JP2011229544A

JP2011229544A - コリネ型細菌形質転換体による高効率な有機化合物の製造方法

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Publication number: JP2011229544A
Application number: JP2011180900A
Authority: JP
Inventors: Shohei Okino; 祥平沖野; Masayuki Inui; 将行乾; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Current assignee: Research Institute of Innovative Technology for the Earth RITE
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2011-11-17
Anticipated expiration: 2026-04-27
Also published as: JP5296166B2

Abstract

【課題】乳酸、コハク酸、エタノール等の有用な有機化合物を工業技術的に高効率かつ高生産性で製造できる方法を提供すること。
【解決手段】発現可能な制御配列下に、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列により形質転換された好気性コリネ型細菌を用いて、還元条件下の反応液中に糖類の代謝速度を向上させて有機化合物を蓄積し、該反応液より有機化合物を回収することを特徴とする有機化合物の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、バイオリファイナリープロセスを実施する為の能力が強化された微生物による有機化合物の高生産性製造方法に関する。さらに詳しくは、バイオマス由来の糖類を原料としてグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＡＰＤＨと略記する）活性が強化されたコリネ型細菌形質転換体を用いて、糖類の代謝速度を向上させることによる高効率な有機化合物の製造方法に関するものである。

乳酸やコハク酸そしてエタノール等の化学製品やエネルギー製品をバイオマス由来の糖類を原料として生物的方法により製造することは（バイオリファイナリー）、化石資源からこれら有機化合物の製造を行う（石油リファイナリー）と異なり、資源枯渇問題や地球温暖化問題を解消し、環境調和型製造技術として期待されているものである。

しかし、生物的方法による各種有機化合物の製造は、一般的に、その生産性が石油化学プロセスに比し低いと云われている。
生物的方法による生産性向上法の一つは、糖類の各種有機化合物への代謝速度を向上させ、バイオ反応溶液中の有機化合物の蓄積濃度を高める（目的有機化合物の分離・精製が高効率に実施できる）ことである。

本発明者らは、既に、高生産性の生物的方法に関するいくつかの技術を提案している（特許文献１，２，３参照）。特許文献４は、解糖系酵素の一つであるＧＡＰＤＨ活性が強化された大腸菌により、好気条件下、培養液中にグルコースからの代謝産物であるピルビン酸を高蓄積する技術を開示している。

ＧＡＰＤＨは解糖経路の一つであるグリセルアルデヒド３−リン酸から１，３−ビスホスホグリセリン酸への変換を触媒する酵素である（図４参照）。この代謝経路には補酵素が必要であり、この代謝経路反応において、補酵素のニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）は還元型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に還元される。

また、このレドックス補酵素対の一方の生成ＮＡＤＨは、ＧＡＰＤＨ活性の阻害因子となることも知られている（非特許文献１および２参照）。代謝経路反応の促進には、このような反応阻害を生じせしめる因子の除去措置を施すことが必要である。

非特許文献３および４は、好気的条件（酸化的条件）と嫌気的条件（還元的条件）では微生物細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ存在量比が異なり、好気的条件ではＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が低い状態で平衡を保つことを教えている。

特許文献４が好気的条件でのピルビン酸製造技術を開示しているのは、好気的条件ではＮＡＤＨの存在量がＮＡＤのそれと比較して低い為、ＮＡＤＨによるＧＡＰＤＨ阻害効果が解消される結果、グルコースからピルビン酸への炭素質の流れがスムースに行われる為と考えられる。

ところが、生物的方法による乳酸、コハク酸、エタノール等の有機化合物の製造は生成物収率の選択性や反応制御の容易性そして反応プロセスの省エネルギー等の観点より嫌気的条件（還元的条件）で実施することが望ましい。嫌気的条件においても代謝経路中の炭素質の流れを阻害することなく（ＮＡＤＨによるＧＡＰＤＨ活性阻害の解消等）、そして、生成する有機化合物の反応液中の濃度を高めることの出来る技術が要望されている。

なお、特許文献５は酵母等の真核性微生物の（ニコチンアミドジヌクレオチドホスフェート／還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホスフェート）（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）レドックス補酵素対に関連するＧＡＰＤＨ形質転換体に関する技術を開示しているが、本発明の（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）レドックス補酵素対に関連するＧＡＰＤＨとは酵素特性が大きく異なる酵素蛋白であり、本発明の原核微生物であるコリネ型細菌の形質転換技術に関するものではない。

ＷＯ２００５／０１０１８２号公報特願２００５−０１０９２８特願２００５−１４８０５３特開２００４−２８３０５０号公報特表２００５−５０７２５５号公報

Ｃ．ＧＡＲＲＩＧＵＥＳ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ．１７，５２８２−５２８７（１９９７）Ｈ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４，９６−１０２（１９９８）Ｍ．Ｒ．Ｇｒａｅｆ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８１，Ｎｏ．８，２３５１−２３５７（１９９９）Ｃ．Ｄｕ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６９：５５４−５６３（２００６）

本発明は、乳酸、コハク酸、エタノール等の有用な有機化合物を工業技術的に高効率かつ高生産性で実施できる還元条件下での製造方法を提供することを目的とする。
本発明の方法に従えば、糖類の代謝産物である有機化合物への炭素質の変換速度を向上させると同時に変換反応経時低下を防止でき、バイオ反応液中の有機化合物の蓄積濃度を向上させることが出来る。

本発明の目的とする還元条件下での糖類からの有用な有機化合物の製造方法は、前述した如く、公知技術からは還元条件下での主要代謝経路におけるＮＡＤＨによるＧＡＰＤＨ阻害効果の解消は困難であるため、高効率に実施することが難しいと予測されたが、鋭意検討した結果、思いがけないことに、ＧＡＰＤＨ活性の発現を強化せしめる微生物を特定することにより本発明の目的が達成されることを見出した。

すなわち、本発明は次の通りである。
（１）発現可能な制御配列下に、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列により形質転換された好気性コリネ型細菌を用いて、還元条件下の反応液中に糖類の代謝速度を向上させて有機化合物を蓄積し、該反応液より有機化合物を回収することを特徴とする有機化合物の製造方法。
（２）形質転換される好気性コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウ属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌およびマイクロコッカス属菌の群から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（１）記載の有機化合物の製造方法。
（３）コリネバクテリウム属菌が、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲＦＥＲＭＰ−１８９７６、ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ１３２３２、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ１３６５５、ＡＴＣＣ１３７４５、ＡＴＣＣ１３７４６、ＡＴＣＣ１３７６１、ＡＴＣＣ１４０２０またはＡＴＣＣ３１８３１、および、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）ＮＢＲＣ１００３９５から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（２）記載の有機化合物の製造方法。
（４）ブレビバクテリウム属菌が、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）もしくはＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、またはブレビバクテリウムアンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（２）記載の有機化合物の製造方法。
（５）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列が、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＦＥＲＭＰ−１８９７６、アクチノマイセスユーロッパエウス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｅｕｒｏｐａｅｕｓ）ＡＴＣＣ７００３５３またはエシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２７３２５由来のものであることを特徴とする前記（１）記載の有機化合物の製造方法。
（６）形質転換された好気性コリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７５）である前記（１）記載の有機化合物の製造方法。
（７）形質転換された好気性コリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７８）である前記（１）記載の有機化合物の製造方法。
（８）形質転換された好気性コリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７７）である前記（１）記載の有機化合物の製造方法。
（９）還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００ミリボルト乃至−５００ミリボルトであることを特徴とする前記（１）記載の有機化合物の製造方法。
（１０）有機化合物がモノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオールおよびビタミンから選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記（１）記載の有機化合物の製造方法。
（１１）コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７５）。
（１２）コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７８）。
（１３）コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７７）。
なお、本願明細書及び特許請求の範囲で使用される△ＰＥＰＣは、
を示す。

本発明により、糖類の代謝変換消費速度を向上させて高生産性かつ高効率に有用な有機化合物を製造することが可能となり、生物的有機化合物生産技術の生産性の低さが克服され、バイオリファイナリー構築を可能とする。

図１は、プラスミドｐＣＲＢ２００構築法を示す。図２は、プラスミドｐＣＲＡ８２０構築法を示す。図３は、ＰＥＰＣ遺伝子破壊用プラスミドｐＣＲＡ７０３構築法を示す。図４は、グルコースからの物質生産代謝経路を示す。図５は、コリネバクテリウムグルタミカムＲ及びコリネバクテリウムグルタミカムＲ／Ｒ−ｎＧＡＰ株の２４時間後及び４８時間後における（Ａ）グルコース消費速度（ｇ／ｌ／ｈ）と（Ｂ）乳酸生成速度（ｇ／ｌ／ｈ）を示す。図６は、コリネバクテリウムグルタミカムＲ／△ＰＥＰＣ、コリネバクテリウムグルタミカムＲ／△ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ、及びコリネバクテリウムグルタミカムＲ／△ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ、株の２４時間後及び４８時間後における（Ａ）グルコース消費速度（ｇ／ｌ／ｈ）と（Ｂ）乳酸生成速度（ｇ／ｌ／ｈ）を示す。

本発明で形質転換される好気性コリネ型細菌は、糖類の代謝変換機能を有していれば特に限定されない。糖類の種類や目的有機化合物の種類に因っては、好気性コリネ型細菌が本来有していない糖類の取り込み、代謝経路あるいは目的有機化合物への変換経路等の新たな機能の導入を必要とする場合があるが、そのような場合には組換え技術や突然変異誘発処理等によりそれらの機能を付与すればよい。

このような好気性コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウ属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌およびマイクロコッカス属菌等が挙げられる。

さらに具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲＦＥＲＭＰ−１８９７６、ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ１３２３２、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ１３６５５、ＡＴＣＣ１３７４５、ＡＴＣＣ１３７４６、ＡＴＣＣ１３７６１、ＡＴＣＣ１４０２０またはＡＴＣＣ３１８３１、および、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）ＮＢＲＣ１００３９５等が挙げられる。

ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）もしくはＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、またはブレビバクテリウムアンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２等が挙げられる。

アースロバクター属菌としては、アースロバクターグロビフォルミス（ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒＧｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８０１０，ＡＴＣＣ４３３６，ＡＴＣＣ２１０５６，ＡＴＣＣ３１２５０，ＡＴＣＣ３１７３８またはＡＴＣＣ３５６９８等が挙げられる。

マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウムボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）ＡＴＣＣ１９２１０またはＡＴＣＣ２７２８９等が挙げられる。

マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカスフロイデンライヒ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）Ｎｏ．２３９（ＦＥＲＭＰ−１３２２１），マイクロコッカスルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｅｕｔｅｕｓ）Ｎｏ．２４０（ＦＥＲＭＰ−１３２２２）またはマイクロコッカスウレアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｕｒｅａｅ）ＩＡＭ１０１０等が挙げられる。

本発明で用いられる好気性コリネ型細菌としては、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲＦＥＲＭＰ−１８９７６、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２またはブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９等が好ましい。

また、本発明で形質転換される好気性コリネ型細菌としては、自然界に存在する野生株の変異株（例えば、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒのセロビオース資化能を獲得した変異株ＦＥＲＭＰ−１８９７７，ＦＥＲＭＰ−１８９７８株など；特開平２００４−８９０２９号公報参照）であってもよく、本発明の構成遺伝子以外の遺伝子が組換えられた人為株（例えば、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２がエタノール生成能力を有すべく形質転換された人為株（ＦＥＲＭＢＰ−７６２１；ＷＯ０１／９６５７３Ａ１号公報参照）やコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株のホスホトランスフェラーゼ系酵素IIに関する遺伝子組換えにより、グルコースとセロビオースの同時併行資化能を発現すべく形質転換された人為株（ＦＥＲＭＰ−１８９７９；特開平２００４−８９０２９号公報参照）であっても良い。

これら上記の好気性コリネ型細菌が本発明の目的の為、下記に詳記するＧＡＰＤＨ高発現の形質転換処理に供せられる。あるいは、ＧＡＤＰＨ高発現処理と上記の変異株や人為株を創製する順序が逆であったり、同時であっても良い。

本発明で使用されるＧＡＰＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、本発明の好気性コリネ型細菌自身の有するものであっても外来（異種）由来のものであっても良い。

ＧＡＰＤＨの遺伝子配列や酵素蛋白特性については、動物、植物、微生物において多く調べられている。微生物については、下記に示す種などが有するＧＡＰＤＨの遺伝子配列や酵素蛋白特性が既に明らかにされている。

・エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，Ｇ．，ａｎｄＪｏｓｓｅＪ．；Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｋｉｎａｓｅ，ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｍｕｔａｓｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２４６（１９７１），４３１９−２５）

・コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（Ｅｉｋｍａｎｎｓ，Ｂ．Ｊ．；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｔｈｒｅｅｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｋｉｎａｓｅ，ａｎｄｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４（１９９２），６０７６−８６）

・ストレプトマイセスアレナ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｒｅｎａｅ）（Ｍａｕｒｅｒ，Ｋ．Ｈ．，ＰｆｅｉｆｆｅｒＦ．，ＺｅｈｅｎｄｅｒＨ．，ａｎｄＭｅｃｋｅＤ．；Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐｅｎｔａｌｅｎｏｌａｃｔｏｎｅｐｒｏｄｕｃｅｒＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｒｅｎａｅ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３（１９８３），９３０−６）

・アスペルギルスニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎ）（Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．，ＤｉｎｇｅｍａｎｓｅＭ．Ａ．，Ｊａｃｏｂｓ−ＭｅｉｊｓｉｎｇＢ．Ｊ．，ＰｏｕｗｅｌｓＰ．Ｈ．，ａｎｄｖａｎｄｅｎＨｏｎｄｅｌＣ．Ａ．；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ，Ｇｅｎｅ．，６９（１９８８），４９−５７）

・シネココッカススピーシーズ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ）（Ｓａｎｄ，Ｏ．，ＰｅｔｅｒｓｅｎＩ．Ｍ．，ＪｏｒｇｅｎＪ．，ａｎｄＩｖｅｒｓｅｎＬ．；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｆｒｏｍＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ，ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．，６５（１９９４），１３３−４２）

・バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，ａｎｄＩｍａｈｏｒｉＫ．；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｆｒｏｍｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｃｅｌｌｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ，ＪＢｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．７３（１９７３），９７−１０６）

・バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｖｉａｅｎｅ，Ａ．，ａｎｄＤｈａｅｓｅＰ．；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１７（１９８９），１２５１）

ＧＡＰＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成したＤＮＡ断片も使用することが出来る。ＤＮＡ配列が不明の場合であっても、ＧＡＰＤＨ活性を指標にして酵素蛋白質を精製し、そのＮ末端アミノ酸配列、部分分解配列により、通常のハイブリダイゼーションの手法によりＤＮＡ断片を単離できる。また、ＧＡＰＤＨ酵素蛋白質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のＧＡＰＤＨ遺伝子配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＰＣＲによって断片を取得することが可能である。

本発明のＧＡＰＤＨ遺伝子はＧＡＰＤＨ活性が保持されている限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換していてもよく、削除されていてもよく、また新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていても良い。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記の一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個であってよい。

本発明のＧＡＰＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片は前述の好気性コリネ型細菌へ、プラスミドベクターを用いて、ＧＡＰＤＨ遺伝子が発現可能な制御配列下に導入される。ここで「制御配列下」とはＧＡＰＤＨ遺伝子が、例えば、プロモーター、インヂューサー、オペレーター、リボソーム結合部位および転写ターミネーター等との共同作業により自律複製できることを意味する。このような目的で使用されるプラスミドベクターとしては、好気性コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、例えば、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４８，２９０１−２９０３（１９８４）およびＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐＳｅｒ．，ｖｏｌ．１６，２６５−２６７（１９８５））（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ２２５６由来）、ｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４８、２９０１−２９０３（１９８４））（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５８由来）、ｐＣＲＹ３０（Ａｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．５７，７５９−７６４（１９９１））、ｐＥＫ０，ｐＥＣ５，ｐＥＫＥｘ１（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０２，９３−９８（１９９１））そしてｐＣＧ４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５９，３０６−３１１（１９８４））（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕａｔｍｉｃｕｍＴ２５０由来）等が挙げられる。

本発明のコリネ型細菌形質転換体創製に使用されるプラスミドの構築は、例えば、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株由来のＧＡＰＤＨ遺伝子を用いる場合では完全なＧＡＰＤＨ遺伝子を含む遺伝子断片〔コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の全ゲノム解析結果（野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、ＫｏｓＰｅｔｅｒ、乾将行、湯川英明「ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０参照）を基にＰＣＲで増幅可能（詳細は、実施例に記載）〕を、適当なプロモーター、ターミネーター等の制御配列を連結後、上記例示されているいずれかのプラスミドベクターの適当な制限酵素部位に挿入し、構築することが出来る。

上記組換えプラスミドにおいて、ＧＡＰＤＨ遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、好気性コリネ型細菌が元来保有するプロモーター等が挙げられるが、それに限られるものではなく、ＧＡＰＤＨ遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればいかなるものであってもよい。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネーターについても、好気性コリネ型細菌が元来保有するターミネーター等が挙げられるが、それらに限定されるものではなく、例えば大腸菌由来のトリプトファンオペロンのターミネーター等のＧＡＰＤＨ遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなるものであってもよい。

ＧＡＰＤＨ遺伝子を含むプラスミドベクターの好気性コリネ型細菌への導入方法としては、電気パルス法（エレクトロポレーション法）やＣａＣ１_２法等好気性コリネ型細菌へのＧＡＰＤＨ遺伝子導入が可能な方法であれば特に限定されるものではない。その具体例として、例えば電気パルス法としては、公知の方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５４，４４３−４４７（１９９０）、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４４，１８１−１８５（１９９３））を用いることができる。

本発明のコリネ型細菌形質転換創製体の取得方法としては、常法に従い、ＧＡＰＤＨ遺伝子を含むプラスミドベクターに薬剤耐性遺伝子等を組み入れて、適切な濃度の当該薬剤を含むプレート培地上にＧＡＰＤＨ遺伝子導入処理を行った本発明のコリネ型細菌を塗布することにより形質転換されたコリネ型細菌を選抜することができる。その方法の具体例としては、例えば、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５４，４４３−４４７（１９９０）、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１４４，１８１−１８５（１９９３）に記載の方法等を挙げることができる。

上記の方法により創製される好気性コリネ型細菌の形質転換体の例としては、具体的には、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７５）、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７８）、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７７）などが挙げられる。

かくして創製された本発明の好気性コリネ型細菌は特定の還元条件下にある反応液中で、糖類を原料として（ＴＣＡ経路に存在するポリカルボン酸を製造する場合は、炭酸イオン等も原料として）、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオールおよびビタミン等の多様な有機化合物を、糖類の代謝速度の向上あるいは経時低下を抑制すると同時に、高い生産速度と高い蓄積濃度でもって、反応液中に生成させることが出来る。

本発明に係る有機化合物の製造方法においては、まず、上記の本発明の好気性コリネ型細菌を好気条件下で増殖培養する。

本発明の好気性コリネ型細菌の培養は、炭素源、窒素源および無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。培養には、炭素源として、例えばグルコースまたは廃糖蜜等を、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウムまたは硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸またはビオチンもしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。

培養は、通常、通気攪拌または振盪等の好気的条件下、約２０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３５℃の温度で行うことが出来る。培養時のｐＨは５〜１０付近、好ましくは７〜８付近の範囲がよく、培養中のｐＨ調整は酸またはアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養開始時の炭素源濃度は、約１〜２０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは約２〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、培養期間は通常１〜７日間程度である。

ついで、本発明の好気性コリネ型細菌の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。

回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものであればよく、例えば、菌体をアクリルアミドまたはカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。

ついで、上記の如くして得られる培養物から回収分離された本発明の好気性コリネ型細菌の培養菌体またはその菌体処理物は還元条件下の反応液中での有機化合物の生成反応に供せられる。有機化合物生成方式は、回分式、連続式いずれの生成方式も可能である。

本発明の還元条件下の生化学反応に於いては、好気性コリネ型細菌の増殖分裂が完全に抑制され、グルコース等の糖類炭素源からの目的有機化合物への変換速度および変換効率が向上し、また増殖に伴う分泌副生物の実質的な完全抑制を実現することが出来る。この観点からは、培養回収されたコリネ型細菌またはその菌体処理物が反応液中に供せられるときには、好気性コリネ型細菌形質転換細胞内外の培養時環境状態が反応液中にもたらされない方法や条件を用いることが推奨される。つまり、反応液は、増殖培養過程で生成し、菌体内外に存在する生成物質を実質的に含有しないことが好ましい。より具体的には、増殖培養過程で生成し、菌体外に放出された分泌副生物、および培養菌体内の好気的代謝機能により生成し菌体内に残存する物質が、還元条件下の反応培地に実質的に存在しない状態であることが推奨される。このような状態は、例えば、増殖培養後の培養液の遠心分離、膜分離等の方法および／または培養後の菌体を還元条件下で２時間ないし１０時間程度放置することで実現される。

本工程においては、還元条件下の反応液を用いる。反応液は、還元条件下にあれば、固体状、半固体状または液体状等いずれの形状を有していてもよい。本発明の必須の要件は、還元条件下で好気性コリネ型細菌形質転換体の代謝機能による生化学反応を行わせしめ、目的とする有機化合物を生成することである。

本発明における還元条件とは、反応系の酸化還元電位で規定され、反応液の酸化還元電位は、好ましくは約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶ程度、より好ましくは約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶ程度である。反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）である程度推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、ＢＲＯＡＤＬＥＹＪＡＭＥＳ社製、ＯＲＰＥｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を用いることによって計測できる。本発明においては、反応液に菌体またはその処理物を添加した直後から有機化合物を採取するまで、還元条件を維持していることが好ましいが、少なくとも有機化合物を採取する時点で反応液が還元状態であればよい。反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応液が還元条件下に保たれていることが望ましい。なかでも、反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応液の酸化還元電位が約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶ程度に保たれていることがより望ましい。

このような還元状態の実現は具体的には、前記の培養後の培養菌体調製方法、反応培地の調整方法、または反応途中における還元条件の維持方法等によりなされる。

還元条件下の反応液の調整方法は、公知の方法を用いてよい。例えば、反応培地用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Ｐｆｅｎｎｉｇ，Ｎｅｔ．ａｌ．（１９８１）：Ｔｈｅｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｏｒｙｓｕｌｆａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ，ＩｎＴｈｅＰｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，ＡＨａｎｄｂｏｏｋｏｎＨａｂｉｔａｔｓ，ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｔｅｒｉａ，Ｅｄ．ｂｙＳｔａｒｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ．ａｌ．ｐ．９２６−９４０，Ｂｅｒｌｉｎ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ．や「農芸化学実験第三巻、京都大学農学部農芸化学教室編、１９９０年第２６刷、産業図書株式会社出版」）などが参考となり、所望する還元状態の水溶液を得ることが出来る。

反応水溶液の調整方法として、より具体的には、反応水溶液を加熱処理や減圧処理することにより溶解ガスを除去する方法等が挙げられる。より具体的には、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは５〜４０分程度、反応水溶液を処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去し、還元条件下の反応水溶液を作成することができる。また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオンそして硫化ソーダ等）を添加して還元状態の反応水溶液を調整することも出来る。また、場合により、これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元状態の反応培地用水溶液を調整する方法となる。

反応途中における還元条件の維持方法としては、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が通常用いられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性コリネ型細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。

本発明の有機化合物生成反応において、生成反応系の酸化還元電位の規定が目的とする有機化合物の効率的な生産に関してなぜ有効であるかの理由は明らかではないが、下記にその推定理由を記す。ただし、本発明はその推定理由になんら限定されるものではない。

本発明の目的生産物である有機化合物は、本発明の好気性コリネ型細菌の代謝機能に基づく生化学反応により産生される化合物である。微生物細胞内の生化学反応には各種の酸化還元反応が関与しており、電子の授受移動が行われている。酸化還元電位は反応系での電子の受容性、供与性の難易度を示す尺度の一つであるが、この電位は微生物細胞内で起こっている代謝経路を構成する各種反応（酸化還元反応）の状態や細胞内外との電子授受の状態を反映している。電位差計により直接測定される酸化還元電位は反応溶液と電極との電位であるが反応溶液の電位は細胞膜を介してある電位勾配を持って細胞内で生じている反応と相関している。即ち、酸化還元電位は細胞内外を含む反応系全体の酸化還元反応の総和を反映（各種反応の内容やその頻度等も含めて）したものである。

反応系の酸化還元電位に影響する因子としては、反応系雰囲気ガスの種類と濃度、反応温度、反応溶液ｐＨ、反応液中に存在する目的有機化合物生成のために使用される無機および有機の各種化合物濃度と組成等が考えられる。本発明における反応培地の酸化還元電位とは上記各種影響因子が統合されて示されるものである。従って、本発明は、目的とする有機化合物への代謝経路には各種化学反応が関与し、これら化学反応は上記因子群の影響下にあるが、単一の酸化還元電位なる反応状態を規定する尺度により、効率的に目的有機化合物が生成されることを見出したことにより、発明の実施条件の一つとして特定したものである。

反応液には、有機化合物生成の原料となる有機炭素源（例えば、糖類等）が含まれている。有機炭素源としては、本発明の好気性コリネ型細菌形質転換体が生化学反応に利用できる物質が挙げられる。

具体的には、糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖類、セロビオース、ショ糖、ラクトースもしくはマルトースなどの二糖類、またはデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。なかでも、グルコースが好ましい。

有機化合物の生成反応に用いられる反応液組成は、本発明の好気性コリネ型細菌形質転換体またはその処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源、蛋白質合成に必要な窒素源、その他リン、カリウムまたはナトリウム等の塩類、さらに鉄、マンガンまたはカルシウム等の微量金属塩を含んでいてもよい。これらの添加量は所要反応時間、目的有機化合物生産物の種類または用いられる好気性コリネ型細菌形質転換体の種類等により適宜定めることが出来る。特定のビタミン類の添加が好ましい場合もある。また、前記の反応系の炭酸ガス封入法にも関連して、反応培地に二酸化炭素または各種の炭酸塩もしくは炭酸水素塩等の無機炭酸塩を糖類などの有機炭素源に加えて注入することが目的有機化合物によっては有効な場合もある。

好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物と糖類との反応は、好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物が活動できる温度条件下で行われることが好ましく、好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。

最後に、上述のようにして反応培地で生成した有機化合物を採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることが出来る。そのような公知の方法として、有機化合物生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法または電気透析法等があり、生成有機化合物の特性に応じてその分離精製採取法は適宜定めることが出来る。

本発明で製造することができる有機化合物としては、有機酸、アルコール、アミノ酸またはビタミン類等が挙げられる。有機酸としては、例えば、酢酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、シスアコニット酸、イタコン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸そしてシキミ酸などが挙げられ、アルコールとしては、例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、グリセロール、ブタノール、１，４−ブタンジオール、キシリトールそしてソルビトールなどが挙げられ、アミノ酸としては、例えば、バリン、ロイシン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、イソロイシンまたはスレオニンなどが挙げられる。

以下、実施例でもって本発明を説明するが、本発明はこのような実施例に限定されるものではない。なお、「％」は、特に断りのない限り、「重量％」を示す。

〔実施例１〕ＧＡＰＤＨ遺伝子のクローン化
（Ａ）コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株からの全ＤＮＡの抽出
Ａ培地１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：７ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４：０．５ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ_４・ｎＨ_２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス２ｇ，カザミノ酸７ｇ，グルコース２０ｇおよび蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）］に、野生株コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒを、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期後期まで３３℃で培養し、菌体を集めた。

得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。

（Ｂ）コリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１の構築
ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９に内在するプラスミドｐＡＭ３３０（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０，２７７１−２７７８（１９８６）、特開昭５８−６７６７９）のＯＲＦ１（ｒｅｐ）を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。

ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ＯＲＦ１（ｒｅｐ）遺伝子増幅用プライマー
Ｒｅｐ−Ｎ；５’−CTCTGTTAACACAACAAGACCCATCATAGT−３’（配列番号１），
Ｒｅｐ−Ｃ；５’−CTCTGTTAACACATGCAGTCATGTCGTGCT−３’（配列番号２）
尚、いずれのプライマーもＨｐａＩサイトが末端に付加されている。
鋳型ＤＮＡは、プラスミドｐＡＭ３３０を用いた。
ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、タカラ・イーエックス・タック（ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ）（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。

反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液１０μｌ
１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液１６μｌ
鋳型ＤＮＡ１０μｌ（ＤＮＡ含有量１μＭ以下）
上記の２種のプライマー各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
タカラ・イーエックス・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ０．５μｌ
滅菌蒸留水６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。

ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５２℃ ６０秒
エクステンション過程：７２℃ １２０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、Ｒｅｐ遺伝子を含む、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

一方、コリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターを構築する際に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）のｌａｃＺα遺伝子とその内部のマルチクローニングサイトを保存するため、ＰＣＲにより新たにＥｃｏＲＶサイトを付加するように、ｐＨＳＧ３９８を増幅した。

ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
プラスミドｐＨＳＧ３９８増幅用プライマー
３９８−Ｎ；５’−CTCTGATATCGTTCCACTGAGCGTCAGACC−３’（配列番号３），
３９８−Ｃ；５’−CTCTGATATCTCCGTCGAACGGAAGATCAC−３’（配列番号４）
尚、いずれのプライマーもＥｃｏＲＶサイトが末端に付加されている。
鋳型ＤＮＡは、プラスミドｐＨＳＧ３９８を用いた。
ＰＣＲは、前述と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、プラスミドｐＨＳＧ３９８全長を含む、約２．２ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

次に、ＨｐａＩで切断した上記Ｒｅｐ遺伝子を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片５μｌとＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐＨＳＧ３９８全長を含む約２．２ｋｂのＤＮＡ断片を混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。

得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
このコリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターをｐＣＲＢ１と記する。

（Ｃ）コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲのＧＡＰＤＨ遺伝子のクローン化
ＰＣＲに際して、ＧＡＰＤＨ遺伝子をクローン化するべく、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の全ゲノム解析結果（野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、ＫｏｓＰｅｔｅｒ、乾将行、湯川英明「ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０参照）を基に、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマー
ＧＡＰＲ−Ｎ；５’−CTCTGGATCCCGATTTCAGGTTCGTTCCCT−３’（配列番号５），
ＧＡＰＲ−Ｃ；５’−CTCTGGATCCCCGGGCTATTGGGATGA−３’ （配列番号６）
尚、いずれのプライマーもＢａｍＨＩサイトがそれぞれ末端に付加されている。
鋳型ＤＮＡは、上記（Ａ）項にて抽出したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株のゲノムＤＮＡを用いた。

ＰＣＲは、上記（Ｂ）項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の場合、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

次に、上記ＧＡＰＤＨ遺伝子を含む１．４ｋｂＰＣＲ産物１０μｌを制限酵素ＢａｍＨＩで切断したもの、及び上記（Ｂ）項で構築したコリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１２μｌを制限酵素ＢａｍＨＩで切断したものをそれぞれ、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇ、ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｘｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）２００ｍｇ、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ１−ｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）１００ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

上記培地上で白色を呈する生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＣＲＢ１約４．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ＧＡＰＤＨ遺伝子（配列番号７）を含有する長さ約１．４ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた（配列番号７）。
該ＧＡＰＤＨ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＢ２００と命名とした（図１参照）。

（Ｄ）アクチノマイセスユーロパエウス（ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｅｕｒｏｐａｅｕｓＡＴＣＣ７００３５３）のＧＡＰＤＨ遺伝子のクローン化
アクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）からのトータルＤＮＡは（Ａ）項と同様に抽出した。
アクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）と同じＧ（＋）バクテリアのｇａｐＡアミノ酸配列の相同性領域を指標に下記のプライマーを合成し、アクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）より精製したトータルＤＮＡを鋳型にして、上記（Ｂ）項と同様の条件でタカラ・エルエー・タック（ＴａＫａＲａＬＡＴａｑ）（宝酒造株式会社製）を使用してＰＣＲを行った。
アクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）ＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマー
ＡｇｐＰ１５’−ATIAAYGGITTYGGIMGIATIGG−３’（配列番号８），
ＡｇｐＰ７５’−SCIYAYTCRTTRTCRTA−３’ （配列番号９）
０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約９００ｂｐのバンドが得られた。
上記の増幅したＤＮＡ断片混合液を、上記（Ｂ）項と同様の条件で精製したあと、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙＶｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、同社のマニュアルに従い１６℃で３時間反応させ、結合させた。

得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９，１９７０）によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液より９３６ｂｐのＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドＤＮＡを抽出した。

該プラスミドを鋳型として、下記の２つのプライマーを用いてＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＶ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を用いて標識し、ＡＢＩＰｒｉｓｍ３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）にて塩基配列を決定した。プライマー決定した配列はデーターベースに登録されている近縁種のＧＡＰＤＨのアミノ酸配列に対して、６０％以上の相同性を示した。
Ｍ１３−Ｍ４５’−GTTTTCCCAGTCACGAC−３’（配列番号１０），
Ｍ１３−ＲＶ５’−CAGGAAACAGCTATGAC−３’（配列番号１１）
サザンハイブリダイゼーションの鋳型として、７種類の制限酵素制限酵素（ＡｃｃＩ，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳｍａＩ，ＳａｌＩ）５Ｕを用いて、上記のアクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）のゲノムを断片化し、（Ａ）項の方法に従って精製した。

上記のシークエンスによって決定したアクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）由来ＧＡＰＤＨの部分塩基配列（９３６ｂｐ）を（Ａ）項の方法に従い精製し、ゲノムサザン用のプローブとした。
６種類の制限酵素でそれぞれ断片化させたＤＮＡ断片を電気泳動した後、プローブとハイブリッドを形成させた。プローブと鋳型ＤＮＡの複合体形成を、アルカリフォスファターゼを用いた蛍光検出により識別した。
その結果、ＡｃｃＩ，ＳｐｈＩで処理したＤＮＡサンプルにおいて、約３−ｋｂ，５．５−ｋｂのバンドを検出した。

上記のＡｃｃＩ，ＰｓｔＩで処理したアクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）由来ＤＮＡをＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅを用いて（Ｂ）項の方法に従ってｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎさせた。
形成された環状ＤＮＡを（Ｂ）項の方法に従って精製し、ＰＣＲの鋳型とした。これまでに決定しているアクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）由来ＧＡＰＤＨの部分塩基配列（９３６ｂｐ）をもとに、下記に示したプライマーを設計した。
Ｃｏｎｔｉｇ−Ｒ５’−CGCACTCGTCGATCTTCGAC−３（配列番号１２）
Ｃｏｎｔｉｇ−Ｆ５’−TGATGGACTCGTCATCGTAG−３’（配列番号１３）
（Ｂ）項の方法に従ってＰＣＲを行った。（Ｂ）項の方法に従って電気泳動した結果、ＳｐｈＩでカットしたゲノムサンプルから約４．５−ｋｂのバンドを得た。
得られたバンドを（Ｂ）項の方法に従って精製し、上記のｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙＶｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローニングした。
約４．５−ｋｂのＰＣＲ産物を挿入したプラスミド溶液を用いて、（Ｂ）項の方法に従ってエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、（Ｂ）項の方法に従って培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出、精製した。

該プラスミドを鋳型に、上記の方法に従ってシーケンスすることによりアクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）由来ＧＡＰＤＨ全長を含む１２９６ｂｐの塩基配列を取得し、ＧＡＰＤＨの全塩基配列を決定した。
上記の１２９６ｂｐの塩基配列をもとに、下記のプライマーを合成し、アクチノマイセスユーロパエウス（Ａ．ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）のゲノムを鋳型にしてＰＣＲを行った。
ｇｅｎｍ−Ｅｃｏ１；
５’−CTCTGAATTCTAAATCTATCGAAACGGTGT−３’（配列番号１４），
ｇｅｎｍ−Ｐｓｔ５；
５’−CTCTGACGTCTCTTCCTCTCGAAGTTCAAT−３’（配列番号１５）
ＰＣＲ産物を（Ｂ）項の方法に従って電気泳動した結果、１２４０−ｂｐのバンドを得た。

上記ＧＡＰＤＨ遺伝子を含む１．２ｋｂＰＣＲ産物１０μｌを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断したもの、及び上記（Ｂ）項で構築したコリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１２μｌを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断したものをそれぞれ、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

上記培地上で白色を呈する生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＣＲＢ１に由来する約４．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ＧＡＰＤＨ遺伝子に由来する長さ約１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を確認した（配列番号１６）。

以下（Ｂ）と同様の手法で、アクチノマイセスユーロパエウス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｅｕｒｏｐａｅｕｓ）ＡＴＣＣ７００３５３由来のＧＡＰＤＨ遺伝子含むプラスミドを得ることができ、該プラスミドをｐＣＲＡ８２０と命名とした（図２参照）。

〔比較例１〕
マーカーレス遺伝子破壊法によるＰＥＰＣ遺伝子破壊株の創製
（Ａ）マーカーレス遺伝子破壊用ベクターｐＣＲＡ７２５の構築
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子増幅用プライマー
ｓａｃＲ−ｓａｃＢ−Ｎ；
５’−CTCTCAATTGATAAAGCAGGCAAGACCTAA−３’（配列番号１７），
ｓａｃＲ−ｓａｃＢ−Ｃ；
５’−CTCTGATATCTTTATTTGTTAACTGTTAAT−３’（配列番号１８）
尚、前者はＭｕｎＩサイトが、後者はＥｃｏＲＶサイトがそれぞれ末端に付加されている。

鋳型ＤＮＡは、プラスミドｐＭＶ５（Ｖｅｒｔｅｓ，Ａ．Ａ．ｅｔａｌ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｏｎｏｆＩＳ３１８３１，ａｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１，７３９−７４６（１９９４））を用いた。
ＰＣＲは、実施例１（Ｂ）項と同様の条件で行った。
生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子を含む、約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を検出した。

次に、ＭｕｎＩとＥｃｏＲＶで切断した上記ｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子を含む１．６ｋｂのＰＣＲ産物１０μｌと、ＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断した約４．６ｋｂの発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）２μｌをそれぞれ、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、アンピリシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出することにより、ベクターｐＣＲＡ７２４を得た。
次に、ｐＣＲＡ７２４を鋳型ＤＮＡにして、ｔａｃプロモーターを付加したｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子（Ｐｔａｃ−ｓａｃＲ−ｓａｃＢ）を増幅した。

ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
Ｐｔａｃ−ｓａｃＲ−ｓａｃＢ増幅用プライマー
Ｐｔａｃ−ｓａｃＲ−ｓａｃＢ−Ｎ；
５’−CTCTGATATCCATAATTCGTGTCGCTCAAG−３’（配列番号１９）
ｓａｃＲ−ＳａｃＢ−Ｎ；
５’−CTCTGATATCTTTATTTGTTAACTGTTAAT−３’（配列番号２０），
尚、いずれのプライマーもＥｃｏＲＶサイトが末端に付加されている。
ＰＣＲは、実施例１（Ｂ）項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、Ｐｔａｃ−ｓａｃＲ−ＳａｃＢ遺伝子を含む、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を検出した。

次に、ＥｃｏＲＶで切断した上記Ｐｔａｃ−ｓａｃＲ−ＳａｃＢ遺伝子を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片５μｌと、ＳｔｕＩで切断した約２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造株式会社製）２μｌをそれぞれ、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。

得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
上記培地上の生育株を常法により液体培養後、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出することにより、マーカーレス遺伝子破壊用ベクターｐＣＲＡ７２５を得た。

（Ｂ）ＰＥＰＣ遺伝子のクローン化と遺伝子破壊用プラスミドの創製
実施例１（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲに際しては、ＰＥＰＣ遺伝子をクローン化するべく、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の全ゲノム解析結果（野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、ＫｏｓＰｅｔｅｒ、乾将行、湯川英明「ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０参照）を基に、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ＰＥＰＣ遺伝子増幅用プライマー
ＰＥＰＣ−Ｎ；５’−CTCTGTCGACATGACTGATTTTCTACGCGA−３’（配列番号２１），
ＰＥＰＣ−Ｃ；５’−CTCTGCATGCCTAGCCGGAGTTGCGCAGTG−３’（配列番号２２）
尚、前者はＳａｌＩサイトが、後者はＳｐｈＩサイトがそれぞれ末端に付加されている。

鋳型ＤＮＡは、実施例Ｉ（Ａ）項にて抽出したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株のゲノムＤＮＡを用いた。
ＰＣＲは、実施例１（Ｂ）項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ＰＥＰＣ遺伝子を含む約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を検出した。

次に、制限酵素ＳａｌＩとＳｐｈＩで切断した上記ＰＥＰＣ遺伝子を含む約２．８ｋｂのＤＮＡ断片１０μｌと、ＳａｌＩとＳｐｈＩで切断した上記（Ａ）項で構築した約４．４ｋｂのマーカーレス遺伝子破壊用ベクターｐＣＲＡ７２５２μｌをそれぞれ、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇ、ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｘｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）２００ｍｇ、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ１−ｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）１００ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

上記培地上で白色を呈する生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出後、制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＣＲＡ７２５約４．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ＰＥＰＣ遺伝子を含有する長さ約２．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
該ＰＥＰＣ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＡ７２５−ＰＥＰＣと命名とした。

次に、ＸｈｏＩで切断したＰＥＰＣ遺伝子マーカーレス破壊用ベクターｐＣＲＡ７２５−ＰＥＰＣ２μｌを、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

上記培地上で生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出後、制限酵素で切断し、ＰＥＰＣ遺伝子中央部約１．１ｋｂの欠失を確認した。この結果、プラスミドｐＣＲＡ７２５約４．４ｋｂのＤＮＡ断片に加え、△ＰＥＰＣ遺伝子断片を含有する長さ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が認められた。
該ＰＥＰＣ遺伝子マーカーレス破壊用プラスミドをｐＣＲＡ７２５−△ＰＥＰＣと命名とした。

（Ｃ）ＰＥＰＣ遺伝子破壊株の創製
ＰＥＰＣ遺伝子マーカーレス破壊用プラスミドｐＣＲＡ７２５−△ＰＥＰＣは、コリネバクテリウム属（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株を含む）内で複製不可能なプラスミドである。ｐＣＲＡ７２５−△ＰＥＰＣを、電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７．１９９０．およびＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５．１９９３）の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株へ導入し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地（１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：７ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４：０．５ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ_４・ｎＨ_２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス２ｇ，カザミノ酸７ｇ，グルコース２０ｇ，寒天１６ｇを蒸留水に１０００ｍｌ溶解（ｐＨ６．６）］に塗布した。

さらに、上記の培地で得られた株を、スクロース含有最少培地（１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：７ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４：０．５ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ_４・ｎＨ_２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，スクロース：１００ｇ，寒天１６ｇを蒸留水に１０００ｍｌ溶解］に塗付した。

プラスミドｐＣＲＡ７２５−△ＰＥＰＣが染色体上の野生型遺伝子と１点相同性組換えを起こした場合、ベクターｐＣＲＡ７２５上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、ｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子の発現によるスクロース致死性を示すのに対し、２点相同性組換えを起こした場合は、ベクターｐＣＲＡ７２５上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、ｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、目的とするＰＥＰＣ遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性、スクロース含有培地生育性を示す。

カナマイシン感受性、スクロース含有培地生育性を示した株を単離し、常法により液体培養し、回収菌体より実施例１（Ａ）項と同様の方法で染色体ＤＮＡを抽出し、シーケンサーＰｒｉｓｍ３１００ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）により、染色体上のＰＥＰＣ遺伝子の破壊を確認した。このようにして得られたＰＥＰＣ遺伝子破壊株をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号；ＦＥＲＭＰ−２０８７６）と命名した。
尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株におけるＰＥＰＣ活性の消失は、以下の方法により確認した。

コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株を、Ａ培地１００ｍｌ（１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：７ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４：０．５ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ_４・ｎＨ_２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス２ｇ，カザミノ酸７ｇ，グルコース２０ｇおよび蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）］）に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期後期まで３３℃で培養し、菌体を集めた。この菌体をトリス緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭＫＣｌ，２０ｍＭＭｇＣｌ_２，５ｍＭＭｎＳＯ_４，０．１ｍＭＥＤＴＡ，２ｍＭＤＴＴ）にて１回洗浄した。この洗浄菌体０．５ｇを同緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕機（ＡｓｔｒａｓｏｎｍｏｄｅｌＸＬ２０２０）を用いて菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００ｘｇ，４℃，３０分）し、上清を粗酵素液として得た。対照として野性型コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の粗酵素液も同様に調製し、以下の活性測定に供した。ＰＥＰＣの活性測定は、ホスホエノールピルビン酸を基質としたリンゴ酸生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ^＋に酸化される量を、３４０ｎｍの吸光度変化として測定する方法（Ｊｅｔｔｅｎ，Ｍ．，ａｎｄＳｉｎｓｋｅｙＡ．Ｊ．；ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１１１（１９９３），１８３−１８８．）により行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株におけるＰＥＰＣ活性は検出されなかったことより、ＰＥＰＣ遺伝子の破壊を確認した。

〔実施例２〕コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭＰ−１８９７６）のＧＡＰＤＨ活性強化株創製
プラスミドｐＣＲＢ２００を電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７．１９９０．及びＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５．１９９３）の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株へ導入した。

組換え菌体名；コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号；ＦＥＲＭＰ−２０８７５）
尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株のＧＡＰＤＨ活性は、ＧＡＰＤＨ活性測定法（Ｏｍｕｍａｓａｂａ，Ｃ．Ａ．，ＯｋａｉＮ．，ＩｎｕｉＭ．，ａｎｄＹｕｋａｗａＨ．；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｓｏｆｏｒｍｓｗｉｔｈｏｐｐｏｓｉｔｅ，ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ＪＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８（２００４），９１−１０３）により、野生株（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株）に比べて５．３倍の活性上昇が観察された。

同様にプラスミドｐＣＲＢ２００を上記方法にてコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株へ導入した。
組換え菌体名；コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号；ＦＥＲＭＰ−２０８７８）
尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株のＧＡＰＤＨ活性は、ＧＡＰＤＨ活性測定法（Ｏｍｕｍａｓａｂａ，Ｃ．Ａ．，ＯｋａｉＮ．，ＩｎｕｉＭ．，ａｎｄＹｕｋａｗａＨ．；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｓｏｆｏｒｍｓｗｉｔｈｏｐｐｏｓｉｔｅ，ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ＪＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８（２００４），９１−１０３）により、親株（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ））に比べて５．４倍の活性上昇が観察された。

同様にプラスミドｐＣＲＡ８２０を上記方法にてコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株へ導入した。
組み換え菌体名；コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号；ＦＥＲＭＰ−２０８７７）
尚、組み換え菌体名；コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株のＧＡＰＤＨ活性は、ＧＡＰＤＨ活性測定法（Ｏｍｕｍａｓａｂａ，Ｃ．Ａ．，ＯｋａｉＮ．，ＩｎｕｉＭ．，ａｎｄＹｕｋａｗａＨ．；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｓｏｆｏｒｍｓｗｉｔｈｏｐｐｏｓｉｔｅ，ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ＪＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８（２００４），９１−１０３）により、親株（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ））に比べて５．６倍の活性上昇が観察された。

〔実施例３〕組換え株の好気培養増殖及び乳酸生成反応実験
（Ａ）好気培養増殖
冷凍庫にて−８０℃で保存してあるコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（実施例２で創製）を、プレート培養用培地であるＡ寒天培地（組成：尿素２ｇ、酵母エキス２ｇ、カザミノ酸７ｇ、硫安７ｇ、第一リン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）０．５ｇ、第二リン酸カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ、硫酸鉄・７水和物６ｍｇ、硫酸マンガン・１水和物４．２ｍｇ、ビオチン０．２ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、グルコース４０ｇ、寒天１．５％（Ｗ／Ｖ）そして蒸留水１Ｌ）に塗布し、３３℃、１２ｈｒ暗所に静置した。

上記のプレート上で生育したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株を、試験管培養用培地であるＡ培地（組成：寒天が含まれていないことを除けば上記Ａ寒天培地と同一成分組成）１０ｍｌに白金耳でもって植菌し、３３℃、１２ｈｒ、２００ｒｐｍで振盪培養した。

このようにして生育したコリネ型細菌株を、好気培養増殖用培地であるＡ−Ｕ培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記Ａ培地と同一成分組成）の５００ｍｌが入っている容量１Ｌのジャーファーメンターに移し、３３℃、１０００ｒｐｍ、滅菌空気を１ｖｖｍで通気して、１３ｈｒ好気培養増殖を行なった。

この間、ＮＨ_４ＯＨ（５Ｎアンモニア水溶液）を使用してジャーファーメンター槽内のｐＨを７．５に常時維持した。
このようにして培養増殖された菌体は、遠心分離（４℃、１０分、５０００ｘＧ）によって回収し、次の還元条件下の乳酸生成反応に供した。

（Ｂ）還元条件下の乳酸生成反応
（Ａ）の好気培養増殖工程より回収された湿潤菌体１５０ｇ（ＤｒｙＣｅｌｌ換算約３０ｇ）を、コハク酸生成反応用溶液であるＢＴ−Ｕ培地（組成：硫安７ｇ、第一リン酸カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）０．５ｇ、第二リン酸カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ、硫酸鉄・７水和物６ｍｇ、硫酸マンガン・１水和物４．２ｍｇ、ビオチン０．２ｍｇ、チアミン０．２ｍｇ、グルコース３６ｇ、重炭酸ソーダ（ＮａＨＣＯ_３）１２．６ｇ、蒸留水１Ｌ）５００ｍｌの入っている容量１Ｌの反応槽に加え、３３℃にて緩やかに攪拌し、還元条件下のコハク酸生成反応を４８時間実施した。反応時の培地の酸化還元電位は、反応開始後直ちに急激に低下し、その後が約−４００ｍＶに維持してコハク酸生成反応が継続された。

この間、５Ｎ（規定）濃度のＮＨ_４ＯＨ（５Ｎアンモニア水溶液）水溶液を使用して反応槽内のｐＨを７．５に常時維持した。
反応槽内のグルコース濃度は逐次少量をサンプリングしてグルコースセンサー（王子計測機器株式会社製）による分析を行い、経時的な生成量の変動を調べた。
反応槽内の生成した乳酸量は逐次少量をサンプリングして液体クロマトグラフィーによる分析を行った。
その結果を図５に記す。（図５におけるグルコース消費速度および乳酸生成速度とは反応開始２４時間後、及び４８時間後におけるそれぞれの単位時間当たりの消費量および生成量である。）
２４時間後、及び４８時間後におけるコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株のグルコース消費速度は、それぞれ１．５８ｇ／ｌ／ｈ、及び１．３７ｇ／ｌ／ｈであった。
また、乳酸の生成速度は、それぞれ、２．０７ｇ／ｌ／ｈ、及び０．９７ｇ／ｌ／ｈであった。
これらの結果を図５に記す。

〔比較例２〕
実施例３で使用したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株に変えて、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株を用いる以外は、実施例３と同様の条件にて好気培養増殖および乳酸生成反応を行なった。
２４時間後、及び４８時間後におけるコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株のグルコースの消費速度は、それぞれ１．４４ｇ／ｌ／ｈ、及び１．２４ｇ／ｌ／ｈであった。
また、乳酸の生成速度は、それぞれ０．８１ｇ／ｌ／ｈ、及び０．３６ｇ／ｌ／ｈであった。
これらの結果を図５に記す。
実施例３および比較例２の実験結果はグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株にてＧＡＰＤＨを高発現することによって、グルコースの消費速度と有機化合物（乳酸）生成速度が増加することを示している。

〔実施例４〕
比較例２で使用したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株に変えて、それぞれ、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株（比較例１で創製）、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（実施例２で創製）、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株（実施例２で創製）を用いる以外は、実施例３と同様の条件にて好気培養増殖及び乳酸生成反応を行なった。それらの結果を図６に記す。

なお、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株は、野生株であるコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒと比較して、グルコースの消費速度に関しては劣るものの、より高い選択性で乳酸を生成することのできる株であることが知られているものである。（Ｉｎｕｉ，Ｍ．，ＭｕｒａｋａｍｉＳ．，ＯｋｉｎｏＳ．，ＫａｗａｇｕｃｈｉＨ．，ＶｅｒｔｅｓＡ．，ａｎｄＹｕｋａｗａＨ．；ＭｅｔａｂｏｌｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｄｕｒｉｎｇｌａｃｔａｔｅａｎｄｓｕｃｃｉｎａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｕｎｄｅｒｏｘｙｇｅｎ−ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ａｃｃｅｐｔｅｄ（２００４）））。

図６より明らかなように、２４時間後、及び４８時間後におけるコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株のグルコースの消費速度は、それぞれ１．０８ｇ／ｌ／ｈ、及び１．０６ｇ／ｌ／ｈであったが、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株のグルコース消費速度は、それぞれ１．９８ｇ／ｌ／ｈ、及び１．９６ｇ／ｌ／ｈであった。また、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株のグルコース消費速度は、それぞれ２．１２ｇ／ｌ／ｈ、及び１．８７ｇ／ｌ／ｈである。

乳酸生成速度に関しては、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株の２４時間後、及び４８時間後における乳酸の生成速度は、それぞれ０．１５ｇ／ｌ／ｈ、及び０．１５ｇ／ｌ／ｈであったが、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株の乳酸の生成速度は、それぞれ０．９９ｇ／ｌ／ｈ、及び０．９１ｇ／ｌ／ｈであった。また、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株の乳酸の生成速度は、それぞれ０．９１ｇ／ｌ／ｈ、及び１．０３ｇ／ｌ／ｈである。

これらの実験結果は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／△ＰＥＰＣ株に関しても、野生株と同様に、ＧＡＰＤＨ（異種、自身由来を問わず）の高発現によって、グルコースの消費速度、及び物質生産速度が増加することを示している。そして、ＧＡＰＤＨに関する以外の好気性コリネ型細菌の人為的変異株であっても、本発明の効果が生み出されていることも明らかである。

本発明に係る有機化合物の製造方法を使用することによって、糖類の代謝変換消費速度を向上させて高生産性かつ高効率に有用な有機化合物を製造することが可能である。

Claims

発現可能な制御配列下に、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡにより形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換体。
コリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲＦＥＲＭＰ−１８９７６、ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ１３２３２、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ１３６５５、ＡＴＣＣ１３７４５、ＡＴＣＣ１３７４６、ＡＴＣＣ１３７６１、ＡＴＣＣ１４０２０またはＡＴＣＣ３１８３１、および、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）ＮＢＲＣ１００３９５から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲＦＥＲＭＰ−１８９７６、アクチノマイセスユーロッパエウス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｅｕｒｏｐａｅｕｓ）ＡＴＣＣ７００３５３またはエシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２７３２５由来のものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の形質転換体。
形質転換されたコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７５）である請求項１に記載の形質転換体。
形質転換されたコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ｒ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７８）である請求項１に記載の形質転換体。
形質転換されたコリネバクテリウムグルタミカムが、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ △ＰＥＰＣ／Ａｃｔｉｎｏ−ｎＧＡＰ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＰ−２０８７７）である請求項１に記載の形質転換体。
請求項１〜６の何れかに記載の形質転換体を用いて、還元条件下の反応液中に糖類の代謝速度を向上させて有機化合物を蓄積し、該反応液より有機化合物を回収することを特徴とする有機化合物の製造方法。
還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００ミリボルト乃至−５００ミリボルトであることを特徴とする請求項７に記載の有機化合物の製造方法。
有機化合物がモノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオールおよびビタミンから選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項７又は８に記載の有機化合物の製造方法。
有機化合物が、酢酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、シスアコニット酸、イタコン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、シキミ酸、エタノール、１，３−プロパンジオール、グリセロール、ブタノール、１，４−ブタンジオール、キシリトール、ソルビトール、バリン、ロイシン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、イソロイシン、スレオニン、及びビタミンから選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項７又は８に記載の有機化合物の製造方法。