JP2011079845A - 外因性アミノ酸および新規atp再生システムを用いたインビトロ高分子生合成の方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インビトロ蛋白質合成反応の、望ましくないアミノ酸又は枯渇に関わる酵素の作用を減じるまたは回避するために、前記酵素の代謝阻害剤または、操作された供給源生物が用いられる前記方法。ATP産生の恒常的システムとして、必要な高エネルギーリン酸結合が、例えば酸化反応との共役を通して合成されるように、インサイチューで合成され供給される前記方法。前記恒常的システムにおいて、エネルギー源は、高エネルギーリン酸結合の作製を触媒する酵素と、ATPを再生するために該高エネルギーリン酸結合を利用できる酵素を組み合わせて、供給される前記方法。
【選択図】なし
Description
タンパク質や他の生物学的高分子の方向付けされた合成は、生化学の大いなる達成点であると言える。組換えDNA技術の発展は、高度に精製されたコード配列の特徴付けと合成を可能にし、高度に精製されたタンパク質を生産するために使用され、該タンパク質は、天然の細胞では微量しか手に入らない。ポリペプチド鎖は、化学的あるいは生物学的方法で合成することができる。生物学的合成は、細胞環境内で行なわれ、またはタンパク質をインビトロで合成するためには、細胞抽出物およびコード配列が使われる。
Mullerら(1993) Science 259: 965-967(非特許文献12)は、チアミンおよびフラビン依存的酵素であるピルビン酸オキシダーゼの構造を述べている。Ryabovaら(1995) Anal. Biochem. 226: 184-186(非特許文献13)は、細菌の無細胞翻訳システムにおけるエネルギー源としてのアセチルリン酸の使用を述べている。ピルビン酸オキシダーゼの突然変異体は、米国特許第5,153,138号(特許文献1)で述べられ、ピルビン酸オキシダーゼはさらに米国特許4,666,832号(特許文献2)および米国特許第4,246,342号(特許文献3)で述べられている。
反応混合液に存在するアミノ酸の代謝の最適化により、および/あるいは再生可能なエネルギーシステムの利用により、増強されたインビトロタンパク質分子合成について、その成分と方法が提供されている。分解反応のためトリプトファン、システインそしてアルギニンを含むある種のアミノ酸の濃度は従来の反応において減少することが明らかとなった。アラニン、アスパラギン酸そしてアスパラギンを含む他のアミノ酸は、供給されるエネルギー源の消費の下、望ましくなく上昇する。これらの反応を触媒する酵素活性を下げることにより、合成の全体的な収率は改善される。
本発明が、ここで述べられている特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物の種や属、試薬に制限されるものでないことが理解されていなければならない。さらに本明細書において使用される用語は、ある特定の態様のみを述べる目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲にのみ制限され、本発明の範囲を制限することを意図したものでないことが理解されていなければならない。
本明細書で用いられているように、生物学的抽出物そして/あるいは厳密に定義された試薬を含む反応混合液での、例えばポリペプチドのような生物学的高分子の無細胞合成を指す。反応混合液は少なくとも、エネルギー源であるATP、例えばDNA、mRNAなどの高分子の産生のための鋳型、アミノ酸、ならびに、例えばリボソーム、tRNA、ポリメラーゼ、転写因子などの合成のために必要な補因子、酵素および他の試薬を含む。本発明の一つの態様としてエネルギー源は恒常的なエネルギー源である。例えば酢酸キナーゼやクレアチンキナーゼなどのような高エネルギー結合よりATPを再生することを触媒する酵素も含まれる。そのような酵素は翻訳のために用いられる抽出物に存在するか反応混合液に添加されるだろう。そのような合成反応系は当技術分野においてよく知られており、文献で報告されている。無細胞系の合成反応はバッチ法、連続フロー法、あるいは半連続フロー法で実行され、これは当技術分野において知られている。
本明細書で用いられているように、核酸の鋳型からポリペプチドの合成を触媒することができ、プレインキュベーションおよび活発なタンパク質合成の期間、特定のアミノ酸の濃度を維持するのに最適化された反応液をいう。混合液は望ましくない酵素反応を減少させる代謝阻害剤を含む場合もある。代わりに、あるいはそれと組み合わせて、増強された反応混合液は、アミノ酸の枯渇あるいは蓄積をもたらす望ましくない副反応に関わる酵素活性が減少するように、遺伝的にあるいは他の段階により操作されるであろう。特別な最適化条件が以下で与えられる。
トリプトファンとシステインの両方の濃度は、プレインキュベーションあるいはタンパク質合成中、急速に減少することが観察されている。これらのアミノ酸の最適化された反応混合液はトリプトファナーゼ活性を欠いている。大腸菌(E. coli)のトリプトファナーゼの遺伝子(tnaA)の配列は、Deely およびYanofsky (1981) J. Bact. 147: 787-796;Genbank accession no. 1790144; locus AE000448,大腸菌(E. coli)の全ゲノム配列accession AE000448において見出される。上で述べられたように、公開されている遺伝学的配列を用いて、修飾された細菌の細胞においてトリプトファナーゼは不活性化され得る。そうしない場合、アフィニティー精製あるいは従来の精製法により、酵素活性を反応混合液において枯渇することができる。
アルギニンも、少なくとも一部プトレッシンやスペルミジンへの変換のため、合成反応混合液より枯渇してしまう。これはプトレッシンおよびスペルミジン産生の二つの既知の経路のうちの一つである。この経路の最初の酵素はアルギニンデカルボキシラーゼである。この酵素はスペルミジンによりフィードバック阻害がかかることが知られている(Tabor およびTabor (1969) J. Biol. Chem. 244: 2286-2292)。よってアルギニンについて最適化された反応液は、この経路の代謝阻害剤を含むか、アルギニンデカルボキシラーゼ活性が減少するように修飾されているものである。
アスパラギン酸とアスパラギンはホスホエノールピルビン酸より形成される。ホスホエノールピルビン酸合成酵素(pps)はピルビン酸をPEPに変換し、合成されるPEP一分子について高エネルギーリン酸結合二当量(ATPがAMPに変換される)を消費する。よってピルビン酸がエネルギー源として用いられる場合、この酵素はピルビン酸とATPの両方を消費する可能性を有している。
アラニンは少なくとも部分的に、アラニングルタミン酸トランスアミナーゼによるピルビン酸のアラニンへの変換により蓄積されることが明らかとなった。この酵素はWangら(1987) J Bacteriol 169(12): 5610-4で述べられている。上で述べたように、この遺伝子はWangらにより述べられているように単離され、配列解析されて次に不活性化された。あるいはまた酵素活性が反応混合液より枯渇させられた。
本明細書では、遊離のリン酸と恒常的なエネルギー源より高エネルギーリン酸結合を再生する酵素をいう。ここで遊離のリン酸は、ATPの加水分解により再利用される。恒常的なエネルギー源がピルビン酸の場合、図11Bで示されるように、酵素はピルビン酸からアセチルリン酸の形成を触媒する。アセチルリン酸は、合成のエネルギー源として用いられ得るので、ピルビン酸オキシダーゼの反応は、タンパク質合成の過程で加水分解されるATPの再生の基礎となる。
本合成システムは独立してあるいはインビトロ反応との組み合わせで用いられる。本発明の方法は、インビトロ合成反応、特に反応に対してリン酸の蓄積が阻害作用を示す場合の、特にポリペプチド合成反応、あるいはATPを一次エネルギー源として利用する反応にその用途を見出す。
プレインキュベーション実験
最初の実施例は、エネルギー源とアミノ酸供給源の両方が枯渇している場合を示している。以下の実施例を通して、無細胞系のタンパク質合成のために、二つの標準的方法が用いられた。まず、ADPからATPを再生するために、ホスホエノールピルビン酸(PEP)とピルビン酸キナーゼを用いる。これはPEPシステムと呼ばれる。次にATPを再生するために、ピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼを用いる。これはピルビン酸システムと呼ばれる。
補給実験
他の一連の実験では、プレインキュベーションは用いられなかった。反応を長引かせるために、代わりに、合成反応混合液への添加が繰り返された。ピルビン酸の系におけるそのような実験の結果は図2で示されている。各反応の初期の容量は、15 μlである。反応が始まった後、一時間ごとに1.1 μlずつ添加する。対照1においては水が加えられる;対照2においては0.25 μlの2 Mピルビン酸と0.85 μlの水である。対照3においては0.85 μlのアミノ酸混合液と0.25 μlの水;そして「Pyr/AA」と標識された曲線に関しては0.25 μlの2 Mピルビン酸と0.8 μlのアミノ酸混合液である。曲線は、S30細胞抽出物中のミリグラムタンパク質当りのタンパク質合成収率を示している。明らかに、エネルギー源のみをさらに加えることは、タンパク質合成の効果的な持続には十分ではない。
アミノ酸の濃度変化の測定
驚くべきことに、いくつかのアミノ酸は増加し、一方他のアミノ酸は、新しいタンパク質に取り込まれる速度より、はるかに速く減少する。前実施例で指摘された観察事項は、タンパク質合成反応の間、個々のアミノ酸の濃度を測定することを喚起した。この場合、900 μlのピルビン酸で稼動される反応が開始された。1時間ごとに100 μlの試料をとり、冷水で1:1に希釈し、200 μlの冷10%TCA(トリクロロ酢酸)溶液を加えることで脱タンパク質化した。遠心分離の後、上清がBeckman 1600アミノ酸分析器で分析された。ほとんどのアミノ酸が濃度を変えなかった。しかし二つの非常に驚くべき結果が図3Aと図3Bに示されている。アラニンおよびアスパラギン酸/アスパラギンの両方で濃度が有意に上昇した。対照的にアルギニン、トリプトファンそしてシステインの濃度全てが有意に減少した。一番目の場合、データはピルビン酸がATPの再生というよりは、アミノ酸合成に用いられることを示唆した。これは反応の非効率性の潜在的に深刻な原因である。二番目の場合、反応を長引かせるためにアミノ酸の添加が必要である理由は、三つのアミノ酸が枯渇するからであることを示す。
アルギニン、システイン及びトリプトファンによる補充
三つのアミノ酸のみの補充は、全ての20個のアミノ酸の補充とほぼ同じ量の産物を産生した。アルギニン、システイン、そしてトリプトファンの枯渇がタンパク質の収率を制限するという仮説を試験するため、三つのうちの一つあるいは二つのみを繰り返して加える実験が実施された。三つ全てのアミノ酸の添加が最大の生産収率のために要求された。驚くべきことに図4のデータは、これらの三つのアミノ酸のみの添加で、20個の全てのアミノ酸の添加と同じ効果があることを指摘している。PEPシステムを用い15 μlの反応混合物より始めることで、実験が実施された。20分ごとに添加が行なわれた。対照1においては、1.15 μlの水が20分ごとに加えられた。対照2においては、0.3 μlの1 M PEPおよび0.85 μlの水;「PEP/全AAmix」では0.3 μlの1 M PEPと0.85 μlのアミノ酸混合液;そして「PEP/Arg, Cys, Trp」では、0.3 μlの1 M PEPおよび0.75 μlのそれぞれ10 mMアルギニン、10 mMシステインそして10 mMトリプトファン溶液が加えられた。
スペルミジンはアルギニンの枯渇を遅らせる
5 mMのスペルミジンはアルギニンの消失を遅延させる。このことはプトレッシンとスペルミジンの合成経路が、アルギニンの消失に関わっていることを示唆する。
シュウ酸はアスパラギン酸/アスパラギン産生の速度を遅らせ、タンパク質合成を増大させる
最も高い可能性としてPEPシンターゼ(pps)を阻害することにより、シュウ酸はアスパラギン酸/アスパラギンの蓄積の速度を遅らせ、タンパク質の収率を増加させることを示している。
有害な酵素の産生の回避
トリプトファナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼそしてホスホエノールピルビン酸シンセターゼのような活性の存在が、無細胞系の反応においてタンパク質の収率に重大な負の効果を持つことを、以前のデータは示している。これらの反応を制御するのに酵素阻害剤を用いるのは、一つの効果的な方法である。しかし、細胞抽出物に酵素が存在しない場合、阻害剤の費用を回避することができる。それらを回避する一つの方法は、これらの酵素の誘導を回避するように細胞を増殖させることである。一つの例は、グルコースを主要な炭素およびエネルギー源として細胞を増殖させることである。トリプトファナーゼの産生は、グルコース代謝の抑制により抑制されていることが知られている。さらに糖新生がもはや必要でないので、糖新生で主要に使われる酵素であるppsの誘導はより少ないだろう。もう一つの方法は、当技術分野において定義づけされたあるいは半ば定義づけされた培養液で、細胞を増殖させることである。しかしその培養液は、アルギニンを含んでいないものである。この場合、プトレッシンとスペルミジンがオルニチンより誘導され、アルギニンデカルボキシラーゼ活性は誘導されない。
ピルビン酸をエネルギー源として用いたタンパク質合成
無細胞系のタンパク質合成時のATPの再生の新しい取り組みが、無機リン酸の蓄積を回避することにより開発され、合成反応を引き延ばした。この取り組みは、大腸菌(Escherichia coli)に由来したバッチシステムで実際に示された。外因性のエネルギー源が高エネルギーリン酸結合を含んでいるような従来の方法と対照的に、新しい系は、反応混合液中に必要な高エネルギーリン酸結合を連続して生成させるように設計されている。これにより、タンパク質の合成時、放出されたリン酸が再利用される。最も高い可能性として遊離のマグネシウムの濃度を減少させることにより、もし蓄積され得るならば、リン酸はタンパク質合成を阻害する。
ホスホエノールピルビン酸(PEP)および大腸菌の総tRNA混合物はベーリンガー・マンハイム社(インジアナポリス、インジアナ州)から購入した。L-[U-14C]ロイシン(11.7 GBq/mmol)、L-[U-3H]ロイシン(4.14 TBq/mmol)および[5,6-3H]UTPは、アマシャムバイオテクノロジー社(アップサラ、スウェーデン)から購入した。その他の試薬は、シグマ社(セントルイス、ミズーリ州)から得た。T7 RNAポリメラーゼは、ダバンルーら(Davanloo、(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2035〜2039)の方法に従って、大腸菌株BL21(pAR1219)の培養から調製した。プラスミドpK7CATは、T7プロモーターとT7ターミネーターとのあいだに細菌CAT配列を含み(キガワら(Kigawa)、(1995)、Journal of Biomolecular NMR 6(2):129〜134)、これをCAT合成の鋳型として用いた。hLT合成に関して、プラスミドpK7LTは、pK7CATのCAT配列をヒトリンフォトキシン配列に置換することによって構築した。S30抽出物は、既に記述されているように(キムら(Kim)、(1996b)、上記)、大腸菌K12(株A19)から調製した。
PEPの非生産的分解。 当初32 mM PEPを含む標準的な反応混合物における無機リン酸の濃度を、タンパク質合成の反応期間の際に測定した。標準的な反応混合物(対照)と表示の成分(図12)を除いた反応混合物を調製して、インキュベートした。試料2μlを所定の時点で採取して、無機リン酸の濃度を、材料および方法において記述したように測定した。図12に示すように、反応混合物における無機リン酸の濃度は、インキュベート期間のあいだに直線的に増加した。
リン酸再利用によるエネルギー源としてのピルビン酸の利用
PEPの他に、リン酸クレアチニンとリン酸アセチルは、真核生物および原核生物起源の様々なインビトロタンパク質合成系におけるエネルギー源に用いて成功している。これらの基質はいずれも、本発明者らの系においてPEPと同程度に効率よくタンパク質合成を支持した。しかし、PEPと同様に、それらはS30抽出物とのインキュベーションのあいだに高エネルギーリン酸結合を失う。このように、ATPを再生するためにリン酸結合エネルギー源の直接使用に依存する限り、エネルギー源の非生産的な枯渇および無機リン酸の蓄積はほとんど不可避であるように思われる。バッチシステムにおいてより長い反応期間を得るために、本発明は、高エネルギーリン酸結合を有する化合物の高濃度を必要としない系、言い換えれば、インサイチューで高エネルギーリン酸ドナーと共にATPを再生することができる系を提供する。
インビトロタンパク質合成の反応条件下でこのスキームを調べるために、必要な化合物を反応混合物に異なる濃度で導入して、37℃で1時間インキュベートした。ピルビン酸、ピルビン酸オキシダーゼ、FAD、TPP、および無機リン酸の異なる濃度を含む標準的な反応混合物を調製して、1時間インキュベートした。[3H]ロイシン取り込みの最終的な量を材料と方法において記載のように測定した。図13A:6.7 U/mlピルビン酸オキシダーゼ、0.3 mM FAD、3.3 mM TPP、6.7 mM無機リン酸。図13B:32 mMピルビン酸、0.3 mM FAD、3.3 mM TPP、6.7 mM無機リン酸、6.7 mM無機リン酸。図13C:32 mMピルビン酸、6.7 U/mlピルビン酸オキシダーゼ、3.3 mM TPP、6.7 mM無機リン酸。図13D:32 mMピルビン酸、6.7 U/mlピルビン酸オキシダーゼ、0.3 mM FAD、6.7 mM無機リン酸。図13E:32 mMピルビン酸、6.7 U/mlピルビン酸オキシダーゼ、3.3 mM TPP、0.3 mM FAD。
新しい系の可能性をさらに調べるために、本発明者らは、ヒトリンフォトキシンの発現にこれを応用した。予想外にも、リンフォトキシンの発現レベルは、ピルビン酸系でははるかに高かった(PEPシステムと比較して150%、図17参照)。プラスミドpK7CATおよびpK7LTを用いて、標準的なPEP(白い棒)系、またはピルビン酸を用いる新しい系(黒い棒)においてCATおよびLTを生成した。ヒトリンフォトキシンのインビトロ発現に及ぼす無機リン酸およびマグネシウムイオンの作用を調べた後、このタンパク質の発現レベルは、無機リン酸およびマグネシウム濃度の変化に対してCATの場合より感受性があることが判明した(図18)。
エネルギー源の繰り返し付加によるタンパク質合成
合成反応は、PEPとアミノ酸の混合物を20分毎にPEPシステムに加えたこと、そしてピルビン酸とアミノ酸の混合物を1時間毎にピルビン酸系に加えたことを除いては、CATの合成に関して実施例8および実施例9に記載したように設定した。いずれの場合においても、当初用いた同じ濃度を毎回加えた。結果を表1および図9Aと9Bに示す。
Claims (25)
- 改善が、
アルギニン、トリプトファン及びシステイン、アスパラギン酸及びアスパラギン、ならびにアラニン代謝の少なくとも一つについて最適化された反応混合物においてポリペプチドを合成する段階
を含む、ポリペプチドの増強されたインビトロ合成法。 - 最適化された反応混合物が、ピルビン酸代謝の代謝阻害剤を含む、請求項1記載の方法。
- 阻害剤がシュウ酸を含む、請求項2記載の方法。
- 最適化された反応混合物がアルギニン分解の代謝阻害剤を含む、請求項1記載の方法。
- 阻害剤がスペルミジンを含む、請求項4記載の方法。
- 反応混合物が、酵素アルギニンデカルボキシラーゼが欠損した大腸菌(E.coli)抽出物を含む、請求項1記載の方法。
- 反応混合物が、酵素トリプトファナーゼが欠損した大腸菌抽出物を含む、請求項1記載の方法。
- 反応混合物が、酵素アラニングルタメートトランスアミナーゼが欠損した大腸菌抽出物を含む、請求項1記載の方法。
- 反応混合物が、酵素大腸菌ピルビン酸オキシダーゼが欠損した大腸菌抽出物を含む、請求項1記載の方法。
- 反応混合物が、酵素ホスホエノールピルビン酸シンセターゼが欠損した大腸菌抽出物を含む、請求項1記載の方法。
- 抽出物の大腸菌供給源において酵素が遺伝的に不活性化されている、請求項6〜10のいずれか一項記載の方法。
- 酵素がアフィニティ精製によって上記の抽出物から枯渇されている、請求項6〜10のいずれか一項記載の方法。
- ATPから加水分解された遊離リン酸が再利用されるような、反応混合物が合成反応に対する恒常的二次エネルギー源および再生酵素をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 合成反応が一次エネルギー源としてATPを含むような、
ATPから加水分解された遊離リン酸が再利用される、恒常的二次エネルギー源及び再生酵素を合成反応に加える段階
を含む、生体高分子の増強された合成法。 - 恒常的二次エネルギー源がピルビン酸であり、再生酵素がピルビン酸オキシダーゼである、請求項4記載の方法。
- ピルビン酸が少なくとも約1mMの初濃度で存在する、請求項15記載の方法。
- ピルビン酸が少なくとも約10 mMの初濃度で存在する、請求項15記載の方法。
- ピルビン酸オキシダーゼが少なくとも約0.5 U/mlの初濃度で存在する、請求項15記載の方法。
- 遊離リン酸の蓄積をもたらす二次エネルギー源が、約1 mM未満の初濃度で存在する、請求項15記載の方法。
- 生体高分子の合成がポリペプチドを産生するためのmRNAの翻訳を含む、請求項14記載の方法。
- 合成がDNA鋳型からのmRNAの転写もまた含む、請求項20記載の方法。
- 生体高分子の合成がバッチ(batch)反応として実施される、請求項14記載の方法。
- 生体高分子の合成が連続反応として実施される、請求項14記載の方法。
- 恒常的エネルギー源が合成の際に一定間隔で加えられる、請求項23記載の方法。
- ATPから加水分解された遊離リン酸が再利用される、恒常的二次エネルギー源および再生酵素を上記の反応に加える段階
を含む、ATPを必要とするインビトロ生物反応に燃料を供給する方法。
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