JP2011041483A

JP2011041483A - 核酸分解剤および核酸分解法

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Publication number: JP2011041483A
Application number: JP2009190141A
Authority: JP
Inventors: Shiro Kitano; 史郎北野; Tomohiko Hashiba; 智彦羽柴; Eiichi Tamiya; 栄一民谷
Original assignee: WINGTURF Co Ltd
Current assignee: WINGTURF Co Ltd
Priority date: 2009-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2011-03-03

Abstract

【課題】ターゲット遺伝子の検出作業に先だって、検査器具装置から核酸を完全に排除するために、液相以外の状態（非ウェット状態）で、核酸を有効に分解する能力を備えた核酸分解剤を提供する。
【解決手段】ヒドロキシメチルラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、水素ラジカル、ヒドロキシルラジカルを少なくとも含むラジカル種メタノール由来の気相物質（ＭＲガス）を含有し、核酸を非可逆的に分解する核酸分解剤。及び、ＭＲガスを用いて、核酸が存続可能な温度条件下において、非可逆的に核酸を分解し、不活化する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸を分解する非ウェット型の核酸分解剤およびそれを用いた核酸分解法に関する。

従来の核酸分解剤として、核酸分解酵素（nuclease）を含む洗浄液（核酸分解液）が知られている。この種の核酸分解剤は、処理対象物（典型的には、遺伝子を検出するための器具、装置）からそれに付着した不要な核酸を除去するのに利用することができる。

このような核酸分解液を用いた核酸分解法では、処理対象物を核酸分解液に漬けてそれに付着している核酸を水溶性の成分に分解する。しかる後、処理対象物を水洗いして、水溶性の成分を洗い流した後、乾燥させる。このため、この種の核酸分解法は、処理工程が複雑で、時間を要する。また、処理対象物の微細構造部に核酸分解液が十分に浸透しない可能性や、あるいは、一部に核酸分解液が残留することがある（特許文献１）。

特定の遺伝子（ターゲット遺伝子）を検出するための検査器具、装置が知られている。この種の器具、装置がターゲット遺伝子以外の遺伝子情報をもつ不要な核酸で汚染されていると、検査の際、ターゲット遺伝子の検出精度が低下し、あるいは、器具、装置に付着した核酸に含まれる遺伝子が誤って検出される可能性がある。このため、ターゲット遺伝子の検出作業に先だって、検査器具、装置から核酸を完全に排除することが望まれる。

特開２００５−２６１２６５号公報

したがって、当該技術分野において、液相以外の状態（非ウェット状態）で、核酸を有効に分解する能力を備えた核酸分解剤を提供するニーズがある。

さらに、この種の非ウェット型の核酸分解剤を用いて、簡便かつ有効に核酸を分解する核酸分解法を提供するニーズがある。

遺伝子検査装置、器具から、汚染物質である核酸を完全に除去できる核酸分解法（核酸除染法）を提供することが、当該技術分野において、強く要望されている。

本発明によれば、核酸を非可逆的に分解する核酸分解剤であって、当該核酸分解剤は、メタノール由来の気相物質（ＭＲガス）であり、ＭＲガスは、ヒドロキシメチルラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、水素ラジカル、ヒドロキシルラジカルを少なくとも含むラジカル種を含有する、核酸分解剤が提供される。

本願発明者は、ＭＲガスが核酸を非可逆的に分解する能力をもつことを見いだした。

本発明の核酸分解剤（ＭＲガス）は、従来技術の核酸分解液（液相物質）とは対照的に、気相物質である。そして、このＭＲガスを核酸分解剤として利用する、本発明の核酸分解法は、従来の核酸分解法に不可欠であった水処理、乾燥処理が、本質的に不要であり、簡単である。

さらに、本発明の一形態によれば、本発明の核酸分解剤（ＭＲガス）を使用して核酸を分解する核酸分解法であって、付着する核酸で汚染した可能性のある処理対象物を、核酸が存続可能な範囲内の加熱温度で加熱する加熱ステップと、前記加熱ステップと同時に、前記処理対象物をＭＲガスに所定時間、暴露する暴露ステップを有する核酸分解法（ＭＲガス暴露加熱同時方式）が提供される。

一般に、処理対象物に対する、本発明の核酸分解法（核酸除染法）の適用において、ＭＲガスによって処理対象物（特に、金属製の処理対象物、または処理対象物の金属部分）が腐食されることはなく、望ましい。すなわち、本発明の核酸分解法は、本質的に、非腐食性を有している。

好ましくは、前記加熱温度は、前記処理対象物を劣化無しに反復して加熱可能な範囲内である。

好ましくは、前記加熱温度は、５０℃〜７０℃である。また、前記所定時間（暴露同時加熱時間）は１時間以上であれば十分である。

本発明の別形態によれば、核酸分解剤（ＭＲガス）を使用して核酸を分解する核酸分解法であって、付着する核酸で汚染した可能性のある処理対象物を、核酸が存続可能な範囲内の加熱温度で所定時間、加熱する加熱ステップと、前記加熱ステップに先だって、前記処理対象物をＭＲガスに所定時間、暴露する暴露ステップを有する核酸分解法（ＭＲガス暴露後加熱方式）が提供される。

本発明の核酸分解剤（ＭＲガス）は気相物質である。ＭＲガスを使用する本発明の核酸分解法は、核酸分解液を使用する従来の核酸分解法と異なり、本質的に、水処理、乾燥処理が不要であり、実に簡便である。

本発明の気相核酸分解剤（ＭＲガス）を用いた核酸分解法を実施するのに用いられる核酸分解装置の外観斜視図である。図１の核酸分解装置の構成を模式的に示す斜視図である。図２のＭＲガス供給装置のブロック図である。図３のＭＲガス発生器の構成図である。ＭＲガスの反応経路とともに生成されるラジカル種を示す図である。量の異なる健全な鋳型ゲノムＤＮＡ（タイプ１：６９２３７）に対してリアルタイムＰＣＲを適用して得られた検量線のグラフである。量の異なる健全な鋳型ゲノムＤＮＡ（タイプ２：７０５７２-３）に対してリアルタイムＰＣＲを適用して得られた検量線のグラフである。特定の動作条件（条件１：加熱温度７０℃、暴露時間１時間）のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料１に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。条件１のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料２に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。条件１のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の対比として、ポジティブコントロール（ＭＲガスを暴露していない各量の鋳型ゲノムＤＮＡ試料）に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。他の特定条件（条件２：加熱温度５０℃、暴露時間１時間）のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料１に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。条件２のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料２に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。条件２のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の対比として、ポジティブコントロール（ＭＲガスを暴露していない各量の鋳型ゲノムＤＮＡ試料）に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。他の特定条件（条件３：加熱温度５０℃、暴露時間３時間）のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ２試料１に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。条件３のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ２試料２に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。条件３のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法の対比として、ポジティブコントロール（ＭＲガスを暴露していない各量の鋳型ゲノムＤＮＡ試料）に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、乾固した各種ゲノム試料に対して、核酸分解法を選択的に適用した後、リアルタイムＰＣＲ蛍光反応を実施、測定した結果を示す図である。ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解法の効果を示す図であり、溶液中の各種ゲノム試料に対して、核酸分解法を選択的に適用した後、リアルタイムＰＣＲ蛍光反応を実施、測定した結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

ＭＲガスはメタノール由来の気相物質であり、様々なラジカル種を含有し、非常に高い反応性を有する。本願発明者は、ＭＲガスが、核酸を非可逆的に分解する能力をもつ新規な核酸分解剤として有用であることを発見した。ＭＲガスは、メタノールを出発物質とし、これを触媒により反応を引き起こすことにより、生成される。ＭＲガスの反応経路の全容、詳細は特定されていない。

図５に、判明しているＭＲガスの反応経路（全反応経路の一部と考えられる）を示す。図示のように、ＭＲガスに含有されるラジカル種は、ヒドロキシルメチルラジカル[・ＣＨ_２] (hydroxymethyl radical)、ヒドロペルオキシラジカル[ＨＯ_２・](hydroperoxy radial)、水素ラジカル[Ｈ・](hydrogen radical)、ヒドロキシルラジカル[ＨＯ・](hydroxyl radical)を少なくとも含んでいる。

本発明の核酸分解法は、このＭＲガスを核酸分解剤として利用するものである。本発明の核酸分解法は、気相の核酸分解剤を使用することから、従来のような水洗処理、乾燥処理は、原理上、不要であり、簡便である。

一形態において、核酸分解法は、付着する核酸で汚染した可能性のある処理対象物を、核酸が存続可能な範囲内の加熱温度で加熱する加熱ステップと、前記加熱ステップと同時に、前記処理対象物をＭＲガスに所定時間、暴露する暴露ステップを有する（ＭＲガス暴露同時加熱方式）。加熱ステップは、処理対象物（特に、最大許容温度が低いプラスチック製処理対象物またはそのプラスチック部分）を劣化無しに反復して加熱可能な範囲内の加熱温度で、実施可能である。別の形態において、核酸分解法は、付着する核酸で汚染した可能性のある処理対象物を、核酸が存続可能な範囲内の加熱温度で所定時間、加熱する加熱ステップと、前記加熱ステップに先だって、前記処理対象物をＭＲガスに所定時間、暴露する暴露ステップを有する（ＭＲガス暴露後加熱方式）。本願発明者は、意図しない核酸で汚染された処理対象物（典型的には遺伝子検査装置、器具）を本発明の気相核酸分解剤「ＭＲガス」に暴露し、暴露と同時または暴露後に加熱することにより、核酸が非可逆的に分解され、処理対象物が事実上完全に除染されることを見いだした。

次に、本発明の気相核酸分解剤（ＭＲガス）による核酸分解法を実施するのに用いられる核酸分解装置について説明する。図１に、この種の核酸分解装置１０の外観を示し、図２に核酸分解装置１０の内部構成を模式的に示す。この核酸分解装置１０は、図示しない処理対象物を収容する、密閉構造のＮＰ処理室(nucleolytic process chamber)２０と、ＮＰ処理室２０内にＭＲガスを供給するＭＲガス供給装置３０を備えている。動作の際、処理対象物は、ＮＰ処理室２０に収納され、ＭＲガスによる核酸分解処理が適用される。

ＮＰ処理室２０は、耐試薬性、耐熱性、耐圧性を有する。ＮＰ処理室２０の前面には処理対象物を出し入れするための開口部２１が設けられている。開口部２１には扉２２が設けられており、扉２２を閉じるとＮＰ処理室２０内が気密に密閉される構造になっている。ＮＰ処理室２０のＭＲガス供給部３０側隔壁２０ａには、ＮＰ処理室２０内にＭＲガスを導入するための導入口２３及び排ガスを排出するための排出口２４が設けられている。導入口２３にはＭＲガス導入管３１の下流端が、排出口２４には排気管３２の上流端が、それぞれ接続されている。ＭＲガス導入管３１の上流端はＭＲガス供給装置３０のＭＲガス排出口３０ａに、排気管３２の下流端はＭＲガス供給装置３０の排ガス吸気口３０ｂに、それぞれ接続されている。

ＮＰ処理室２０の側壁内部には、ＮＰ処理室２０内の温度を調節するための電熱ヒータ（室温調節用ヒータ）２５が設けられている。また、ＮＰ処理室２０内には、処理対象物を載置するための図示しない台（棚）が設けられており、この台（棚）の上に、図示しない電熱ヒータ（対象加熱用ヒータ）が設置されていて、載置した処理対象物を加熱するのに使用される。各電熱ヒータには図示しない温度センサが設けられており、その温度センサの出力がＭＲガス供給装置３０内の制御器６０（図３参照）に入力される。

また、ＭＲガス供給装置３０の前面部には、核酸分解処理のモード（暴露同時加熱／暴露後加熱）の選択、処理時間（暴露時間／加熱時間）の設定、供給されるＭＲガスの濃度、温度Ｔ１、湿度、対象加熱用ヒータの温度Ｔ２、ＮＰ処理室２０の温度（室温調節用ヒータの温度Ｔ３）の設定等をするための各種操作子６１や状態表示器６２が設けられている。

図３にＭＲガス供給装置３０の構成を示す。ＭＲガス供給装置３０は、ＭＲガスを発生するＭＲガス発生器４０と、このＭＲガス発生器４０からのＭＲガスを密閉されたＮＰ処理室２０内に導入するガス搬送系５０と、制御器６０を備えている。制御器６０は、ＭＲガス発生器４０およびガス搬送系５０の動作を制御するとともに、ＮＰ処理室２０の各電熱ヒータへの通電を制御するように構成されている。

図４にＭＲガス発生器４０の構成を示す。ＭＲガス発生器４０内には、図示しないメタノール供給源から搬送管４１を通してメタノールが供給される気化室４２と、気化室４２を周囲から加熱する第１温度調節器４３と、気化室４２の上方に接続された略円筒状の触媒槽４４と、触媒槽４４を周囲から加熱する第２温度調節器４５とが設けられている。触媒槽４４には、粒状化した触媒４６が充填されている。触媒４６には、白金、銅、アルミニウム、または炭素、あるいはこれらの混合物が用いられる。

ＭＲガス発生器４０にてＭＲガスを発生させる際、まず気化室４２内に所定量のメタノールが供給される。気化室４２に供給されたメタノールは、加熱により気化されて触媒槽４４に供給される。触媒槽４４内では、メタノールガスに触媒が作用することにより、ＨＣＨＯ（ホルムアルデヒド）および各種ラジカル種（ヒドロキシルメチルラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、水素ラジカル、ヒドロキシルラジカル等）を含むＭＲガスが発生する（図５参照）。ＭＲガスの発生量は、気化室４２におけるメタノールの気化量、触媒槽４４に供給されるメタノールガスの量、触媒槽４４の加熱温度、等の動作条件に依存する。メタノールを出発物とし、触媒反応によって生成されるＭＲガスには、多様なラジカル種が含まれ、ラジカル種を介して核酸分解能が発現すると推測される。

図３において、ガス搬送系５０は、外気またはＭＲガス（ＭＲガスまたはＭＲガスと外気との混合気体）をＮＰ処理室２０内に送り込む吸気ポンプ（ガス搬送器）５１と、ＮＰ処理室２０内に供給するＭＲガスの湿度を調節する湿度調節器５２と、ＮＰ処理室２０内に供給するＭＲガスの温度を調節する温度調節器５３と、ＮＰ処理室２０内からの排ガスを処理（不活性化）するための排ガス処理器５４、処理済の排ガスを排出する排気ポンプ（ガス排出器）５５とを有する。排気ポンプ５５の排気口側通路と吸気ポンプ５１の吸気口側通路は、還流空気通路５６により接続されている。

ＭＲガス供給装置３０（図３）において、ＭＲガス発生器４０、吸気ポンプ５１、湿度調節器５２、温度調節器５３、排ガス処理器５４および排気ポンプ５５は、制御器６０により制御される。

制御器６０は、ＭＲガス発生器４０を制御することによりＭＲガスの濃度（発生量）を所定範囲の濃度に制御するとともに、湿度調節器５２と温度調節装置５３とを制御することによりＮＰ処理室２０内に供給するＭＲガスの温度および湿度を所定の範囲に制御する。さらに、制御器６０は、吸気ポンプ５１と排気ポンプ５５とを制御することによりＮＰ処理室２０内へのＭＲガスの搬送量およびＮＰ処理室２０内からの排ガスの排出量を制御する。また、制御器６０は、ＮＰ処理室２０内の温度センサの検出値に応じて、各電熱ヒータに通電する電流量を制御する。

次に、上記核酸分解装置１０を用いた核酸分解法の実施について説明する。

核酸分解法の実施に際し、処理対象物およびＮＰ処理室２０の取り扱いならびにＭＲガス供給装置３０の操作は専門の作業員が行う。まず、除染すべき処理対象物（たとえば、遺伝子検査装置）をＮＰ処理室２０内に収容し、扉２２を閉める。次に、核酸分解法として、ＭＲガス暴露同時加熱によるモード、またはＭＲガス暴露後加熱モードのいずれかをモード選択操作子により、選択する。

ＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解法を実施する場合は、パラメータ設定として、供給されるＭＲガスの温度Ｔ1、ガス湿度、処理対象物の加熱温度Ｔ２（対象物用ヒータの温度）、ＮＰ処理室２０の温度Ｔ３（室温調節用ヒータの温度）等を設定する。ガス温度Ｔ１は、たとえば、２０℃〜４０℃の範囲から選ばれ、ガス湿度は、たとえば、相対湿度８０〜９０％の範囲から選ばれ、加熱温度Ｔ２は、たとえば、５０℃〜７０℃の範囲から選ばれる。ＭＲガス温度Ｔ１、加熱温度Ｔ２、処理対象物の最高許容温度Ｔ０について、Ｔ１＜Ｔ２＜Ｔ０の関係が成り立つ。また、ＮＰ処理室温度Ｔ３は加熱温度Ｔ２より低く設定される。つぎに、核酸分解装置１０を起動する。これにより、対象物用ヒータ及び室温調節用ヒータへの通電が開始され、対象物用ヒータの温度が設定加熱温度Ｔ２になったら、ＮＰ処理室２０内にＭＲガスが導入され、ＮＰ処理室２０内に収容されている処理対象物が、ＭＲ暴露下で加熱され、核酸の除染が行なわれる。その際、ＮＰ処理室２０内に供給されるＭＲガスの温度は設定温度Ｔ１に制御される。また、供給されるＭＲガスの湿度は設定された湿度Ｈ１に制御される。なお、この例では、室温調節用ヒータ２５を作動させてＭＲガス供給前のＮＰ処理室２０内の温度調節を行っているが、外気温が３０℃程度であれば、ＮＰ処理室２０内の温度調節を行わずにＭＲガスの供給を開始してもよい。

ＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の実施において、ＭＲガスの供給を開始してから設定された処理時間ＨＲ１（暴露同時加熱時間）が経過すると、ＭＲガスの供給が停止されるとともに、各電熱ヒータへの通電が遮断される。このとき、処理対象物の表面に付着していた核酸は、この核酸分解処理により、十分に分解され、処理対象物は、除染されている。つづいて、排気運転が開始される。排気運転は、ＭＲガス発生器４０を停止させた状態で、吸気ポンプ５１および排気ポンプ５５を運転することにより行う。これにより、ＮＰ処理室２０内からの排ガスが排ガス処理器５４で処理される。処理された排ガスは、還流空気通路５６を介して吸気ポンプ５１に供給され、再度、ＮＰ処理室２０内に供給することによりＮＰ処理室２０内の空気を循環させる。この処理をＮＰ処理室２０内のＭＲガス濃度が所定の値より低くなるまで実施する。その後、ＮＰ処理室２０内に外気を取り込む換気運転が行われる。

以上の一連の工程を終えた後、作業者は、ＮＰ処理室２０内から核酸が除染された処理対象物を取り出す。

一方、ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解法を実施する場合は、加熱ステップに先立って、常温下で、処理対象物をＭＲガスに暴露させる。たとえば、ＮＰ処理室２０内が常温である温度（２０℃〜４０℃の範囲から選ばれる）状態で、ＮＰ処理室２０内にＭＲガスが供給され、ＮＰ処理室２０内に収容されている処理対象物にＭＲガスを暴露させる。その際、処理室２０内に供給されるＭＲガスの温度も処理室２０内の温度とほぼ同じ温度Ｔ１に制御される。また、供給されるＭＲガスの湿度は設定された湿度Ｈ１に制御される。

ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解法の実施において、ＭＲガスの供給を開始してから所定時間（ＭＲガス暴露時間ＨＲ1）が経過すると、ＭＲガスの供給が停止される。それと同時に、加熱ステップに移行するために、電熱ヒータ２５および対象物用ヒータへの通電量が増加され、対象物用ヒータが加熱温度Ｔ２になるまで加熱される。これにより、加熱ステップのモードになる。この間、ＮＰ処理室２０内にはＭＲガスが残存している。

所定時間（加熱時間ＨＲ２）の間、加熱ステップを実行した後、各電熱ヒータ（電熱ヒータ２５および対象物用ヒータを含む）への通電が停止される。つづいて排気運転が開始される。すなわち、ＭＲガス発生器４０を停止させた状態で、吸気ポンプ５１および排気ポンプ５５が運転される。そして、ＮＰ処理室２０内からの排ガスを排ガス処理器５４により処理する。排ガス処理器５４により処理された排ガスは、還流空気通路５６を介して吸気ポンプ５１に供給され、再度、ＮＰ処理室２０内に供給することによりＮＰ処理室２０内の空気を循環させる。この処理をＮＰ処理室２０内のＭＲガス濃度が所定の値より低くなるまで実施する。その後、ＮＰ処理室２０内に外気を取り込む換気運転が行われる。その後は、ＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理と同様である。

なお、本発明の核酸分解法によれば、ＨＣＨＯの換算濃度が２００〜４００ｐｐｍあるいはそれ以下の極めて低濃度のＭＲガスを使用することが可能であるので、ＨＣＨＯの残留が問題となることはなく安全かつ確実に核酸分解処理を実施できる。

なお、上記実施形態ではＭＲガス供給装置３０のガス搬送系５０が二つのポンプ５１、５５を備えた構成例について説明したが、ポンプを一つだけ備え、そのポンプによって処理容器内へのガスの供給および排出がなされるように構成してもよい。また、ＭＲガスをＮＰ処理室２０に循環させるガス循環ループを設けてもよい。

以下に、本発明の核酸分解処理方法の実施例を列挙する。まず、ＭＲガス暴露同時加熱方式の実施例を説明し、後で、ＭＲガス暴露後加熱方式の実施例を説明する。

以下、ＭＲガス暴露同時加熱方式の実施例について説明する。ここでは、ヒト遺伝子の分解処理に適用した場合を例示する。
［分解対象としたヒトゲノムＤＮＡ］
・６９２３７(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)：１５０ｎｇ、１５ｎｇ、１．５ｎｇ、０．１５ｎｇに調製し、９６穴マイクロプレート（96-well microtiter plate）の穴（ウェル）底に乾固させた。
・７０５７２-３(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)：１８０ｎｇ、１８ｎｇ、１．８ｎｇ、０．１８ｎｇに調製し、９６穴マイクロプレートの穴（ウェル）底に乾固させた。

[ＭＲガス暴露及び加熱条件］
・暴露装置：ＭＲガスシステム（(株)バイオメディア社製）
・暴露時間：１時間または３時間
・ＭＲガス：触媒温度４５０℃に達した際のＭＲガス濃度(ホルムアルデヒド濃度換算で1,500ppm)、ガスレベル２Ａ
・加熱構造：９６穴のアルミブロックにヒートブロック（対象加熱用ヒータ）を埋め込み、アルミブロックごと加熱する。暴露時に９６穴マイクロプレートをアルミブロックに嵌め合わせた。
・同時加熱温度：５０℃または７０℃(アルミブロックの温度を熱電対により追跡)

［実験］
条件１：暴露同時加熱温度７０℃、暴露時間1時間、ヒトゲノムＤＮＡは６９２３７(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)
条件２：暴露同時加熱温度５０℃、暴露時間1時間、ヒトゲノムＤＮＡは６９２３７(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)
条件３：暴露同時加熱温度６０℃、暴露時間3時間、ヒトゲノムＤＮＡは７０５７２-３(Ｎｏｖａｇｅｎ社製)

［ＰＣＲ］
ＰＣＲ自動測定装置（TaqMan(R) RNase P Detection Reagents(FAM(TM))を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施し、同じ反応条件で、サイクル毎に９６穴マイクロプレートのウェル内ゲノム量を蛍光反応強度により検査した。希釈系列上の各鋳型量のＤＮＡ試料から検出したＣｔ値から検量線(standard curve)を作成した。ＰＣＲで増幅生成さアンプリコン(amplicon)のサイズは１００ｂｐ以下である。なお、Ｃｔ値とは、検出閾値の蛍光強度（生成物であるアンプリコンの生成量を表す）が検出されたときのＰＣＲサイクル数(threshold cycle)を指す。

ゲノムＤＮＡタイプ１（６９２３７）及びゲノムＤＮＡタイプ２（７０５７２-３）に対する、リアルタイムＰＣＲの定量範囲を、それぞれ、図６、図７に示すように、確認した。鋳型量について、ゲノムＤＮＡタイプ１は、１５０ｎｇ、１５ｎｇ、１．５ｎｇ、０．１５ｎｇ、０．０１５ｎｇの対数希釈試料を作製し、ゲノムＤＮＡタイプ２は、１８０ｎｇ、１８ｎｇ、１．８ｎｇ、０．１８ｎｇ、０．０１ｎｇの対数希釈試料を作製した。なお、検量線の信頼値はそれぞれ９９．８％（図６）、９９．９％（図７）と高い一致度を示した。
前記ＰＣＲ自動測定装置を使用した反応系ではゲノムＤＮＡタイプ１は、最小１５ｐｇまで、ゲノムＤＮＡタイプ２は、最小１８ｐｇまで定量可能である。ゲノム１５ｐｇのコピー数は２．３コピー、１８ｐｇのコピー数は２．７コピーであるので検出感度としては十分であると考えられる。なお、コピー数は次式により計算される。
コピー数＝（ゲノム重量×６×１０^２３）/（３×１０^９×２×３３０×２）

このＰＣＲ反応系を用いてＭＲガス暴露同時加熱処理後の残存ゲノムＤＮＡ量を定量し、分解効果の指標とした。

［条件１：暴露同時加熱温度７０℃、暴露時間１時間］
条件１で核酸分解処理したゲノムＤＮＡ（タイプ１）に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応を図８から図１０に示す。詳細には、図８は、条件１のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料１に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。同様に、図９は、条件１のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料２に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。図１０は、条件１のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の対比（ポジティブコントロール）として、ＭＲガスを暴露していない各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。図８から図１０の各図において、鋳型ゲノムＤＮＡの分量は、（ａ）が１５０ｎｇ、（ｂ）が１５ｎｇ、（ｃ）が１．５ｎｇ、（ｄ）が０．１５ｎｇ、（ｅ）がゼロである。各グラフの縦軸は蛍光強度（アンプリコン生成量を表す）、横軸は実施したＰＣＲサイクル数である。驚くべきことに、ＭＲガスに暴露され加熱されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ蛍光反応は、分量ゼロのゲノムＤＮＡ試料のＰＣＲ蛍光反応とほぼ同様になっている。これらの結果から、９９．９％を超えて（１５０ｎｇのゲノムＤＮＡ試料の場合で、約９９．９％の分解率）、ほとんどのゲノムＤＮＡは、条件１の暴露同時加熱処理により、分解されたことが確認された。

［条件２：暴露同時加熱温度５０℃、暴露時間１時間］
条件２で核酸分解処理したゲノムＤＮＡ（タイプ１）に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応を図１１から図１３に示す。詳細には、図１１は、条件２のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料１に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。同様に、図１２は、条件２のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料２に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。図１３は、条件１のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の対比（ポジティブコントロール）として、ＭＲガスを暴露していない各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。図１１から図１３の各図において、鋳型ゲノムＤＮＡの分量は、前と同様に、（ａ）が１５０ｎｇ、（ｂ）が１５ｎｇ、（ｃ）が１．５ｎｇ、（ｄ）が０．１５ｎｇ、（ｅ）がゼロである。同様に、各グラフの縦軸は蛍光の相対強度、横軸はＰＣＲサイクル数である。条件２では、加熱温度を条件１の７０℃から５０℃に下げたにもかかわらず、図１１および図１２に示すように、顕著なＤＮＡ分解作用が観測された。図示のように、ＰＣＲサイクル数が３０以下において、ＰＣＲ生成物であるアンプリコンは、実質、増幅していないことが読みとれる。９９％以上のゲノムＤＮＡが加熱温度５０℃、暴露加熱同時処理時間１時間の核酸分解処理により、分解したことが判明した。

［条件３：暴露同時加熱温度５０℃、暴露時間３時間］
条件１、２から、ＭＲガスの核酸分解能（またはＰＣＲ阻害効果）について、試料のゲノムＤＮＡ量との相関、ＭＲガス暴露された対象の加熱温度との相関が確認されたので条件３の実験では暴露時間を過剰にして、ゲノムＤＮＡの分解効果を検証した。なお、鋳型ゲノムＤＮＡ試料としては、タイプ２（７０５７２-３）を使用した。条件３で核酸分解処理したゲノムＤＮＡ（タイプ２）に発生したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応を図１４から図１６に示す。詳細には、図１４は、条件３のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の効果を示す図であり、この核酸分解処理を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ２試料１に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。同様に、図１５は、条件３のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の効果を示す図であり、この核酸分解法を適用した各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ１試料２に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。図１６は、条件３のＭＲガス暴露同時加熱による核酸分解処理の対比（ポジティブコントロール）として、ＭＲガスを暴露していない各量の鋳型ゲノムＤＮＡタイプ２試料に対して実施したリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果を示す図である。図１４から図１６の各図において、鋳型ゲノムＤＮＡ（タイプ２）の分量は、（ａ）が１８０ｎｇ、（ｂ）が１８ｎｇ、（ｃ）が１．８ｎｇ、（ｄ）が０．１８ｎｇ、（ｅ）がゼロである。各グラフの縦軸は蛍光強度（アンプリコン生成量を表す）、横軸は実施したＰＣＲサイクル数である。驚くべきことに、３時間にわたり、ＭＲガスに暴露され加熱（温度５０℃）されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ蛍光反応は、分量ゼロのゲノムＤＮＡ試料のＰＣＲ蛍光反応（アンプリコン生成量はゼロと考えられる）と差異が観測されなかった。この結果から、事実上１００％のゲノムＤＮＡが、条件３の暴露同時加熱処理により、分解されたと認められる。

［ＭＲガス核酸分解能］
なお、実施例で述べたＰＣＲのアンプリコンサイズは１００ｂｐ以下であり、核酸分解処理後のヒトゲノムのＰＣＲ反応が阻害されているという観察結果から、核酸分解処理により、ヒトゲノムＤＮＡは、１００ｂｐ以下のレベルに裁断、もしくはＰＣＲで増幅できないように不活化していることが示唆される。このことはＰＣＲを用いるヒト遺伝子検出装置の品質を保証する上で非常に有意である。

以下、ＭＲガス暴露後加熱方式による核酸分解法の実施例を説明する。

[試験サンプル調製]
試験対象の核酸としてヒトゲノムＤＮＡ（TaqMan(R) Β-actin Control Reagents, Part No.401846）を使用した。このヒトゲノムＤＮＡをそれぞれ１５ｎｇ、１．５ｎｇ、０．１５ｎｇ分、ＰＣＲチューブ内の１．５μｌ溶液に添加し、その後、ホットプレートにて乾固させたものを試料（乾燥試料）として調製した。同様に、ＰＣＲチューブにセットされ、同量のヒトゲノムＤＮＡを含有する溶液のものも試料（溶液試料）として調製した。

[ＭＲガス暴露後加熱]
小型ＭＲガス発生装置のガス室に、試料の入った各ＰＣＲチューブからキャップを取り外して、セットし、各試料にＭＲガスを１８０分間、暴露した。ＭＲガス暴露は、温度４１．９〜４４．２℃、湿度７３．６〜８７．５％ＲＨの条件下で実施した。また、ＭＲガス暴露中、ファンにてガス室内のガス循環を行った。暴露後、ＰＣＲチューブのキャップを閉じた状態で恒温槽にて９０℃、３０分間の加熱処理を行った。

[ＰＣＲ実施]
ＭＲガスを暴露後加熱処理した各試料にリアルタイムＰＣＲを実施して、ＭＲガス暴露後加熱処理によるゲノムＤＮＡの不活効果を確認した。詳細には、暴露後加熱処理した試料のＰＣＲチューブ内に、滅菌蒸留水、PCR buffer、3.5mMのMgCl₂、200μMのdNTPs、300nMのΒ-actin forward primer、300nMのΒ-actin reverse primer、200nMのTaqMan (TR) Β-actin probe、0.025U/μｌのTaq DNA polymeraseを添加して全量25μｌのリアルタイムＰＣＲ反応溶液を調製した。その後、Cepheid社製Smart Cycler (TR) Systemにより、最初に９５℃６００秒（酸素活性化）を１サイクル行った後、９５℃１５秒（熱変性）、６０℃６０秒（アニーリング／伸長）を１サイクルとして５０サイクル行うことによってＰＣＲ蛍光反応を測定した。なお、ＰＣＲ反応生成物であるアンプリコンＤＮＡのサイズは２９５ｂｐである。

[試験結果]
試験結果を図１７および図１８に示す。図１７は、乾固したヒトゲノムＤＮＡ試料に対して、ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解処理を選択的に適用した後、リアルタイムＰＣＲ蛍光反応を実施、測定した結果を示す。一方、図１８は、溶液中のヒトゲノムＤＮＡ試料に対して、ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解法を選択的に適用した後、リアルタイムＰＣＲ蛍光反応を実施、測定した結果を示したものである。

図１７、図１８において、「sample」は、ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解処理を適用したヒトゲノムＤＮＡの試料を表している。一方、「control」は、対比として、ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解法を適用しなかった（ＭＲガスを暴露しなかった）ヒトゲノムＤＮＡ試料を表している。また、「negative control」は、対比として、ヒトゲノムＤＮＡ試料がないことを表している。「(s)」は、試料が乾固した（固体）試料であることを表し、「(l)」は、試料が溶液（液体）試料であることを表している。たとえば、「sample 1.5ng (s)」が指すサイクル／蛍光強度のプロット（図１７）は、ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解処理を適用した１．５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡの乾固試料から得られたリアルタイムＰＣＲ蛍光反応の測定結果である。

図１７のリアルタイムＰＣＲ蛍光反応測定グラフに示すように、ヒトゲノムＤＮＡを乾固させた状態で核酸分解処理を適用した試料については、量が１５ｎｇと１．５ｎｇの試料がサイクル数３０以上で、若干の蛍光強度（ＰＣＲ反応生成物の量を表す）の増加を呈したものの、０．１５ｎｇの処理適用乾固試料では、ＰＣＲ反応の増幅は認められなかった。

また、図１８のリアルタイムＰＣＲ蛍光反応測定グラフに示すように、ヒトゲノムＤＮＡを溶液中においた状態で核酸分解処理を適用した試料については、１５ｎｇ、１．５ｎｇ、０．１５ｎｇのいずれも、ＰＣＲ蛍光反応の増加を示さず、鋳型無しのＰＣＲ蛍光反応グラフ（negative controlのグラフ）と同様になった。

このようにして、ＭＲガス暴露後加熱による核酸分解処理によっても、核酸が非可逆的に分解されることが確認された。

多様なラジカル種を含有するＭＲガスを気相の核酸分解剤として使用する本発明の核酸分解法は、核酸を気相雰囲気下で効果的に分解できるので、遺伝子を検出するための各種デバイス（バイオチップ、マイクロ流体デバイス、等）の品質保証に有効に利用できる。また、この種のデバイスの使用後における核酸分解処理やＰＣＲ産物の分解処理にも利用できる。以上で、実施形態の説明を終えるが、本発明の趣旨から逸脱すること無しに、種々の変更が当業者には自明である。したがって、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によってのみ規定されるべきである。

１０核酸分解装置
２０ＮＰ処理室
３０ＭＲガス供給装置
４０ＭＲガス発生器
４２気化室
４３触媒槽
５０ガス搬送系
５１吸気ポンプ（ＭＲガス搬送器）
５２湿度調節器
５３温度調節器
５４排ガス処理器
５５排気ポンプ（ガス排出器）
６０制御器

Claims

核酸を非可逆的に分解する核酸分解剤であって、当該核酸分解剤は、メタノール由来の気相物質（ＭＲガス）であり、ＭＲガスは、ヒドロキシメチルラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、水素ラジカル、ヒドロキシルラジカルを少なくとも含むラジカル種を含有する、核酸分解剤。
請求項１に記載の核酸分解剤（ＭＲガス）を使用して核酸を分解する核酸分解法であって、
付着する核酸で汚染した可能性のある処理対象物を、核酸が存続可能な範囲内の加熱温度で加熱する加熱ステップと、
前記加熱ステップと同時に、前記処理対象物を前記ＭＲガスに所定時間、暴露する暴露ステップを
有する核酸分解法。
前記加熱温度は、前記処理対象物を劣化無しに反復して加熱可能な範囲内である、請求項２に記載の核酸分解法。
前記加熱温度は５０℃〜７０℃である、請求項２に記載の核酸分解法。
前記所定時間は１時間以上である、請求項２に記載の核酸分解法。
請求項１に記載の核酸分解剤（ＭＲガス）を使用して核酸を分解する核酸分解法であって、
付着する核酸で汚染した可能性のある処理対象物を、核酸が存続可能な範囲内の加熱温度で所定時間、加熱する加熱ステップと、
前記加熱ステップに先だって、前記処理対象物を前記ＭＲガスに所定時間、暴露する暴露ステップを
有する核酸分解法。