CN112812901A - 一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂及应用 - Google Patents

一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂及应用，该试剂由过氧化物、金属盐、稳定剂、酸度调节剂、防冻剂和试剂用水组成，所述过氧化物的浓度为50‑400mM，所述金属盐的浓度为50‑400mM，所述稳定剂的浓度为0.01‑5mM，所述防冻剂的浓度为20wt%‑34wt%，所述试剂的pH值为2‑4。该试剂不仅可以在常温下高效发挥作用，还可以应用在低温环境，能够快速清除被核酸及被病毒衣壳蛋白包裹核酸所污染的环境，而且可以在试剂喷施后，瞬时消解污染，试剂残余物待风干后无毒性，人员无需等待，即刻投入实验；使用安全无毒、不易燃、不易爆，有效避免对操作者的伤害，污染清除率高，应用范围广阔。

Description

一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体来说，涉及一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂及应用。
背景技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），即PCR反应，是分子生物学中用于放大扩增特定DNA片段的常用技术。该技术在医学、传染性疾病诊断、法医以及生物科学等方面有极其广泛的应用。
通常在临床端有很多治疗的选择以及对于疗效的确定，是基于对病人组织或细胞的DNA和RNA分析。因此只有确保操作环境中没有核酸污染这个前提，才可以保证临床医生得到正确的检测结果。
PCR反应最突出的优点是灵敏度高，最大的特点就是能将原本极微量的DNA，在反应结束后，呈现指数幅度的放大。以小片段的核酸（引物或寡核苷酸）为例，初始仅用几份目标序列，在经过30多个循环的扩增，就可以获得1000多万份的核酸序列。PCR的高灵敏度使操作者能够从微量样本中提取和扩增DNA，从而获得目标DNA的信息。虽然这种水平的灵敏度对实验室有利，但如果不小心被实验室环境中“残余”的其它DNA模板和扩增子（先前扩增获得的PCR产物）所污染，那么这一微量的污染就会在PCR反应中以指数方式放大，从而产生错误或不准确的结果，这些由污染引发的错误很可能导致非目标模板被扩增，即产生假阳性结果，给临床诊断带来干扰。
环境中的核酸污染主要存在于检测场所内表面，仪器、器具、物品的外表面，以及气溶胶和管道内。为了消除实验室里这些“残余”的其它DNA模板和扩增子，很多实验室采用酒精和/或次氯酸钠的擦拭、湿热或干热消杀、紫外线辐照、UDG/UNG酶相结合的方式。
然而这些操作存在有各种缺陷：
70%的酒精和/或2‰的次氯酸钠，对于操作台面、仪器的内外表面的擦拭，主要是进行消毒灭菌，无法有效降解核酸(实施例中有实验数据)，对于DNA模板和扩增子只能起到“稀释”的作用。尤其是在低温环境下，常规消杀剂对于0℃以下环境的效果很差；
湿热或干热消杀，主要是依靠高压蒸汽灭菌手段对离心管、枪头、容器内外表面进行消毒灭菌，不适用于降解核酸；
紫外线辐照，主要是利用波长在200~275nm的短波紫外线对场所长时间进行照射，消杀病菌，对核酸的降解能力集中体现在对大片段的破坏上。而对于核酸片段在500bp以下，尤其对于200bp以下的小片段，紫外线的消杀能力效果很差（马祥，戴镜红，王长年，康桦华.兽医PCR实验室的污染控制策略[J].广东畜牧兽医科技，2020，45(03):20-23）。而200bp以下的小片段，正是临床检测（比如荧光定量）时常用的检测长度。
UDG/UNG酶，是采用在扩增中添加dUTP替代dTTP，利用UDG/UNG酶降解含dUTP核酸片段的方式达到消解核酸的作用。该方法最大的局限性在于只能用于扩增试剂等小量液体反应体系，且仅对富含dUTP的人工扩增产物有效；诸如检测环境中存在的质粒、基因组DNA等模板污染，由于不含dUTP，致使完全无法消除。
中国专利CN101613730B公开了一种用于预防核酸扩增技术中遗留污染的改良方法，包括用UDG处理含dUTP的DNA。该方法主要是解决含有dUTP的扩增产物降解问题，局限性在于只用于扩增试剂等小量液体反应体系，不适用于质粒、基因组DNA等模板污染。
中国专利CN111183978A公开了一种消除空气中核酸气溶胶的试剂及方法，依靠过氧化物与金属离子的作用清除空气中的核酸气溶胶。该方法主要是解决常温下空气中的核酸气溶胶问题，不适用于清除低温环境中的核酸污染。
中国专利CN111662957A公开了一种消化核酸污染的试剂，通过过氧化氢与金属离子的作用消化核酸污染。该方法主要是解决常温下物品表面的核酸污染问题，不适用于解决气溶胶，也不适用于清除低温环境中核酸污染。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂及应用，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂（完全版的混合液，现场直接喷施），由过氧化物、金属盐、稳定剂、酸度调节剂、防冻剂和试剂用水组成，试剂用水是配制试剂时起溶解及稀释的作用。所述过氧化物的浓度为50-400mM，所述金属盐的浓度为50-400mM，所述稳定剂的浓度为0.01-5mM，所述防冻剂的浓度为20wt%-34wt%，所述试剂的pH值为2-4。
根据本发明的另一方面，提供了另一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂（分成A、B两瓶版本，在现场要分先后喷施），由A液和B液组成，所述A液由金属盐、稳定剂、酸度调节剂、防冻剂和试剂用水组成，所述B液由过氧化物、酸度调节剂、防冻剂和试剂用水组成；所述A液中金属盐的浓度为50-400mM，所述A液中稳定剂的浓度为0.01-5mM，所述A液中防冻剂的浓度为20wt%-34wt%，所述A液的pH值为2-4，所述B液中过氧化物的浓度为50-400mM，所述B液中防冻剂的浓度为20wt%-34wt%，所述B液的pH值为2-4。
优选的，所述过氧化物为过氧化氢或过氧乙酸，所述金属盐为金属硫酸盐或金属盐酸盐，所述稳定剂为抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、草酸、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种，所述酸度调节剂为硫酸、盐酸、硝酸或乙酸，所述防冻剂为多元醇或无机盐，所述试剂用水为超纯水、自来水、GMP车间生产用水或煮沸过的纯化水。
优选的，所述过氧化物为过氧化氢，所述金属盐为Fe、Cu、Mg或Ca的硫酸盐，所述稳定剂为抗坏血酸，所述酸度调节剂为硫酸，所述防冻剂为氯化钠，所述试剂用水为煮沸过的纯化水。
优选的，所述金属盐为硫酸亚铁。
优选的，所述过氧化物的浓度为100mM，所述金属盐的浓度为100mM，所述防冻剂的浓度为30wt%，所述稳定剂的浓度为0.025mM，所述试剂的pH值为3。
优选的，所述A液中金属盐的浓度为200mM，所述A液中稳定剂的浓度为0.05mM，所述A液中防冻剂的浓度为30wt%，所述B液中过氧化物的浓度为200mM，所述B液中防冻剂的浓度为30wt%，所述A液和B液的pH值均为3，所述试剂中A液与B液的体积比为1：1。
本发明还提供了所述试剂在清除常温及低温环境的核酸污染中的应用，所述常温及低温环境的核酸污染包括-10℃环境(包括物品表面)所含有的核酸污染，喷施所述试剂后即刻完成消除。
本发明试剂清除核酸污染的机理为：
酸性条件下，铁盐与双氧水发生反应，生成活性氧自由基，可以消除诸如醇类、蛋白、脂类等有机物，
H2O2+Fe2+→ ·OH+OH-+Fe3+
Fe3+ +H2O2→ Fe2++HO2·+H+
Fe2++ ·OH-→Fe3++ OH-
H2O2+·OH→HO2·+ H2O
HO2·+·OH→O2+ HO2
·OH+·OH→H2O2
上述整个反应体系较为复杂，Fe2+为催化剂，在反应中起激发和传递作用，该机理清除诸如醇类、蛋白、脂类等有机物的关键在于能产生大量的活性氧自由基。为实现这一点，实际应用上业内往往采用现配现用，且多用于废水处理领域，并不预先制作成品液。究其原因就在于二价铁盐溶液的极不稳定，正常保存时不仅会产生三价铁降低效率，还会发生水解出现大量絮状沉淀，抑制后续反应中氧自由基的发生（李明玉，熊林，尚微，田依林，汤心虎，张渊明.Fenton反应催化降解苯胺及影响因素研究[J].给水排水，2005(07):58-61）。由于该机理的核心在于要想产生氧自由基，需要可变价金属离子，原先铁盐可在二价及三价之间自由转换的优势，却由于二价铁盐的极不稳定在成品液中直接变为了三价，从而成了劣势。为了改变这一劣势，相关研究多是从更换金属离子或使用其他药剂替换金属盐，直接与过氧化氢发生反应的角度入手。但更换其他金属离子（如Cu、Ni）或还原药剂（如硫醇类）虽然可以使最终产品的稳定性增加，但由此生成的活性氧自由基的量与电势，远不及能达到自然界第二电势强的铁盐与过氧化氢的生成物（李金莲, 金永峰, 钱慧娟,等.Fenton试剂在水处理中的应用研究[J]. 化工科技市场, 2006(06):28-33）。
为了仍旧利用铁盐的高效能，就需要解决二价铁盐的不稳定问题。不稳定主要来自两方面，一个是氧化，来自液面上方的氧气以及来自溶液里的溶解氧，致使原本投入的二价铁离子在储存过程中变为了三价铁离子；另一个是铁离子的水解，生成氢氧化铁，进而出现沉淀。结合过往相关研究，我们验证并有针对性的使用了煮沸过的纯化水（去除溶解氧），并在溶液中加入低剂量的稳定剂，验证了如抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钾，草酸，目的是抵消残余氧气对二价铁盐的氧化作用。还试验了草酸、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、加酸，用于对于铁离子的络合，最终发现加入稀硫酸后，一方面可以增强铁盐溶液的稳定性，另一方面可以调整pH抗水解防沉淀。同时还验证了其他金属离子对于替代二价铁盐的对比效能，均证明了前人试验过的其他金属离子的效能不如铁离子（陈华军，尹国杰.Fenton及类Fenton试剂的研究进展[J]. 洛阳理工学院学报(自然科学版)，2007，17(003):1-4）。
同时结合当前形势，由于消杀药剂在低温下的效能大打折扣(吴苡婷. 防范冷链新冠污染该如何进行[N]. 上海科技报，2020-12-02(001) )，为拓宽应用的温度范围，我们添加了防冻剂并试验了在防冻领域效果出色的乙二醇、丙三醇、氯化钠、氯化钙等。经实验验证找到了合适的防冻剂，成本低，性能稳定，对活性氧自由基的产生无不利影响，对病毒本体及组成的杀灭效果好（实施例中有经过提取核酸操作及荧光定量检测，确认无残存）。
为证明最终成品试剂（以下简称清除剂）的效能，我们在这些真实场景（实验台、器具台面、低温物体表面、气溶胶、灭活的腺病毒培养液）中做了污染的清除验证，还测试了清除所需的反应时间。经验证在试剂喷施后，瞬时消解污染，无需等待。由于最终的反应产物为CO2、三价的硫酸铁盐、氯化钠和水，使用安全无毒、不易燃、不易爆，有效避免对操作者的伤害，污染清除率高，应用范围广阔。
本发明的有益效果：本发明的可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂中各组分配比完全，在反应中的转化率高，活性氧自由基的产生量高；试剂的稳定性高，可以长期保存，无需现配现用；不仅可以清除常温环境中的污染，而且还可以清除低温环境的污染，操作简便，效果稳定；不仅可以清除被核酸污染的环境，而且可以清除被病毒衣壳蛋白包裹核酸所污染的环境（包括物品表面）；在喷施清除剂后，瞬时消解污染，试剂残余物待风干后无毒性，无需等待，即刻投入工作；使用安全无毒，不含醇类防冻剂，不易燃、不易爆，有效避免对操作者的伤害，污染清除率高，应用范围广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是按照本发明所述的两种版本制备出的清除剂与次氯酸钠消毒剂在清除高浓度PCR产物的效果及反应时间的对比图；
图2是本发明所述的清除剂对涂抹了PCR产物的仪器表面和实验室台面的核酸清除效果；
图3是本发明所述的清除剂对高浓度气溶胶的清除效果；
图4是本发明所述的清除剂在低温及常温下对PCR产物的清除效果；
图5是比较不同金属离子及稳定剂在添加进本发明所述的清除剂后对PCR产物的清除效果；
图6是本发明所述的清除剂在不同pH值条件下对PCR产物的清除效果；
图7是本发明所述的清除剂消除被病毒衣壳蛋白包裹核酸的效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
主要验证试剂：
质粒DNA购自中美泰和，荧光定量机器(7500及stepone plus)购自AppliedBiosystems，荧光定量试剂购自Promega，引物序列来自王国政等发表的四重荧光定量RT-PCR检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒(临床检验杂志，2014，32(11):801-805)；
实施例1
一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂（以下简称清除剂），分为两种版本，一种版本是完全版的混合液，由过氧化氢(100mM)、硫酸亚铁(100mM)、抗坏血酸(0.025mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸及煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3；另一种版本是分成A、B两瓶版本，A瓶中A液由硫酸亚铁(200mM)、抗坏血酸(0.05mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸、煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3；B瓶中B液由过氧化氢(200mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸及煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3。
对比试剂为次氯酸钠工作液：1份市售次氯酸钠消毒液原液+20份纯化水（终浓度0.2%的有效氯）。
将上述的两种版本的清除剂与次氯酸钠工作液，在清除高浓度PCR产物的效果及反应时间上进行对比，具体实验设置为：将上述试剂分别与PCR产物（约40ng/μL，下同）按照1：1的体积比、1：4的体积比进行混合；等待设定时间后，进行琼脂糖电泳检测，电泳图如图1所示，其中：
泳道M：marker；
泳道1：作为对照，6μL的PCR产物原液；
泳道2：配制并室温避光存放了1天的完全版的混合液取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道3：配制并室温避光存放了1天的完全版的混合液取6μL，与24μL的PCR产物按照1：4的体积比混合后，立即点样；
泳道4：取3μL的A液与3μL的B液，与6μL 的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道5：取3μL的A液与3μL的B液，与24μL 的PCR产物按照1：4的体积比混合后，立即点样；
泳道6：配制并室温避光存放了1天的完全版的混合液取6μL，与6μL 的PCR产物按照1：1的体积比混合后，静置30分钟，再点样；
泳道7：配制并室温避光存放了1天的完全版的混合液取6μL，与24μL 的PCR产物按照1：4的体积比混合后，静置30分钟，再点样；
泳道8：取3μL的A液与3μL的B液，与6μL 的PCR产物按照1：1的体积比混合后，静置30分钟，再点样；
泳道9：取3μL的A液与3μL的B液，与24μL 的PCR产物按照1：4的体积比混合后，静置30分钟，再点样；
泳道10：取6μL 的次氯酸钠(0.2%的有效氯)工作液，与6μL 的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道11：取6μL 的次氯酸钠(0.2%的有效氯)工作液，与6μL 的PCR产物按照1：1的体积比混合后，静置30分钟，再点样。
实验结果证明：所述两种制备版本的试剂，无论是完全版的混合液，还是分成A、B两瓶的版本，与PCR产物混合后，无需等待，即刻完全清除核酸片段。而次氯酸钠(0.2%的有效氯)工作液，在反应了半小时后，仍有大量的PCR产物残留被检测出。
实施例2
一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂（以下简称清除剂），由过氧化氢(100mM)、硫酸亚铁(100mM)、抗坏血酸(0.025mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸、煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3。
检测所述的清除剂对涂抹了PCR产物的仪器表面和实验室台面的核酸清除效果。产物涂抹的设置为：准备1mL的PCR产物稀释液(大约30ng/μL)，分别涂抹于生物安全柜外表面的圈定区域、实验台面。清除方式：直接对该区域喷施完全版的混合液(30mL/m2)。
具体实验设置为：
1、涂抹PCR产物稀释液后，使用无菌的棉签蘸取超纯水，对仪器表面和实验室台面进行擦拭取样，然后使用试剂盒进行核酸提取操作，随后抽取提取物进行PCR荧光定量扩增；
2、涂抹PCR产物稀释液后，再喷施清除剂，随后使用无菌的棉签蘸取超纯水，对仪器表面和实验室台面进行擦拭取样，然后使用试剂盒进行核酸提取操作，随后抽取提取物进行PCR荧光定量扩增。
荧光定量结果如图2所示，对仪器表面和实验室台面涂抹了PCR产物稀释液，荧光定量检测到了大量的核酸污染(ct在27~29)。但经过喷施清除剂后，核酸污染均被消除。
实施例3
一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂（以下简称清除剂），由过氧化氢(100mM)、硫酸亚铁(100mM)、抗坏血酸(0.025mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸及煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3。
检测所述的清除剂对高浓度气溶胶的清除效果，气溶胶的设置为：露天室外，准备4个约有0.6m3容积的纸箱，使用小喷壶，向每个纸箱中喷施20mL的PCR产物稀释液(大约5ng/μL)，静置10分钟。
露天的室外实验设置为：
1、打开第一个纸箱内，小心放置一个装了5mL超纯水的培养皿(开盖)，合上纸箱，代称（1）；
2、打开第二个纸箱内，使用小型空气加湿器，通过小洞向箱子内吹雾化的清除剂20min。然后小心放置一个装了5mL超纯水的培养皿(开盖)，合上纸箱，代称（2）；
3、打开第三个纸箱内，使用小型空气加湿器，通过小洞向箱子内吹雾化的清除剂8min。然后小心放置一个装了5mL超纯水的培养皿(开盖)，合上纸箱，代称（3）；
4、打开第四个纸箱内，使用小型空气加湿器，通过小洞向箱子内吹雾化的清除剂1min。然后小心放置一个装了5mL超纯水的培养皿(开盖)，合上纸箱，代称（4）；
5、小心按照(2、3、4、1)的顺序取出四个箱子内的培养皿，每取出一个就吸取1微升水，加入PCR荧光定量扩增体系当中；
6、将体系装管压紧盖子，带回实验室上荧光定量扩增仪进行检测。
荧光定量结果如图3所示：本实施例所述的清除剂，在雾化后对高浓度气溶胶的清除效果良好，并且随着时间的持续，效果更加明显。
实施例4
未添加防冻剂的清除剂由过氧化氢(100mM)、硫酸亚铁(100mM)、抗坏血酸(0.025mM)、硫酸及煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3。
防冻剂的备选：
乙二醇，终浓度30wt%的氯化钠，终浓度60wt%的氯化钙。
实验设置：
1、将上述防冻剂，分别加入未添加防冻剂的清除剂当中，观察稳定性；
2、观察添加了防冻剂的清除剂在低温下是否结冰，
3、观察添加了防冻剂的清除剂在低温下对于核酸的清除效果。
添加防冻剂后的稳定性：
将乙二醇加入到未添加防冻剂的清除剂中，即立即发生剧烈反应，生成大量气泡(醇类被氧化降解)；
将氯化钙，加入到未添加防冻剂的清除剂中，终浓度60wt%，室温下即有大量絮状沉淀生成；
将氯化钠，加入到未添加防冻剂的清除剂中，终浓度30wt%，在零下10℃的冰箱里1h均不结冰。
对核酸的清除效果：电泳图如图4所示：
泳道M：marker；
泳道1：作为对照，6μL的PCR产物原液；
泳道2：终浓度30wt%氯化钠的清除剂，在室温维持1h后，取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道3：终浓度30wt%氯化钠的清除剂，在零下10℃的冰箱里存放1h后，取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样。
实验结果证明：本发明所述的清除剂选择终浓度30wt%的氯化钠作为防冻剂，可用于处理常温及低温-10℃的核酸污染。
实施例5
未添加金属离子的清除剂由过氧化氢(100mM)、抗坏血酸(0.025mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸及煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3。
备选的金属离子盐：
硫酸亚铁、硫酸铜、氯化镁、氯化钙。
未添加稳定剂的清除剂由过氧化氢(100mM)、硫酸亚铁(100mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸及煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3。
备选的稳定剂(0.25mM)：
抗坏血酸、抗坏血酸钠、草酸、EDTA、EDTA二钠。
实验设置：
将上述备选金属离子分别加入未添加金属离子的清除剂中，再抽取6μL的混合液与6μL的PCR产物按照1：1的体积比进行混合，立即电泳；将上述备选稳定剂分别加入未添加稳定剂的清除剂中，再抽取6μL的混合液与6μL的PCR产物按照1：1的体积比进行混合，立即电泳，
电泳图如图5所示：
泳道M：marker；
泳道1：作为对照，6μL的PCR产物原液；
泳道2：加入了终浓度100mM硫酸亚铁的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道3：加入了终浓度100mM硫酸铜的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道4：加入了终浓度100mM氯化镁的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道5：加入了终浓度100mM氯化钙的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道6：加入了终浓度0.5mM抗坏血酸的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道7：加入了终浓度0.5mM抗坏血酸钠的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道8：加入了终浓度0.5mM草酸的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道9：加入了终浓度0.5mM EDTA的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道10：加入了终浓度0.5mM EDTA二钠的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样。
实验结果证明：本发明所述的清除剂中，只有添加了铁盐、抗坏血酸的效果最好。
实施例6
未调pH的清除剂：由过氧化氢(100mM)、硫酸亚铁(100mM)、抗坏血酸(0.025mM)、氯化钠(30wt%)和煮沸过的纯化水组成，
使用硫酸调pH为2-4，实验设置：
第一组，使用硫酸调pH到2；
第二组，使用硫酸调pH到3；
第三组，使用硫酸调pH到4。
调整好pH的清除剂，分别抽取6μL的混合液与6μL的PCR产物按照1：1，及1:4的体积比进行混合，立即电泳，电泳图如图6所示：
泳道1：作为对照，6μL的PCR产物原液；
泳道2：pH为2的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道3：pH为2的清除剂取6μL，与24μL的PCR产物按照1：4的体积比混合后，立即点样；
泳道4：pH为3的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道5：pH为3的清除剂取6μL，与24μL的PCR产物按照1：4的体积比混合后，立即点样；
泳道6：pH为4的清除剂取6μL，与6μL的PCR产物按照1：1的体积比混合后，立即点样；
泳道7：pH为4的清除剂取6μL，与24μL的PCR产物按照1：4的体积比混合后，立即点样。
实验结果证明：本实施例所述的清除剂在pH为3的时候，清除PCR产物的效果最好。
实施例7
一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂（以下简称清除剂），由过氧化氢(100mM)、硫酸亚铁(100mM)、抗坏血酸(0.025mM)、氯化钠(30wt%)、硫酸及煮沸过的纯化水组成，硫酸调pH为3。
将所述的清除剂用于消除被病毒衣壳蛋白包裹核酸，灭活腺病毒培养液浓度为5.5×108/mL，实验设置为：
1、100μL的消除剂（完全版的混合液）与100μL的灭活腺病毒培养液，按照1：4的体积比混合后，立即使用试剂盒进行核酸提取，代称(1)；
2、抽取100μL的灭活腺病毒培养液提取核酸，代称(2)；
3、对上述两种提取样本，各抽取1μL进行荧光定量试剂的扩增检测，荧光定量结果如图7所示：本实施例所述的清除剂能够快速清除高浓度的灭活腺病毒培养液中本体及核酸，也就是说可以清除被核酸及被病毒衣壳蛋白包裹核酸所污染的环境(包括物品表面)。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明的可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂中各组分配比完全，在反应中的转化率高，活性氧自由基的产生量高；试剂的稳定性高，可以长期保存，无需现配现用；不仅可以清除常温环境中的污染，而且还可以清除低温环境的污染，操作简便，效果稳定；不仅可以清除被核酸污染的环境，而且可以清除被病毒衣壳蛋白包裹核酸所污染的环境（包括物品表面）；在喷施清除剂后，瞬时消解污染，试剂残余物待风干后无毒性，无需等待，即刻投入工作；使用安全无毒，不含醇类防冻剂，不易燃、不易爆，有效避免对操作者的伤害，污染清除率高，应用范围广阔。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂，其特征在于，由过氧化物、金属盐、稳定剂、酸度调节剂、防冻剂和试剂用水组成，所述过氧化物的浓度为50-400mM，所述金属盐的浓度为50-400mM，所述稳定剂的浓度为0.01-5mM，所述防冻剂的浓度为20wt%-34wt%，所述试剂的pH值为2-4。
2.一种可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂，其特征在于，由A液和B液组成，所述A液由金属盐、稳定剂、酸度调节剂、防冻剂和试剂用水组成，所述B液由过氧化物、酸度调节剂、防冻剂和试剂用水组成；所述A液中金属盐的浓度为50-400mM，所述A液中稳定剂的浓度为0.01-5mM，所述A液中防冻剂的浓度为20wt%-34wt%，所述A液的pH值为2-4，所述B液中过氧化物的浓度为50-400mM，所述B液中防冻剂的浓度为20wt%-34wt%，所述B液的pH值为2-4。
3.根据权利要求1或2所述的可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂，其特征在于，所述过氧化物为过氧化氢或过氧乙酸，所述金属盐为金属硫酸盐或金属盐酸盐，所述稳定剂为抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、草酸、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种，所述酸度调节剂为硫酸、盐酸、硝酸或乙酸，所述防冻剂为多元醇或无机盐，所述试剂用水为超纯水、自来水、GMP车间生产用水或煮沸过的纯化水。
4.根据权利要求1或2所述的可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂，其特征在于，所述过氧化物为过氧化氢，所述金属盐为Fe、Cu、Mg或Ca的硫酸盐，所述稳定剂为抗坏血酸，所述酸度调节剂为硫酸，所述防冻剂为氯化钠，所述试剂用水为煮沸过的纯化水。
5.根据权利要求1或2所述的可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂，其特征在于，所述金属盐为硫酸亚铁。
6.根据权利要求1所述的可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂，其特征在于，所述过氧化物的浓度为100mM，所述金属盐的浓度为100mM，所述防冻剂的浓度为30wt%，所述稳定剂的浓度为0.025mM，所述试剂的pH值为3。
7.根据权利要求2所述的可以高效清除常温及低温环境中核酸污染的试剂，其特征在于，所述A液中金属盐的浓度为200mM，所述A液中稳定剂的浓度为0.05mM，所述A液中防冻剂的浓度为30wt%，所述B液中过氧化物的浓度为200mM，所述B液中防冻剂的浓度为30wt%，所述A液和B液的pH值均为3。
8.如权利要求1或2所述的试剂在清除常温及低温环境的核酸污染中的应用，其特征在于，所述常温及低温环境的核酸污染包括-10℃环境含有的核酸污染。
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