JP2011188787A5 - - Google Patents

Description

２．変異ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドの作製
ヘイケボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において３４４番目のアミノ酸残基であるロイシンがアラニンに変異し（３４４Ａ変異）、２８７番目のアミノ酸残基であるバリンがアラニンに変異し（２８７Ａ変異）、３２６番目のアミノ酸残基であるグリシンがセリンに変異し（Ｇ３２６Ｓ変異）、４６７番目のアミノ酸残基であるフェニルアラニンがイソロイシンに変異した（Ｆ４６７Ｉ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド（ｐＨＬｆＡ３Ｔ）を、以下のように作製した。

３．発光量向上変異ホタルルシフェラーゼの取得
実施例２記載の組換え体プラスミドｐＨＬｆ−ＢＬＵ−Ｙ−Ａ３Ｔを鋳型とし、変異ルシフェラーゼ遺伝子領域の上流、下流に設計したプライマー（配列番号１１および１２）を用いてエラープローンＰＣＲを行った。具体的には、これらのプライマーを終濃度０．２μＭにて用い、マンガンイオン濃度０．１ｍＭ、マグネシウムイオン濃度６．５ｍＭ下でＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を使用して、ｐＨＬｆ−ＢＬＵ−Ｙ−Ａ３Ｔ遺伝子領域に対するＰＣＲ増幅反応を行うことにより、種々の変異が導入されたホタルルシフェラーゼ遺伝子断片を得た。次いでこれらを、ＮｄｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理したのち、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＲＥＣＯ−ＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて電気泳動後のゲルからＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＨＬｆ−ＢＬＵ−Ｙ−Ａ３ＴをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ処理して得られたｐＨＬｆ−ＢＬＵ−Ｙ−Ａ３Ｔベクターに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてライゲーションさせた。ライゲーション終了後、上述の方法に準じて、変異が導入された組換え体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン社製）を形質転換し、変異体ライブラリーを作製した。この形質転換株をＬＢ−ａｍｐ寒天培地〔１％（ｗ／ｖ） バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ） 酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、および５０μｇ／ｍｌ アンピシリン、および１．４％（ｗ／ｖ）寒天〕に接種し、３７℃で平板培養した。

１２時間後、出現してきた各々のコロニーをＬＢ−ａｍｐ液体培地〔１％（ｗ／ｖ） バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ） 酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ、および５０μｇ／ｍｌ アンピシリン〕に接種し、９６穴プレートにて３７℃で静置培養した。１２〜１８時間培養した後、溶菌剤（バグバスター、ノバジェン社製）を用いて菌体を溶菌させ、次いで活性測定試薬〔５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，４ｍＭ ＡＴＰ，２ｍＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，１０ｍＭ ＭｇＳＯ４，ｐＨ７．８〕に供し、ルミノメーター（ベルトールド社製、ＬＢ９６Ｖ）を用いて各々の菌株に含まれるホタルルシフェラーゼの活性を確認した。上記の測定において、ホタルルシフェラーゼの活性すなわち発光量が変異導入前の親株と比較して１．２倍以上に増大したホタルルシフェラーゼを、発光量向上変異体の候補として選択した。

７．変異ホタルルシフェラーゼの熱安定性
実施例５で試験した各変異体の粗酵素液を、０．３Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，０．２％ ＢＳＡ，５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｐＨ７．８に１〜１０μｌ添加したものを、４７℃反応温度下にて９０分の熱処理に供した。そして、活性測定試薬〔５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，４ｍＭ ＡＴＰ，２ｍＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，１０ｍＭ ＭｇＳＯ４，ｐＨ７．８〕を用いて、熱処理前後のルシフェラーゼ粗酵素の活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、ルミノメーター（ベルトールド社製、ＬＢ９６Ｖ）を用いて１秒間の積算にて得られる発光量にて評価し、熱処理前の発光量に対する熱処理後の発光量値の比を、「活性残存率」として算出した。
その結果、ＢＬＵ−Ｙ Ａ３Ｔでは、活性残存率が３４．４％であったのに対し、ＢＬＵ−Ａ３Ｔ−１では３７．３％、Ｂ−Ａ３Ｔ−２では３８．３％、Ｂ−Ａ３Ｔ−３では５０．７％、さらにＢＬＵ−Ａ３Ｔ−４では５０．６％、ＢＬＵ−Ａ３Ｔ−５では５２．７％であった。すなわち、７５Ａ変異という発光量向上変異、または７５Ａ変異に加えて２９３Ｍ変異、３５１Ｖ変異、１７２Ｅ変異および２５９Ｉ変異、あるいは３５９Ｖ変異および４９０Ｑ変異の１以上を組み合わせた発光量向上変異を導入しても、３４４Ａ変異、２８７Ａ変異、３２６Ｓ変異、さらに４６７Ｉ変異の効果である高い熱安定性は良好に保持され、むしろ、さらに向上する傾向をも示すことが判明した。