JP2011510651A - 改良されたプロモーターおよびこれを用いたｌ−リシンの生産方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結され、改良されたプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミカム由来の核酸分子、この核酸分子を含むベクター、このベクターで形質転換された形質転換体、およびこの形質転換体を用いてＬ−リシンを生産する方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、改良されたプロモーターおよびこれを用いたＬ−リシンの生産方法に関し、具体的には、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結され、プロモーターの活性を有する、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の核酸分子、この核酸分子を含むベクター、このベクターで形質転換された形質転換体、およびこの形質転換体を用いてＬ−リシンを生産する方法に関する。

コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、伝統的に、アミノ酸と核酸関連物質の生産に最も広く用いられる産業用微生物であって、主に、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トレオニン、およびグルタミン酸などのアミノ酸および各種核酸を含む飼料、医薬品および食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産するのに用いられるグラム陽性細菌であり、生育にビオチンを要求する。細胞分裂の際に直角に折り曲げられる特徴（ｓｎａｐｐｉｎｇ）を持っており、生成された代謝物質に対する分解活性が低いことも、このコリネ型細菌が持つ利点の一つである。代表的な菌種としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を含むコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）を含むブレビバクテリウム属、アルスロバクター種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、およびマイクロバクテリウム種（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）などがある。

Ｌ−リシンは、Ｌ−アミノ酸の一つであって、その他のアミノ酸の吸収を増加させることにより飼料の質を向上させることが可能な能力により動物飼料補充物として商業的に用いられており、人体医学では特に注入用溶液剤の成分として使用され、製薬産業にも使用されている。よって、リシンを産業的に生産することは経済的に重要な産業工程である。

リシンの生産効率を改善させるための方法として、リシン生合成経路上の遺伝子を増幅させる方法、あるいは遺伝子のプロモータを変形させて生合成経路上の酵素活性を増大させる方法が用いられてきた。従来のリシン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム菌株およびこれを用いたＬ−リシン生産方法が知られていた。例えば、米国特許第６，７４６，８５５号には、ｌｙｓＥ遺伝子（リシン排出キャリア遺伝子）が強化され、ｄａｐＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子およびｄａｐＢ遺伝子よりなる群から選ばれた遺伝子が追加的に導入されたコリネバクテリアを培養してＬ−リシンを生産する方法が開示されている。また、米国特許第６，２２１，６３６号には、Ｌ−リシンおよびＬ−トレオニンによるフィードバック阻害において実質的に脱感作化されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡで形質転換されたコリネバクテリアが開示されている。

また、韓国登録特許第１０−０３４５５９２号には、Ｌ−リシンによるフィードバック抑制が解除されたｄａｐＡ、ｌｙｓＣを細胞に導入させ、ｄａｐＢおよびｄｄｈ遺伝子が増幅されたエシェリキア属細菌、およびこれを用いたＬ−リシン生産方法が開示されている。

このようなコリネ型細菌を、遺伝工学的または代謝工学的技術を用いて目的の物質を高力価で生産することが可能な菌株として開発するためには、菌株内で様々な代謝過程に関連した遺伝子の発現を選択的に調節することができなければならない。このような調節のためには、調節遺伝子の一つとしてＤＮＡ分子上にＲＮＡ合成酵素が結合して転写を開始する部位としてのプロモーターの活性を調節することが重要である。

コリネ型細菌由来のプロモーターに関連した先行特許としては、コリネバクテリウム由来のプロモーターが記載された特許として、米国登録特許第５，７００，６６１号「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ」、米国登録特許第５，９６５，３９１号「ＤＮＡ ｗｈｉｃｈ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ」、米国登録特許第７，１４１，３８８号「Ｎｕｃｌｏｅｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」、および韓国登録特許第１０−０６５３７４２号「新規のＬ−リシン誘導性プロモーター」などがあり、コリネバクテリウムアンモニアゲネス由来のプロモーターが記載された韓国公開特許第１０−２００６−００６８５０５「コリネバクテリウム属細胞に由来した新規のプロモーター配列、それを含む発現カセットおよびベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、およびそれを用いて遺伝子を発現する方法」がある。

ところが、現在まで、リシン生合成経路のうち最も中心的な役割を担当すると思われる遺伝子であるｄｄｈ（ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）のプロモーターを改良して、宿主細胞染色体上のプロモーターを置換させることにより、酵素の発現率を高めたコリネ型細菌については開示されたことがない。

本発明者は、コリネバクテリウム染色体上に存在するｄｄｈ遺伝子のプロモーターを塩基置換によって改良させ、改良されたプロモーターを導入させることにより、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性が内在的活性より増加しているコリネバクテリウム属微生物を提供することができることを見出し、本発明を完成した。

本発明の目的は、改良されたプロモーターの活性を有するコリネバクテリウム・グルタミカム由来の核酸分子を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記プロモータの活性を有する核酸分子を含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養する段階を含む、リシンの生産方法を提供することにある。

本発明に係るｄｄｈ遺伝子と作動可能に連結され、改良されたプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミカム由来の核酸分子は、天然型に比べて高いプロモーター活性を示してジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増加させることにより、これらの核酸分子を用いたリシン生産菌株のリシン生産効率を高めることができる。

図１はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを示す図である。 図２はコリネバクテリウム塩基置換用ベクターｐＤＺ−ｄｄｈＰ１を示す図である。

一つの様態として、本発明は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結され、配列番号２のヌクレオチド配列を持つ、改良されたプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミカム由来核酸分子に関する。

本発明において、用語「プロモーター」とは、ポリメラーゼに対する結合部位を含み、プロモーター下流にある遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有し、かつコード領域の上流の非解読された核酸配列、すなわち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域をいい、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置する。
本発明のプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミカム核酸分子は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結される。ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、それぞれｄｄｈ遺伝子であって、コリネバクテリウム属細菌でリシンを生産する生合成経路上の主要な遺伝子である。

また、前記用語「作動可能に連結」とは、本発明のプロモーター活性を有する核酸配列がジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写を開始および媒介するように、前記遺伝子配列とプロモーター配列とが機能的に連結されていることを意味する。これは本発明のプロモーター活性を有する核酸配列がｄｄｈ遺伝子と作動可能に連結されることにより、前記ｄｄｈ遺伝子の転写活性を調節することができることを意味する。

本発明のプロモーター活性を有する核酸配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてｄｄｈ遺伝子のプロモーターを改良させたもので、天然型プロモーターより高いプロモーター活性を持つようにしたことを特徴とする。すなわち、酵素の内在的活性より増加した酵素活性を示すようにしたのである。ここで、内在的活性とは、コリネバクテリア属微生物が天然の状態で持っている酵素の活性状態を意味する。さらに高いプロモーター活性を持つように改良させる方法は、当業界における公知の方法によって容易に行われ得る。好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカムｄｄｈ遺伝子のプロモーター核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して改良させる。

本発明のプロモーター核酸分子は、標準的分子生物学技術を用いて分離または製造できる。例えば、適切なプライマー配列を用いてＰＣＲによって分離することができる。また、自動化されたＤＮＡ合成器を用いる標準合成技術を利用して製造することもできる。具体的な一実施例において、本発明者は、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ｄｄｈ遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣｇ１２５２８）のプロモーター部位を含む塩基配列を確保し（配列番号１）、この塩基配列に基づいて４つのプライマー（配列番号３〜６）を設計した。その後、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーを用いてＰＣＲを行い、主要部位に変形された配列を有するプロモーターを含む本発明に係る核酸分子（配列番号２）を確保した。

本発明のコリネバクテリウム・グルタミカムプロモーターの活性を有する核酸分子は、好ましくは原核細胞、特に大腸菌またはコリネ型細菌における遺伝子発現のためのプロモーターとして有用である。本発明において、用語「コリネ型細菌」は、コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム属の微生物を含む概念である。このようなコリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびこれらから製造されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１００１を含み、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１であるが、これらの例に限定されない。

他の様態として、本発明は、前記改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターに関する。

本発明の用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的の遺伝子を発現させることができるように適切な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することが可能なプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および解読の終結を調節する配列を含む。

本発明で使用されるベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界における公知の任意のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ粒子、または簡単には潜在的ゲノム挿入物であり、好ましくはｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｔｉｏｎ ＃Ｘ０６４０２）を使用することができるが、これに限定されない。ベクターは、適当な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは関係なく複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合できる。

具体的に、本発明のベクターは、宿主細胞内に導入させ、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列が宿主細胞ゲノム上の内在性ｄｄｈ遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こし、染色体内に挿入できる。したがって、本発明のベクターとしては、宿主染色体への挿入有無を確認するための選択マーカーをさらに含みうる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち、目的遺伝子の挿入有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーが使用できる。選択剤が処理された環境では、選択マーカーを発現する細胞のみが生存し、あるいは他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。ベクターとして好ましくは、ｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。

本発明の具体的な実施様態において、本発明者は、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミカムのｄｄｈ遺伝子のプロモーター部位を、プロモーター活性が増進するように変異されたプロモーター配列で代替させることが可能なベクターを製造した。まず、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７を制限酵素処理して平滑末端化した後、ｌａｃＺ遺伝子を挿入させるために、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて自体プロモーターを含むようにｌａｃＺ遺伝子を増幅した後、多数の制限酵素認識部位を含むアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを製造した（図１）。その後、上述したように高いプロモーター活性を持つように製造された、ｄｄｈ遺伝子のプロモーター主要部位に変形された配列を持つプロモーターを含む核酸分子を、前記ｐＤＺベクターのアダプター部位に挿入させることにより、配列番号２の核酸配列を含むベクターｐＤＺ−ｄｄｈＰ１（図２）を製造した。

別の様態として、本発明は、前記ベクターで形質転換された形質転換体に関する。

本発明の用語「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子として、または染色体に統合され、完成することによって複製可能になることを意味する。本発明の形質転換体は、ベクターが宿主細胞内に形質転換された後、プラスミドの形態でベクターを固定するか、あるいはベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列が宿主細胞ゲノム上の内在性ｄｄｈ遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こして染色体内に挿入される。

本発明のベクターを宿主細胞内へ導入する限りにおいて、核酸を細胞内に導入するいずれの方法も行うことができる。宿主細胞に応じて、当分野における公知の適切な標準的技術が選択され、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、陽イオンリポソーム法、および酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などがある。

前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を使用することが望ましいが、原核および真核を含む全ての微生物が使用可能であり、好ましくは大腸菌またはコリネ型細菌、さらに好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１を使用することができる。

本発明のベクターで形質転換された形質転換体では、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミカムのｄｄｈ遺伝子のプロモーター部位を、プロモーター活性が増進するように変異されたプロモーター配列で代替することにより、ｄｄｈ遺伝子は改良されたプロモーターを有する。これにより形質転換体は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が天然型より増加する特徴を持つ。

本発明の具体的な実施例では、本発明に係る配列番号２で構成されるプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターｐＤＺ−ｄｄｈＰ１をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１に形質転換させることにより、ｄｄｈ遺伝子のプロモーター活性が改良されてジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの活性が増進した形質転換体（ＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１）をＣＡ０１−０１３６と命名し、２００８年１月１８日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、以下「ＫＣＣＭ」と略する。）に受託番号ＫＣＣＭ１０９２０Ｐで寄託した。

別の様態として、本発明は、前記形質転換体を培養する段階を含む、リシンの生産方法に関する。

本発明の形質転換体は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が天然型より増加している。ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼは、リシンの生合成経路上の最も必要な酵素なので、本発明の形質転換体を発酵培養してリシンの生産効率を高めることができる。

本発明において、形質転換体の培養は公知の方法によって行われ得る。培養温度、培養時間および培地のｐＨなどの条件は適切に調節できる。これらの公知の培養方法は、文献［Ｃｈｍｉｅｌ；Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１）、およびＳｔｏｒｈａｓ；Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４］に詳細に記述されている。また、培養方法には回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、および流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれる。好ましくはバッチ工程、または注入バッチまたは反復注入バッチ工程で連続的に培養することができるが、これらに限定されない。

使用される培養培地は、特定の菌株の要求条件を適切に充足させなければならない。多様な微生物に対する培養培地は公知である（例えば、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」ｆｒｏｍ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）。培地内の炭素供給源としては、糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラッセ、澱粉およびセルロース）、油脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナツオイル）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、および有機酸（例：酢酸）などを用いることができる。これらの物質は個別的にまたは混合物として使用できる。窒素供給源は、窒素含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉および尿素）、または無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）を用いることができ、これらの物質も個別的にまたは混合物として使用することができる。リン供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩を用いることができる。

また培養培地は、成長に必須の金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）を含有することができ、最終的に、アミノ酸およびビタミンなどの必須成長促進物質を前述した物質の他に使用することができる。適切な前駆体を前記培養培地にさらに加えることができる。前記供給物質は、培養物に一度に全部加えるか、あるいは培養中に適切に供給することができる。

培養物のｐＨは、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を適切に用いて調節することができる。発泡は脂肪酸ポリグリコールエステルなどの起泡剤を用いて調節することができる。酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養物中に導入させて好気性条件を維持させることができる。培養温度は通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養は所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続けられ、このような目的によって通常１０〜１６０時間で達成される。Ｌ−リシンは培養培地中に排出されるか、あるいは細胞中に含まれていてもよい。

一方、本発明の形質転換体を培養する工程を含むリシンの生産方法は、前記培養工程で生成されるリシンを回収する工程をさらに含みうる。当業界における公知の方法によって、細胞または培養培地からＬ−リシンを分離することができる。本発明において有用なＬ−リシン回収方法の例として、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣなどの方法が挙げられるが、これらの例に限定されない。

以下、下記実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は本発明を例示的に実施するためのもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。

本実施例では、リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミカムのｄｄｈ遺伝子のプロモーターを、相同組換えによって改良されたプロモーターで置換させるための組換えベクターを製作し、前記ベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１菌株に形質転換させて、染色体上のプロモーターが改良された菌株を得ることにより、リシン生産効率の向上した菌株を製造した。

本発明で利用するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム野生株（ＡＴＣＣ１３０３２）を母菌株として人工変異法によって製作されたＳ−（２−アミノエチル）システイン（以下、「ＡＥＣ」という）に対する耐性およびホモセリン漏出（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌｅａｋｙ）の特徴を持つ菌株である（韓国登録特許第０１５９８１２号、同第０３９７３２２号参照）。

実施例１：プロモーター改良用組換えベクターの製作
（１）染色体挿入用ベクター（ｐＤＺ）の製作
本実施例では、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｔｉｏｎ ＃Ｘ０６４０２）を基本ベクターとして用いて、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを製作した。

ｐＡＣＹＣ１７７ベクターをＡｃｕＩおよびＢａｎＩ制限酵素で処理した後、クレノウ酵素処理によって平滑末端化した。選択マーカーとして使用される大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子は、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって自体プロモーターを含むように増幅した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼ処理によって５’−末端リン酸化および平滑化することにより準備した。このように準備した２種のＤＮＡ断片を接合し、接合された環状ＤＮＡ分子の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に、人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを完成した。図１はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを示す図である。

（２）ｄｄｈ遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクターの製作
本実施例では、リシンを生産する菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｄｄｈ遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクターを製作した。

まず、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ｄｄｈ遺伝子（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣｇ１２５２８）のプロモーター部位を含む塩基配列（配列番号１）を確保し、主要部位に変形された配列を有するプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号２）を確保した。変形プロモーター配列は一般に微生物において知られているプロモーターコンセンサス配列に基づいて考案した。

また、前記変形されたプロモーター配列を製造するためのプライマーとしては、前記塩基配列に基づいて４つのプライマー（表１、配列番号３〜６）を合成した。

コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｄｄｈ遺伝子のプロモーター配列を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表１に表記されたオリゴヌクレオチド対をプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは、変性９６℃３０秒、アニーリング５３℃３０秒、および重合反応７２℃３０秒の条件を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。その結果、置換部位を一方の側の末端に含んでいる３００ｂ ＤＮＡ断片を得た。ｄｄｈＰ１−１は配列番号３と６をプライマーとして用いて増幅されたものであり、ｄｄｈＰ１−２は配列番号５と４をプライマーとして用いて増幅されたものである。前記増幅産物を、予めＸｂａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＺベクターと混合し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてクローニングすることにより、ｐＤＺ−ｄｄｈＰ１ベクターを得た。

図２は配列番号２に該当するｄｄｈＰ１を含んでいるコリネバクテリウム染色体置換用ベクターｐＤＺ−ｄｄｈＰ１を示す図である。

実施例２：組換えベクターのコリネバクテリウム・グルタミカム菌株内への挿入
本実施例では、コリネバクテリウムの染色体上のｄｄｈ遺伝子プロモーターを改良するために、前記で製作した組換えベクターをリシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１に形質転換させて、菌株染色体のプロモーター配列と前記ベクター上のプロモーター配列を相同組換えによって置換させることにより、染色体内に前記改良プロモーター配列を挿入させた。

最後に、改良プロモーター配列に対応するＤＮＡ断片を含む組換えベクターｐＤＺ−ｄｄｈＰ１を、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１に電気パルス法で導入して形質転換した後（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５２：５４１−５４５による形質転換法を用いる）、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選択培地で、染色体上の同遺伝子との相同性により挿入された菌株を選択した。

ベクターの染色体挿入が成功したことは、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む固体培地で青色を示すか否かにより確認した。ベクターとゲノムそれ自体との一重交差体（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒｓ）を、栄養培地で振とう培養（３０℃、８時間）した後、それぞれ１０^−４から１０^−１０に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。大部分のコロニーが青色を示すが、これに反して低い比率で現れる白色のコロニーを選択することにより、二重交差（Ｄｏｕｂｌｅ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によってｄｄｈ遺伝子のプロモーターの主要部位に塩基配列が置換された菌株を選択した。このように選択された菌株は、ＰＣＲを用いた塩基置換の有無の確認および該当地域に対する塩基配列確認過程を経て最終選定された。ｐＤＺ−ｄｄｈＰ１ベクターで形質転換された菌株のプロモーター塩基置換の有無は、配列番号４と７をプライマーとして用いてＰＣＲと塩基のシークエンシングを行うことにより、目的の部位に対する塩基配列分析によって最終確認した。

最終的に、二重の交差工程を経て、染色体上でｄｄｈ遺伝子のプロモーターの主要部位に置換された塩基を含んでいる、リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１を得た。

実施例３：ｄｄｈプロモーター改良菌株におけるジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性の測定
母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１菌株および実施例２で最終的に製作されたＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１菌株を培養し、培養液からタンパク質を分離して、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した。

対数期まで培養した培養液をＯＤ_６００-値が０．３となるように下記の種培地５０ｍＬに接種した後、ＯＤ_６００-値が約１５に達するまで培養した。培養液から遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分）によって菌体を収去し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄した後、同緩衝溶液によって６１０ｎｍの濁度が１６０程度となるように懸濁した。懸濁液１．５ｍＬ当り１．２５ｇのガラスビーズを添加した後、ビーズビーター（ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）によって上澄み液を収去し、ブラッドフォード（Ｍ．Ｍ １９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によるタンパク質の濃度を定量した後、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として使用した。

ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を測定するためには、０．２Ｍ グリシン／ＮａＯＨ（ｐＨ１０．５）、２ｍＭ ＮＡＤＰ、および４ｍＭメソ−ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ）を含む反応液に約０．０１ｍＬの粗タンパク質溶液を混合して総体積が１ｍＬとなるようにし、反応を開始した。２５℃で１０分間反応させた後、３４０ｎｍ波長で吸光度の変化を連続的に測定した。ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性単位（Ｕ）は、１分間１ｍｇのタンパク質が還元させたＮＡＤＰＨのμｍｏｌｅとして定義した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１菌株は、母菌株ＫＦＣＣ１０８８１に比べて２３．２倍増加したジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を示すことを確認した（表２）。

＊種培地（Ｉ）（ｐＨ７．０）
原糖２０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１５０μｇ、チアミンＨＣｌ １５００μｇ、カルシウム−パントテン酸３０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）

実施例４：ｄｄｈプロモーター改良菌株におけるリシンの生産
母菌株として用いたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１菌株、および実施例２で最終的に製作されたＬ−リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１菌株を、Ｌ−リシン生産のために下記の方法で培養した。

下記の種培地（ＩＩ）２５ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカム母菌株ＫＦＣＣ１０８８１およびＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。下記の生産培地２４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに１ｍＬの種培養液を接種し、３０℃で１２０時間（２００ｒｐｍ）で振とう培養した。

培養終了の後、ＨＰＬＣを用いた方法によってＬ−リシンの生産量を測定した。コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１およびＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１における培養液中のＬ−リシン濃度は、下記表３のとおりである。

＊種培地（ＩＩ）（ｐＨ７．０）
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１Ｌ基準）

＊生産培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）
表３に示すように、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性が２３倍以上強化されたＫＦＣＣ１０８８１−ｄｄｈＰ１菌株は、母菌株ＫＦＣＣ１０８８１に比べてリシン生産効率が約３％以上増加したことを確認することができた。

本発明の改良されたプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミカム由来の核酸分子は、天然型に比べて高いプロモーター活性を示し、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増加させることによって、リシンの生合成効率を増加させることができる。これにより、産業的に有用なＬ−アミノ酸の一種である、Ｌ−リシンを高収率で生産することができる。

Claims (9)

1. ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結され、配列番号２のヌクレオチド配列を持つ、改良されたプロモーター活性を有する核酸分子。
2. 請求項１の改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含む、ベクター。
3. 前記ベクターが、図２に示したｐＤＺ−ｄｄｈＰ１である、請求項２に記載のベクター。
4. 請求項２のベクターで形質転換された、形質転換体。
5. 前記形質転換体が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属である、請求項４に記載の形質転換体。
6. 受託番号ＫＣＣＭ１０９２０Ｐであって、ＣＡ０１−０１３６と命名された、請求項４に記載の形質転換体。
7. 請求項１の改良されたプロモーター活性を有する核酸分子が、染色体内に相同組換えで挿入されることを特徴とする、請求項４に記載の形質転換体。
8. 請求項１の改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を、プラスミド形態で保有していることを特徴とする、請求項４に記載の形質転換体。
9. 請求項４の形質転換体を培養する工程を含む、リシンの生産方法。

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