BRPI0906584A2 - promotor aprimorado e método para a produção de l-lisina usando o mesmo - Google Patents

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BRPI0906584A2
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lysine
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Hang Jeon Gey
Joon Kim Hyung
Soo Choi Jong
Jo Lim Sang
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Abstract

promotor aprimorado e método para a produção de llisina usando o mesmo a presente invenção refere-se a: uma molécula de ácido nucleico derivada da corynebacterium glutamicum, com atividade promotora aprimorada e operavelmente ligada a um gene que codifica a diaminopimelato desidrogenase; um vetor contendo a molécula de ácido nucleico; um transformante transformado com o vetor; e um método para produzir l-lisina usando o transformante .

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROMOTOR APRIMORADO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-LISINA USANDO O MESMO”
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a um promotor aprimorado e a um método para produzir L-lisina usando o mesmo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a: uma molécula de ácido nucléico derivada da Corynebacterium glutamicum apresentando atividade promotora aprimorada e operavelmente ligada a um gene que codifica a diaminopimelato desidrogenase; um vetor contendo a molécula de ácido nucléico; um transformante com o vetor introduzido nele; e um método para produzir L-lisina usando o transformante.
Estado da Técnica
Bactérias corineformes são tradicionalmente microorganismos industriais usados em sua maioria para a produção de uma série de materiais químicos úteis nos setores de rações para animais, medicina e alimentos, incluindo aminoácidos, tal como a L-treonina, a L-arginina e o ácido glumático, e materiais relacionados a ácidos nucleicos. Esses microorganismos são gram-positivos e precisam da biotina para seu crescimento. Eles se dividem por fissão e sua baixa capacidade de degradar os metabólicos que produzem pode ser usada de forma vantajosa. Exemplos representativos de bactérias corineformes incluem o gênero Corynebacterium, tal como a Corynebacterium glutamicum, o gênero Brevibacterium, tal como a Brevibacterium flavum, a spp. Athrobacter, a spp. Microbacterium etc.
O L-lisina é um L-aminoácido importante do ponto de vista comercial que é usado como aditivo alimentício na nutrição animal graças à sua capacidade de ajudar o corpo a absorver outros aminoácidos, melhorando assim a qualidade dos alimentos. Para o corpo, a L-lisina é usada como um dos ingredientes de uma solução de injeção, além de ter aplicações no campo farmacêutico. Sendo assim, a produção industrial de L-lisina é um processo industrial importante do ponto de vista econômico.
O rendimento da produção de lisina está relacionado à atividade enzimática na via de biossíntese, o que pode ser tipicamente aprimorado ampliando-se um ou mais genes na via da biossíntese de lisina ou usando-se um promotor modificado para os genes. As linhagens de Corynebacterium com genes associados à biossíntese da lisina aprimorados e a produção de L-lisina usando-as são bem conhecidas. Por exemplo, a patente dos Estados Unidos n2 6.746.855 revela um processo para a produção de L-lisina fermentando-se corynebacteria produtoras de L-lisina com um gene LysE aprimorado (gene portador-exportador de lisina) em que genes adicionalmente escolhidos dentre o grupo composto por gene dapA, gene lysC, gene pyc e gene dapB são aprimorados. A patente dos Estados Unidos n2 6.221.636 revela corynebacteria transformadas com um DNA recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma aspartato quinase em que a retroinibição pela L-lisina e pela L-treonina é substancialmente des sensibilizada e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma diaminopimelato decarboxilase.
A patente coreana n2 10-0345592 descreve uma linhagem Escherichia a que o dapA e o lysC, ambos modificados para eliminar a retroinibição pela L-lisina, são introduzidos e em que os genes dapA e ddh são amplificados, além de um método para a produção de L-lisina usando a referida linhagem.
Para o desenvolvimento de bactérias corineformes em variantes capazes de produzir produtos-alvo a títulos elevados, necessita-se de uma técnica de engenharia genética ou metabólica pela qual os genes envolvidos no metabolismo possam ser controlados seletivamente. Para tanto, é importante modificar a atividade de um promotor, uma região reguladora do DNA que oferece um sítio de ligação inicial seguro para a RNA polimerase controlar a transcrição de genes regulados.
É possível encontrar promotores modificados derivados de bactérias corineformes em muitas patentes. Por exemplo, promotores da corynebacterium são descritos na patente dos Estados Unidos n2 5.700.661 intitulada “Gene expression regulatory DNA”, na patente dos Estados Unidos n2 5.965.391 intitulada “DNA which regulates gene expression in coryneform bacteria”, na patente dos Estados Unidos η2
7.141.388 intitulada “Nucleotide sequences for transcriptional regulation in corynebacterium glutamicum” e na patente coreana η2 10-0653742 intitulada “Novel L-lysine-inducible promoter” e um promotor da Corynebacterium ammoniagenes é descrito na patente coreana n2 10-2006-0068505 intitulada Novel promoter nucleic acid originating from corynebacterium genus bacteria, expression cassette comprising the promoter and vector comprising the cassette, host cell comprising the vector and method for expressing a gene using the cell”.
No entanto, até hoje, não foi revelada nenhuma das bactérias corineformes aprimoradas quanto à atividade de ddh (diaminopimelato desidrogenase), que desempenha um papel crítico na via da biossíntese de lisina, com um promotor aprimorado para a enzima substituído pelo promotor endógeno no genoma da célula hospedeira.
Revelação
Problema Técnico
Voltando-nos à presente invenção, pesquisas intensivas e meticulosas sobre a produção de L-lisina resultaram na descoberta de que, quando sendo transformado com um promotor do gene ddh modificado em bases específicas no genoma da corynebacterium, um microorganismo do gênero corynebacterium apresenta atividade de diaminopimelato desidrogenase aprimorada em relação à atividade endógena.
Solução Técnica
Um dos objetivos da presente invenção é o de propor uma molécula de ácido nucleico derivada da Corynebacterium glutamicum que apresente atividade promotora aprimorada.
Outro objetivo da presente invenção é o de propor um vetor contendo a molécula de ácido nucleico que apresenta atividade promotora aprimorada.
Ainda outro objetivo da presente invenção é o de propor um transformante com o vetor ligado a ele.
Ainda outro objetivo adicional da presente invenção é o de propor um método para produzir L-lisina fermentando-se o transformante.
Efeitos Vantajosos
Quando operavelmente ligada a um gene ddh, a molécula de ácido nucleico derivada da Corynebacterium glutamicum, que apresenta atividade promotora aprimorada, de acordo com a presente invenção apresenta maior atividade promotora do que o promotor do tipo selvagem e, portanto, pode aumentar a atividade de diaminopimelato desidrogenase. Sendo assim, a linhagem produtora de lisina transformada com a molécula de ácido nucleico pode produzir lisina a taxas mais elevadas.
Descrição dos Desenhos
A Fig. 1 é um diagrama ilustrando um mapa genético do vetor pDZ para a integração no genoma de uma corynebacterium.
A Fig. 2 é um diagrama ilustrando um mapa genético do vetor pDZ-ddhPl para a substituição do promotor.
Melhor Modo
De acordo com um de seus aspectos, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico derivada da Corynebacterium glutamicum com uma sequência de nucleotídeos de N~ ID SEQ 2 que é operavelmente ligada a um gene que codifica a diaminopimelato desidrogenase e apresenta uma atividade promotora aprimorada.
O termo “promotor”, conforme usado no presente documento, refere-se a uma região do DNA que contém um sítio de ligação inicial para a RNA polimerase e facilita a transcrição de um gene específico a jusante dele. Ou seja, um promotor é uma sequência de nucleotídeos não-traduzida a montante de uma região de codificação a que a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição de um gene e se localiza tipicamente perto dos genes que regula na mesma fita e a montante (rumo à região 5’ da fita em sentido).
A molécula de ácido nucléico da presente invenção, derivada da Corynebacterium glutamicum e com atividade promotora, é operavelmente ligada a um gene que codifica a diaminopimelato desidrogenase. O gene ddh que codificada a diaminopimelato desidrogenase desempenha um papel importante na via da biossíntese de lisina na spp. Corynebacterium.
O termo “operavelmente ligado”, conforme usado no presente documento, destina-se a designar uma ligação entre a sequência de nucleotídeos com uma atividade promotora de acordo com a presente invenção e a sequência promotora em uma relação funcional tal que o promotor possa servir para iniciar e mediar a transcrição de um gene que codifica a diaminopimelato desidrogenase. Em outras palavras, quando ligada operavelmente a um gene ddh, a sequência de nucleotídeos com atividade promotora de acordo com a presente invenção pode controlar a atividade de transcrição do gene ddh.
A sequência de nucleotídeos com uma atividade promotora de acordo com a presente invenção, derivada de um promotor de tipo selvagem do promotor do gene ddh da Corynebacterium glutamicum, é modificada para garantir uma atividade enzimática superior à atividade endógena. Por atividade endógena queremos dizer uma atividade enzimática nas bactérias corineformes do tipo selvagem. É possível chegar a modificações para garantir a maior atividade promotora usando técnicas conhecidas na técnica, de preferência induzindo uma mutação na sequência de nucleotídeos do promotor do gene ddh por deleção, inserção, substituição não-conservadora ou conservadora ou uma combinação destas.
A molécula de ácido nucleico com uma atividade promotora de acordo com a presente invenção pode ser isolada ou preparada usando-se uma técnica biológica padrão. Por exemplo, é possível realizar a reação em cadeia de polimerase (PCR) para o isolamento na presença de oligonucleotideos iniciadores adequados. Como alternativa, é possível sintetizá-la com técnicas biológicas padrão usando um sintetizador de DNA automatizado. Em uma concretização, na base de uma sequência de nucleotídeos (N2 ID SEQ 1) contendo uma região promotora de um gene ddh (gene NCBI ID: NCgl2528) obtida a partir dos dados do NIH GenBank, sintetizam-se quatro oligonucleotideos iniciadores (N— ID SEQ 3 ~ 6). Na presença de oligonucleotideos iniciadores, realizamos uma PCR para obter uma molécula de ácido nucléico com promotor que sofreu modificações em posições de base específicas (N2 ID SEQ 2) com o DNA genômico do Corynebacterium glutamicum KFCC10881 servindo como modelo.
De preferência, a molécula de ácido nucléico com atividade promotora da Corynebacterium glutamicum de acordo com a presente invenção é útil como um promotor para a expressão gênica em procariontes, em especial em bactérias E. coli ou corineformes. Conforme usado no presente documento, o termo “bactérias corineformes” refere-se aos microorganismos que pertencem aos gêneros Corynebacterium ou Brevibacterium. Exemplos de bactérias corineformes úteis na presente invenção incluem, entre outras, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium thermoamino genes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 e mutantes produtores de Laminoácidos ou linhagens derivadas deles, tais como
Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e Corynebacterium glutamicum KFCC11001, com preferência pela Corynebacterium glutamicum KFCC10881.
De acordo com outro de seus aspectos, a presente invenção refere-se a um vetor onde se encontra a molécula de ácido nucleico com atividade promotora aprimorada.
Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” refere-se a uma construção de DNA em que um gene de interesse é operavelmente ligado a um elemento regulador para que o gene possa ser expresso em um hospedeiro adequado que liga o vetor a ele. O elemento regulador inclui um promotor para iniciar a transcrição, um operador para controlar a transcrição, um código de sequência para um sítio de ligação de mRNA ribossomo e uma sequência para controlar o término da transcrição e tradução.
Contanto que seja ele replicável em hospedeiros, é possível usar qualquer vetor conhecido na técnica na presente invenção sem restrições em específico. Por exemplo, o vetor usado na presente invenção pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago ou simplesmente um inserto genômico potencial, mas a presente invenção não se limita a eles. Um vetor preferível é o pACYC177 (New England Biolab, número de acesso GenBank X06402). Após ser transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode ser replicado ou realizar sua função independente do genoma hospedeiro ou ser integrado ao genoma em si.
Mais especificamente, quando o vetor de acordo com a presente invenção é inserido em uma célula hospedeira, a molécula de ácido nucléico com atividade promotora dentro do vetor pode passar por recombinação homóloga com uma região promotora para um gene ddh endógeno no genoma hospedeiro, resultando na integração do vetor no cromossomo da célula hospedeira. Portanto, o vetor de acordo com a presente invenção pode compreender ainda um marcador de seleção para indicar a inserção dele no cromossomo hospedeiro. Adaptado para indicar uma célula transformada com o vetor, ou seja, se um gene de interesse foi inserido no genoma da célula hospedeira, o marcador de seleção pode manter a célula com a capacidade de apresentar resistência a fármacos, resistência a agentes citotóxicos, auxotrofia ou expressão de fenótipo selecionável, tal como a expressão de uma proteína de superfície. Na presença de um agente seletivo, as células transformadas podem ser selecionadas, pois somente células que expressam o processamento do marcador de seleção sobrevivem ou demonstram outro fenótipo. De preferência, o vetor pode compreender um gene lacZ como marcador de seleção.
Em uma concretização da presente invenção, constrói-se um vetor para conter um promotor ddh modificado aprimorado quanto à atividade que pode ser substituído pelo promotor ddh endógeno da Corynebacterium glutamicum por recombinação homóloga. Para tanto, em primeiro lugar, o vetor pACYC177 para a clonagem de E. coli é digerido com enzimas de restrição e tem suas extremidades cegadas com fragmento Klenow. Separadamente, uma sequência de nucleotídeos que contém um gene lacZ e seu promotor é amplificada a partir do DNA genômico da E. coli K12W3110 por PCR. Esses dois fragmentos de DNA assim obtidos são ligados uma ao outro para gerar uma molécula de ácido nucléico circular, seguido pela inserção de uma sequência adaptadora que contém vários sítios enzimáticos de restrição nela na molécula de ácido nucléico circular para preparar o vetor pDZ para a inserção no cromossomo da Corynebacterium (FIG. 1). Em seguida, insere-se um promotor de gene ddh modificado em bases específicas para apresentar atividade elevada na sequência adaptadora do vetor pDZ para obter o vetor pDZ-ddhPl compreendendo a sequência de nucleotídeos de N2 ID SEQ 2 (FIG. 2).
De acordo com outro de seus aspectos, a presente invenção refere-se a um transformante com o vetor ligado a ele.
O termo “transformação”, conforme usado na presente invenção, refere-se à introdução de um material de DNA exógeno em uma célula hospedeira em que o material de DNA exógeno é replicável como um elemento separado do genoma hospedeiro ou incorporado a ele. Como resultado da transformação do vetor dentro de uma célula hospedeira, o transformante liga-se ao vetor na forma de um plasmídeo ou como se incorpora ao cromossomo da célula hospedeira após a sequência de nucleotídeos com atividade promotora passar por recombinação homóloga com uma região promotora endógena para um gene ddh no genoma da célula hospedeira.
Contanto que seja usada para introduzir o vetor da presente invenção em uma célula hospedeira, a presente invenção admite o uso de qualquer técnica. Dependendo da célula hospedeira, é possível escolher uma técnica padrão, por exemplo, dentre eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, uma técnica com polietilenoglicol (PEG), uma técnica com DEAEdextrano, uma técnica com lipossoma catiônica e uma técnica com acetato de lítio-DMSO.
É possível usar uma célula hospedeira altamente eficiente na absorção e expressão de materiais de DNA estranhos e isso se aplica a todos os microorganismos, incluindo procariontes e eucariontes. De preferência, utilizam-se bactérias E. coli ou corineformes e, mais preferencialmente, a Corynebacterium glutamicum KFCC10881.
Nas células transformadas com o vetor da presente invenção, o promotor modificado com atividade aprimorada é substituído pelo promotor endógeno por recombinação homóloga, potencializando o nível de mRNA do gene ddh. Como resultado, o transformante tem maior atividade de diaminopimelato desidrogenase do que o tipo selvagem.
Em uma concretização da presente invenção, o vetor pDZ-dhhPl em que o promotor com uma sequência de nucleotídeos de N2 ID SEQ 2 de acordo com a presente invenção foi inserido foi transformado em Corynebacterium glutamicum KFCC10881 para obter um transformante (KFCC10881-ddhPl), chamado de CA01-0136, apresentando atividade aprimorada de diaminopimelato desidrogenase, que foi então depositado junto ao Centro de Cultura de Microorganismos da Coréia (doravante chamado de “KCCM”) pelo número de acesso KCCM10920P no dia 18 de janeiro de 2008.
De acordo com ainda outro de seus aspectos, a presente invenção refere-se a um método para a produção de lisina compreendendo a fermentação do transformante.
Em comparação ao tipo selvagem, o transformante de acordo com a presente invenção é aprimorado quanto à atividade da diaminopimelato desidrogenase. Visto que a diaminopimelato desidrogenase é a enzima mais essencial na via da biossíntese de lisina, a fermentação do transformante leva à produção de lisina a uma taxa mais elevada.
Na presente invenção, é possível realizar a fermentação do transformante usando-se um método bem conhecido e controlar as condições para a fermentação, incluindo temperatura, tempo, pH etc., de forma adequada. Os documentos a seguir apresentam uma descrição detalhada da fermentação: Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) e Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994). É possível chegar à fermentação por cultivo de lotes, cultivo contínuo ou cultivo de lotes alimentados. De preferência, o processo de lotes alimentados ou o processo de lotes alimentados repetido são usados de forma contínua para a fermentação, mas a presente invenção não se restringe a isso.
Para ser usado na fermentação, um meio deve satisfazer aos requisitos da linhagem empregada. Meios de cultura adequados para uso no cultivo de vários microorganismos são bem conhecidos na técnica (por exemplo, o Manual of Methods for General Bacteriology da American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Os meios de cultura podem conter, como fontes de carbono, sacarídeos e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, molasso, amido e celulose), lipídios e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico), alcoóis (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânico (por exemplo, ácido acético). Esses materiais podem ser usados sozinhos ou em combinação. Como fontes de nitrogênio, compostos orgânicos que contêm nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, caldo, extrato de malte, água de maceração de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos que contêm nitrogênio (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) podem ser usados sozinhos ou em combinação. Exemplos de fontes de fósforo que podem ser usadas nos meios de cultura incluem hidrogenofosfato de dipotássio, dihidrogenofosfato de potássio e sais de sódio correspondentes.
Além disso, os meios de cultura contêm sais metálicos essenciais ao crescimento das células (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato ferroso) e podem ser suplementados com nutrientes essenciais para estimular o crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas. Ademais, é possível adicionar precursores adequados aos meios de cultura. Os nutrientes ou suplementos podem ser adicionados juntos de uma vez ou separadamente durante a fermentação.
O pH dos meios de cultura pode ser ajustado por meio de um composto alcalino (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). A geração de espumas nos meios de cultura pode ser restrita usando-se um agente antiespumante tal como poliglicol éster de ácido graxo. Os meios de cultura podem ser mantidos em condição aeróbica introduzindo-se oxigênio ou uma mistura de gás que contêm oxigênio neles. Quanto à temperatura da cultura, ela é tipicamente entre 20° e 45° C e, de preferência, entre 25° e 40° C. A fermentação continua até produzir uma quantidade máxima de Laminoácido. Sendo assim, ela pode levar entre 10 e 160 horas. Após a produção, a L-lisina pode ser exportada aos meios de cultura ou mantida dentro das células.
Como alternativa, o método para a produção de lisina de acordo com a presente invenção pode compreender ainda coletar a lisina produzida. A L-lisina pode ser isolada dos meios de cultura ou células usando-se métodos bem conhecidos. Exemplos de métodos de coleta que podem ser usados na presente invenção incluem filtragem, cromatografia de troca aniônica, cristalização e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), entre outros.
Será possível entender melhor a presente invenção em vista aos exemplos a seguir, apresentados apenas para ilustrar a presente invenção e que, portanto, não devem ser interpretados de modo a limitá-la.
Modo para a Invenção
Nos exemplos a seguir, construímos um vetor recombinante para conter um promotor para um gene ddh da Corynebacterium glutamicum modificado para ter sua atividade aprimorada. O vetor recombinante foi transformado em Corynebacterium glutamicum KFCC10881 na qual o promotor ddh modificado foi, então, incorporado ao genoma da célula por recombinação homóloga com o promotor endógeno, resultando em uma nova linhagem capaz de produzir lisina a taxas mais elevadas.
Artificialmente mutada a partir de uma linhagem selvagem da Corynebacterium glutamicum (ATCC13032), a Corynebacterium glutamicum KFCC10881 usada na presente invenção é resistente à S-(2-aminoetil) cisteína (doravante chamada de “AEC”) e isenta de homosserina (patentes coreanas de n- 0159812 e 0397322).
EXEMPLO 1: Construção do Vetor Recombinante Contendo o Promotor Aprimorado (1) Construção de um vetor para integração no genoma (pDZ)
Neste exemplo, construímos um pDZ, vetor que será integrado ao genoma da Corynebacterium, com base no pACYC177 (New England Biolab, número de acesso GenBank X06402), um vetor para uso na E. coli.
Após tratá-lo com AcuI e Bani, cegamos as extremidades do vetor pACYC177 com um fragmento Klenow. Para uso como marcador de seleção, preparamos um gene lacZ derivado da E. coli amplificando um DNA genômico da E. coli K12 W3110 compreendendo o gene e seu promotor por PCR, seguido pelo tratamento do produto da PCR com T4 DNA polimerase e polinucleotídeo quinase para fosforilato na extremidade 5' e tornamos as extremidades opostas cegas, respectivamente. Os dois fragmentos de DNA assim obtidos foram ligados um ao outro para obter uma molécula de ácido nucleico circular, na qual uma sequência adaptadora sintetizada artificialmente contendo vários sítios de enzima de restrição foi então inserida para preparar o vetor pDZ para a inserção no cromossomo da Corynebacterium. A FIG. 1 ilustra esquematicamente o vetor pDZ para integração no cromossomo da Corynebacterium.
(2) Construção de um vetor contendo um promotor aprimorado para o gene ddh
Neste exemplo, construímos um vetor recombinante para conter um promotor aprimorado para um gene 5 ddh de Corynebacterium glutamicum da linhagem produtora de lisina.
Com base nos dados do NIH GenBank, em primeiro lugar, obtemos uma sequência de nucleotídeos (SEQ N2 1) compreendendo uma região promotora para o gene ddh(NCBI io ID N2 NCgl2528). A partir desta sequência de nucleotídeos, preparamos um fragmento de DNA que foi mutado em posições de base específicas. Cada sequência promotora modificada foi projetada com base em uma sequência promotora de consenso típico encontrada em microorganismos.
Para uso na preparação das sequências promotoras modificadas, sintetizamos quatro oligonucleotídeos iniciadores (N— ID SEQ 3 ~ 6, Tabela 1) com base nas sequências de base.
TABELA 1
Oligonucleotídeo Iniciador Sequência de Nucleotídeos N2 ID SEQ
ddh/PF CCG GGG ATC CTC TAG AGT GCG TGG CGA GTT TTA CAA AG 3
ddh/PR GCA GGT CGA CTC TAG AGG CGA ACT GCG CGA ACT TTG G 4
ddh/PlF TAT GCA TTG TGG TAA GCT CG 5
ddh/PIR CGA GCT TAC CAC AAT GCA TA 6
ddh/Plmut CTA AGT ATG CAT TGT 7
Preparamos uma sequência promotora para o gene ddh de Corynebacterium glutamicum por PCR usando conjuntos dos oligonucleotídeos iniciadores da Tabela 1 na presença de DNA Polimerase de Alta Fidelidade PfuUltra™ (Stratagene) com o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 servindo de modelo. Realizamos a PCR com 30 ciclos de desnaturação a 96° C por 30 segundos, andamento a 53° C por 30 segundos e extensão a 72° C por 30 segundos. Como resultado, o produto da PCR foi um fragmento de DNA de 300 bp com a parte de substituição localizada em uma região terminal. O ddhPl-1 foi amplificado com um conjunto dos oligonucleotídeos iniciadores de N— ID SEQ 3 e 6 e, o ddhPl-2, com um conjunto dos oligonucleotídeos iniciadores de N— ID SEQ 5 e 4. O produto da PRC foi digerido com Xbal e clonado em pDZ usando-se um kit de clonagem em fusão (TAKARA) para preparar o vetor recombinante pDZ-ddhPl.
A FIG. 2 é um mapa do vetor pDZ-ddhPl contendo a sequência promotora de N2 ID SEQ 2 integrada ao genoma da Corynebacterium.
EXEMPLO 2: Introdução do Vetor Recombinante nas linhagens Corynebacterium glutamicum
Neste exemplo, introduzimos o vetor recombinante preparado acima na linhagem de produção de lisina Corynebacterium glutamicum KFCC-10881 de modo que a sequência promotora ddh modificada no vetor fosse integrada ao genoma da célula por recombinação homóloga com o promotor ddh endógeno no genoma.
Para tanto, transformamos o vetor recombinante pDZ-ddhPl contendo o fragmento de DNA correspondente à sequência promotora modificada em Corynebacterium glutamicum KFCC10881 usando um método de eletroporação (com base na publicação Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545), seguido pela escolha de um meio de seleção contendo canamicina em uma quantidade de 25 mg/L, os transformantes em que o promotor modificado foi integrado ao genoma por recombinação homóloga com o promotor endógeno.
Confirmamos o êxito na inserção do vetor no genoma pelo surgimento de uma coloração azulada na placa que contém X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-â-D-galactosídeo). Cruzamentos únicos com o vetor incorporado no genoma dele foram cultivados em um caldo nutritivo com agitação (30° C, 8 horas); em seguida, diluímos a cultura a uma concentração de 10'4 para IO'10 antes de espalhá-la em placas contendo X-gal. Embora a maioria das colônias que cresceram nas placas fosse azul, apenas uma baixa proporção delas permaneceu branca. As colônias brancas foram selecionadas como colônias de duplocruzamento que ligaram o promotor do promotor ddh que foi mutado em posições de base específicas. Para confirmar, examinamos as linhagens específicas quanto à substituição de base por PCR e à sequência de base. A linhagem transformada com o pDZ-ddhPl foi examinada quanto à substituição de base no promotor usando um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores de N— ID SEQ 4 e 7 por PCR e sequência de base.
A linhagem de produção de lisina Corynebacterium glutamicum KFCC10881-ddhPl em que o promotor ddh mutado em posições de base específicas foi integrado ao genoma foi, enfim, confirmada por cruzamento duplo.
EXEMPLO 3: Estudo da Linhagem com Promotor Aprimorado ddh Quanto à Atividade da Diaminopimelato Desidrogenase
A linhagem-mãe Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e a linhagem de produção de lisina Corynebacterium glutamicum KFCC10881-ddhPl preparada por último no Exemplo 2 foram cultivadas e as proteínas foram isoladas das culturas e analisadas quanto à atividade do diaminopimelato desidrogenase conforme o seguinte.
Cada uma das culturas que cresceram até a fase logarítmica foi inoculada em 50 mL do meio de semeadura (I) a seguir para obter OD60q de 0,3 e, então, encubada até que a densidade óptica a 600 nm atingisse 15. Após coletá-la por centrifugação (5.000 rpm, 15 min), lavamos a massa celular duas vezes com 20 mM de Tris HC1 (pH 8,0) e a suspendemos no mesmo tampão para obter uma absorção óptica a 610 nm de turvação 160. Rompemos as células por 6 minutos em um batedor de vidro com contas de vidro acrescentadas a 1,25 g/1,5 ml da suspensão. Após a centrifugação (15.000 rpm, 20 min), o supernadante foi medido quantativamente quanto ao teor de proteínas pelo método de Bradford (Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72: 248 a 254) e usado como uma solução de proteína bruta para medir a atividade da diaminopimelato desidrogenase.
A fim de quantificar a atividade da diaminopimelato desidrogenase, misturou-se cerca de 0,01 mL da solução de proteína bruta a uma solução de reação contendo 0,2 M de Glicina/NaOH (ph 10,5), 2 mM de NADP e 4 mM de mesodiaminopimelato para se obter um volume total de 1 mL e permitiu-se que a mistura reagisse por 25° C por 10 minutos, durante os quais as absorvências a 340 nm foram monitoradas. Definimos a atividade da diaminopimelato desidrogenase em imoles de NADPH reduzidos em 1 mg de proteína por minuto e a expressamos em unidade (U).
Observamos, na Corynebacterium glutamicum KFCC10881-ddhPl, uma atividade de diaminopimelato desidrogenase 23,2 vezes maior do que na linhagem-mãe KFCC10881 (Tabela 2).
TABELA 2
Linhagem Diaminopimelato Desidrogenase (U) Vezes
KFCC10881 25,2 1
KFCC10881-ddhPl 584,5 23,2
* Meio de semeadura (I) (pH 7,0)
Vinte gramas de glicose, 10 g de polipeptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de (NH4)2SO4, 1,5 g de uréia, 4 g de
KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 150 Mg de biotina, 1.500 Mg de tiamina HC1, 3.000 Mg de pantotenato de cálcio, 3.000 Mg de nicotinamida (por litro de água destilada)
EXEMPLO 4: Produção de Lisina na Linhagem com o Promotor Aprimorado ddh
A linhagem-mãe Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e a linhagem de produção de Llisina Corynebacterium glutamicum KFCC10881-ddhPl preparada no Exemplo 2 foram fermentadas para produzir L-lisina de acordo com o seguinte.
A Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e a KFCC10881-ddhPl foram inoculadas em fracos de fundo baffled de 250 mL, cada um contendo 25 mL do meio de semeadura (II) a seguir, e cultivadas a 30° C por 20 horas com agitação a 200 rpm. Para 24 mL do meio de produção a seguir em um frasco de fundo baffled de 250 mL, acrescentamos 1 mL da cultura de semeadura, seguido pela incubação a 30° C por 120 horas com agitação (200 rpm).
Após o término da cultura, realizou-se a análise HPLC para determinar as quantidades de L-lisina produzidas pelas linhagens. As concentrações de L-lisina nas culturas de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e KFCC-10881-ddhPl são resumidas na Tabela 3 abaixo.
TABELA 3
Linhagem Lisina (g/L)
Lote 1 Lote 2 Lote 3
KFCC10881 43,2 42,5 42,5
KFCC10881-ddhPl 44,2 44,2 44, 1
* Meio de semeadura (II) (pH 7,0)
Vinte gramas de açúcar bruto, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de uréia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 100 iag de biotina, 1.000 iag de tiamina HC1, 2.000 Mg de pantotenato de cálcio, 2.000 Mg de nicotinamida (por litro de água destilada) * Meio de produção (pH 7,0)
Cem gramas de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de concentrado de água de lavagem do milho, 3 g de ureia, Ig de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 100 Mg de biotina, 1.000 Mg de cloreto de tiamina, 2.000 Mg de pantotenato de cálcio, 3.000 Mg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 (por litro de água destilada)
Conforme ilustra a Tabela 3, descobrimos que a Corynebacterium glutamicum KFCC-dhhPl com atividade da diaminopimelato desidrogenase aprimorada em cerca de 23 vezes aumenta a produtividade de lisina em cerca de 3% em comparação à linhagem-mãe KFCC10881.
Aplicabilidade Industrial
Com a atividade promotora mais elevada do que a do tipo selvagem, como descrito até agora, a molécula de ácido nucléico derivada da Corynebacterium glutamicum de acordo com a presente invenção pode melhorar a atividade da diaminopimelato desidrogenase, aumentando assim a eficiência da biossíntese de lisina. Como consequência, a linhagem que liga 5 o promotor aprimorado pode produzir L-lisina, um aminoácido importante do ponto de vista industrial, a taxas elevadas.

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES
    L - Molécula de ácido nucleico com uma sequência dc nucleotídeos de No. ID SEQ 2, caracterizada por ser operavelmente ligada a um gene que codifica a diaminopimelato desidrogenase e com atividade promotora aprimorada por expressão.
  2. 2. - Vetor, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleíco conforme definido na reivindicação I.
  3. 3. — Vetor, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser um pDZ-ddhPI com o mapa genético da FIG. 2.
  4. 4. - Transformante, caracterizada por incluir o vetor conforme definido na reivindicação 2.
  5. 5. ..... Transformante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por pertencer aos gêneros Coryneúocmrnoií ou /SVrnsGnemnwn
  6. 6. - Transformante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser chamado de CA01.-()136 com o número de acesso KCCM10920P.
  7. 7. Transformante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1 com atividade promotora aprimorada ser incorporada a um genoma do transformante por rneío de recombinação homóloga.
  8. 8. - Transformante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por incluir a molécula da reivindicação 1 com atividade promotora aprimorada como uni plásmido.
  9. 9< - Método para produzir lisina sendo caracterizado por compreender fermentar o transformante conforme definido na reivindicação 4.
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