본 발명은 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제로 선정된 화합물, 보다 바람직하게는 바이칼레인을 유효성분으로 함유하는 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 화합물을 유효성분으로 함유하는 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선청성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과 뇌졸중 및 말초혈관질환 등을 포함하는 허혈성 심혈관 질환, 보다 바람직하게는 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 허혈성 질환을 예방 또는 치료를 위한 혈 관생성촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제로서 선정된 화합물은 우수한 혈관생성 촉진 효과를 가짐으로써 심혈관 질환 및 허혈성 질환의 치료 또는 예방 효과를 가질 수 있다. 상기 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제로서 선정된 화합물은 특별히 한정되는 것은 아니나, 바이칼레인(Baicalein)인 것이 바람직하다. 상기 바이칼레인 외에 또 다른 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제 화합물로는 시클로피록스(ciclopirox)를 포함할 수 있으나, 이미 HIF-1α의 수산화 반응을 억제하여 HIF-1α 및 VEGF의 발현을 증가시킨다는 보고가 있다(Linden, et al., FASEB J. 17, 761-763, 2003).

따라서, 본 발명에서는 프롤릴 하이드록실라제 2의 억제제로서 선정된 화합물을 대표하는 화합물로서 바이칼레인을 사용하여, 세포수준 단계에서 바이칼레인에 의한 정상산소 상태에서 HIF-1α의 안정성이 저산소 상태와 유사할 수 있는지, 또한 HIF-1α의 대표적인 표적 유전자로 알려진 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현량이 증가될 수 있는지, 최종적으로 생체내 유정란에서 신생혈관생성을 촉진하는지를 분석하였고, 이를 통해 본 발명에 의해 스크리닝된 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제가 지속적으로 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는지를 조사하였다.

프롤릴 하이드록실라제 2뿐만 아니라 FIH-1의 활성을 저해하는 바이칼레인이 정상산소 상태에서 세포내 HIF-1α의 단백질 발현을 증가시키는지 웨스턴 블랏으로 분석한 결과, 상기 바이칼레인은 프롤릴 하이드록실라제 2와FIH-1의 활성을 저해함 으로써 HIF-1α의 단백질 발현을 농도-의존적으로 증가시켰고(도 4a 및 4b 참조), 정상산소 상태에서 바이칼레인에 의해 안정화된 HIF-1α가 표적 유전자의 프로모터상에 존재하는 저산소 반응인자(hypoxia-response element, HRE)와의 결합력은 유사 저산소 상태(hypoxia-mimic condition)에서 HIF-1α가 저산소 반응인자와 결합하는 것과 유사하였다(도 5a 및 5b 참조).

또한, 바이칼레인에 의해 안정화된 HIF-1α가 저산소 반응인자와 결합하여 특정 유전자, 바람직하게는 HIF-1α의 대표적인 표적 유전자로 알려진 혈관내피성장인자(VEGF)의 mRNA(HepG2 세포주) 및 단백질량(HeLa 세포주)을 증가시켜(도 6a 및 6b 참조), 최종적으로 생체내 유정란에서 혈관생성을 촉진한다는 것을 CAM(Chick Chorioallantioic Membrane) 분석으로 증명하였다(도 7 참조).

이는, 본 발명에 의한 바이칼레인은 프롤릴 하이드록실라제 2를 억제시켜 정상산소 상태에서도 HIF-1α의 활성을 유도하고 혈관내피성장인자와 같은 HIF-1α의 표적 치료용 유전자의 발현을 증가시켜 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다. 상기 조성물내 바이칼레인 등의 유효성분의 유효함량은 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과 뇌졸중 및 말초혈관질환 등을 포함하는 허혈성 심혈관 질환, 바람직하게는 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 조성물의 사용방법 또는/및 목적에 따라 적절하게 조절하여 사용할 수 있다.

상기 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 이때 상기 첨가제의 종류는 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.또한, 상기 조성물은 경구용으로 사용될 수 있으며, 예를 들면 경고제, 과립제, 산제, 정제, 또는 캡슐제 등으로 제조될 수 있다. 이때, 상기 조성물의 투여량은 용도, 사용목적, 환자의 상태, 나이, 성별, 체중, 처방약 및 질병의 종류에 따라 적절하게 조절하는 것이 바람직하며, 통상적으로는 0.01 내지 100mg/kg, 보다 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg이고, 하루에 1회 내지 수회, 보다 바람직하게는 1일 3회로 나누어 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> VBC ( von Hippel - Lindau - Elongin B- Elongin C), 프롤릴 하이드록실라제 2( HIF -1α specific prolyl hydroxylase 2, PHD2 ), 및 FIH -1( Factor -inhibiting HIF -1) 단백질 제조

VBC(von Hippel-Lindau-Elongin B-Elongin C) 단백질을 제조하기 위하여, 본 실시예에서는 Human von Hippel-Lindau 유전자(GeneBank 등재번호: NM000551)의 54-213번째 아미노산 서열 및 Human Elongin B 유전자(GeneBank 등재번호: NM007108)의 1-118 번째 아미노산 서열을 pGEX-4T-1(GE Healthcare Life Sciences, USA)에 클로닝하여 pGEX4T-VHL-EB 발현벡터를 제조하였고, Human Elongin C 유전 자(GeneBank 등재번호: NM005648)의 17-112 번째 아미노산 서열을 pET29b(Novagen)에 클로닝하여 pDEV-EC발현벡터를 각각 제조한 후 BL21(DE3)(Novagen) 균주에 동시에 형질전환시켰다.

또한, PHD2 단백질을 제조하기 위하여 인간 림프구 cDNA 라이브러리(human lymphocyte cDNA library)로부터 클로닝한 Human PHD2 유전자(GeneBank 등재번호: AJ310543)의 184-426 번째 아미노산 서열을 pGEX-4T-1에 클로닝한 후 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 이처럼 형질전환된 세포는 50 ㎍/㎖의 앰피실린과 100 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 LB 배지(VBC 단백질 생산용 배지), 또는 50 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유한 LB 배지(PHD2 단백질 생산용 배지)에 각각 접종한 후 흡광도가 0.6 이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 단백질 발현을 유도하기 위해 0.5 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 18℃에서 15시간 동안 배양하였다.　 원심분리하여 수득한 상기 세포에 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 리소자임(lysozyme)을 최종농도가 각각 0.2 mM 및 1 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 10 mM의 인산염완충용액(PBS, pH 7.4; 110 mM NaCl, 1 mM DTT)에 현탁시킨 후 4℃에서 초음파로 분쇄하였다.　

상기 얻어진 세포 추출물에 2% Triton X-100을 첨가하여 잘 섞어준 후 10분간 얼음에 두었다가 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다.　 분리된 상등액에 1 mM의 DTT를 첨가하여 글루타치온-세파로스[glutathione(GST)-sepharose] 4B 수지(Bio-Rad)와 혼합한 후 4℃에서 2시간 동안 교반하였고,　반응된 수지 혼합액에 10배 부피의 인산염완충용액을 첨가하여 2,100 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상 등액을 제거하였다.　 상기 과정을 3회 연속으로 반복하여 상등액을 제거한 후, 반응 수지 혼합물을 Bio-Spin^®Disposable Chromatography Columns(Bio-Rad)에 넣어서 5 ㎖의 PBS로 여과시키고, 2 ㎖의 1 M NaCl 용액으로 여과시킴으로써 불필요한 반응물들을 제거하였다.　 상기 컬럼을 10 mM의 글루타치온(GSH)으로 용출시켜 GST-VBC 및 GST-PHD2 단백질을 각각 수득하였다.　 이때, 수득된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 순도를 확인하였고 Bradford 단백질 분석법(Bio-Rad)으로 정량하였다.

또한, Human FIH-1(Factor-inhibiting HIF-1) 단백질을 제조하기 위하여 HIF-1 전체 아미노산(1-349) 서열을 pET-28a(Novagen)에 클로닝한 후 BL21(DE3)(Novagen) 균주에 형질전환시켰다. 형질전환된 상기 세포는 100 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 LB 배지에 접종한 후 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 단백질 발현을 유도하기 위해 0.5 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 18℃에서 15시간 동안 배양하였다.　 원심분리하여 수득한 상기 세포에 2-ME(2-mercaptoethanol), PMSF, 및 리소자임을 최종농도가 각각 0.014 mM, 0.2 mM, 및 1 ㎎/㎖이 되도록 첨가한 세포분쇄액(50 mM NaH₂PO₄, 500 NaCl, 10 mM Imidazole)에 현탁시킨후 4℃에서 초음파로 분쇄하였다.　

상기 얻어진 세포 추출물에 1% Triton X-100을 첨가하여 잘 섞어준 후 10분간 얼음에 두었다가 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 분리된 상등액에 Ni-NTA agarose(Quagen)를 혼합한 후 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 세척용액(50 mM NaH₂PO₄, 500 NaCl, 20 mM Imidazole)으로 2회 연속 세척한 후 2100 rpm으로 원 심분리하여 반응되지 않은 상층액을 제거한 다음, 반응 수지 혼합물을 Bio-Spin^®Disposable Chromatography Columns(Bio-Rad)에 넣어서 5 ㎖의 PBS로 여과시키고, 300 mM의 Imidazole로 용출시켜 His-FIH-1 단백질을 수득하였다.　 이때, 수득된 단백질은 SDS-PAGE 및 Bradford 단백질 분석법을 이용하여 각각 순도 및 정량하였다.

< 실시예 2> PHD2 억제제 선정 및 활성 저해능 분석

<2-1> 형광표지된 HIF-1α 펩타이드 제조

HIF-1α 펩타이드에 형광물질을 부착하기 위하여, HIF-1α 아미노산 서열 중 수산화 반응을 유도하는 프롤린 잔기를 포함한 556-575 번째 아미노산 부위를 대상으로 선정하였고, 상기 HIF-1α 펩타이드의 N-말단에는 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)를 붙였으며, 그 끝에 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 표지한 3 부분으로 구성된 펩타이드를 애니젠(Anygen, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 합성된 상기 펩타이드는 F-P564(FITC-ACA-DLDLEALAPYIPADDDFQLR, 서열번호 1)로 명명하였고, 상기 F-P564 펩타이드의 564번째 프롤린 잔기(서열번호 1의 아미노산 서열 중 12번째 아미노산)가 수산화된 펩타이드인 F-HyP564(FITC-ACA-DLDLEALAHyPYIPADDDFQLR, 서열번호 2), 질량 분석을 위해 FITC 대신 Biotin을 표지한 펩타이드인 B-P564(Biotin-FITC-ACA-DLDLEALAPYIPADDDFQLR, 서열번호 3), 및 HIF-1α C-말단 부위의 전사활성에 영향을 주는 아스파라긴 아미노산(803번째에 위치한 아스파라긴 잔기)의 수산화 반응을 분 석하기 위한 펩타이드인 F-N803(FITC-ACA- DESGLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRAL, 서열번호 4)을 각각 합성하였다(표 1).

합성 펩타이드	형태
F-P564(서열번호 1)	FITC-ACA-DLDLEALAPYIPADDDFQLR
F-HyP564(서열번호 2)	FITC-ACA-DLDLEALAHyPYIPADDDFQLR
B-P564(서열번호 3)	Biotin-FITC-ACA-DLDLEALAPYIPADDDFQLR
F-N803(서열번호 4)	FITC-ACA-DESGLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRAL

<2-2> PHD2 억제제 스크리닝

프롤릴 하이드록실라제 2(PHD2)의 활성 억제제를 스크리닝하기 위하여, 본 실시예에서는 1040개의 생물학적 활성을 가진 화합물(NINDS Custom Collection II, MicroSource Discovery Systems)을 이용하였다. 우선, 프롤린 잔기의 수산화 반응 시 최종 농도가 20 μM 되도록 1 μL의 상기 화합물을 각각 1.5 mL 튜브에 분주하였다. 이어, 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5% NP-40)을 첨가하고 최종 농도가 0.2-0.3 μg/μL가 되도록 GST-PHD2를 각각 상기 화합물을 포함하는 용액에 잘 섞어준 후, 아스코르브산(ascorbic acid) 및 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)의 최종 농도가 각각 200 μM 및 20 μM이 되도록 상기 반응물에 첨가한 다음, 1 μM의 F-P564 펩타이드를 혼합하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기와 같이 준비된 반응물과 VBC 단백질간의 결합력을 분석하기 전, 최종 농도가 0.5%가 되도록 NP-40(nonidet P-40)을 첨가한 완충용액(50 mM Tris, 120 mM NaCl, pH 8.0)에 상기 효소 반응물을 F-P564 펩타이드 최종 농도가 100 nM이 되도록 희석하고, 250 nM의 VBC 단백질을 혼합한 다음 96-well plate에 옮겨 VICTOR(Perkin-Elmer)를 이용하여 형광편광 값을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 이미 수산화된 프롤린 잔기를 가진 펩타이드인 F-HyP564(100 nM)와 VBC 단백질(250 nM) 혼합용액의 형관편광 값을 기준으로 하여 각각의 화합물이 F-P564 펩타이드에 대한 프롤릴 하이드록실라제 2의 저해 정도를 나타낸 결과, 26개의 화합물이 프롤릴 하이드록실라제 2를 60% 이상 저해하고 있음을 확인하였다(도 1). 이 중 한 개의 화합물은 세포배양 시 처리할 경우 세포사멸을 유도했기 때문에 제외하였고, 나머지 25개의 후보 억제제 화합물을 대상으로 하여 정상상태 산소 조건에서 HIF-1α의 발현 및 목표 유전자의 전사 활성에 어떠한 영향을 주는지 조사하였다.

<2-3> 바이칼레인에 의한 PHD2 활성 억제 분석

상기 스크리닝 방법으로 선정된 25개의 후보 억제제 화합물 중 HIF-1α 발현을 증가시키는 2종의 화합물인 바이칼레인 및 시클로피록스(ciclopirox)을 선정하였고, 이 중에서 HIF-1α와 연관됨이 최초로 밝혀진 바이칼레인에 대하여 프롤릴 하이드록실라제 2에 대한 활성 억제능을 조사하기 위하여, 바이칼레인의 최종 농도를 0 내지 200 μM로 증가시키면서 형광표지된 F-P564 펩타이드 100 nM과 500 nM의 VBC 단백질을 혼합한 후 형광편광 값을 측정하였다. 이때, 형광편광 값은 형광분석기(fluorometer, Perkin-Elmer)를 이용하였고, 슬릿의 크기는 6 ㎚, 적분 시간은 5초로 설정하였다.　 또한, 프롤릴 하이드록실라제 2 활성을 50% 저해하는 바이칼레인의 농도는 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 프로그램으로 계산하여 측정하였다. 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, IC₅₀ 값 즉, 프롤릴 하이드록실라제 2 활성을 50% 저해하는 바이칼레인 농도는 14.98 μM임을 확인할 수 있었다(도2a). 또한, 바이칼레인에 의한 상기 형광편광 값의 감소가 VBC 단백질과의 결합을 억제함으로써 일어나는지 확인하기 위하여, 0 내지 20 μM 농도의 바이칼레인 존재 하에서 이미 수산화된 프롤린 잔기를 가진 펩타이드인 F-HyP564(100 nM)와 500 nM의 VBC 단백질을 혼합한 후 형광편광 값을 측정하였다. 그 결과를 도 2b에 나타내었다.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 바이칼레인 농도에 따라 형광편광 값의 감소가 일어나지 않음을 알 수 있었다(도 2b). 즉, 바이칼레인은 HIF-1α와 VBC간의 결합을 직접적으로 저해하는 것이 아니라 프롤릴 하이드록실라제 2 활성을 저해하여 HIF-1α의 프롤린 잔기의 수산화 반응을 억제시킴으로써 최종적으로 HIF-1α와 VBC간의 결합을 억제한다는 것을 의미한다.

이를 위해, 본 실시예에서는 프롤릴 하이드록실라제 2에 의한 HIF-1α 펩타이드 내 프롤린 잔기의 수산화 반응이 바이칼레인에 의해 억제되는지 조사하였다. 구체적으로, 아스코르브산(ascorbic aicd) 및 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)를 최종 농도가 각각 400 μM 및100 μM이 되도록　첨가된 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5% NP-40)에 800 μM의 바이칼레인과 1.4 μg/μL의 PHD2를 첨가하여 혼합하였다. 이어, 상기 혼합물에 3 μM의 Biotin-P564 펩타이드를 혼합한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 효소 반응물 내에 있는 염은 ZipTip-C18(Millipore)을 사용하여 제거하였고, 용출된 반응물을 MALDI 질량분석기(mass spectrometry)로 분석하였다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 바이칼레인이 무첨가된 반응물은 프롤린 잔기가 수산화된 반면, 바이칼레인을 첨가한 반응물은 프롤린 잔기가 수산화되지 않음을 알 수 있었다(도 3a). 이는, 바이칼레인이 프롤릴 하이드록실라제 2에 대한 저해능을 가지고 있음을　의미한다. 또한, 바이칼레인이 FIH-1에 대한 저해능을 가지고 있는지 조사하기 위하여, 아스코르브산 및 α-케토글루타레이트를 최종 농도가 각각 400 μM 및 100 μM이 되도록 첨가된 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂)에 20 μM의 바이칼레인 및 0.55 μg/μL의 His-FIH-1을 첨가하여 혼합하였다. 이어, 상기 혼합물에 4 μM의 F-N803 (HIF-1α의788-822 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드)을 혼합한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 ZipTip-C18에 통과시켜 염을 제거한 후 MALDI 질량분석기로 분석하였다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b에 나타낸 바와 같이, 바이칼레인이 무첨가된 효소 반응물은 아스파라긴 잔기가 수산화된 반면, 바이칼레인을 첨가한 효소 반응물은 아스파라긴 잔기가 수산화되지 않음을 알 수 있었다(도 3b). 즉, 바이칼레인은 프롤릴 하이드록실라제 2뿐 아니라 정상산소 상태(normoxia)에서 p300 또는 CBP 단백질과 결합하는 HIF-1α의 억제제인 FIH-1을 특이적으로 저해한다는 것을 알 수 있다.

< 실시예 3> HIF-1α에 대한 바이칼레인의 효능 분석

<3-1> HIF-1α 단백질의 발현량 변화

바이칼레인에 의한 세포내 HIF-1α 단백질의 발현량 변화를 조사하기 위하여, 우선 HepG2 또는 SH-SY5Y 세포주를 각각 60 mm tissue culture 플레이트에 80%가 되도록 배양하였다. 배양된 상기 세포에 바이칼레인을 0 내지 100 μM 농도-의존적으로 첨가하여 정상산소 상태에서 6시간 동안 배양하였고, 바이칼레인의 양성 대조군으로는 저산소 상태(hypoxia, H) 및/또는 Clioquinol(CQ, 50 μM)에서 각각 6시간 동안 배양된 세포를 이용하였다(Choi, et al., J. Biol. Chem., 281, 34056-34063, 2006). 상기 배양된 세포를 각각 4℃ 인산염완충용액으로 세척하였고 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris(pH 7.4), 100 μg/mL phenylmethylsufonyl fluoride(PMSF), 10 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL antipain, 10 μg/mL aprotinin, 50 mM β-glycerophosphate, 25 mM NaF, 20 mM EGTA, 1 mM DTT, 및 1 mM Na₃VO₄ 을 포함하는 분석 용액으로 용출하였다. 또한, 원심분리하여 수득한 세포 추출물을 Bradford 단백질 분석법으로 정량하였다.

HIF-1α에 대한 웨스턴-블랏은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 20 μg의 상기 세포 추출물을 SDS sample buffer에 현탁시켜 물중탕에서 5분 동안 가열한 후, 상기 반응액을 8 % SDS-PAGE에서 전기영동한 다음 상기 겔을 NC 막(nitrocellulose membrane)에 전달(transfer)하였다. 이어, 일차 항체인 anti-HIF-1α IgG 또는 anti-Hsp70 IgG(BD Pharmingen)를 처리한 후 PBS로 세척하였고, 다시 이차 항체인 HRP가 결합된 anti-mouse IgG를 처리하였다. 상기 막을 세척한 후, ECL 용액을 처리하여 반응을 유도하였고 X-ray 필름을 5분간 덮은 후 HIF-1α 단백질을 최종적으로 검출하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 50 μM 농도 이상의 바이칼레인을 처리한 경우, 처리하지 않은 군에 비하여 현저하게 HIF-1α 단백질 발현량이 증가됨을 확인하였고, 저산소 상태(hypoxia, H) 및/또는 유사 저산소 상태를 유도하는 화합물인 Clioquinol(CQ, Choi, et al., J. Biol. Chem., 281, 34056-34063, 2006)을 처리한 군에서 발현된 HIF-1α 단백질 발현량과 유사하게　증가됨을 관찰할 수 있었다(도 4a 및 4b). 이는, 정상산소 상태에서 바이칼레인이 HIF-1α의 안정성을 현저하게 증가시켰음을 의미한다.

<3-2> HIF-1α와 저산소 반응인자(HRE)와의 결합능 분석

정상산소 상태에서 바이칼레인에 의해 안정화된 HIF-1α가 표적 유전자상에 존재하는 저산소 반응인자(HRE)와 결합하는지 알아보기 위하여, 본 실시예에서는 리포터 분석을 실시하였다. 구체적으로, HeLa 세포주(5ⅹ10⁴개/웰)를 24-웰 플레이트에 분주하여 배양한 후, 100 ng의 p(HRE)₄-luciferase 벡터와 50 ng의 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 발현용 벡터인 pCHO110 벡터를 co-transfection 하였다. 형질도입 32시간 후, 상기 세포에 바이칼레인(20 μM), 유사 저산소 상태를 만드는 금속이온(metal ions)인 DFO(Deferoxamine, 50 μM 및 100 μM) 및 CoCl₂(50 μM 및 100 μM)를 각각 처리한 다음 16시간 동안 배양하였다. 배양된 상기 세포의 추출물을 수득한 후 luminometer(Tuner Designs)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, β-갈락토시다제 활성 값으로 보정한 경우, 바이칼레인(20 μM)으로 처리한 군은 50 μM의 DFO으로 처리한 군(유사 저산소 상태)과 유사한 활성 값을 가진 반면, 음성 대조군인 DMSO로 처리군에서는 낮은 활성 값을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5a). 이는, 바이칼레인에 의해 HIF-1α가 저산소 인자와 결합한다는 것을 의미한다. 또한, 총 단백질량으로 보정한 경우에도 상기와 유사한 결과를 관찰할 수 있었다(도 5b).

< 실시예 4> 혈관내피성장인자( VEGF )에 대한 바이칼레인의 효능 분석

<4-1> VEGF mRNA 의 발현량 변화

HIF-1α의 대표적인 표적 유전자로 알려진 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현량 변화에 바이칼레인이 어떠한 영향을 주는지 조사하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. 구체적으로, DMSO(음성 대조군), 50 μM의 Clioquinol(CQ, 양성 대조군), 및 바이칼레인(실험군)을 각각 16시간 동안 처리한 HepG2 세포주를 준비하였다. 상기 세포에서 발현된 VEGF mRNA의 cDNA를　증폭시키기 위하여, 배양된 세포의 전체 RNA를 정방향(F-VEGF; 5'-ccatgaactttctgctdtctt-3', 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(R-VEGF; 5'-atcgcatcaggggcacag-3', 서열번호 6)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 또한, 18s rRNA의 cDNA를 증폭시키기 위하여, 준비된 전체 RNA를 주형으로 정방향(F-18s; 5'-accgcagctaggaataatggaata-3', 서열번호 7) 및 역방향 프라이머(R-18s; 5'-ctttcgctctggtccgtctt-3', 서열번호 8)를 이용하여 상기와 같이 RT-PCR을 실시하였다(표 2).

프라이머	서열
F-VEGF(서열번호 5)	5'-ccatgaactttctgctdtctt-3'
R-VEGF(서열번호 6)	5'-atcgcatcaggggcacag-3'
F-18s(서열번호 7)	5'-accgcagctaggaataatggaata-3'
R-18s(서열번호 8)	5'-ctttcgctctggtccgtctt-3'

증폭된 PCR 산물은 1.5 % 아가로스-겔에서 전기영동하였고, mRNA 발현 정도를 phosphoimager(Model Las3000, Fuji)로 측정하였다. 그 결과를 도 6a에 나타내었다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, 바이칼레인의 농도 증가에 따라 VEGF mNRA 발현이 증가됨을 확인할 수 있었고, 이는 양성 대조군인 Clioquinol(CQ)를 처리한 군과 유사한 정도로 발현됨을 알 수 있었다(도 6a 참조).

<4-2> VEGF 단백질의 발현량 변화

혈관내피성장인자(VEGF)는 분비성 단백질(secretion protein)이기 때문에, 본 실시예에서는 상기 단백질의 분비량 변화를 조사하기 위하여 상기 세포 배양액을 ELISA로 측정하였다. 구체적으로, HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 분주하여 24-48시간 동안 배양한 후, DMSO, CoCl₂(200 μM), DFO(125 μM), 및 바이칼레인(20 μM)을 각각 처리하였다. 16시간 배양 후, 상기 배양액을 각각 회수하였고 원심분리를 통해 상층액(supernatants)을 분리하였다. 이렇게 준비된 상층액을 VEGF 항체로 코팅된 96-웰 플레이트인 Human VEGF Quantikine ELISA kit(R&D Systems, MN, USA)에 분주한 후 luminometer를 이용하여 혈관내피성장인자의 분비된 단백질량을 측정하였다. 그 결과를 도 6b에 나타내었다.

도 6b에 나타낸 바와 같이, DMSO를 처리한 대조군에 비해 바이칼레인을 처리한 실험군에서는 분비된 VEGF 단백질이 현저하게 증가됨을 관찰할 수 있었고, 이 값은 유사 저산소 상태를 만들어 주는 금속이온인 CoCl₂ 처리군의 것과 유사하였다(도 6b). 따라서, 바이칼레인에　의한 HIF-1α의 안정화가 표적 단백질의 하나인 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현량을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

<4-3> 유정란에서의 혈관생성 변화

본 발명의 스크리닝 방법으로 선정된 바이칼레인이 실질적으로 생체내 유정란에서 혈관생성을 촉진시키는지 조사하기 위하여, 융모막요막 분석(Chick Chorioallantoic Membrane, CAM assay)을 실시하였다. 구체적으로, 유정란을 55% 습도 조건의 37℃ 배양기에서 10일간 배양한 후, CAM의 vascular branch point 부분에 1 cm² 크기의 흠집(window)을 내었다. 지름이 0.5 cm인 원형 멸균필터용지 디스크(autoclaved filter paper disk, Whatman, UK)에 양성 대조군으로는 10 ng의 VEGF를, 음성 대조군으로는 DMSO를, 실험군으로는 10 μM 의 바이칼레인을 각각 10 μl씩 떨어뜨려 말린 후, "Y"자 굵은 혈관위에 오려놓고 sealing한 후 3일간 배양하였다. 3일간 배양한 후, 굵은 혈관에 올려놓은 VEGF, DMSO, 및 바이칼레인이 각각 처리된 필터용지를 굵은 혈관과 함께 마이크로포셉(microforcep)으로 잘 떼어낸 후 35 mm dish에 올려놓고 PBS로 세척한 후 광학현미경(Leica MJF3, X20 magnification)으로 관찰하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, CAM 분석 결과 바이칼레인을 처리한 경우에는 음성 대조군(DMSP)에 비해 신생혈관 생성이 촉진되어 양성 대조군(VEGF)과 비슷한 수준을 보였고, 총 7개의 유정란에서 4개의 신생혈관이 생성되어, 이를 혈관생성도(%)로 나타낼 경우, 57%에 해당함을 알 수 있었다. 이는, 본 발명의 바이칼레인이 생체내 유정란에서 혈관생성을 촉진시킬 수 있음을 의미한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 VBC 단백질의 결합을 분석하는 스크리닝 방법으로 선정된 프롤릴 하이드록실라제 2 억제제, 바람직하게는 바이칼레인은 관상동맥부전, 뇌부전, 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

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바이칼레인을 유효성분으로 함유하는, 관상동맥부전, 뇌부전 및 혈관부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물.
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제3항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 더욱 포함하는 것인, 조성물.