JP2010525837A - アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるトリアゾール耐性の検出 - Google Patents
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるトリアゾール耐性の検出 Download PDFInfo
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Abstract
試料中のトリアゾール耐性真菌を検出する方法が提供される。方法は、真菌がトリアゾール耐性であるかを判定するため、変異ＡｚＲＦ１転写因子をコードする遺伝子の存在又は転写因子のレベルに関して試料を評価するステップを含む。プライマー、プローブ及びキットも提供される。
Description
（関連出願の相互参照）
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年５月４日に出願された米国仮出願第６０／９１６，１９３号の優先権を主張するものである。
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年５月４日に出願された米国仮出願第６０／９１６，１９３号の優先権を主張するものである。
真菌感染症は、様々な重症患者における罹患及び死亡の重要な原因である。例えば、真菌は免疫不全患者において表在性の、また、致死性となる場合が多い播種性感染を引き起こし得る。全身性真菌感染症は、白血病において約２５％の感染症関連の死亡、また、肺、膵臓又は肝臓移植を受ける患者において５〜１０％の死亡を引き起こす。後天性真菌性敗血症が、最大１３％の極低出生体重児において生じることも公知である。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のメンバーは、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属のメンバーに次いで真菌感染症の二番目に一般的な原因である。
一般的に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のメンバーによって引き起こされる真菌感染症は、トリアゾール類で処置される。トリアゾール類は、Ｃ−１４脱メチル化段階においてエルゴステロール生合成経路を遮断することによって作用する。Ｃｈａｍｉｌｏｓら、Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｕｐｄａｔｅｓ（２００５）８：３４４−３５８。トリアゾール類には、例えば、ボリコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、イトラコナゾール及びポサコナゾールが含まれる。トリアゾール類はこれまでアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）真菌感染症を処置するのに有効であったが、トリアゾール処置に対するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の耐性が増加している。上記Ｃｈａｍｉｌｏｓｅら。そのような耐性は、トリアゾール処置を効果のないものにし得る。
特定の真菌感染症がトリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）を含むかを認識することは、患者に適切な治療を提供する上で重要である。従って、特定のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の真菌が、トリアゾール処置に対して感受性であるかを判定する方法が必要である。
一態様では、変異ＡｚＲＦ１転写因子をコードする遺伝子の存在に関して試料を評価するステップと（変異ＡｚＲＦ１は前記遺伝子の５５９−５６２位における残基ＱＳＱＳの欠失を含む）、変異遺伝子の存在をトリアゾール耐性真菌の存在と関連付けるステップとを含む、試料中のトリアゾール耐性真菌を検出する方法が提供される。一部の態様では、その評価は、前記遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む。一部の実施形態では、その評価は、前記試料を前記変異遺伝子とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む。オリゴヌクレオチドは検出可能な標識を含み得る。一例では、オリゴヌクレオチドはフルオロフォア及び発色団を含み、一方、別例では、オリゴヌクレオチドはフルオロフォア及び非蛍光性クエンチャーを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５又は配列番号６の核酸配列を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５又は配列番号６の核酸配列との９０％超の相同性を含み得る。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号７、配列番号８又は配列番号９の核酸配列を含み得る。
一部の態様では、変異遺伝子は前記ハイブリダイゼーション前に増幅される。増幅はＰＣＲを含み得る。増幅は、試料を配列番号３及び配列番号４の核酸配列を有するプライマーと接触させるステップも含み得る。
他の実施形態では、トリアゾール耐性真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する。トリアゾール耐性真菌は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）であり得る。
場合により、トリアゾール耐性真菌は、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、イサブコナゾール又はラブコナゾールに対して耐性を示す。
別の実施形態では、試料中のトリアゾール耐性真菌を検出する方法は、（Ａ）変異ＡｚＲＦ１転写因子をコードする遺伝子の存在に関して試料を評価するステップと、（Ｂ）遺伝子の存在をトリアゾール耐性真菌の存在と関連付けるステップとを含む。一部の態様では、評価は遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む。
別の態様では、配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列、又は配列番号５若しくは配列番号６との９０％超の相同性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、試料中のトリアゾール耐性真菌を検出するためのキットが提供される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは標識を含み、キットは１つ以上の増幅プライマーを更に含む。
以下の詳細な説明から他の目的、特徴及び利点が明らかになる。この詳細な説明から本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び改変が当業者には明らかになるため、詳細な説明及び特定の実施例は例示のみのために示される。更に、実施例は本発明の原理を示すものであり、本発明のあらゆる実施例への適用を具体的に示すことを期待され得ず、適用された場合、それは当業者には明らかに有用である。
（配列の説明）
配列番号３，５’−ＣＧＧＴＴＡＧＣＧＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣ−３’は、増幅反応のための典型的な順方向プライマーである。
配列番号４，５’−ＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣ−３’は、増幅反応のための典型的な逆方向プライマーである。
配列番号５，５’−ＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＴ−３’は、典型的な検出プローブである。
配列番号６，５’−ＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＴＴ−３’は、別の典型的な検出プローブである。
配列番号７，５’−ＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧ−３’は、典型的な検出プローブである。
配列番号８，５’−ＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＧＣＣＧ−３’は、別の典型的な検出プローブである。
配列番号９，５’−ＣＧＧＣＧＧＣＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＧ−３’は、別の典型的な検出プローブである。
本発明者らは、トリアゾール剤に対して耐性を示す変異真菌に特異的なＤＮＡ領域を発見した。従って、これらのＤＮＡ領域は、試料がトリアゾール耐性真菌を含むかを判定するために用いることができる。従って、これらの領域を検出するために用いることができる新規のプローブ及びプライマーが提供されるように、トリアゾール耐性真菌を検出する方法が提供される。
（トリアゾール耐性の検出）
（トリアゾール耐性の検出）
一態様では、変異ＡｚＲＦ１転写因子をコードする遺伝子の存在に関して試料を評価するステップを含む、試料中のトリアゾール耐性真菌を検出する方法が提供される。一実施形態では、本発明方法は、変異ＡｚＲＦ１転写因子をコードする遺伝子の存在に関して試料を評価するステップと（変異ＡｚＲＦ１は遺伝子の５５９−５６２位における残基ＱＳＱＳの欠失を含む）、変異遺伝子の存在をトリアゾール耐性真菌の存在と関連付けるステップとを含む。
別の実施形態では、トリアゾール耐性は、真菌におけるＡｚＲＦ１遺伝子の活性を測定することにより、真菌において評価することができる。特に、トリアゾール耐性真菌は、異常量のＡｚＲＦ１転写因子を有することが見出されている。従って、ＡｚＲＦ１遺伝子のコピー数又はその発現レベルの測定は、トリアゾール耐性を検出するのに有用であり得る。一部の態様では、そのような検出法は、被験真菌株におけるＡｚＲＦ１遺伝子の活性が典型的レベルの２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍又はそれ以上であるかを確認するステップを含む。
試料は、生物源又は非生物源から得ることができる。生物源の例には、生体液、組織又はその組合せが含まれるが、これに限定されない。非生物源の例には、環境から得られる試料、例えば、空気試料、水試料、土壌試料又はその組合せが含まれるが、これに限定されない。非生物源の他の例は、車両、船舶、航空機、建物又は住居の一部である。
一実施形態では、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するトリアゾール耐性真菌の試料中における有無の迅速検出のための方法が提供される。方法は、トリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に特異的な真菌ＤＮＡ領域を試料中に検出するステップを含む。特定のトリアゾール耐性属に特異的な真菌ＤＮＡ領域の試料中における存在は、そのタイプの属に属する真菌の存在を示す。特定のトリアゾール耐性属に特異的な真菌ＤＮＡ領域の試料中での欠如は、そのタイプの属に属する真菌の欠如を示す。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するトリアゾール耐性真菌の存在を検出する方法は、任意の試料に対して実施することができる。試料の具体的な種類については、以下により詳細に述べられる。一実施形態では、方法は真菌を含むことが既知である試料に対して実施される。例えば、方法は、既に全真菌検出法を受け、陽性結果が得られた試料に対して実施することができる。また、方法は、試料中におけるその存在が既知である１つ以上のトリアゾール耐性真菌の識別性を確認するために、試料に対して実施することもできる。別の実施形態では、方法は真菌含有状態が未知である試料に対して実施される。
一部の実施形態では、検出法は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する任意のトリアゾール耐性真菌種の有無を検出するために用いることができる。例えば、真菌は、アスペルギルス・アリアセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｌｌｉａｃｅｕｓ）、アスペルギルス・アルタセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｌｕｔａｃｅｕｓ）、アスペルギルス・アトロビオラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、アスペルギルス・セシェルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ）、アスペルギルス・カンジタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ）、アスペルギルス・カルネウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｅｕｓ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・クラバト−ナニカス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｏ−ｎａｎｉｃｕｓ)、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・コニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・デフレクタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ）、アスペルギルス・フィシャリアヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎｕｓ、アスペルギルス・フラビペス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・ホランディカス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｈｏｌｌａｎｄｉｃｕｓ)、アスペルギルス・ヤヌス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｎｕｓ)、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉｉ）、アスペルギルス・ニベウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスベルギルス・ペニシロイデス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス・レプタンス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｔａｎｓ)、アスペルギルス・レストリクタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）、アスペルギルス・ルブロブルンネウス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｕｂｒｏｂｒｕｎｎｅｕｓ)、アスペルギルス・スピノサス）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｉｎｏｓｕｓ、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉｉ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・テトラゾナス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｔｒａｚｏｎｕｓ)、アスペルギルス・ウングイス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｎｇｕｉｓ）、アスペルギルス・ウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓｔｕｓ）又はアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）であり得る。
一実施形態では、トリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に特異的な真菌ＤＮＡ領域（「真菌領域」）それ自体が検出される。別の実施形態では、ＤＮＡ真菌領域から転写される任意のＲＮＡが検出される。
一実施形態では、真菌領域のみが検出される。別の実施形態では、真菌領域は、より大きい配列の一部として検出される。例えば、領域はフランキング配列を有する配列の一部として検出され得る。
真菌領域は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて検出され得る。好ましくは、真菌領域は、領域と特異的にハイブリダイズするプローブを用いて検出される。一態様では、検出は、存在する場合、プローブが領域と特異的にハイブリダイズする条件下でプローブを試料と接触させるステップと、ハイブリダイゼーション産物の有無を判定するステップとを含む。ハイブリダイゼーション産物の存在は、真菌領域の存在を示す。逆に、ハイブリダイゼーション産物の欠如は真、菌領域の欠如を示す。
典型的には、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又は合成核酸のような核酸である。プローブが他のＤＮＡ又はＲＮＡ配列とではなく、真菌領域と優先的又は選択的にハイブリダイズする場合、プローブは、真菌領域と特異的にハイブリダイズする。
一実施形態では、プローブは、ストリンジェント条件下で真菌領域と特異的にハイブリダイズする。種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、ニューヨーク（１９９５））。検出は、低ストリンジェンシー条件下で行うことができ、例えば、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ及び１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液の存在下で行い、次に、５０℃で１倍（０．１６５０Ｍ Ｎａ＋）〜２倍（０．３３Ｍ Ｎａ＋）ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）中での洗浄を行う。検出は、中等度ストリンジェンシー条件下で行うことができ、例えば、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ及び１％ＳＤＳの緩衝液の存在下で行い、次に、５５℃で０．５倍（０．０８２５Ｍ Ｎａ＋）〜１倍（０．１６５０Ｍ Ｎａ＋）ＳＳＣ中での洗浄を行う。検出は、高ストリンジェンシー条件下で行うことができ、例えば、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液の存在下で行い、次に、６０℃で０．１倍（０．０１６５０Ｍ Ｎａ＋）ＳＳＣ中での洗浄を行う。
プローブは、真菌領域と同じ長さで、真菌領域より短く、又は真菌領域より長くてよい。典型的には、プローブは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５又は少なくとも１００ヌクレオチド長である。例えば、プローブは、５〜２００、７〜１００、１０〜５０ヌクレオチド長でよい。好ましくは、プローブは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド長である。好ましくは、プローブは、真菌領域との配列同一性に基づき、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。相同性は、上記したように決定される。
一実施形態では、プローブは、検出可能に標識される。任意の検出可能な標識が用いられ得る。好適な標識には、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体及びリンカー、例えば、ビオチンが含まれるが、これに限定されない。
プローブは、分子ビーコンプローブでよい。例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照されたい。分子ビーコンプローブは、一端に蛍光標識及び他端に消光分子を含む。検出される領域の非存在下、プローブは、ヘアピンループを形成し、消光分子は蛍光標識に近接され、そのため、シグナルは検出されない。検出される領域とのプローブのハイブリダイゼーションと同時に、ループは開き、蛍光分子はクエンチャーから分離され、そのため、シグナルが検出される。分子ビーコンに用いる好適な蛍光分子とクエンチャーとの組合せは当該技術分野において公知である。そのような組合せには、限定されないが、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びダブシルが含まれる。
一実施形態では、プローブは、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて支持体に固定され得る。好適な固体支持体は周知であり、多穴プレートのようなプレート、フィルター、膜、ビーズ、チップ、ピン、ディップスティック及び多孔質担体を含む。
一態様では、真菌領域の検出は、真菌領域又は真菌領域から転写されるＲＮＡを増幅するステップを含む。一実施形態では、領域はその存在が確定される前に増幅される。別の実施形態では、領域はその存在が確定されながらリアルタイムで検出される。リアルタイム法は、実施例において開示されており、当該技術分野において述べられている。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４８７，９７２号及び第６，２１４，９７９号並びにＡｆｏｎｉａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００２；３２：９４６−９）に述べられており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、検出される領域のみが増幅される。他の実施形態では、検出される領域は、はるかにより大きい長さの真菌ＤＮＡ又はＲＮＡの一部として増幅される。少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００又は少なくとも５００ヌクレオチドを有し、検出される領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡの配列が増幅される。例えば、１０〜２０００、２０〜１５００、５０〜１０００又は１００〜５００ヌクレオチドを有する配列が増幅される。そのような配列は、抗真菌薬トリアゾールに対する標的遺伝子の上流に位置し（別名Ｃｙｐ５１Ａ又はＣｙｐ ５１Ｂとして公知の１４αデメチラーゼ）、前記遺伝子の発現を制御し得る。
ＤＮＡ又はＲＮＡは、当該技術分野において公知の常法を用いて増幅することができる。一部の実施形態では、真菌ＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号を参照されたい）；リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１０７７−１０８０（１９８８）；Ｄ．Ｙ．Ｗｕ及びＲ．Ｂ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９（１９８９）；並びにＦ．Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：５−１６（１９９１）を参照されたい）；ループ媒介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）（Ｎａｇａｍｉｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７（９）：１７４２−１７４３（２００１）；Ｎｏｔｏｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１２）：Ｅ６３（２０００））；核酸配列に基づく分析（ＮＡＳＢＡ）（Ｊ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９２（１９９１））；自家持続配列複製（「３ＳＲ」）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（５）：１８７４−１８７８（１９９０））；鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：１６９１−１６９６（１９９２）及びＷａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２−３９６（１９９２））；又は転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）（Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（３）：６７６−６７８（１９９７））を用いて行われる。
当業者は、見出された欠失の領域及びＡｚＲＦ１転写因子を全般的に含む、核酸を増幅するための特異的なプライマーを容易に設計することができる。通常、プライマーは、増幅される配列のいずれかの一端において配列に相補的であるが、他の配列に相補的ではないように設計される。プライマー設計については、例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１に述べられている。
単位複製配列は、上述の方法を含む、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて検出し得る。一実施形態では、単位複製配列を検出するため、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分を用いた加水分解プローブフォーマット（例えば、ＴＡＱＭＡＮ）を用いることができる。別の実施形態では、二本鎖ＤＮＡに結合するシアニン色素を用いることができる。典型的なシアニン色素には、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＳＹＢＲゴールド、ＹＯ（オキサゾールイエロー）、ＴＯ（チアゾールオレンジ）及びＰＧ（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）が含まれるが、これに限定されない。
他の実施形態では、試験ステップは融解曲線解析を行う工程を含み得る。特定の色素又はプローブフォーマットが用いられる場合、ＰＣＲ終了時での蛍光対温度プロットの検討により、更なる情報を提供できる。例えば、ＳＹＢＲグリーン色素を用いて、ＰＣＲ産物の純度及び識別性を融解温度によって確認することができる。同様に、ハイブリダイゼーションプローブが用いられる場合、プローブ融解温度によって多型を含む配列変化を識別し得る。
一例では、最終のＰＣＲサイクルの直後、蛍光が継続的にモニタリングされながら、試料は９０℃〜９５℃で変性され、対象とするＴｍ範囲を下回る約５℃〜１０℃に冷却され、次に、典型的には０．１〜０．４℃／秒の範囲のランプ率にて緩徐に加熱される。特定の蛍光の化学的性質により、（ａ）プローブが単位複製配列から解離し（ハイブリダイゼーションプローブの場合）、又は（ｂ）二本鎖ＰＣＲ産物が一本鎖ＤＮＡに解離する温度に達した際のいずれかの場合に、蛍光の著しい減少が認められる。
融解転移は一度に生じるのではなく、小範囲の温度にわたって生じる。蛍光対温度プロット上の融解曲線の勾配の中央はＴｍと称される。融解温度、即ち、Ｔｍは、ＤＮＡ二本鎖の熱安定性の尺度であり、長さ、Ｇ／Ｃ含量及び各タイプのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃなど）の相対位置を含む多くの因子に依存する（Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．１９９７．ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６：２２７−２５９）。更に、融解温度は、ＤＮＡ：ＤＮＡ又はプローブ：ＤＮＡ二本鎖間に生じ得るヌクレオチドミスマッチ（Ａ：Ａ、Ａ：Ｇ、Ｇ：Ｔ、Ｇ：Ａなど）の数、相対位置及びタイプに依存する（Ｓ．Ｈ．Ｋｅ及びＷａｒｔｅｌｌ，Ｒ．１９９３．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ｌｏｎｇ ＤＮＡ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：５１３７−５１４３）。従って、標的産物のサイズ及び配列が既知である場合、融解温度によって特定の単位複製配列の存在を確認することが可能である。同様に、配列多様性による融解温度差に基づき、２つの異なる種を識別することが可能である。ＰＣＲベースの検出システムにおける融解曲線解析の実用性及び有用性は周知である。
一実施形態では、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるトリアゾール耐性に特異的な真菌ＤＮＡ領域は、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択される分子ビーコンプローブを用いて検出される。別の実施形態では、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるトリアゾール耐性に関与する真菌ＤＮＡ領域は、配列番号３及び４のプライマーを用いて増幅される。
一部の実施形態では、本発明の検出法は内部増幅制御を更に含む。
（試料）
（試料）
任意の好適な試料を用いることができる。一実施形態では、生体試料が用いられる。生体試料は任意の生物体から得られ、又は抽出される。
一態様では、体液のような液体試料が用いられる。典型的な試料には、限定されないが、尿、リンパ液、唾液、脳脊髄液、腹水、心膜液、硝子体又は他の眼球試料、複合液、膣液、粘液、膿汁又は羊水が含まれるが、血液、血漿及び血清が好ましい。試料は、細胞又は組織試料、例えば、肺、脳、肝臓、皮膚又は爪でよい。
一例では試料はヒトに由来するものであり、一方、別例ではヒトに由来しない試料が用いられる。例えば、試料は、ウマ、ウシ、ヒツジ若しくはブタのような商業的に飼育された動物由来又はネコ若しくはイヌのような愛玩動物に由来するものでよい。植物由来の試料も評価することができる。
本発明方法は、非生体試料に対しても適用できる。非生体試料は、液体又は固体でよい。非生体試料の例には、手術液、空気、土壌、飲料水のような水、実験室試験用の試薬及び家庭用容器が含まれるが、これに限定されない。或いは、非生体試料は、空気、水、別の液体又は物質を含む粒子捕集デバイスでよい。
一実施形態では、試料は、例えば、遠心分離により、又は赤血球のような不要な分子若しくは細胞を除去する膜の通過により、試験される前に処理される。或いは、試料は試験前に、例えば、ＰＣＲによって増幅され得る。ある場合には、試料は単離直後又は単離後間もなく試験され、一方、別の場合には、試料はアッセイ前に、例えば、−７０℃以下で保存される。
（キット）
（キット）
一態様では、試料中のトリアゾール耐性真菌を検出するためのキットが提供される。一実施形態では、キットは、配列番号５若しくは６の核酸配列又は配列番号５若しくは６との９０％超の相同性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、標識を含むことができ、キットは、１つ以上の増幅プライマーを更に含むことができる。別の実施形態では、キットは、配列番号７、配列番号８又は配列番号９の核酸配列を有する分子ビーコンプローブと、配列番号３及び４の核酸配列を有する増幅プライマーとを含む。
他の実施形態では、キットは、試料から真菌ＤＮＡ若しくはＲＮＡを抽出するための試薬及び／又は真菌ＤＮＡ領域を増幅するために用いることができるプライマー及び／又は増幅・検出段階のための内部制御を含むことができる。キットは、本発明の方法が実施されることを可能にする１つ以上の試薬又は器具を更に含むことができる。そのような試薬又は器具には、例えば、１つ以上の次のもの：好適な緩衝液（水溶液）、対象から試料を得る手段（例えば、針を含む容器又は器具）又は反応が行われ得る穴を含む支持体が含まれる。液体試料が試薬を再懸濁させるように、試薬は乾燥状態であり得る。キットは、トリアゾール耐性真菌の存在を検出するための試薬を使用するための説明書も含むことができる。
Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ｔａｃ１ｐ配列［ＡＢＤ８５２８９．１］を用いて、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ゲノムを調べた。８つの推定Ｚｎ２Ｃｙｃ６転写因子を、同定した（図１）。ＣＥＱ ８０００キャピラリー電気泳動ＤＮＡシークエンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）を用いて、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のトリアゾール感受性株及びトリアゾール耐性株から、推定Ｚｎ２Ｃｙｃ６転写因子を配列決定した。
ＡＢＣトランスポーターを過剰発現することが既知のよく特徴付けられたイトラコナゾール耐性株から、８つの推定Ｃ６転写因子（ＴＦ）を増幅した。Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００３）４７：１７１９−２６。推定変異ＴＦを野生型レシピエント株に導入し、１０μｇ／ｍｌのイトラコナゾールに対する抵抗性に関して形質転換体をスクリーニングした。３７℃で４８時間の増殖後、０．０１〜１６．０μｇ／ｍｌの存在下、ＲＰＭＩ １６４０培地において米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）Ｍ３８−Ａ微量希釈法により、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。
イトラコナゾールに対する強力な抵抗性を付与し（ＭＩＣ＞１６μｇ／ｍｌ）、かつ、ボリコナゾールに対する交差抵抗性を示す（ＭＩＣ＞８．０μｇ／ｍｌ）、第５染色体（ＧｅｎｅＢａｎｋ番号ＸＰ７５３９５３）上に位置するＡｚＲＦ１という名称の変異株におけるＴＦを同定した。ＡｚＲＦ１は、Ｔａｃ１蛋白質（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＤ８５２８９．１）との３５％の配列同一性を有する、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＴａｃ１と密接に関連するＣ６転写因子である。
変異ＡｚＲＦ１は、１６７５−１６８６位においてＣＴＣＡＧＴの２つのヌクレオチド反復の欠失を含み（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿７４８８６０）、その結果、５５９−５６３位における４つのアミノ酸（ＱＳＱＳ）の喪失となる。図２を参照されたい。
変異ＡｚＲＦ１対立遺伝子のＡ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）野生型株ＡＴＣＣ １３０７３への導入は、イトラコナゾールに対する抵抗性（ＭＩＣ＞１６．０μｇ／ｍｌ）及びボリコナゾールに対する交差抵抗性（ＭＩＣ＞８．０μｇ／ｍｌ）を付与した（表２）。ＡｚＲＦ１−Ｍ株によって示されたトリアゾール抵抗性が、変異ＡｚＲＦ１遺伝子の存在によるものかを判定するため、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のＡｚＲＦ１ ＰＣＲ産物を、自己複製プラスミドであるｐＲＧ３−ＡＭＡ１−Ｂａｍ ＨＩにクローニングした（表１）。ｐＲＧ３−ＡＭＡ１−ＡｚＲＦ１プラスミドを、トリアゾール感受性Ｋｕ８０株に形質転換した。自己複製プラスミドに変異ＡｚＲＦ１を含む、得られた変異ＡｚＲＦ１−Ａもトリアゾール剤に対して抵抗性を示した（表２）。薬剤非含有最少培地での１０回の継代培養によって、ｐＲＧ３−ＡＭＡ１−ＡｚＲＦ１プラスミドの喪失が達成され、ＡｚＲＦ１−Ｒ株となった。ＡｚＲＦ１−Ｒ株におけるｐＲＧ３−ＡＭＡ１−ＡｚＲＦ１プラスミドの喪失を、ＰＣＲによって確認した。ＡｚＲＦ１−Ｒ株は、トリアゾール剤に対する感受性を回復していた（表２）。
本試験で用いたアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）親株、派生変異株及びプラスミドを、以下の表１に示す。
このデータは、ＡｚＲＦ１における変異がＡ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）においてトリアゾール剤に対する抵抗性を付与することを示す。この知見は、アスペルギルス感染症におけるトリアゾール耐性のマーカーとしての臨床的意義を有する。
Claims (16)
- 試料中のトリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）を検出する方法であって、
（Ａ）ＡｚＲＦ１転写因子が５５９−５６２位における残基ＱＳＱＳの欠失の変異を含む、前記ＡｚＲＦ１転写因子（配列番号２）をコードする遺伝子の存在に関して前記試料を評価するステップと、
（Ｂ）前記変異の存在を前記トリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の存在と関連付けるステップとを、
含む方法。 - 前記評価が、前記遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記評価が、前記試料を前記変異遺伝子とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション前に前記変異遺伝子を増幅するステップを更に含む、請求項３に記載の方法。
- 前記増幅がＰＣＲを含む、請求項４に記載の方法。
- 前記増幅が、前記試料を配列番号３及び配列番号４の核酸配列を有するプライマーと接触させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、フルオロフォア及び発色団を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、フルオロフォア及び非蛍光性クエンチャーを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５又は配列番号６の核酸配列を含む、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５又は配列番号６の核酸配列との９０％超の相同性を含む、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号７、配列番号８又は配列番号９の核酸配列を含む、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記トリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）が、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）である、請求項１に記載の方法。
- 前記トリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）が、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、イサブコナゾール又はラブコナゾールに対して耐性を示す、請求項１に記載の方法。
- 試料中のトリアゾール耐性アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）を検出するためのキットであって、配列番号５若しくは配列番号６の配列又は配列番号５若しくは配列番号６との９０％超の相同性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、キット。
- 前記オリゴヌクレオチドが標識を含み、前記キットが１つ以上の増幅プライマーを更に含む、請求項１５に記載のキット。
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