CN115786039A - 一种基于银的核酸清除剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种基于银的核酸清除剂及其制备方法和应用，所述基于银的核酸清除剂包括如下组分和含量：0.01 ppm‑200 ppm纳米银/银盐、0.05%‑7%辅助氧化剂、0.05%‑2.5%表面活性剂、0.5%‑10%无机盐、0.1 ppm‑10 ppm高分子材料、0‑1%pH调节剂，余量为水。本发明能够通过纳米银/银盐与其他有效组分的联合作用，使吸附在仪器和实验台表面的核酸脱离，并且使核酸的磷酸二酯键断裂，导致核酸的降解，不仅可以清除小片段的核酸，而且能够降低对于仪器和人体的伤害。

Description

一种基于银的核酸清除剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种基于银的核酸清除剂及其制备方法和应用。

背景技术

核酸检测技术是一种在医疗诊断、动物检疫、遗传育种等多个方面具有重要应用的高灵敏检测手段，尤其是病原体的检测上，核酸检测技术发挥着重要的作用。荧光定量PCR是核酸检测技术的重要手段之一，具有极高的灵敏度，可以精准地检测微量、甚至痕量的核酸片段；正因为该技术具有高灵敏度，操作过程中极微量的核酸片段污染也会导致荧光定量PCR结果出现假阳性（尤其是在密闭的环境中，例如方舱检测车），从而导致对疾病疫情的误判，产生严重的后果。

尽管每一位检测人员在实验过程中都小心谨慎地反复确认每一次的实验步骤，但是在实验过程中，当液体的液面与空气产生了摩擦，如打开PCR的管盖、或者使用不带滤芯的移液枪的枪头反复吸样等都会导致核酸的气溶胶污染（即DNA/RNA气溶胶污染）出现。

核酸的气溶胶污染是一个累积的过程，当实验室中出现核酸气溶胶污染时，一般的处理方法是用酒精、强酸强碱溶液、强氧化剂或核酸酶等进行擦除，或者利用紫外线照射。然而，即使是用常规的紫外线照射2小时，依旧无法彻底消除小片段（200bp以下）DNA的污染。

传统的核酸清除方式包括使用80%的乙醇、强酸强碱溶液、强氧化剂或核酸酶等进行擦除，但这几种擦除剂都存在各自的缺点：（1）80%的乙醇溶液可以擦除大片段的核酸，但对于小片段（200bp以下）核酸的清除效果有限，不能清除干净，依旧会影响qPCR的实验结果；（2）强酸强碱溶液如盐酸、硫酸、氢氧化钠等，溶液中的氢离子会参与催化磷酸二酯键的水解，从而破坏DNA双链中的磷酸二酯键，导致DNA的降解，但是，强酸强碱溶液对金属表面有腐蚀性，因此会影响仪器的使用寿命，并且强酸强碱溶液在操作过程中有一定的危险性；（3）强氧化剂如3%的过氧化氢、1%的高锰酸钾、10%的次氯酸钠等，会释放出羟自由基和氧自由基氧化核酸片段，使DNA中的磷酸二酯键断裂，从而降解DNA，但强氧化剂在使用过程中容易致敏，对实验人员的人身安全有一定的影响；（4）核酸酶可以催化DNA双链中磷酸二酯键的断裂，从而使DNA降解，虽然核酸酶的使用可以彻底清除DNA的污染，但是核酸酶本身也会污染待测物，使qPCR结果出现假阴性。

现如今，市面上出现了多种多样的核酸清除剂，如朗司、诺唯赞、济凡生物等，都是以喷洒擦除的方式对核酸进行清除，其主要原理是通过核酸清除剂中的有效组分，改变吸附在仪器和实验台表面的核酸的电荷分布，促进核酸脱离吸附表面，然后再结合擦拭过程中产生的剪切力进一步使得核酸从吸附表面解离出来，从而达到去除表面核酸污染的效果。虽然在部分产品的公开资料中可以看到其降解核酸的展示，但是更多的集中在对大于1kb的核酸片段，甚至是对基因组核酸片段的效果展示，对于易形成气溶胶的小片段核酸（200 bp以下）的清除、降解效果有限，即现有的核酸清除剂只能进行常规的核酸清除，难以彻底消除核酸气溶胶污染。

发明内容

为改善现有技术的不足，本发明提供一种基于银的核酸清除剂，能够通过纳米银/银盐与其他有效组分的联合作用，使吸附在仪器和实验台表面的核酸脱离，并且使核酸的磷酸二酯键断裂，导致核酸的降解，不仅可以清除小片段的核酸，而且能够降低对于仪器和人体的伤害。

本发明的第一个目的在于提供一种基于银的核酸清除剂，包括如下组分和含量：

纳米银/银盐 0.01 ppm-200ppm；

辅助氧化剂 0.05%-7%；

表面活性剂 0.05%-2.5%；

无机盐 0.5%-10%；

高分子材料 0.1 ppm-10 ppm；

pH调节剂 0-1%；

水 余量。

根据本发明的实施方案，所述纳米银的浓度为0.01 ppm-2 ppm，优选所述纳米银的浓度为0.6 ppm-2 ppm，进一步优选地，所述纳米银的浓度为1.0 ppm-1.2ppm，例如所述纳米银的浓度为1.0 ppm、1.1 ppm、1.2 ppm中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述纳米银的粒径为10 nm-350 nm，优选所述纳米银的粒径为50 nm-220 nm，进一步优选地，所述纳米银的粒径为100 nm-200 nm，例如所述纳米银的粒径为100 nm、120 nm、140 nm、160 nm、180 nm、200 nm中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述银盐选自氯化银、溴化银、氧化银、硝酸银、硫酸银、卤化银中的一种或几种，优选所述银盐选自氯化银、溴化银、氧化银、硝酸银中的一种或几种，进一步优选地，所述银盐为氯化银、氧化银和硝酸银。

根据本发明的实施方案，所述银盐的浓度为0.5 -200 ppm，优选所述银盐的浓度为25 -150 ppm，进一步优选地，所述银盐的浓度为60 -100 ppm，例如所述银盐的浓度为60ppm、70 ppm、80 ppm、90 ppm、100 ppm中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述辅助氧化剂选自次氯酸钠、次氯酸钾、高锰酸钾、高氯酸钾、重铬酸钠、重铬酸钾、过氧化氢、过氧乙酸、过硫酸铵、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾中的一种或几种，优选所用辅助氧化剂选自高锰酸钾、过氧化氢、过硼酸钠、过硼酸钾中的一种或几种，进一步优选地，所用辅助氧化剂选自过氧化氢和/或过硼酸钠。

根据本发明的实施方案，所述辅助氧化剂的浓度为0.05%-7%，优选所述辅助氧化剂的浓度为2%-4%，进一步优选地，所述辅助氧化剂的浓度为3.5%-4%，例如所述辅助氧化剂的浓度为3.5%、3.8%、4%中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化亚铁、氯化铁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氟化钠、氟化氢钾、氟化铯、氯化钠、氯化钾中的一种或多种，优选所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、碳酸钠、硝酸钠、硝酸钾、磷酸钠、磷酸钾中的一种或多种，进一步优选地，所述无机盐为氯化钠、硝酸钠和磷酸钾。

根据本发明的实施方案，所述无机盐的浓度为0.5%-10%，优选为所述无机盐的浓度为1%-4%，进一步优选地，所述无机盐的浓度为1.2%-3%，例如所述无机盐的浓度为1.2%、1.5%、2%、3%中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述高分子材料选自聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、阿拉伯树胶、琼脂糖、聚乙烯、聚苯醚、饱和聚酯、聚甲醛、聚酰胺、聚苯硫醚、聚酰亚胺中的一种或多种，优选所述高分子材料选自聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、聚苯硫醚和聚酰亚胺中的一种或多种，进一步优选地所述高分子材料为聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯树胶。

根据本发明的实施方案，所述高分子材料的浓度为0.1 ppm-10 ppm，优选所述高分子材料的浓度为0.5 ppm-3 ppm，进一步优选地，所述高分子材料的浓度为0.5 ppm-1ppm，例如所述高分子材料的浓度为0.5 ppm、0.8 ppm、1ppm中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述表面活性剂选自莎梵婷、四丁基氟化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、聚苯乙烯交联二乙烯苯、十二烷基酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基醇醚硫酸钠、月桂酰胺聚氧乙烯醚、月桂酰胺丙基甜菜碱、十六烷基三甲基溴化铵、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或几种，优选所述表面活性剂选自聚苯乙烯交联二乙烯苯、十二烷基硫酸钠、月桂酰胺聚氧乙烯醚和吐温40中的一种或几种，进一步优选地，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠和吐温40。

根据本发明的实施方案，所述表面活性剂的浓度为0.05%-2.5%，优选所述表面活性剂的浓度为0.3%-1.5%，进一步优选地，所述表面活性剂的浓度为0.8%-1%，例如所述表面活性剂的浓度为0.8%、0.9%、1%中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述pH调节剂选自盐酸、碳酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氧化钠、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉乙酸钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种，优选所述pH调节剂选自盐酸、硝酸、磷酸、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种，进一步优选地，所述pH调节剂为盐酸、磷酸和磷酸二氢钠。

根据本发明的实施方案，所述pH调节剂的浓度为0-1%，优选地，所述pH调节剂的浓度为0.2-0.5%，例如所述pH调节剂的浓度为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

本发明的第二个目的在于提供一种基于银的核酸清除剂的制备方法，包括将如上所述纳米银/银盐、辅助氧化剂、表面活性剂、无机盐、高分子材料、pH调节剂与水混合。

本发明的第三个目的在于提供一种上述基于银的核酸清除剂在清除核酸中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种核酸清除方法，包括将基于银的核酸清除剂与待清除装置接触。

根据本发明的实施方案，所述接触包括擦拭、浸泡、喷涂或浸润。

根据本发明的实施方案，所述接触的时间为1-30 min，优选所述接触的时间为3-15 min，进一步优选地，所述接触的时间为5-10 min，例如为5 min、6 min、8 min、10 min中的任意值或任意两点值构成的范围值中的任意值。

根据本发明的实施方案，所述将核酸清除剂与待清除装置接触时或接触后，还包括使用紫外光照射的步骤。

根据本发明的实施方案，所述紫外光照射的时间为1-10 min，优选为2-5 min，例如为2 min、3 min、4 min或5 min。

根据本发明的实施方案，所述将核酸清除剂与待清除装置接触后，还包括擦除待清除装置表面核酸清除剂的步骤。

有益效果

本发明中基于银的核酸清除剂，包括纳米银/银盐、辅助氧化剂、表面活性剂、无机盐、高分子材料和pH调节剂，将上述成分在水中混合形成溶液后，溶液中的纳米银/银盐与其他有效组分联合作用，能够让吸附在仪器和实验台表面的核酸的磷酸二酯键断裂，使核酸降解，之后再进行擦除即可去除仪器或实验台表面附着的核酸，与现有技术中难以消除小片段（200 bp以下）核酸相比，本发明能够清除小片段例如162 bp的核酸片段，且清除效果较好，本发明能够有效清除实验室中核酸的污染，使荧光定量PCR的检测结果更加精准。

附图说明

图1为本发明实施例3中不同核酸清除剂清除小片段（162 bp）核酸的对比图；

图2为本发明对比例1中添加纳米银与未添加纳米银的核酸清除剂清除小片段（162 bp）核酸的对比图；

图3为本发明实施例4中清除剂在紫外照射下和非紫外照射下清除小片段（162bp）核酸的对比图；

图4为本发明实施例5中配方E和配方F对于不同片段核酸的清除效果对比图；

图5为本发明实施例6中配方E和配方F对1 μg小片段（162 bp）核酸样本的清除效果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的组分及其制备方法和应用作更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1 基于银的核酸清除剂的配制

基于银的核酸清除剂配制方法：在烧杯中，按照表1添加对应组分，之后转至1 L容量瓶，使用纯水进行定容，混匀后即可得到对应的核酸清除剂。

表1 核酸清除剂配比

实施例2：核酸擦除实验

核酸擦除实验步骤：按照实施例1核酸清除剂配置方法配置A-G的核酸清除剂。准备7块大小一致的玻璃，用移液枪吸取10 μL（约1 μg）的核酸样本，滴在玻璃表面，用热风枪吹干后，分别使用沾有A-G的核酸清除剂的棉签擦拭不同玻璃表面，之后将棉签放到MAGBETTER^® 样本释放剂中释放10分钟后，得到对应的处理体系，利用MAGBETTER^® 核酸纯化试剂对处理体系进行纯化，之后将纯化样本加入qPCR扩增体系，测试清除效果。

其中，核酸纯化试剂使用MagBetter MNAPure PCR试剂，编号为MNAP-PCR-500 mL。

表2 核酸清除效果测试

本实施例中通过将采用核酸清除剂处理后的效果与仅仅使用纯水的效果进行比较，Ct值越大说明清除越干净，含有纳米银的配方E、F对长度为23 kb、162 bp的核酸片段均具有较好的清除效果，且优于使用含银盐的配方A-D。

实施例3：小片段核酸的消除实验

消除实验步骤：按照实施例1核酸清除剂配置方法，配置A-G的核酸清除剂。在1.5mL 的EP管中，分别加入1 μg（约10 μL）长度为162 bp的PCR产物，向不同EP管中分别加入50μLA-G的核酸清除剂，混合均匀后，室温静置20 min，取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳实验。

如图1所示，配方A-G对长度大于162 bp的核酸片段具有良好的降解作用，对长度为162bp的小片段核酸有一定的降解作用，其中配方E和配方F对应的核酸清除剂对长度为162bp的小片段核酸的清除效果尤为明显。

在核酸消除实验中，200 bp以下的片段较难清除，核酸片段越小，越难清除干净，如果可以清除较小的核酸片段，说明清除剂的清除效果较好。

对比例1：银或者银离子对核酸消除的增益效果

首先按实施例1的核酸清除剂配置方法，根据配方E和配方F，去除纳米银的组分，其他组分不变的情况下，配置出对应的核酸清除剂E-1和F-1。

在1.5 mL的EP管中，先加入1 μg（约10 μL）162 bp核酸片段再分别向不同的EP管中加入50 μL核酸清除剂E-1、F-1，混合均匀后，室温静置20 min，取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳实验。

参见图2所示，未添加纳米银的核酸清除剂E-1、F-1只能清除长度较大的片段核酸，不能清除长度为162 bp的小片段核酸；添加了纳米银的的核酸清除剂E、F不仅能够清除长度较大的片段核酸，还能够清除长度为162 bp的小片段核酸，效果更好。

实施例4：紫外照射下对于核酸消除的增益效果

实验组：在1.5 mL的不同EP管中，分别加入1 μg（约10 μL）162 bp的核酸片段，分别加入50 μL实施例1制备的A-G的核酸清除剂，混合均匀后，在紫外照射下，核酸清除剂处理3 min，取5 μL进行琼脂糖凝胶进行电泳实验。

对照组：在1.5 mL的EP管中，分别加入1 μg（约10 μL）162 bp的核酸片段，分别加入50 μL实施例1中A-G的核酸清除剂，混合均匀后，核酸清除剂处理3 min，取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳实验。

参见图3所示，实施例1制备的清除剂在紫外照射下，核酸的清除效果更加明显。

实施例5：配方E和配方F对于不同片段核酸的清除效果

在1.5 mL的不同EP管中，分别加入1 μg（约10 μL）长度为23 kb、1 μg长度为800bp、1 μg长度162 bp的PCR产物（每个长度设置两份作为对照），向每个浓度分别加入50 μL核酸清除剂（配方E或配方F）、水、乙醇，混合均匀后，室温静置20 min，取 5 μL进行琼脂糖凝胶电泳实验。

如图4所示，配方E和配方F对于不同片段核酸的清除效果都较好，但水和乙醇不仅对于小片段核酸的降解效果比较差，对于大片段核酸（大于200 bp）的降解效果也不明显。

实施例6：配方E和配方F对于常量小片段核酸的清除效果

在1.5 mL 的EP管中，分别加入1 μg（约10 μL）162 bp的核酸片段，向不同的EP管中分别加入50 μL的E核酸清除剂、50 μL的F核酸清除剂、50 μL的水、50 μL的80%乙醇，处理5-10 min后，利用核酸纯化试剂对处理体系进行纯化，纯化样本加入qPCR扩增体系，测试清除效果。

参见图5和表3所示，从qPCR的结果来看，配方E和配方F的核酸清除剂对于小片段核酸样本（162 bp的核酸片段）的去除效果显著，Ct值均大于39。

表3核酸清除效果

实验组	Ct
		阳性对照	25.30
水	34.35
		80%乙醇	34.92
配方E	39.07
		配方F	41.23

以上通过实施例对本发明的具体实施方式进行了示例性的说明。但是，本发明的保护范围不拘囿于上述示例性的实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，本领域技术人员所作出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于银的核酸清除剂，其特征在于，包括如下组分和含量：

纳米银/银盐 0.01 ppm-200 ppm；

辅助氧化剂 0.05%-7%；

表面活性剂 0.05%-2.5%；

无机盐 0.5%-10%；

高分子材料 0.1 ppm-10 ppm；

pH调节剂 0-1%；

水 余量。

2. 根据权利要求1所述的基于银的核酸清除剂，其特征在于，所述纳米银的浓度为0.01 ppm-2 ppm；所述纳米银的粒径为10 nm-350 nm；

所述银盐选自氯化银、溴化银、氧化银、硝酸银、硫酸银、卤化银中的一种或几种，所述银盐的浓度为0.5 ppm-200 ppm。

3.根据权利要求1所述的基于银的核酸清除剂，其特征在于，所述辅助氧化剂选自次氯酸钠、次氯酸钾、高锰酸钾、高氯酸钾、重铬酸钠、重铬酸钾、过氧化氢、过氧乙酸、过硫酸铵、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾中的一种或几种，所述辅助氧化剂的浓度为0.05%-7%。

4.根据权利要求1-3任一项所述的基于银的核酸清除剂，其特征在于，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化亚铁、氯化铁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氟化钠、氟化氢钾、氟化铯、氯化钠、氯化钾中的一种或多种，所述无机盐的浓度为0.5%-10%。

5. 根据权利要求1-3任一项所述的基于银的核酸清除剂，其特征在于，所述高分子材料选自聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、阿拉伯树胶、琼脂糖、聚乙烯、聚苯醚、饱和聚酯、聚甲醛、聚酰胺、聚苯硫醚、聚酰亚胺中的一种或多种，所述高分子材料的浓度为0.1ppm-10 ppm。

6.根据权利要求1-3任一项所述的基于银的核酸清除剂，其特征在于，所述表面活性剂选自莎梵婷、四丁基氟化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、聚苯乙烯交联二乙烯苯、十二烷基酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基醇醚硫酸钠、月桂酰胺聚氧乙烯醚、月桂酰胺丙基甜菜碱、十六烷基三甲基溴化铵、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或几种，所述表面活性剂的浓度为0.05%-2.5%。

7.根据权利要求1-3任一项所述的基于银的核酸清除剂，其特征在于，所述pH调节剂选自盐酸、碳酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氧化钠、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉乙酸钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种，所述pH调节剂的浓度为0-1%。

8.一种基于银的核酸清除剂的制备方法，包括将如权利要求1-7任一项所述的纳米银/银盐、辅助氧化剂、表面活性剂、无机盐、高分子材料、pH调节剂和水混合。

9.一种核酸清除方法，包括将权利要求1-7任一项所述的基于银的核酸清除剂或权利要求8所述的方法制备的核酸清除剂与待清除装置接触。

10.根据权利要求9所述的核酸清除方法，其特征在于，所述将核酸清除剂与待清除装置接触时或接触后，还包括使用紫外光照射的步骤。

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