PT2152910E - Detecção de resistência a triazol em aspergillus - Google Patents

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PT2152910E
PT2152910E PT08747528T PT08747528T PT2152910E PT 2152910 E PT2152910 E PT 2152910E PT 08747528 T PT08747528 T PT 08747528T PT 08747528 T PT08747528 T PT 08747528T PT 2152910 E PT2152910 E PT 2152910E
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aspergillus
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triazole
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Eleusa Maria F Rocha
Steven Park
David S Perlin
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Myconostica Ltd
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Description

1
DESCRIÇÃO "DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA A TRIAZOL EM ASPERGILLUS" Descrição
REFERÊNCIA CRUZADA A DEPÓSITOS DE PATENTES RELACIONADOS
Este pedido de patente reivindica prioridade para o pedido de patente provisório No. 60/916.193, depositado em 4 de Maio 2007.
ANTECEDENTES
As infecções fúngicas são uma causa significativa de morbilidade e mortalidade numa variedade de pacientes gravemente doentes. Por exemplo, os fungos podem causar infecções superficiais e disseminadas com frequência fatais em pacientes imunocomprometidos. As infecções fúngicas sistémicas causam aproximadamente 25 % das mortes relacionadas com infecção em pacientes com leucemia e 5-10 % das mortes em pacientes que sofrem transplante de pulmão, pâncreas ou fígado. Sabe-se também que a septicemia fúngica adquirida ocorre em até 13 % das crianças que nasceram com peso muito baixo. Membros do género Aspergillus são a segunda causa mais comum de infecções fúngicas a seguir aos membros do género Candida.
As infecções fúngicas causadas por membros do género do Aspergillus comummente são tratadas com triazóis. Os triazóis actuam pelo bloqueio da via biossintética do ergosterol na etapa de desmetilação de C-14. Chamilos et ai. Drug Resistence Updates (2005) 8:344-358. Triazóis incluem, por exemplo, voriconazol, isavuconazol, ravuconazol, itraconazol e posaconazol. Embora os triazóis tenham sido eficazes no tratamento de infecções fúngicas por Aspergillus, há um aumento em resistência de
Aspergillus a tratamento com triazol. Chamilose et al., 2 supra. Tal resistência pode tornar o tratamento com triazol ineficaz.
Reconhecer se uma infecção fúngica particular compreende Aspergillus resistente a triazol é importante em proporcionar o cuidado apropriado a pacientes. Assim, são necessários métodos para determinar se um fungo Aspergillus particular é susceptível a tratamento com triazol.
SUMÁRIO
Num aspecto, são proporcionados métodos para detectar fungos resistentes a triazol numa amostra que compreende avaliar a amostra para a presença de um gene que codifica um factor de transcrição de AzRFl mutante, em que o AzRFl mutante contém uma deleção de resíduos QSQS na posição 559-562 do dito gene e correlacionar a presença do gene mutante com a presença do fungo resistente a triazol. Em alguns aspectos, a avaliação envolve medir o nível de expressão do dito gene. Em algumas formas de realização, a avaliação compreende colocar em contacto a dita amostra com um oligonucleótido capaz de hibridar com o dito gene mutante. 0 oligonucleótido pode compreender um marcador detectável. Num exemplo, o oligonucleótido compreende um fluoróforo e um cromóforo, enquanto em outro, o oligonucleótido compreende um fluoróforo e um extintor não fluorescente.
Em algumas formas de realização, o oligonucleótido compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Numa forma de realização, o oligonucleótido pode compreender mais de 90 % de homologia com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em outras, o oligonucleótido pode compreender a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9.
Em alguns aspectos, o gene mutante é amplificado antes da dita hibridação. A amplificação pode compreender PCR. A amplificação também pode compreender colocar em contacto a 3 amostra com iniciadores que têm a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.
Em outras formas de realização, o fungo resistente a triazol pertence ao género Aspergillus. 0 fungo resistente a triazol pode ser Aspergillus fumigatus.
Em alguns casos, o fungo resistente a triazol é resistente a itraconazol, posaconazol, voriconazol, isavuco-nazol, ou ravuconazol.
Em outra forma de realização, um método de detecção de fungos resistentes a triazol numa amostra compreende (A) avaliar a amostra para a presença de um gene que codifica um factor de transcrição de AzRFl e (B) correlacionar a presença do gene com a presença do fungo resistente a triazol. Em alguns aspectos, a avaliação envolve medir o nivel de expressão do gene.
Em outro aspecto, é proporcionado um kit para detectar fungos resistentes a triazol numa amostra que compreende um oligonucleótido que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 ou uma sequência com mais de 90 % de homologia com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em algumas formas de realização o oligonucleótido compreende uma etiqueta e o kit compreende ainda um ou mais iniciadores de amplificação.
Outros objectos, características e vantagens se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. A descrição detalhada e os exemplos específicos são dados para ilustração. Além disso, os exemplos demonstram o princípio da invenção e não pode ser esperado que ilustrem especificamente a aplicação desta invenção para todos os exemplos onde será obviamente útil para aqueles peritos na especialidade.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra um alinhamento de sequência da região de domínio de ligação a ADN de grupo binuclear de 4
Zn2Cys6 similar a GAL4 dos 8 factores de transcrição putativos em A. fumigatus. A Figura 2 mostra um alinhamento de sequência de aminoácido de factor de transcrição de AzRFl mutante e selvagem. A Figura 3 proporciona uma sequência de ARNm parcial (SEQ ID NO: 1) do factor de transcrição C6 (AzRFl) de Aspergillus fumigatus Af293 (AFUA_5G06800) como notado em
GeneBank a gi|70998461|ref|XM_748860,1. A Figura 4 proporciona a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) da C6 factor de transcrição (AzRFl) de
Aspergillus fumigatus Af293, como notado em GeneBank at gi|70998462|ref|XP_753953,1|.
DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 3, 5'-CGGTTAGCGTCGATGCTGC-3', é um iniciador directo de exemplo para reacções de amplificação. SEQ ID NO: 4, 5'-AGGACATCTCCGAGCGGTC-3', é um iniciador reverso de exemplo para reacções de amplificação. SEQ ID NO: 5, 5'-CCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAT-3', é uma sonda de detecção de exemplo. SEQ ID NO: 6,5'-ACCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATT-3', é outra sonda de detecção de exemplo. 7,5'- uma 5 outra 5 outra SEQ ID NO: CGGCAGCCCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATGCTGCCG-3', é sonda de detecção de exemplo. SEQ ID NO: 8, CGGCGGCACCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATTGCCGCCG-3', é sonda de detecção de exemplo. SEQ ID NO: 9, CGGCGGCCCGCAGTCTCAGTCTCAGTCTCAGTCTCATGCCGCCG-3', é sonda de detecção de exemplo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Os inventores descobriram regiões de ADN especificas para fungos mutantes que são resistente a fármaco de triazol. Consequentemente, estas regiões de ADN podem ser 5 utilizadas para determinar se uma amostra contém fungos resistentes a triazol. Portanto, são proporcionados métodos de detecção de fungos resistentes a triazol, assim como são sondas e iniciadores inovadores que podem ser utilizados para detectar estas regiões.
Detecção de Resistência a Trialzol
Num aspecto, são proporcionados métodos para detectar fungos resistentes a triazol numa amostra que compreende avaliar a amostra para a presença de um gene que codifica um factor de transcrição de AzRFl mutante. Numa forma de realização, os métodos compreendem avaliar a amostra para a presença de um gene que codifica um factor de transcrição de AzRFl mutante, em que o AzRFl mutante contém uma deleção de resíduos QSQS na posição 559-562 do gene e correlacionar a presença do gene mutante com a presença do fungo resistente a triazol.
Em outra forma de realização, a resistência a trialzol pode ser avaliada em fungos pela medição da actividade do AzRFl gene nos fungos. Em particular, descobriu-se que fungos resistentes a triazol possuem quantidades anormais de factor de transcrição de AzRFl. Assim, medir o número de cópias do gene de AzRFl ou seus níveis de expressão pode ser útil para detectar resistência a trialzol. Em alguns aspectos, tais métodos de detecção envolvem determinar se a actividade do gene de AzRFl na estirpe de fungo de teste é 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes ou mais superior aos níveis típicos.
As amostras podem ser obtidas a partir de fontes biológicas ou não biológicas. Exemplos de fontes biológicas incluem, mas não são limitadas a, fluido biológico, tecido, ou uma combinação dos mesmos. Exemplos de fontes não biológicas incluem, mas não são limitadas a, amostras obtidas do ambiente, tal como uma amostra de ar, uma amostra de água, uma amostra de solo, ou combinações das mesmas. Outros exemplos de fontes não biológicas são uma 6 peça de um veículo, embarcação, aeronave, prédio ou residência.
Numa forma de realização, são proporcionados métodos para a rápida detecção da presença ou ausência numa amostra de um fungo resistente a triazol que pertence ao género Aspergillus. Os métodos envolvem detectar na amostra uma região de ADN de fungo que é específica para Aspergillus resistente a triazol. A presença numa amostra de uma região de ADN de fungo que é especifica para um género resistente a triazol particular é indicativa da presença de um fungo que pertence a esse tipo de género. A ausência da amostra de uma região de ADN de fungo que é específica para um género resistente a triazol particular é indicativa da ausência de um fungo que pertence a esse tipo de género. Métodos para detectar a presença de um fungo resistente a triazol que pertence ao género Aspergillus podem ser levados a cabo em qualquer amostra. Os tipos de amostra específicos são discutidos em mais detalhe a seguir. Numa forma de realização, os métodos são levados a cabo numa amostra que se sabe que contém um fungo. Por exemplo, os métodos podem ser levados a cabo numa amostra que já foi submetida a um método de detecção panfúngico e foi conseguido um resultado positivo. Os métodos também podem ser levados a cabo numa amostra para confirmar a identidade de um ou mais fungos resistentes a triazol cuja presença na amostra é conhecida. Em outra forma de realização, os métodos são levados a cabo numa amostra que não se sabe que contém fungo.
Em algumas formas de realização, os métodos de detecção podem ser utilizados para detectar a presença ou ausência de qualquer espécie de fungo resistente a triazol que pertence ao género Aspergillus. Por exemplo, o fungo pode ser Aspergillus alliaceus, Aspergillus alutaceus, Aspergillus atroviolaceus, Aspergillus caesiellus,
Aspergillus candidus, Aspergillus carneus, Aspergillus 7 chevalieri, Aspergillus clavato-nanicus, Aspergillus clavatus, Aspergillus conicus, Aspergillus deflectus, Aspergillus fischerianus, Aspergillus flavipes, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus hollandicus, Aspergillus janus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamorii, Aspergillus niveus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus penicilloides, Aspergillus reptans, Aspergillus restrictus, Aspergillus rubrobrunneus, Aspergillus spinosus, Aspergillus sydowii, Aspergillus tamarii, Como-pergillus terreus, Aspergillus tetrazonus, Aspergillus unguis, Aspergillus ustus ou Aspergillus versicolor.
Numa forma de realização, a região de ADN de fungo que é específica para Aspergillus resistente a própria triazol ("a região de fungo") é detectada. Em outra forma de realização, qualquer ARN transcrito a partir da região de ADN de fungo é detectada.
Numa forma de realização, somente a região de fungo é detectada. Em outra forma de realização, a região de fungo é detectada como parte de sequência mais longa. Por exemplo, a região pode ser detectada como parte de uma sequência que tem sequências flanqueantes. A região de fungo pode ser detectada utilizando qualquer método conhecido no estado da técnica. A região de fungo é preferivelmente detectada utilizando uma sonda que especificamente híbrida com a região. Num aspecto, a detecção compreende colocar em contacto a sonda com a amostra sob condições em que a sonda especificamente híbrida com a região, se estiver presente, e determinar a presença ou ausência do produto de hibridação. A presença do produto de hibridação indica a presença da região de fungo. De modo inverso, a ausência do produto de hibridação indica a ausência da região de fungo. 8 A sonda é tipicamente um ácido nucleico, tal como ADN, ARN, PNA ou um ácido nucleico sintético. Uma sonda especificamente híbrida com as regiões de fungo se preferencialmente ou selectivamente híbrida com a região de fungo e não a outras sequências de ADN ou ARN.
Numa forma de realização, uma sonda especificamente híbrida com a região de fungo sob condições restringentes. Condições de hibridação de várias restringências são bem conhecidas no estado da técnica (por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press; e Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2; Ausubel et al., Eds. , Greene Publishing e Wiley-lnterscience, Nova Iorque (1995)) . A detecção pode ser levada a cabo sob condições de baixa restringência, por exemplo, na presença de uma solução tamponada de 30 a 35 % de formamida, 1 M de NaCl e 1 % de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37 °C seguido por uma lavagem em desde IX (0, 1650 M Na+) até 2X (0,33 M de Na+) de SSC (citrato de sódio padrão) a 50 °C. A detecção pode ser levada a cabo sob condições de restringência moderada, por exemplo, na presença de uma solução tampão de 40 a 45 % de formamida, 1 M de NaCl, e 1 % de SDS a 37 °C, seguido por uma lavagem em desde 0,5X (0,0825 M de Na+) até IX (0, 1650 M de Na+) de SSC a 55 °C. A detecção pode ser levada a cabo sob condições de restringência elevada, por exemplo, na presença de uma solução tamponada de 50 % de formamida, 1 M de NaCl, 1 % de SDS a 37 °C, seguido por uma lavagem em 0,1 X (0,0165 M de Na+) de SSC a 60 °C. A sonda pode ser do mesmo comprimento que, mais curta que ou mais longa que a região de fungo. A sonda é de tipicamente pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 75 ou pelo menos 100 nucleótidos de comprimento. Por exemplo, a sonda pode ser 9 desde 5 até 200, desde 7 até 100, desde 10 até 50 nucleótidos em comprimento. A sonda é preferivelmente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucleótidos de comprimento. A sonda preferivelmente inclui uma sequência que comparte pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % de homologia com base em identidade de sequência com a região de fungo. A homologia pode ser determinada como foi discutido anteriormente.
Numa forma de realização, a sonda é marcada de forma detectável. Qualquer etiqueta detectável pode ser utilizada. Etiquetas adequadas incluem, mas não são limitadas a, moléculas fluorescentes, radioisótopos, por exemplo, I, S, enzimas, anticorpos e ligantes, tal como biotina. A sonda pode ser uma sonda molecular de guia. Veja-se, por exemplo, a Pat. U.S. No. 6.150.097. Sondas moleculares de guia compreendem uma etiqueta fluorescente numa extremidade e uma molécula de extinção na outra. Na ausência da região a ser detectada, a sonda forma uma ansa de grampo de cabelo e a molécula de extinção é trazida em proximidade imediata com a etiqueta fluorescente de modo que nenhum sinal pode ser detectado. Sob hibridação da sonda com a região a ser detectada, a ansa abre e a molécula fluorescente é separada do extintor tal que um sinal pode ser detectado. As combinações de molécula fluorescente e extintor adequadas para utilização em guias moleculares são conhecidas no estado da técnica. Tais combinações incluem, mas não são limitadas a, carboxifluorseceina (FAM) e dabcilo.
Numa forma de realização, a sonda pode ser imobilizada num suporte utilizando qualquer tecnologia que é conhecida no estado da técnica. Suportes sólidos adequados são bem conhecidos e incluem placas, tal como placas de multipoços, 10 filtros, membranas, pérolas, chips, pinos, varetas e portadores porosos.
Num aspecto, a detecção da região de fungo compreende amplificar a região de fungo ou o ARN transcrito da mesma. Numa forma de realização, a região é amplificada antes de sua presença ser determinada. Em outra forma de realização, a região é detectada em tempo real conforme sua presença é determinada. Os métodos de tempo real são revelados nos exemplos e foram descritos no estado da técnica. Tais métodos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.487.972 e 6.214.979 e em Afonia et al. (Biotechniques, 2002; 32: 946-9), todos dos quais são pela presente incorporados por referência.
Numa forma de realização, somente a região a ser detectada é amplificada. Em outras formas de realização, a região a ser detectada é amplificada como parte de um comprimento mais longo de ADN ou ARN de fungo. Sequências de ADN ou ARN que têm pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 400 ou pelo menos 500 nucleótidos e que compreendem a região a ser detectada podem ser amplificadas. Por exemplo, sequências que têm desde 10 até 2000, desde 20 até 1500, desde 50 até 1000 ou desde 100 até 500 nucleótidos podes ser amplificadas. Tais sequências podem ser localizadas a montante do gene alvo para fármacos antifúngicos de triazol (14 alfa desmetilase de outro modo conhecido como Cyp51A ou Cyp 51B) e controlar a expressão dos ditos genes. 0 ADN ou ARN pode ser amplificado utilizando métodos de rotina que são conhecidos no estado da técnica. Em algumas formas de realização, a amplificação de ADN de fungo é levada a cabo utilizando reacção em cadeia da polimerase (PCR) (Veja-se, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 11 4.683.195 e 4.683.202); reacção em cadeia da ligase ("LCR") (Veja-se, por exemplo, Landegren et al., Science 241:1077-1080 (1988); D. Y. Wu e R. B. Wallace, Genomics 4:560-569 (1989); e F. Barany, PCR Methods Appl. 1:5-16 (1991)); amplificação isotérmica mediada por ansa ("LAMP") (Nagamin et al., Clin. Chem. 47(9):1742-1743 (2001); Notomi et al., Nucleic Acids Res. 28(12): E63 (2000)); análise com base em sequência de ácido nucleico (NASBA)( J. Compton, Nature 350:91-92 (1991)); replicação de sequência auto-sustentada ("3SR")( Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87(5):1874-1878 (1990)); amplificação com deslocamento de cadeia ("SDA") (Walquer et ai., Nucleic Acids Res., 20:1691-1696 (1992); e Walquer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Um. 89:392-396 (1992)); ou amplificação mediada por transcrição ("TMA") (Pasternack et ai., J. Clin. Microbiol. 35(3): 676-678 (1997)).
Geralmente um perito na especialidade pode facilmente desenhar iniciadores específicos para amplificar um ácido nucleico que compreende a região da deleção descoberta e o factor de transcrição de AzRFl. Iniciadores são normalmente desenhados para ser complementares às sequências na extremidade da sequência a ser amplificada, mas não complementar a qualquer outra sequência. O desenho do iniciador é discutido em, por exemplo, Sambrook et al., 2001, supra.
Amplicões podem ser detectados utilizando qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo aqueles descritos anteriormente. Numa forma de realização, um formato de sonda de hidrólise (por exemplo, TAQMAN) com fraeção de ligador de ranhura menor (MGB) pode ser utilizado para detectar amplicões. Em outra forma de realização, um corante de cianina que se liga a ADN de cadeia dupla pode ser utilizado. Corantes de cianina de exemplo incluem, mas não são limitados a, SYBR GREEN II, 12 SYBR GOLD, YO (Oxazol Yellow), TO (Thiazol Orange), e PG (PicoGreen).
Em outras formas de realização, a etapa de teste pode compreender conduzir uma análise de curva de fusão. Representações gráficas de inspecção de fluorescência versus temperatura no final do PCR podem proporcionar informação adicional quando certos corantes ou formatos de sonda são utilizados. Por exemplo, com o corante SYBR Green, a pureza e a identidade dos produtos de PCR podem ser confirmadas através de suas temperaturas de fusão. De maneira similar, quando sondas de hibridação são utilizadas, alterações de sequência, incluindo polimorfismos, podem ser distinguidas pela temperatura de fusão da sonda.
Num exemplo, imediatamente após o último ciclo de PCR, as amostras são desnaturadas a 90 °C ~95 °C, arrefecidas até aproximadamente 5 °C ~10 °C abaixo do intervalo da Tm de interesse e então lentamente aquecidas a uma taxa de rampa tipicamente que varia desde 0,1 até 0,4 °C/s, enquanto a fluorescência é continuamente monitorizada. Uma diminuição notável em fluorescência é observada quando uma temperatura é alcançada na qual, dependendo das quimica de fluorescência particular, (A) uma sonda dissocia do amplicão (no caso de sondas de hibridação) ou (b) o produto de PCR de cadeia dupla dissocia em ADN de cadeia simples. A transição de fusão não ocorre toda de uma vez, mas ocorre ao longo de um pequeno intervalo de temperaturas. A metade da declive da curva de fusão na representação gráfica de fluorescência versus temperatura é referida como a Tm. A temperatura de fusão ou Tm é uma medida da estabilidade térmica de um ADN duplex e é dependente de factores, incluindo o comprimento, conteúdo de G/C e posição relativa de cada tipo de nucleótido (A, T, G, C, etc.) (Wetmur, J. G. 1997. DNA Probes: applications of the principies od nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem 13
Mol Biol. 26:227-259) . A temperatura de fusão é ainda dependente do número, posição relativa, e tipo de falta de coincidências de nucleótido (A:A, A:G, G:T, G:A, etc), que pode ocorrer entre ADN:ADN ou Sonda:ADN duplexes (S.H. Ke e Wartell, R. 1993. Influence of nearest neighbor sequence on the stability of base pair mismatches in long DNA: determination by temperature-gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Res 21:5137-5143..) É, portanto, possível confirmar a presença de um amplicão particular por meio de temperatura de fusão se o tamanho e a sequência do produto alvo é conhecida. Do mesmo modo, é possível diferenciar duas espécies distintas com base em temperatura de fusão diferencial devido a variação de sequência. A natureza prática e a utilidade da análise de curva de fusão em sistemas de detecção com base em PCR é bem conhecida.
Numa forma de realização, a região de ADN de fungo que é especifica para resistência a trialzol em Aspergillus é detectada utilizando uma sonda molecular de guia seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9. Em outra forma de realização, a região de ADN de fungo responsável pela resistência a trialzol em Aspergillus é amplificada utilizando os iniciadores de SEQ ID NOs: 3 e 4.
Em algumas formas de realização, os métodos de detecção da invenção compreendem ainda um controlo de amplificação interno.
Amostras
Qualquer amostra adequada pode ser utilizada. Numa forma de realização, uma amostra biológica é utilizada. A amostra biológica pode ser obtida a partir de ou extraída de qualquer organismo.
Num aspecto, uma amostra de fluido é utilizada, tal como um fluido corporal. Amostras de exemplo incluem, mas não são limitadas a, urina, linfa, saliva, fluido cerebrospinal, fluido peritoneal, fluido pericardíaco, 14 vítreo ou outra amostra ocular, fluido plural, fluido vaginal, muco, pus ou fluido amniótico, mas é preferivelmente sangue, plasma e soro. A amostra pode ser uma amostra de célula ou tecido, tal como pulmão, cérebro, fígado, pele ou unhas.
Num exemplo, uma amostra é de origem humana, enquanto em outro são utilizadas amostras não humanas. Por exemplo, a amostra pode ser de animais de criação agrícola tais como cavalos, gado, ovelha ou porcos ou de animais domésticos tais como gatos ou cães. Amostras de plantas também podem ser avaliadas.
Os métodos também podem ser realizados em amostras não biológicas. A amostra não biológica pode ser um fluido ou um sólido. Exemplos de amostras não biológicas incluem, mas não são limitadas a, fluidos cirúrgicos, ar, solo, água, tal como água potável, reagentes para testes de laboratório e contentores domésticos. Alternativamente, a amostra não biológica pode ser um dispositivo de colheita de partícula que contém ar, água, outro líquido ou material.
Numa forma de realização, uma amostra é processada antes de ser testada, por exemplo, por meio de centrifugação ou por meio de passagem através de uma membrana que retira por filtração moléculas ou células indesejadas, tal como células vermelhas do sangue. Alternativamente, uma amostra pode ser amplificada, por exemplo, por meio de PCR, antes de testar. Em alguns casos, uma amostra é testada imediatamente ou logo após o isolamento, enquanto em outros uma amostra é armazenada, por exemplo, abaixo de -70 °C, antes do ensaio.
Kit s
Num aspecto, são proporcionados kits para detectar fungos resistentes a triazol numa amostra. Numa forma de realização, um kit compreende um oligonucleótido que tem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NOS: 5 ou 6 ou uma sequência com mais de 90 % de homologia para a SEQ ID NOS: 15 5 ou 6. 0 oligonucleótido pode compreender uma etiqueta, e o kit pode compreender ainda um ou mais iniciadores de amplificação. Em outra forma de realização, o kit compreende uma sonda molecular de guia que têm a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 e iniciadores de amplificação que têm as sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 3 e 4.
Em outras formas de realização, os kits podem compreender reagentes para extrair ADN ou ARN de fungo a partir de uma amostra e/ou iniciadores que podem ser utilizados para amplificar a região de ADN de fungo e/ou um controlo interno para a amplificação e estágios de detecção. 0 kit adicionalmente pode compreender um ou mais reagentes ou instrumentos que possibilitam que os métodos inventivos sejam levados a cabo. Tais reagentes ou instrumentos incluem, por exemplo, um ou mais dos seguintes: tampão(ões) adequados (soluções aquosas), meios para obter uma amostra a partir do sujeito (tal como um contentor ou um instrumento que compreende uma agulha) ou um suporte que compreende poços em que as reacções podem ser feitas. Os reagentes podem estar num estado seco, tal que uma amostra de fluido ressuspende os reagentes. 0 kit também pode compreender instruções para utilização dos reagentes para detectar a presença de um fungo resistente a triazol.
Exemplo 1 0 genoma de Aspergillus fumigatus foi examinado utilizando uma sequência de C. albicans tac 1 p [ABD85289.1]. Oito factores de transcrição de Zn2Cyc6 putativos foram identificados (Figura 1) . Os factores de transcrição de Zn2Cyc6 putativos foram sequenciados a partir de uma estirpe susceptível a triazol e uma estirpe resistente triazol de Aspergillus fumigatus utilizando um sequenciador de ADN por electroforese de capilaridade CEQ 8000 (Beckman coulter, Inc., Fullerton, CA). 16
Os oito factores de transcrição putativos C6 (TFs) foram amplificados a partir de uma estirpe resistente a itraconazol bem caracterizada conhecida por sobre-expressar transportadores ABC. Nascimento et ai. Antimicrob. Agents Chemother. (2003) 47:1719-26. Os mutantes putativos TFs foram introduzido numa estirpe receptora de tipo selvagem e transformantes examinados para resistência a 10 pg/ml de itraconazol. As concentrações de inibição mínimas (MICs) foram determinadas pelo método de microdiluição M38-A do National Committee for Clinicai Laboratory Standards (NCCLS) em meio RPMI 1640 na presença de 0,01 a 16,0 pg/ml após 48 horas de crescimento a 37 °C.
Um TF na estirpe mutante, denominado AzRFl, localizado no cromossoma 5 (número de GenBank XP_753953) foi identificado que conferia forte resistência a itraconazol (MIC >16 pg/ml) e mostrou resistência cruzada a voriconazol (MIC > 8,0 pg/ml). AzRFl é um factor de transcrição C6 que está intimamente relacionado com Taci de C. albicans com 35 % de identidade de sequência para as proteínas Taci (número de acesso de GeneBank ABD85289.1). 0 mutante AzRFl contém uma deleção de duas repetições de nucleótido de CTCAGT na posição 1675-1686 (número de acesso de GeneBank XM_748860), que resultam na perda de quatro aminoácidos (QSQS) na posição 559-563. Veja-se a Figura 2. A introdução do alelo do mutante AzRFl na estirpe de A. fumigatus de tipo selvagem ATCC 13073 conferiu resistência a itraconazol (MIC>16,0 pg/ml) e resistência cruzada a voriconazol (MIC>8,0 pg/ml) (quadro 2). Para determinar se a resistência a trialzol mostrada pela estirpe AzRFl-Μ era dependente da presença do gene mutante AzRFl, o produto de PCR AzRFl de A. fumigatus foi clonado em pRG3-AMAl-Bam Hl, um plasmídeo de replicação autónomo (Quadro 1). O Plasmídeo pRG3-AMAl- AzRFl foi transformado 17 na estirpe susceptível a triazol Ku80. 0 mutante derivado AzRFI-A, contendo o mutante AzRFl num plasmídeo de replicação autónomo foi também resistente a fármaco de triazol (quadro 2). A perda do plasmideo pRG3-AMAI-AzRFl foi conseguida em 10 série de subcultura no meio minimo livre de fármaco que resultou na estirpe AzRFl-R. A perda de plasmideo pRG3-AMAl- AzRFl na estirpe AzRFl-R foi confirmada por meio de PCR. A estirpe AzRFl-R restaurou a sensibilidade a fármaco de triazol (quadro 2).
As estirpes parentais de Aspergillus fumigatus, mutantes derivados e plasmideos utilizados neste estudo são descritas a seguir no Quadro 1.
Quadro 1. Estirpes e plasmideos utilizados neste estudo
Estirpe / Plasmideo ATCC 13073 Genotipo / Descrição estirpe de A. fumigatus de tipo selvagem Fonte ATCC KY80 DELTA A. fumigatus pyrGAF::Delta KU80; estirpe de tipo selvagem sensível a fármacos de equinocandina da Silva et al. Eukaryot. Cell, 5:207-11 (2006) . AzRFl-M mutante de AzRFl recombinante homólogo de ATCC 13073 formado seguindo a transformação com AzRFl produto de PCR mutante Este estudo 18(cont.)
Estirpe / Plasmídeo ATCC 13073 Genotipo / Descrição estirpe de A. fumígatus de tipo selvagem Fonte ATCC AzRFl-H mutante de AzRFl recombinante homólogo de KU80 formado seguindo transformação com pRG3-(pyr4)-AMAl linear cortado com Bam Hl Este estudo AzRFl-A mutante AzRFl de KU80 transformado com plasmídeo de replicação não cortado de maneira autónoma pRG3-(pyr4)-AMAl-AzRFl; também contém AzRFl de tipo selvagem Este estudo AzRFl-R Estirpe derivada de AzRFl-A após plasmídeo evicção Este estudo pRG3-AMAl Contém genes de A. nidulans AMAI e pyr4 Aleksenko et al. Mol. Microbiol. (1996) 19:565-74; Aleksenko et al. Fungai Genet. Biol. (1997) 21:373-87; e Liu et al. Antimicrob. Agents Chemother. (2004) 48:2490-6 pRG3-AMAI-AzRFl Contém A. fumígatus mutante fksl - AzRFl em pRG3-(pyr4)-AMAI
Estirpe MIC (pg/ml) ITRACONAZOL VORICONAZOL ATCC 13073 0, 25 0, 06 AzRFl-M >16,0 >8, 0 KU80 DELTA 0, 25 0, 06
Quadro 2. Susceptibilidades ao antifúngico Triazol de _estirpe parental e mutantes derivados_ 19
Estirpe MIC (pg/ml) ITRACONAZOL VORICONAZOL AzRFl-H >16, 0 >8,0 AzRFl-A >16, 0 >8,0 AzRFl- R >16,0 >8,0
Esta dado demonstra que uma mutação em AzRFl confere resistência a fármaco de triazol em A. fumigatus. Este achado pode ter significância clínica como um marcador para resistência a trialzol em infecções Aspergillus. 20
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 91619307 P [0001] • US 6150097 A [0038] • US 5487972 A [0040] • US 6214979 A [0040] • US 4683195 A [0042] • US 4683202 A [0042]
Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Chamilos et al. Drug Resistance Updates, 2005, vol. 8, 344-358 [0003] • Sambrook et al. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001 [0035] • Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley-lnterscience, 1995 [0035] • Afonia et al. Biotechniques, 2002, vol. 32, 946-9 [0040] • Landegren et al. Science, 1988, vol. 241, 1077-1080 [0042] • D.Y. Wu ; R.B. Wallace. Genomics, 1989, vol. 4, 560-569 [0042] • F. Barany. PCR Methods Appl., 1991, vol. 1, 5-16 [0042] • Nagamin et al. Clin. Chem., 2001, vol. 47 (9), 1742-1743 [0042] • Notomi et al. Nucleic Acids Res., vol. 28 (12), E63 [0042] • J. Compton. Nature, 1991, vol. 350, 91-92 [0042] 21 • Guatelli et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1990, vol. 87 (5), 1874-1878 [0042] • Walker et al. Nucleic Acids Res., 1992, vol. 20, 1691- 1696 [0042] • Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1992, vol. 89, 392-396 [0042] • Pasternack et al. J. Clin. Microbiol., 1997, vol. 35 (3), 676-678 [0042] • Wetmur, J.G. DNA Probes: applications of the principies of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol., 1997, vol. 26, 227-259 [0047] • S.H. Ke; Wartell, R. Influence of nearest neighbor sequence on the stability of base pair mismatches in long DNA: determination by temperature-gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Res, 1993, vol. 21, 5137- 5143 [0047] • Nascimento et al. Antimicrob. Agents Chemother., 2003, vol. 47, 1719-26 [0058] • da Silva [0062] et al. Eukaryot. Cell, 2006, vol. 5, 207-11 • Aleksenko et al. Mol. Microbiol., 1996, vol. 19, 565-74 [0062] • Aleksenko et al. Fungai Genet. Biol., 1997, vol. 21, 373-87 [0062] • Liu et al. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, vol. 48, 2490-6 [0062]

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de detecção de Aspergillus resistente a triazol numa amostra que compreende (A) avaliar a dita amostra para a presença de um gene que codifica um factor de transcrição de AzRFl {SEQ ID NO: 2), em que o dito factor de transcrição de AzRFl contém uma mutação de uma deleção de residuos QSQS na posição 559-562 e (B) correlacionar a presença da dita mutação com a presença do dito Aspergillus resistente a triazol. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a avaliação envolve medir o nivel de expressão do dito gene. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita avaliação compreende colocar em contacto a dita amostra com um oligonucleótido capaz de hibridar com o dito gene mutante. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 3, que compreende ainda amplificar o dito gene mutante antes da dita hibridação. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que a dita amplificação compreende PCR. 6. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que a dita amplificação compreende colocar em contacto a amostra com iniciadores que têm as sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. 7. 0 método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito oligonucleótido compreende um marcador detectável. 2 8. 0 método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito oligonucleótido compreende um fluoróforo e um cromóforo. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito oligonucleótido compreende um fluoróforo e um extintor não fluorescente. 10. 0 método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito oligonucleótido compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
11. O método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito oligonucleótido compreende mais de 90 % de homologia com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 . 12. 0 método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o dito oligonucleótido compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9.
13. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o Aspergillus resistente a triazol é Aspergillus fumigatus.
14. O método de acordo com a reivindicação í, em que o Aspergillus resistente a triazol é resistente a itraconazol, posaconazol, voriconazol, isavuconazol, ou ravuconazol.
15. Um kit para detectar Aspergillus resistente a triazol numa amostra que compreende um oligonucleótido que tem a sequência SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 ou uma sequência com mais de 90 % de homologia com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que o dito oligonucleótido preferivelmente compreende 3 um marcador e em que o dito kit preferivelmente compreende ainda um ou mais iniciadores de amplificação.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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GB201809450D0 (en) * 2018-06-08 2018-07-25 Imperial Innovations Ltd Method for detecting a tandem repeat

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
JP3898228B2 (ja) * 1996-04-12 2007-03-28 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 検出プローブ、キット及びアッセイ
US20080228406A1 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 Myconostica Ltd. System and method for fungal identification

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