JP2009543544A5

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Publication number: JP2009543544A5
Application number: JP2009511045A
Authority: JP
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2010-07-01

Description

置換されたテトラサイクリン化合物を用いて、遺伝子または遺伝子産物の発現を調節する方法

（関連出願）
本願は、２００６年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／８００，６６２号への優先権を主張する。本願はまた、２００７年５月１５日に出願された米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号に関連する。上述の出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

（発明の背景）
遺伝子の発現レベルまたはそれらの合成のタイミングを変化させる能力は、例えば、遺伝子治療に対する遺伝子機能の分析から、多くの適用について大きい有用性を有する。このアプローチのために、外的刺激によって制御される誘導性の発現系が、大いに所望される。このような系によって、遺伝子発現について「オン／オフ（ｏｎ／ｏｆｆ）」状態が得られ、そしてまた所望のレベルでの遺伝子の限定発現が可能になる。

真核生物細胞における原核生物テトラサイクリン（ｔｅｔ）耐性オペロン機能の構成要素が、遺伝子発現を調節するために用いられている。原核生物のＴｅｔリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の構成要素を利用する調節系は、真核生物細胞における遺伝子発現を調節するために広範に用いられている。このような系は、当該分野で公知であり、そして例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２；特許文献１３；および特許文献１４に記載されている。

米国特許第５，８８８，９８１号明細書米国特許第５，８６６，７５５号明細書米国特許第５，７８９，１５６号明細書米国特許第５，６５４，１６８号明細書米国特許第５，６５０，２９８号明細書米国特許第６，００４，９４１号明細書米国特許第６，２７１，３４８号明細書米国特許第６，２７１，３４１号明細書米国特許第６，７８３，７５６号明細書米国特許第５，４６４，７５８号明細書米国特許第６，２５２，１３６号明細書米国特許第５，９２２，９２７号明細書米国特許第５，９１２，４１１号明細書米国特許第５，８５９，３１０号明細書

近年、耐性の頻度が劇的に増大している多剤耐性が大きな問題になってきている。この問題は、哺乳動物被験体における遺伝子転写を調節するためには望ましくないテトラサイクリンの使用をもたらし得、詳細には所望の結果を達成するために高用量の抗生物質が用いられなければならない。置換されたテトラサイクリン化合物のうちどれが遺伝子調節に影響を及ぼす上で最も有用であるかの決定も有用なものである。なぜならそのような化合物は、微生物感染の処置に最も有用であるものとは同じでないかもしれないからである。さらに、全てのテトラサイクリンが同じ組織分布特性を有するわけではなく、例えば、全てのテトラサイクリンが、血液脳関門をまたぐ能力を有するわけではない。従って、改善された特性（例えば、テトラサイクリン応答性発現系における、変更された用量応答性プロフィールまたは所望の組織分布プロフィール）を有する新規なテトラサイクリン誘導体またはアナログの開発は、インビトロおよびインビボの適用のために大きな利点である。

（発明の要旨）
本発明は、新規な置換されたテトラサイクリン化合物が、テトラサイクリン制御された遺伝子転写の調節における使用においてそれらを優れたものにする改善された特性を有するという発見に、少なくとも一部は基づく。本発明は、細胞において遺伝子または遺伝子産物の発現を調節するための原核生物のＴｅｔリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の構成要素を利用する調節系で用いられる化合物、およびこのような化合物を用いて遺伝子または遺伝子産物の発現を調節する方法に関する。本発明の系による遺伝子または遺伝子産物の発現の調節は一般には、少なくとも２つの構成要素を包含する。すなわち、テトラサイクリンに応答する調節配列に作動可能に連結される標的核酸配列、およびテトラサイクリンの有無のいずれかにおいて、調節配列に結合し、そしてその遺伝子または遺伝子産物の転写を活性化または阻害する、タンパク質、である。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）細胞中での転写を調節する第二のポリペプチドに作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の存在下または非存在下で該ＴＲＥに結合する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含む細胞におけるｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための方法であって、該細胞中で該標的ヌクレオチド配列の発現が調節されるように、該細胞における該置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節する工程を包含し、ここで該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：

（式中、
ｐは、単結合または二重結合であり、
Ｘは、ＣＨＣ（Ｒ ^１３Ｙ’Ｙ）、ＣＲ ^６’ Ｒ ^６、Ｃ＝ＣＲ ^６’ Ｒ ^６、Ｓ、ＮＲ ^６、またはＯであり、かつＲ ^５’ はｐが単結合であるとき水素であり、
ＸはＣＲ ^６’’ であり、かつＲ ^５’ はｐが二重結合であるとき存在せず、
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^４’ 、およびＲ ^４’’ は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^３およびＲ ^１２は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^４はＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ 、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ ^６およびＲ ^６’ は各々独立して水素、メチレン、非存在、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^７ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ ^７ａであり、
Ｒ ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^８ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ ^８ａであり、Ｒ ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^９ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ ^９ａであり、
Ｒ ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ ^１１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシルであり、
Ｒ ^７ａ、Ｒ ^７ｂ、Ｒ ^７ｃ、Ｒ ^７ｄ、Ｒ ^７ｅ、Ｒ ^７ｆ、Ｒ ^８ａ、Ｒ ^８ｂ、Ｒ ^８ｃ、Ｒ ^８ｄ、Ｒ ^８ｅ、Ｒ ^８ｆ、Ｒ ^９ａ、Ｒ ^９ｂ、Ｒ ^９ｃ、Ｒ ^９ｄ、Ｒ ^９ｅおよびＲ ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^１３は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
ＥはＣＲ ^８ｄＲ ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ ^８ｆ、またはＳであり、
ＷはＣＲ ^７ｄＲ ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ ^７ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ ^９ｄＲ ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ ^９ｆであり、
Ｙ’およびＹは各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、スルフヒドリル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルである）
の化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーである、方法。
（項目２）
前記標的ヌクレオチド配列がタンパク質をコードする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第一のポリペプチドが、前記置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で前記ＴＲＥに結合する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記第一のポリペプチドが、前記置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で前記ＴＲＥに結合するが、存在下では結合しない、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記融合タンパク質の前記第一のポリペプチドが、変異されたＴｅｔリプレッサーである、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記変異されたＴｅｔリプレッサーがＢクラスのリプレッサーである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記変異されたＴｅｔリプレッサーが、アミノ酸位置７１、位置９５、位置１０１および位置１０２からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸位置でアミノ酸置換を有するＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記変異されたＴｅｔリプレッサーが、アミノ酸位置７１、位置９５、位置１０１および位置１０２からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸位置でアミノ酸置換を有するＴｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサーである、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記融合タンパク質の前記第二のポリペプチドが、単純ヘルペスのビリオンタンパク質１６の転写活性化ドメインを含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記細胞の染色体にランダムに組み込まれる、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、前記細胞の染色体内の予め決定された位置に組み込まれる、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子が、エキソビボで細胞に導入され、被験体に該細胞を投与する工程をさらに包含する、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ｔｅｔオペレーター連結核酸が、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結されている細胞の内因性の核酸である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ｔｅｔオペレーター連結核酸分子が、前記細胞中に導入されている外因性の核酸分子である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞がさらに、第二の標的核酸分子を含む、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記テトラサイクリン化合物が、抗生物質活性を有さない、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３およびＲ ^１２が各々水素であり、Ｒ ^４がＮＲ ^４Ｒ ^４’ であり、Ｒ ^４およびＲ ^４’ が各々アルキルであり、かつＲ ^１１がヒドロキシルである、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ｐが単結合であり、ＸがＣＲ ^６Ｒ ^６’ であり、Ｒ ^６がアルキルであり、Ｒ ^６’ が水素であり、かつＲ ^５がヒドロキシルである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
Ｒ ^７およびＲ ^８が各々水素である、項目２８に記載の方法。
（項目２０）
Ｒ ^１０がヒドロキシルである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
Ｒ ^９がアミノアルキル、アルケニル、アルコキシカルボニルまたは複素環部分である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記アルコキシカルボニルが、メトキシカルボニルである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記複素環部分が、モルホリンである、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記アミノアルキルが、アミノメチルである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記アルケニルが、アミノカルボニルアルキルである、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
Ｒ ^９が水素である、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
Ｒ ^１０がアルコキシである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記アルコキシがブトキシである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
ｐが単結合であり、ＸがＣＲ ^６Ｒ ^６’ であり、Ｒ ^５、Ｒ ^６およびＲ ^６’ が各々水素である、項目１７に記載の方法。
（項目３０）
Ｒ ^８が水素である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
Ｒ ^７がアミノである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記アミノが、ジアルキルアミノである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ジアルキルアミノがジメチルアミノである、項目３７に記載の方法。
（項目３４）
Ｒ ^１０がヒドロキシルである、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
Ｒ ^９がハロゲン、アルキル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アルケニル、アルキニル、アリールまたは複素環部分である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ハロゲンがフッ素である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記アルコキシカルボニルが、メトキシカルボニルである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記アルキルカルボニルがアシルである、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記複素環部分が、モルホリンである、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記アリールがヘテロアリールである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ヘテロアリールがフラニルである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記フラニルがアルキル置換フラニルである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記アルキルがプロピルである、項目３５に記載の方法。
（項目４４）
前記アミノアルキルがアミノメチルである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記アミノメチルがアルキルアミノメチルまたはアリールアミノメチルである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記アルケニルが、アルコキシカルボニルアルケニルまたはアミノアルケニルである、項目３５に記載の方法。
（項目４７）
前記アミノアルケニルがアルキルアミノアルケニルである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記アルコキシカルボニルアルケニルがエトキシカルボニルアルケニルである、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
Ｒ ^９が水素であり、かつＲ ^１０がアルコキシである、項目３１に記載の方法。
（項目５０）
前記アルコキシがブトキシである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
Ｒ ^１０がヒドロキシルである、項目３０に記載の方法。
（項目５２）
Ｒ ^７がハロゲンである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ハロゲンがヨウ素である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
Ｒ ^９がアルキルである、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
Ｒ ^７がアリールである、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記アリールがヘテロアリールである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ヘテロアリールがピリジニルである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
Ｒ ^９がアルキルである、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記アルキルがメチルである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
Ｒ ^７がアルケニルである、項目５１に記載の方法。
（項目６１）
前記アルケニルが１つ以上のハロゲンで置換される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ハロゲンがフッ素である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
Ｒ ^９がアミノまたはニトロである、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
Ｒ ^７がアルキルである、項目５１に記載の方法。
（項目６５）
前記アルキルがエチルである、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
Ｒ ^９がアミノアルキルである、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
前記アミノアルキルがアルキルアミノアルキルである、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
Ｒ ^９が水素であり、かつＲ ^１０がヒドロキシルである項目３０に記載の方法。
（項目６９）
Ｒ ^７がアミノ、アリール、アルキル、アルケニル、アミノアルキル、シアノ、複素環部分またはオキシミルである、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記アミノが、アルキルアミノまたはアルキルカルボニルアミノである、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記アミノがジアルキルアミノである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記ジアルキルアミノがジエチルアミノである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記アリールがフェニルまたはヘテロアリールである、項目６９に記載の方法。
（項目７４）
前記ヘテロアリールが、ピリジニル、フラニル、イソオキサゾリルまたはピラゾリルである、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ピリジニルが、１つ以上のハロゲンで置換される、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ハロゲンが塩素またはフッ素である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記イソオキサゾリルがアルキル置換イソオキサゾリルである、項目７４に記載の方法。
（項目７８）
前記アルキルが、メチル、イソブチル、イソプロピル、イソプロペニル、またはアルコキシ置換アルキルである、項目６９に記載の方法。
（項目７９）
前記複素環部分がモルホリンである、項目６９に記載の方法。
（項目８０）
前記アルケニルが、１つ以上のハロゲン、シアノ、アルコキシカルボニルまたはアルキルカルボニルで置換される、項目６９に記載の方法。
（項目８１）
前記ハロゲンがフッ素である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記アルコキシカルボニルがメトキシカルボニルである、項目８０に記載の方法。
（項目８３）
前記アルキルカルボニルがアシルである、項目８０に記載の方法。
（項目８４）
前記アミノアルキルがアミノメチルである、項目６９に記載の方法。
（項目８５）
前記アミノメチルが複素環部分で置換される、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記複素環部分がピペリジンである、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
Ｒ ^１０がヒドロキシルである、項目２９に記載の方法。
（項目８８）
Ｒ ^７が水素であり、かつＲ ^８がハロゲンまたはアリールである、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記ハロゲンが塩素または臭素である、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記アリールがフェニルまたはピリジニルである、項目８８に記載の方法。
（項目９１）
前記ピリジニルがハロゲンで置換される、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記ハロゲンがフッ素である、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
Ｒ ^９が水素またはアミノである、項目８８に記載の方法。
（項目９４）
前記アミノがアルキルカルボニルで置換される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記アルキルカルボニルがアシルである、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
Ｒ ^７がアミノであり、Ｒ ^８がハロゲンであり、かつＲ ^９が水素である、項目８７に記載の方法。
（項目９７）
前記ハロゲンが塩素である、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
Ｒ ^７が水素であり、かつＲ ^１０がヒドロキシルである、項目２９に記載の方法。
（項目９９）
Ｒ ^９が複素環部分またはアミノアルキルである、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記複素環部分がピペリジンまたはモルホリンである、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記アミノアルキルがアミノメチルである、項目９９に記載の方法。
（項目１０２）
前記アミノメチルがトリフルオロアルキルで置換される、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
Ｒ ^７およびＲ ^９が水素であり、かつＲ ^１０がアルコキシである、項目３０に記載の方法。
（項目１０４）
前記アルコキシがプロポキシまたはブトキシである、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記アルコキシが、ヒドロキシルで置換される、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）
ｐが二重結合であり、ＸがＣＲ ^６’’ であり、かつＲ ^６’’ が水素である、項目１７に記載の方法。
（項目１０７）
Ｒ ^８およびＲ ^９が水素であり、かつＲ ^１０がヒドロキシルである、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
Ｒ ^７がハロゲンである、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記ハロゲンが塩素である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）細胞中での転写を調節する第二のポリペプチドに作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の有無において該ＴＲＥに結合する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含む細胞におけるｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための方法であって、該細胞中で該標的ヌクレオチド配列の発現が調節されるように、該細胞における置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節する工程を包含し、ここで該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（ＩＩ）：

（式中、
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^４’ 、およびＲ ^４’’ は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^３およびＲ ^１２、およびＲ ^１４は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^４はＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ 、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ ^６ａは水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^７ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ ^７ａであり、
Ｒ ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^８ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ ^８ａであり、
Ｒ ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^９ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ ^９ａであり、
Ｒ ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ ^７ａ、Ｒ ^７ｂ、Ｒ ^７ｃ、Ｒ ^７ｄ、Ｒ ^７ｅ、Ｒ ^７ｆ、Ｒ ^８ａ、Ｒ ^８ｂ、Ｒ ^８ｃ、Ｒ ^８ｄ、Ｒ ^８ｅ、Ｒ ^８ｆ、Ｒ ^９ａ、Ｒ ^９ｂ、Ｒ ^９ｃ、Ｒ ^９ｄ、Ｒ ^９ｅおよびＲ ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
ＷはＣＲ ^７ｄＲ ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ ^７ｆ、またはＳであり、
ＥはＣＲ ^８ｄＲ ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ ^８ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ ^９ｄＲ ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ ^９ｆである）
の化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーである、方法。
（項目１１１）
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３、Ｒ ^５、Ｒ ^８、Ｒ ^９、Ｒ ^１１、Ｒ ^１２およびＲ ^１４が各々水素であり、Ｒ ^４がＮＲ ^４Ｒ ^４’ であり、Ｒ ^４、Ｒ ^４’ 、Ｒ ^６ａが各々アルキルであり、かつＲ ^１０がヒドロキシルである、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
各々のＲ ^７が水素である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
Ｒ ^７がハロゲンである、項目１１１に記載の方法。
（項目１１４）
前記ハロゲンが塩素である、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、以下：

およびそれらの薬学的に受容可能な塩、
からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１６）
前記化合物が、以下：

およびそれらの薬学的に受容可能な塩、
からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１７）
前記化合物が、以下：

およびそれらの薬学的に受容可能な塩、
からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１８）
前記アルキルが、アルキルチオ、アルキルスルホニルまたはアルキルスルフィニルで置換される、項目５４に記載の方法。
（項目１１９）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で該ＴＲＥに結合するが、非存在下では結合しない、変異されたＴｅｔリプレッサーとを含む細胞におけるｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための方法であって、該細胞中で該標的ヌクレオチド配列の発現が調節されるように、該細胞における置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節する工程を包含し、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、式（Ｉ）：

の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの存在下で、該変異されたＴｅｔリプレッサーが該ＴＲＥに選択的に結合するように選択され、
式中、
ｐは、単結合または二重結合であり、
ＸはＣＨＣ（Ｒ ^１３Ｙ’Ｙ）、ＣＲ ^６’ Ｒ ^６、Ｃ＝ＣＲ ^６’ Ｒ ^６、Ｓ、ＮＲ ^６、またはＯであり、かつＲ ^５ ’はｐが単結合であるとき水素であり、
ＸはＣＲ ^６’’ であり、かつＲ ^５’ はｐが二重結合であるとき存在せず、
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^４’ およびＲ ^４’’ は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^３およびＲ ^１２は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^４はＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ 、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ ^６およびＲ ^６’ は各々独立して水素、メチレン、非存在、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^７ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ ^７ａであり、
Ｒ ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^８ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ ^８ａであり、
Ｒ ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^９ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ ^９ａであり、
Ｒ ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ ^１１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシルであり、
Ｒ ^７ａ、Ｒ ^７ｂ、Ｒ ^７ｃ、Ｒ ^７ｄ、Ｒ ^７ｅ、Ｒ ^７ｆ、Ｒ ^８ａ、Ｒ ^８ｂ、Ｒ ^８ｃ、Ｒ ^８ｄ、Ｒ ^８ｅ、Ｒ ^８ｆ、Ｒ ^９ａ、Ｒ ^９ｂ、Ｒ ^９ｃ、Ｒ ^９ｄ、Ｒ ^９ｅおよびＲ ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^１３は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
ＥはＣＲ ^８ｄＲ ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ ^８ｆ、またはＳであり、
ＷはＣＲ ^７ｄＲ ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ ^７ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ ^９ｄＲ ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ ^９ｆであり、
Ｙ’およびＹは各々独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、スルフヒドリル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルである、方法。
（項目１２０）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で該ＴＲＥに結合するが、非存在下では結合しない、変異されたＴｅｔリプレッサーとを含む細胞におけるｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための方法であって、該細胞中で該標的ヌクレオチド配列の発現が調節されるように、該細胞における置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節する工程を包含し、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、該変異されたＴｅｔリプレッサーが式（ＩＩ）：

の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの存在下でＴＲＥに選択的に結合するように選択され、
ここで、
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^４’ およびＲ ^４’’ は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり；
Ｒ ^３、Ｒ ^１２およびＲ ^１４は各々水素またはプロドラッグ部分であり；
Ｒ ^４はＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ 、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり；
Ｒ ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり；
Ｒ ^６ａは水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり；
Ｒ ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^７ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ ^７ａであり；
Ｒ ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^８ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ ^８ａであり；
Ｒ ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^９ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ ^９ａであり；
Ｒ ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり；
Ｒ ^７ａ、Ｒ ^７ｂ、Ｒ ^７ｃ、Ｒ ^７ｄ、Ｒ ^７ｅ、Ｒ ^７ｆ、Ｒ ^８ａ、Ｒ ^８ｂ、Ｒ ^８ｃ、Ｒ ^８ｄ、Ｒ ^８ｅ、Ｒ ^８ｆ、Ｒ ^９ａ、Ｒ ^９ｂ、Ｒ ^９ｃ、Ｒ ^９ｄ、Ｒ ^９ｅおよびＲ ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
ＷはＣＲ ^７ｄＲ ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ ^７ｆ、またはＳであり、
Ｅは、ＣＲ ^８ｄＲ ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ ^８ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ ^９ｄＲ ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ ^９ｆである、方法。
（項目１２１）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で該ＴＲＥに結合するが、ただし存在下では結合しない変異されたＴｅｔリプレッサーとを含む細胞におけるｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための方法であって、該細胞中で標的ヌクレオチド配列の発現が調節されるように、該細胞における該置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節する工程を包含し、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、該変異されたＴｅｔリプレッサーが式（Ｉ）：

の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの非存在下でのみＴＲＥに選択的に結合するように選択され、
式中、
ｐは単結合または二重結合であり、
ＸはＣＨＣ（Ｒ ^１３Ｙ’Ｙ）、ＣＲ ^６’ Ｒ ^６、Ｃ＝ＣＲ ^６’ Ｒ ^６、Ｓ、ＮＲ ^６、またはＯであり、かつＲ ^５’ はｐが単結合であるとき水素であり、
ＸはＣＲ ^６’’ であり、かつＲ ^５’ はｐが二重結合であるとき存在せず、
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^４’ およびＲ ^４’’ は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^３およびＲ ^１２は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^４はＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ 、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ ^６およびＲ ^６’ は各々独立して水素、メチレン、非存在、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^７ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ ^７ａであり、
Ｒ ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^８ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ ^８ａであり、
Ｒ ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^９ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ ^９ａであり、
Ｒ ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ ^１１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシルであり、
Ｒ ^７ａ、Ｒ ^７ｂ、Ｒ ^７ｃ、Ｒ ^７ｄ、Ｒ ^７ｅ、Ｒ ^７ｆ、Ｒ ^８ａ、Ｒ ^８ｂ、Ｒ ^８ｃ、Ｒ ^８ｄ、Ｒ ^８ｅ、Ｒ ^８ｆ、Ｒ ^９ａ、Ｒ ^９ｂ、Ｒ ^９ｃ、Ｒ ^９ｄ、Ｒ ^９ｅおよびＲ ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^１３は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｅは、ＣＲ ^８ｄＲ ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ ^８ｆ、またはＳであり、
ＷはＣＲ ^７ｄＲ ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ ^７ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ ^９ｄＲ ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ ^９ｆであり、
Ｙ’およびＹは各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、スルフヒドリル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルである、方法。
（項目１２２）
（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で該ＴＲＥに結合するが、存在下では結合しない変異されたＴｅｔリプレッサーとを含む細胞におけるｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための方法であって、該細胞中で標的ヌクレオチド配列の発現が調節されるように、該細胞における該置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を調節する工程を包含し、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、該変異されたＴｅｔリプレッサーが式（ＩＩ）：

の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの非存在下でのみＴＲＥに選択的に結合するように選択され、
ここで、
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^４’ およびＲ ^４’’ は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^３、Ｒ ^１２およびＲ ^１４は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ ^４はＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ 、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ ^６ａは水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^７ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ ^７ａであり、
Ｒ ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^８ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ ^８ａであり、
Ｒ ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ _２） _０−３（ＮＲ ^９ｃ） _０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ ^９ａであり、
Ｒ ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ ^７ａ、Ｒ ^７ｂ、Ｒ ^７ｃ、Ｒ ^７ｄ、Ｒ ^７ｅ、Ｒ ^７ｆ、Ｒ ^８ａ、Ｒ ^８ｂ、Ｒ ^８ｃ、Ｒ ^８ｄ、Ｒ ^８ｅ、Ｒ ^８ｆ、Ｒ ^９ａ、Ｒ ^９ｂ、Ｒ ^９ｃ、Ｒ ^９ｄ、Ｒ ^９ｅおよびＲ ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
ＷはＣＲ ^７ｄＲ ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ ^７ｆ、またはＳであり、
Ｅは、ＣＲ ^８ｄＲ ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ ^８ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ ^９ｄＲ ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ ^９ｆである、方法。
（項目１２３）
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、表２の化合物である、項目１１９〜１２２のいずれか１つに記載の方法。
（項目１２４）
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、少なくとも約１３μｇ／ｍＬの濃度で７０を超えるＫｌｕｘを示す、項目１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
前記テトラサイクリン化合物が、少なくとも約１３μｇ／ｍＬの濃度で約５１と約７０との間のＫｌｕｘを示す、項目１２４に記載の方法。

このＴｅｔ／リプレッサー／オペレーター／インデューサー系は、広範な種々の生物体由来の培養細胞（真核生物および原核生物の細胞を含む）において機能的である。さらに、この系は、事実上全ての生物体、例えば、動物植物、単細胞生物、酵母、真菌および寄生生物で機能し、ここで試験されている。

本発明の置換されたテトラサイクリン化合物は、転写の調節に特に有効であることが見出されており、そして当該分野で公知の遺伝子または遺伝子産物の転写の調節のための適用において用いられ得る。詳細には、一態様では、本発明は、被験体の細胞中でテトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）の転写制御下である標的核酸配列の調節発現のために本発明の新規な置換されたテトラサイクリン化合物を用いる方法に関する。一実施形態では、本発明の方法は、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下において転写を活性化するかまたは転写を阻害する融合タンパク質をコードする第一の核酸、およびテトラサイクリン応答性プロモーターエレメントの制御下で置換された第二の標的核酸配列を細胞中に導入する工程と、この細胞が曝されるテトラサイクリンのレベルを調節する工程とを包含する。

一実施形態では、トランス活性化ドメイン（例えば、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６のドメイン）またはタンパク質間相互作用（例えば、非共有結合的相互作用）によって融合タンパク質と相互作用するように転写活性化因子（例えば、内因性の転写活性化因子）を補充するドメイン（例えば、二量体化ドメイン）に融合されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉトランスポゾンＴｎ１０のＴｃ耐性オペロン由来のＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を含む融合タンパク質が細胞に導入される。この構築物は、ｔｅｔ−制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）と呼ばれ、そしてテトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）の転写制御下である標的核酸配列の発現を制御する。ＴＲＥは、最少プロモーターに（例えば、最少ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩＩの改変プロモーターで、ｔＴＡの非存在下で転写的にサイレントであるプロモーターに対して）融合された少なくとも１つのＴｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列（例えば、１つ以上、例えば、コンカテマー化されるかまたは多量体化されたｔｅｔＯ配列を含む）から作成される。最少プロモーター配列の１例は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期プロモーター由来であった。テトラサイクリンの非存在下では、ｔＴＡはＴＲＥに結合して、標的核酸配列の転写を活性化する。テトラサイクリンの存在下では、ｔＴＡは、ＴＲＥに結合できず、そして標的核酸配列由来の発現は不活性のままである。

別の実施形態では、融合タンパク質であって、改変型のｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびトランス活性化ドメインまたはタンパク質間相互作用（例えば、非共有結合的相互作用）によって融合タンパク質と相互作用するように転写活性化因子（例えば、内因性の転写活性化因子）を補充するドメイン（例えば、二量体化ドメイン）からなる融合タンパク質を細胞中に導入する。この構築物は、リバース・トランスサイクリン制御トランスアクチベータ（ｒｔＴＡ）と呼ばれる。ＴｅｔＲの改変は一般に、ＴｅｔＲにおけるアミノ酸変化であって、そのＤＮＡ結合特徴を変えてその結果テトラサイクリンの存在下で標的の導入遺伝子におけるｔｅｔＯ配列のみを認識し得る、ＴｅｔＲにおけるアミノ酸変化を包含する。従って、ＴＲＥ調節される標的核酸配列の転写は、テトラサイクリンの存在下においてのみｒｔＴＡによって刺激される。

別の実施形態では、本発明のテトラサイクリン化合物は、ネイティブなＴｅｔオペレーターの制御下で、かつ細胞中でのネイティブなＴｅｔＲの存在下で遺伝子または遺伝子産物の転写を調節するために用いられ得る。一実施形態では、本発明は、このような細胞に関与する。例えば、ＪＥ３０５Ｋは、破壊されたａｃｒＢおよびｗａａＰ遺伝子を有し、かつｔｅｔＡプロモーター／オペレーターの調節下にｔｅｔＲおよびｌｕｘＣＤＡＢＥオペロン（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来）を含むプラスミドを含む株である。

一実施形態では、この第一および第二の核酸分子は、単一の分子内であってもよい（例えば、同じベクター中）。別の実施形態では、この第一および第二の核酸分子は、別の分子上に存在する。

本発明の方法によって、少なくとも１つのＴＲＥに対して作動可能に連結されている細胞の内因性遺伝子である遺伝子または遺伝子産物の調節が可能になる。あるいは、ＴＲＥ連結遺伝子は、細胞に導入されている外因性の遺伝子または遺伝子産物であってもよい。

本発明の方法によれば、遺伝子転写は、インビトロで調節されても、またはインビボで調節されてもよい。

別の実施形態では、この方法は、被験体から細胞を得る工程、この細胞をエキソビボで、１つ以上の上述の核酸分子を含むように改変する工程、この改変された細胞を被験体に投与する工程、およびこの被験体における本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を改変する工程を包含する。

ドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。５−シクロブタノエートドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。５−シクロヘキサノエートドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。５−プロピノイル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。７−アセチルアミノドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。９−１’メチルシクロブチルドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。図２Ａは、３４Ｒ変異体に対するドキシサイクリンの効果の描写である。図２Ｂは、ＭＴ２変異体に対するドキシサイクリンの効果の描写である。図２Ｃは、３４Ｒ変異体に対する９−ｔ−ブチルドキシサイクリンの効果の描写である。図２Ｄは、ＭＴ２変異体に対する９−ｔ−ブチルドキシサイクリンの効果の描写である。ドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。５−シクロブタノエートドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。５−シクロヘキサノエートドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。５−プロピノイル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。７−アセチルアミノドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。９−１’−メチルシクロブチルドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。９−ｔ−ブチル−７−メチルチオメチルドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリンについての用量応答曲線を示すグラフである。マウスでのルシフェラーゼ発現のデジタル画像である。

（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも一部は、高度に制御された方式で、細胞または生物体における遺伝子または遺伝子産物の発現を調節するために用いられ得る、テトラサイクリン応答性の発現系を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物の使用に関する。本発明の化合物が使用され得る例示的な系は当該分野で公知である。一実施形態では、本発明の系による発現の調節は、少なくとも２つの構成要素を包含する。すなわち、調節配列に作動可能に連結されている遺伝子、および誘導性因子の有無のいずれかにおいて、この調節性配列に結合して、この遺伝子の転写を活性化または阻害するタンパク質である。本発明は、真核生物細胞における遺伝子発現を調節するために原核生物のＴｅｔリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の構成要素を利用する。

本発明の種々の態様は、ＴＲＥに連結された遺伝子の転写を活性化または阻害し得る、融合タンパク質の活性を調節する置換されたテトラサイクリン化合物に関する。このような融合タンパク質は、置換されたテトラサイクリン化合物の単に存在下において、あるいは非存在下において、テトラサイクリンサイクエレメントに結合する。従って、宿主細胞では、ＴＲＥに作動可能に結合された遺伝子の転写は、宿主細胞と接触している置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を変更すること（例えば、培養培地由来の置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を添加もしくは除去もしくは変化すること、または宿主生物体などに対して置換されたテトラサイクリン化合物を投与することもしくは中止することもしくはその投与された濃度を変更することなど）によって本発明の融合タンパク質によって刺激または阻害され得る。

本発明は、テトラサイクリンに応答性である遺伝子調節系において有益な特性を有する（例えば、非抗生物質であるか、および／または活性の増強を有する）置換されたテトラサイクリン化合物に関する。このような調節性の系は、当該分野で公知である（例えば、それらの特許の各々の内容がその全体が参照によって本明細書に援用されている、米国特許第５，８８８，９８１号；同第５，８６６，７５５号；同第５，７８９，１５６号；同第５，６５４，１６８号；同第５，６５０，２９８号；同第６，００４，９４１号；同第６，２７１，３４８号；同第６，２７１，３４１号；同第６，７８３，７５６号；同第５，４６４，７５８号；同第６，２５２，１３６号；同第５，９２２，９２７号；同第５，９１２，４１１号；同第５，８５９，３１０号）。

置換されたテトラサイクリン化合物を用いて遺伝子の転写を刺激または阻害するための方法、および本明細書で記載される調節系の構成要素を含むキットがまた、本発明によって包含される。本発明の種々の態様および例示的な調節系が下にさらに詳細に考察される。本発明のテトラサイクリン化合物は、テトラサイクリンが当該分野において遺伝子および遺伝子産物の発現を調節するために用いられている他の適用で用いられてもよいということが当業者によって理解される。

（定義）
「テトラサイクリン」という用語は、非置換および置換のテトラサイクリン化合物を包含する。

「置換されたテトラサイクリン化合物」という用語は、テトラサイクリン化合物またはテトラサイクリンに対して類似の環構造を有する化合物の誘導体またはアナログを包含する。置換されたテトラサイクリン化合物の例としては以下が挙げられる：クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、サンサイクリン（ｓａｎｃｙｃｌｉｎｅ）、ケロカルジン（ｃｈｅｌｏｃａｒｄｉｎ）、ロリテトラサイクリン（ｒｏｌｉｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン（ｌｙｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、アピサイクリン（ａｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）；クロモサイクリン（ｃｌｏｍｏｃｙｃｌｉｎｅ）、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、メグルサイクリン（ｍｅｇｌｕｃｙｃｌｉｎｅ）、メピルサイクリン（ｍｅｐｙｌｃｙｃｌｉｎｅ）、ペニメピサイクリン（ｐｅｎｉｍｅｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、ピパサイクリン（ｐｉｐａｃｙｃｌｉｎｅ）、エタモサイクリン（ｅｔａｍｏｃｙｃｌｉｎｅ）、ペニモサイクリン（ｐｅｎｉｍｏｃｙｃｌｉｎｅ）など。類似の４つの環構造を含む他の誘導体およびアナログも含まれる（その内容全体が参照によって本明細書に援用される、Ｒｏｇａｌｓｋｉ，「ＣｈｅｍｉｃａｌＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ」を参照のこと）。表１は、テトラサイクリンおよびいくつかの公知のテトラサイクリン誘導体を示す。

本発明の方法で用いられ得る他の置換されたテトラサイクリン化合物としては、限定はしないが、６−デメチル−６−デオキシ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；テトラサイクリノ−ピラゾール；７−クロロ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；４−ヒドロキシ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；１２α−デオキシ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；５−ヒドロキシ−６α−デオキシ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；４−デジメチルアミノ−１２α−デオキシアンヒドロテトラサイクリン；７−ジメチルアミノ−６−デメチル−６−デオキシ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；テトラサイクリノニトリル；４−オキソ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン４，６−ヘミケタール；４−オキソ−１１ａＣ１−４−デジメチルアミノテトラサイクリン−４，６−ヘミケタール；５ａ，６−アンヒドロ−４−ヒドラゾン−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；４−ヒドロキシイミノ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；４−ヒドロキシイミノ−４−デジメチルアミノ５ａ，６−アンヒドロテトラサイクリン；４−アミノ−４−デジメチルアミノ−５ａ，６アンヒドロテトラサイクリン；４−メチルアミノ−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；４−ヒドラゾノ−１１ａ−クロロ−６−デオキシ−６−デメチル−６−メチレン−４−デジメチルアミノテトラサイクリン；テトラサイクリン四級アンモニウム化合物；アンヒドロテトラサイクリンベタイン；４−ヒドロキシ−６−メチルプレテトラミド（ｐｒｅｔｅｔｒａｍｉｄｅｓ）；４−ケトテトラサイクリン；５−ケトテトラサイクリン；５ａ，１１ａジヒドロテトラサイクリン；１１ａＣ１−６，１２ヘミケタールテトラサイクリン；１１ａＣ１−６−メチレンテトラサイクリン；６，１３ジオールテトラサイクリン；６−ベンジルチオメチレンテトラサイクリン；７，１１ａ−ジクロロ−６−フルオロ−メチル−６−デオキシテトラサイクリン；６−フルオロ（α）−６−デメチル−６−デオキシテトラサイクリン；６−フルオロ（β）−６−デメチル−６−デオキシテトラサイクリン；６−αアセトキシ−６−デメチルテトラサイクリン；６−βアセトキシ−６−デメチルテトラサイクリン；７，１３−エピチオテトラサイクリン；オキシテトラサイクリン；ピラゾロテトラサイクリン；テトラサイクリンの１１ａハロゲン；テトラサイクリンの１２ａホルミルおよび他のエステル；テトラサイクリンの５，１２ａエステル；テトラサイクリンの１０，１２ａ−ジエステル；イソテトラサイクリン；１２−ａ−デオキシアンヒドロテトラサイクリン；６−デメチル−１２ａ−デオキシ−７−クロロアンヒドロテトラサイクリン；Ｂ−ノルテトラサイクリン；７−メトキシ−６−デメチル−６−デオキシテトラサイクリン；６−デメチル−６−デオキシ−５ａ−エピテトラサイクリン；８−ヒドロキシ−６−デメチル−６−デオキシテトラサイクリン；モナルデン（ｍｏｎａｒｄｅｎｅ）；クロモサイクリン；５ａメチル−６−デメチル−６−デオキシテトラサイクリン；６−オキサテトラサイクリン、および６チアテトラサイクリンが挙げられる。

「置換されたテトラサイクリン化合物」という用語は、テトラサイクリンに構造的に関連し、そして少なくとも約１０^６Ｍ^−１というＫ_ａでＴｅｔリプレッサーに結合する化合物を包含するものとする。置換されたテトラサイクリン化合物は一般に、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物である。好ましくは、この置換されたテトラサイクリン化合物は、約１０^９Ｍ^−１以上の親和性で結合する。一実施形態では、「置換されたテトラサイクリン化合物」という用語は、非置換のテトラサイクリン化合物、例えば、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ならびにＨｌａｖｋａおよびＢｏｏｔｈｅによって開示される他の化合物を含まない。「ＴｈｅＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ」ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ７８，Ｒ．Ｋ．Ｂｌａｃｋｗｏｏｄら（編集），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ−ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８５；Ｌ．Ａ．Ｍｉｔｓｃｈｅｒ，「ＴｈｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」，ＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ９，Ｄｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７８；ＮｏｙｅｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，「ＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒｏｃｅｓｓｅｓ」ＣｈｅｍｉｃａｌＰｒｏｃｅｓｓＲｅｖｉｅｗｓ，ＰａｒｋＲｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，２ｖｏｌｕｍｅｓ，１９６９；Ｒ．Ｃ．Ｅｖａｎｓ，「ＴｈｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ」，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｒｉｅｓ１，ＱｕａｄｒａｎｇｌｅＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６８；およびＨ．Ｆ．Ｄｏｗｌｉｎｇ，「Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ」，ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＭｏｎｏｇｒａｐｈｓ，ｎｏ．３，ＭｅｄｉｃａｌＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９５５。置換されたテトラサイクリン化合物は、テトラサイクリンに比較して低下した抗生物質活性を有し得る。

「置換されたテトラサイクリン化合物」という用語は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１１ａ、１２、１２ａもしくは１３位置で、または本発明の置換されたテトラサイクリン化合物がその意図された機能を果たす、例えば、遺伝子発現または遺伝子産物を調節することを可能にする任意の他の位置で、１つ以上のさらなる置換基を有するテトラサイクリン化合物を包含する。

置換されたテトラサイクリン化合物の例としては、その各々がその全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，１６５，９９９号；同第５，８３４，４５０号；同第５，８８６，１７５号；同第５，５６７，６９７号；同第５，５６７，６９２号；同第５，５３０，５５７号；同第５，５１２，５５３号；同第５，４３０，１６２号に記載される化合物が挙げられる。置換されたテトラサイクリン化合物の他の例としては、例えば、ＷＯ０３／０７９９８４、ＷＯ０３／０７５８５７、ＷＯ０３／０５７１６９、ＷＯ０２／０７２５４５、ＷＯ０２／０７２５３２、ＷＯ９９／３７３０７、ＷＯ０２／１２１７０、ＷＯ０２／０４４０７、ＷＯ０２／０４４０６、ＷＯ０２／０４４０４、ＷＯ０１／９８２６０、ＷＯ０１／９８２５９、ＷＯ０１／９８２３６、ＷＯ０１／８７８２４、ＷＯ０１／７４７６１、ＷＯ０１／５２８５８、ＷＯ０１／１９７８４、ＷＯ８４／０１８９５、米国特許出願第６０／３６７，０５０号、米国特許出願第０９／８９５，７９７号、米国特許出願第６０／３０５，５４６号、米国特許出願第６０／３４６，９３０号、米国特許出願第６０／３４６，９２９号、米国特許出願第６０／３４７，０６５号、米国特許出願第６０／３４６，９５６号、米国特許出願第６０／３６７，０４９号、米国特許出願第１０／０９７，０９５号、米国特許出願第１０／０９７，１３５号、米国特許出願第６０／３６２，６５４号、米国特許出願第６０／３６７，０４５号、米国特許出願第６０／３６６，９１５号、米国特許出願第６０／３６７，０４８号、米国特許出願第１１／２５８，６２２号、米国特許出願第１１／２５８，６１３号、米国特許出願第１１／３４８，６０８号、米国特許出願第６０／７０１，７３０号および米国特許第１１／４９０，８６７号に記載の化合物が挙げられる。置換されたテトラサイクリン化合物の他の例は、欧州特許第０５８２８１０号（Ｂ１）；欧州特許第０５３６５１５号（Ｂ１）；欧州特許第０５８２７８９号（Ｂ１）；欧州特許第０５８２８２９号（Ｂ１）；欧州特許第０５８２７８８号（Ｂ１）；米国特許第５，５３０，１１７号；米国特許第５，４９５，０３０号；米国特許第５，４９５，０１８号；米国特許第５，４９４，９０３号；米国特許第５，４６６，６８４号；欧州特許第０５３５３４６号（Ｂ１）；米国特許第５，４５７，０９６号；米国特許第５，４４２，０５９号；米国特許第５，４３０，１６２号；米国特許第５，４２０，２７２号；米国特許第５，４０１，８６３号；米国特許第５，４０１，７２９号；米国特許第５，３８６，０４１号；米国特許第５，３８０，８８８号；米国特許第５，３７１，０７６号；欧州特許第６１８１９０号；米国特許第５，３２６，７５９号；欧州特許第５８２８２９号；欧州特許第５２８８１０号；欧州特許第５８２７９０号；欧州特許第５８２７８９号；欧州特許第５８２７８８号；米国特許第５，２８１，６２８号；欧州特許第５３６５１５号；欧州特許第５３５３４６号；ＷＯ９６／３４８５２；ＷＯ９５／２２５２９Ａ１；米国特許第４，０６６，６９４号；米国特許第３，８６２，２２５号；米国特許第３，６２２，６２７号；ＷＯ０１／８７８２３Ａ１；ＷＯ００／２８９８３Ａ１；ＷＯ０７／０１４，１５４；ＷＯ０６／０８４，２６５；ＷＯ０６／０４７，６７１；ＷＯ０６／０４７，７５６；米国特許出願公開第２００６−０２８７２８３号；ＷＯ０６／５４９，７１７；および米国特許出願公開第２００５−０１４３３５２号に記載される。これらの上述の適用および特許の各々は、その全体が参照によって本明細書に援用される。

「融合タンパク質」という用語は、作動可能に連結される、２つの異なるポリペプチド由来、代表的には異なる供給源（例えば、異なる細胞および／または異なる生物体）由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。このようなポリペプチドについては、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、この２つのポリペプチドが、各々のポリペプチドがその意図される機能を果たし得るような方式で接続されるということを意味するものとする。代表的には、この２つのポリペプチドは、ペプチド結合を通じて共有結合される。この融合タンパク質は一般には、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、第二のポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子に連結され、そしてこの得られたハイブリッドＤＮＡ分子が、宿主細胞で発現されて、融合タンパク質を生成する。このＤＮＡ分子は、お互いに対して５’から３’の方向で結合され、その結果、連結後に、コードされたポリペプチドの翻訳フレームは変更されない（すなわち、ＤＮＡ分子は、お互いにインフレームで連結される）。

「異種」という用語は、この第二のポリペプチドが第一のポリペプチドとは異なるタンパク質に由来するということを意味するものである。トランス活性化因子融合タンパク質と同様に、転写サイレンサー融合タンパク質は、本明細書で上述したような標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。

本発明の方法の転写調節因子は、宿主細胞または動物中に導入された外因性のヌクレオチド配列の転写を調節するために用いられ得る。「外因性」ヌクレオチド配列とは、宿主細胞に導入されており、かつ代表的には宿主のゲノムに挿入されるヌクレオチド配列である。外因性ヌクレオチド配列は、宿主のゲノム中のいずこにも存在しなくてもよいし（例えば、外来ヌクレオチド配列）、または宿主のゲノム内に存在するが、そのゲノムの異なる部位に組み込まれる配列のさらなるコピーであってもよい。転写され、かつｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結されるべき外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞または動物中に導入される単一のヌクレオチド分子内に含まれてもよい。

あるいは、本発明の方法の転写調節因子は、ｔｅｔオペレーター配列が連結されている内因性ヌクレオチド配列の転写を調節するために用いられ得る。「内因性」ヌクレオチド配列は、宿主のゲノム内に存在するヌクレオチド配列である。内因性遺伝子は、ＴＲＥを含む組み換えベクターと外因性遺伝子の配列との間の相同組み換えによってｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結され得る。例えば、内因性遺伝子の正確なプロモーター領域を排除することによって、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列および内因性遺伝子のコード領域に相当する配列とその３’末端で隣接し、かつ内因性遺伝子の上流領域由来の配列とその５’末端で隣接する最小プロモーター配列を含む、相同組み換えベクターが調製され得る。この隣接する配列は、内因性遺伝子でのベクターＤＮＡの首尾よい相同組み換えのために十分な長さの配列である。好ましくは、数キロベースの隣接するＤＮＡが、この相同組み換えベクターに含まれる。ベクターＤＮＡと宿主細胞における内因性遺伝子との間の相同組み換えの際、内因性プロモーターの領域は、最小プロモーターに作動可能に連結された１つ以上のｔｅｔオペレーター配列を含むベクターＤＮＡによって置換される。従って、内因性遺伝子の発現はもはや、その内因性プロモーターの制御下ではなく、ｔｅｔオペレーター配列および最小プロモーターの制御下にある。

「ｔｅｔオペレーター配列」という用語は、全てのクラスのｔｅｔオペレーター（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）を包含するものとする。転写されるべきヌクレオチド配列は、単一のｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結されてもよく、または調節の増強された範囲については、それは、ｔｅｔオペレーター配列の複数のコピーまたは複数のｔｅｔオペレーター配列（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上のオペレーター配列）に対して作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、転写されるべき配列は、７つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結される。

本明細書において用いる場合、「ｔｅｔオペレーター」および「ｔｅｔオペレーター配列」という用語は、全てのクラス、例えばクラスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのｔｅｔオペレーター配列を包含する。ｔｅｔオペレーターのこれらの５つのクラスのヌクレオチド配列は、米国特許第６，２７１，３４８号に提示され、そしてさらに、Ｗａｔｅｒｓ，Ｓ．Ｈ．ら、（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ１１（１７）：６０８９〜６１０５，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．およびＳｃｈｏｌｌｅｎｍｅｉｅｒ，Ｋ．（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ１１（２）：５２５〜５３９，Ｓｔｕｂｅｒ，Ｄ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１６７〜１７１，Ｕｎｇｅｒ，Ｂ．ら、（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ１２（２０）：７６９３〜７７０３、ならびにＴｏｖａｒ，Ｋ．ら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：７６〜８０に記載される。特定の実施形態では、この変異されたＴｅｔリプレッサーは、Ｔｎ１０−コードされたリプレッサー（すなわち、クラスＢ）であり、そしてこのｔｅｔオペレーター配列は、クラスＢのｔｅｔオペレーター配列である。あるいは、変異されたクラスＡのＴｅｔリプレッサーは、クラスＡのｔｅｔオペレーター配列とともに用いられてもよく、他のクラスのＴｅｔリプレッサー／オペレーターについても同様である。

本明細書において用いる場合、転写の「抑制、リプレッション（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、転写サイレンサータンパク質による調節の前の転写のレベルまたは量と比較した、標的核酸配列の転写のレベルまたは量における減少を意味するものとする。転写阻害は、部分的であっても完全であってもよい。

「Ｔｅｔリプレッサー」という用語は、テトラサイクリンの有無における原核生物細胞でのＴｅｔオペレーター配列由来の転写を調節する、天然に存在するタンパク質またはその改変型を包含する。「野性型Ｔｅｔリプレッサー」という用語は、テトラサイクリンの非存在下で原核生物細胞におけるＴｅｔオペレーター配列由来の転写を抑制する、天然に存在するタンパク質について記載するものとする。「変異されたＴｅｔリプレッサー」という用語は、野性型Ｔｅｔリプレッサーと同様であるが、野性型のＴｅｔリプレッサーとは少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するものとする。このような変異されたＴｅｔリプレッサーは、ＴＲＥ調節標的核酸配列の転写がテトラサイクリンの存在下でこのリプレッサーによって刺激されるように、機能が変更されてもよい。

「動作（作動）可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」または「作動（動作）可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ）」という句は、ヌクレオチド配列に対する言及について用いられる場合、目的のヌクレオチド配列（例えば、テトラサイクリン誘導性方式で発現されるべきポリペプチドをコードする配列）が、調節性配列（例えば、「ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列」であるヌクレオチド配列については、ｔｅｔオペレーター）に対して、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で（例えば、この構築物が宿主細胞中に導入されるときは宿主細胞中で、またはインビトロ転写／翻訳系において）連結されるということを意味する。「調節性配列（制御配列）（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、当該分野で認識され、かつプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節性配列は、当業者に公知であり、そしてＧｏｅｄｄｅｌ，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節性配列としては、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節性配列）が挙げられる。特定の発現ベクターの設計に含まれる他のエレメントは、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存し得る。本発明の発現構築物は、宿主細胞中に導入されて、それによって、本明細書に記載されるような核酸によりコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを生成し得る。

転写単位内では、「転写されるべきヌクレオチド配列」は代表的には、下流部分のみが転写され、転写のための転写機構に位置するように（少なくとも一部は）機能する最小プロモーター配列を含む。最小プロモーター配列は、ホスホジエステル結合によって５’〜３’方向で目的の転写配列に連結され（すなわち、プロモーターは、目的の転写配列の上流に位置する）、隣接するヌクレオチド配列を形成する。従って、本明細書において用いる場合、「転写されるべきヌクレオチド配列」または「標的ヌクレオチド配列」という用語は、ｍＲＮＡに転写されるヌクレオチド配列と、作動可能に連結された上流の最小プロモーター配列との両方を包含するものとする。「最小プロモーター」という用語は、転写されるべき連結された配列について転写の開始部位を規定するが、それ自体では、仮にあったとしても、転写を効率的に開始できない部分プロモーター配列を包含する。従って、このような最小プロモーターの活性は、作動可能に連結された調節性配列（１つ以上のｔｅｔオペレーター配列など）に対する、転写活性化因子（例えば、本発明のテトラサイクリン誘導性融合タンパク質）の結合に依存する。一実施形態では、最小プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス由来である（Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）Ｃｅｌｌ４１：５２１〜５３０に記載のとおり）。好ましくは、約＋７５〜−５３と＋７５〜−３１の間のヌクレオチド位置が用いられる。他の適切な最小プロモーターは、当該分野で公知であるか、または標準的な技術によって特定されてもよい。例えば、隣接して連結されたレポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）の転写を活性化する機能的プロモーターは、レポーター遺伝子単独の発現をもはや活性化しなくなるまで徐々に欠失されてもよいが、さらなる調節性配列の存在はむしろ必要とする。

「真核生物細胞における転写を活性化するポリペプチド）」という用語は、本明細書において用いる場合、転写を直接または間接的に活性化するポリペプチドを包含する。

「宿主細胞における融合タンパク質の発現に適切な形態において」という用語は、組み換え発現ベクターが、ｍＲＮＡへの核酸の転写、およびこのｍＲＮＡの融合タンパク質への翻訳を可能にする方式で、融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された１つ以上の調節性配列を含むということを意味するものとする。

「宿主細胞」という用語は、真核生物または原核生物の細胞または細胞株を包含する。用いられ得る哺乳動物細胞株の非限定的な例としては、ＣＨＯｄｈｆｒ．ｓｕｐ．−ｃｅｌｌｓ（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６〜４２２０）、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：第５９頁）または骨髄腫細胞、例えば、ＳＰ２またはＮＳ０（ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３〜４６）が挙げられる。

「被験体」という用語は、ヒトおよび他の非ヒト哺乳動物を包含し、これには、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ならびにそのトランスジェニックおよび相同な組換え種が挙げられる。さらに、「被験体」という用語は、非哺乳動物動物、例えば、昆虫、両生類、単細胞生物、寄生生物、植物、例えば、トランスジェニック植物などを包含する。

「形質転換、トランスフォーメーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、宿主細胞に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための当該分野で認識された種々の技術をいい、これには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクチンまたはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、および他の実験マニュアルに見出され得る。

「相同組み換え生物体」という用語は、本明細書において用いる場合、ある遺伝子を含む、生物体、例えば、動物、植物または単細胞生物体であって、その遺伝子と、その動物の細胞、例えば、その動物の胚細胞に導入されたＤＮＡ分子との間の相同組み換えによって改変されている生物体を述べる。一実施形態では、この非ヒト動物は、マウスであるが、本発明は、それに限定されない。融合タンパク質をコードする核酸がゲノムの特定の部位に導入されている、すなわちこの核酸が、内因性の遺伝子と相同的に組み換えされている、動物が作成され得る。

Ｉ．テトラサイクリン化合物
一実施形態では、本発明の方法における使用のための置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：

の化合物であり、
ここで、
ｐは、単結合または二重結合であり、
Ｘは、ＣＨＣ（Ｒ^１３Ｙ’Ｙ）、ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｃ＝ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｓ、ＮＲ^６、またはＯであり、かつＲ^５’はｐが単結合であるとき水素であり、
ＸはＣＲ^６’’であり、かつＲ^５’はｐが二重結合であるとき存在せず、
Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’、およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ^６およびＲ^６’は各々独立して水素、メチレン、非存在、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ^７ａであり、
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり、
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり、
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ^１１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシルであり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅおよびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^１３は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
ＥはＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆ、またはＳであり、
ＷはＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆであり、
Ｙ’およびＹは各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、スルフヒドリル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルである、化合物、
ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーである。

ある実施形態では、本発明の方法および組成物において用いられる置換されたテトラサイクリン化合物は、例えば２、５、６、７、８、９、１０、１１、１１ａ、１２、１２ａ位置で、そして／またはメタサイクリンの場合には１３位置での置換による置換されたサンサイクリン化合物である。本発明の置換されたサンサイクリン化合物では、Ｒ^４’およびＲ^４’’は各々アルキル（例えば、低級アルキル、例えば、メチル）であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、そしてＲ^６、Ｒ^６’およびＲ^５は各々、一般には、水素である。ある実施形態では、この置換されたテトラサイクリン化合物は、置換されたテトラサイクリン（例えば、一般には、Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、Ｒ^４’であり、そしてＲ^４’’はメチルであり、Ｒ^５は水素であり、そしてＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、ここでＲ^６はメチルであり、そしてＲ^６’はヒドロキシである）、置換されたドキシサイクリン（例えば、Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’でありＲ^４’およびＲ^４’’はメチルであり、Ｒ^５はヒドロキシルであり、そしてＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、ここでＲ^６はメチルであり、そしてＲ^６’は水素である）、置換されたミノサイクリン（例えば、ここでＲ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’であり、Ｒ^４’およびＲ^４’’はメチルであり、Ｒ^５は水素であり、そしてＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、ここでＲ^６およびＲ^６’は水素原子であり、そしてＲ^７はジメチルアミノである）または置換されたサンサイクリン（ここでＲ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’であり、Ｒ^４’およびＲ^４’’はメチルであり、Ｒ^５は水素であり、かつＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、ここでＲ^６およびＲ^６’は水素原子である）である。一実施形態では、この置換されたテトラサイクリン化合物は、非抗生物質である。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、そしてＲ^１１はヒドロキシルである。さらなる実施形態では、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^６はアルキルであり、Ｒ^６’は水素であり、Ｒ^５はヒドロキシルであり、Ｒ^７およびＲ^８は各々水素であり、そしてＲ^１０はヒドロキシルである。さらに別の実施形態では、Ｒ^９はアミノアルキル（例えば、アミノメチル）、アルケニル（例えば、アミノカルボニルアルキル）、アルコキシカルボニル（例えば、メトキシカルボニル）または複素環部分（例えば、モルホリン）である。

さらに別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルである。さらなる実施形態では、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^６はアルキルであり、Ｒ^６’は水素であり、Ｒ^５はヒドロキシルであり、Ｒ^７およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^９は水素であり、かつＲ^１０はアルコキシ（例えば、ブトキシ）である。

別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^７はアルキルアミノ（例えば、ジアルキルアミノ、例えば、ジメチルアミノなど）であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^９はハロゲン（例えば、フッ素）、アルキル（例えば、プロピル）、アミノアルキル（例えば、アルキルアミノメチルまたはアリールアミノメチル）、アルコキシカルボニル（例えば、メトキシカルボニル）、アルキルカルボニル（例えば、アシル）、アルケニル（例えば、アミノアルケニル、例えばアルキルアミノアルケニル、またはアルコキシカルボニルアルケニル、例えば、エトキシカルボニルアルケニル）、アルキニル、アリール（例えば、ヘテロアリール、例えば、置換または非置換のフラニル（例えば、アルキル置換されたフラニル）など）または複素環部分（例えば、モルホリン）である。

さらなる実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^７はアルキルアミノ（例えば、ジアルキルアミノ、例えば、ジメチルアミノなど）であり、Ｒ^９は水素であり、かつＲ^１０はアルコキシ（例えば、ブトキシ）である。

さらに別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、Ｒ^７はハロゲン（例えば、ヨウ素）であり、かつＲ^９はチオアルキル、スルホニルアルキルまたはスルフィニルアルキルである。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、Ｒ^７はアリール（例えば、ヘテロアリール、例えば、ピリジニル）であり、かつＲ^９はアルキル（例えば、メチル）である。

別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、Ｒ^７はアルケニル（例えば、フッ素などの１つ以上のハロゲンで置換されたアルケニル）であり、かつＲ^９はアミノまたはニトロである。

さらなる実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、Ｒ^７はアルキル（例えば、エチル）であり、かつＲ^９はアミノアルキル（例えば、アルキルアミノアルキル）である。

さらに別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’、Ｒ^８およびＲ^９は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^７はアミノ（例えば、アルキルアミノまたはアルキルカルボニルアミノ）、アリール（例えば、フェニルまたはヘテロアリール、例えば、ピリジニルなどであり、これは、１つ以上のハロゲン（例えば、塩素またはフッ素）、フラニル、イソオキサゾリル（例えば、アルキル置換されたイソオキサゾリル、例えば、メチル、イソブチル、イソプロピル、イソプロペニルまたはアルコキシ置換アルキル）、ピラゾリルで置換されてもよい）、アルキル、アルケニル（例えば、１つ以上のハロゲン、例えばフッ素で置換されたアルケニル、シアノ、アルコキシカルボニル、例えば、メトキシカルボニル、またはアルキルカルボニル、例えば、アシル）、アミノ（例えば、ジアルキルアミノ、例えば、ジエチルアミノ）、アミノアルキル（例えば、複素環部分、例えば、ピペリジンで置換されたアミノメチル）シアノ、複素環部分（例えば、モルホリン）またはオキシミルである。

別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’、Ｒ^７およびＲ^９は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^８はハロゲン（例えば、塩素または臭素）またはアリール（例えば、フェニルまたはピリジニル、例えばハロゲン置換されたピリジニル）である。

さらなる実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^７は各々水素であり、かつＲ^８はハロゲン（例えば、塩素または臭素）またはアリール（例えば、フェニルまたはピリジニル、例えばハロゲン置換されたピリジニル）であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^９は水素またはアミノ（例えば、アシルのような、アルキルカルボニルで置換されたアミノ）である。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^７は各々水素であり、かつＲ^８はハロゲン（例えば、塩素または臭素）またはアリール（例えば、フェニルまたはピリジニル、例えばハロゲン置換されたピリジニル）であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^９は水素またはアミノ（例えば、アシルのような、アルキルアルキルカルボニルで置換されたアミノ）である。

別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’およびＲ^９は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、Ｒ^７はアミノであり、かつＲ^８はハロゲン（例えば、ハロゲン）である。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’、Ｒ^７およびＲ^８は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^９は複素環部分（例えば、ピペリジンまたはモルホリン）またはアミノアルキル（例えば、トリフルオロメチルで置換されたアミノメチルなどのアミノメチル）である。

別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは単結合であり、ＸはＣＲ^６Ｒ^６’であり、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６’、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は各々水素であり、かつＲ^１０はアルコキシ（例えば、ヒドロキシで置換されてもよい、プロポキシまたはブトキシ）である。

さらに別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４およびＲ^４’は各々アルキルであり、かつＲ^１１はヒドロキシルであり、ｐは二重結合であり、ＸはＣＲ^６’’であり、かつＲ^６’’、Ｒ^８およびＲ^９は各々水素であり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^７はハロゲン（例えば、塩素）である。

一実施形態では、本発明の方法における使用のための置換されたテトラサイクリン化合物は、式（ＩＩ）の化合物：

、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーであって、
ここで、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^３、Ｒ^１２およびＲ^１４は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ^６ａは水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（−Ｗ’）ＷＲ^７ａであり、
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり、
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり、
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅ、およびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｗは、ＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
Ｅは、ＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆまたはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆである。

別の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１４は各々水素であり、Ｒ^４はＮＲ^４Ｒ^４’であり、Ｒ^４、Ｒ^４’およびＲ^６ａは各々アルキルであり、Ｒ^１０はヒドロキシルであり、かつＲ^７は水素またはハロゲン（例えば、塩素）である。

さらに別の実施形態では、置換されたテトラサイクリン化合物は、表２の化合物である。

およびその薬学的に受容可能な塩。

一実施形態では、置換されたテトラサイクリン化合物は、実施例５に例示されるように、この置換されたテトラサイクリンがｔｅｔＡプロモーター／オペレーターでスクリーニングされるとき、少なくとも約１３μｇ／ｍＬの濃度で７０より大きいＫｌｕｘを示す。別の実施形態では、この置換されたテトラサイクリン化合物は、この置換されたテトラサイクリンが、ｔｅｔＡプロモーター／オペレーターでスクリーニングされるとき、少なくとも約１３μｇ／ｍＬの濃度で約７０〜約５１というＫｌｕｘを示す。

本発明の置換されたテトラサイクリン化合物は、以下のスキームに記載される方法を用いて、および／または当該分野で認識される技術を用いることによって合成され得る。本明細書で記載される全ての新規の置換されたテトラサイクリン化合物は、化合物として本発明に包含される。

９−および７−置換のテトラサイクリンは、スキーム１に示される方法によって合成され得る。スキーム１に示されるとおり、９−および７−置換のテトラサイクリン化合物は、テトラサイクリン化合物（例えば、ドキシサイクリン、１Ａ）を、硫酸および硝酸ナトリウムで処理することによって合成してもよい。この得られた生成物は、７−ニトロおよび９−ニトロ異性体（それぞれ、１Ｂおよび１Ｃ）の混合物である。７−ニトロ（１Ｂ）および９−ニトロ（１Ｃ）誘導体を、水素ガスおよび白金触媒を用いて水素化によって処理して、アミン１Ｄおよび１Ｅを生成する。この異性体は、従来の方法によってこの時点で分離する。７−置換または９−置換のアルケニル誘導体を合成するために、７−または９−アミノのテトラサイクリン化合物（それぞれ、１Ｅおよび１Ｆ）を、ＨＯＮＯで処理して、ジアゾニウム塩を得る（１Ｇおよび１Ｈ）。この塩（１Ｇおよび１Ｈ）を、適切な反応試薬で処理して、所望の化合物を得る（例えば、スキーム１では、７−シクロペント−１−エニルドキシサイクリン（１Ｈ）および９−シクロペント−１−エニルドキシサイクリン（１Ｉ））。

スキーム２に示されるとおり、Ｒ^７がカルバメートまたは尿素誘導体である本発明のテトラサイクリン化合物は、以下のプロトコールを用いて合成され得る。サンサイクリン（２Ａ）を、酸性条件下でＮａＮＯ_２で処理して、位置異性体の混合物中で７−ニトロサンサイクリン（２Ｂ）を形成する。次いで、７−ニトロサンサイクリン（２Ｂ）をＨ_２ガスおよび白金触媒で処理して、７−アミノのサンサイクリン誘導体（２Ｃ）を形成する。尿素誘導体（２Ｅ）を形成するために、イソシアネート（２Ｄ）を、７−アミノのサンサイクリン誘導体（２Ｃ）で処理する。カルバメート（２Ｇ）を形成するために、適切な酸塩化物エステル（２Ｆ）を２Ｃで処理する。

スキーム３に示されるとおり、Ｒ^７が複素環式（すなわち、チアゾール）置換アミノ基である本発明のテトラサイクリン化合物は、上記のプロトコールを用いて合成してもよい。７−アミノのサンサイクリン（３Ａ）を、Ｆｍｏｃ−イソチオシアネート（３Ｂ）と反応させて、保護されたチオ尿素（３Ｃ）を生成する。次いで、この保護されたチオ尿素（３Ｃ）を、脱保護して、活性なサンサイクリンチオ尿素（３Ｄ）化合物を得る。このサンサイクリンチオ尿素（３Ｄ）を、α−ハロケトン（３Ｅ）で処理して、チアゾール置換された７−アミノのサンサイクリン（３Ｆ）を生成する。

７−アルケニルテトラサイクリン化合物、例えば７−アルキニルサンサイクリン（４Ａ）および７−アルケニルサンサイクリン（４Ｂ）を水素化して７−アルキル置換のテトラサイクリン化合物（例えば、７−アルキルサンサイクリン、４Ｃ）を形成してもよい。スキーム４は、この生成物を得るための、圧力下におけるパラジウム／炭素触媒での飽和メタノールおよび塩酸溶液中における、７位置の二重または三重の結合の選択的水素化を示している。

スキーム５では、７位置のアリール誘導体を合成するための一般的合成スキームが示される。ヨードサンサイクリン（ｉｏｄｏｓａｎｃｙｃｌｉｎｅ）化合物とのアリールボロン酸の鈴木カップリングを示す。ヨードサンサイクリン化合物（５Ｂ）は、酸性条件下で少なくとも１当量のＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）を用いてサンサイクリン（５Ａ）を処理することによりサンサイクリンから合成してもよい。この反応をクエンチし、次いで得られた７−ヨードサンサイクリン（５Ｂ）を、当該分野で公知の標準的な技術を用いて精製してもよい。アリール誘導体を形成するために、次いで、７−ヨードのサンサイクリン（５Ｂ）を塩基水溶液（例えば、Ｎａ_２ＣＯ_３）および適切なボロン酸（５Ｃ）を用い、そして不活性雰囲気下で処理する。この反応物を、パラジウム触媒（例えば、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２）で触媒する。この生成物（５Ｄ）は、当該分野で公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）によって精製してもよい。他の７−アリール、アルケニル、およびアルキニルのテトラサイクリン化合物は、同様のプロトコールを用いて合成され得る。

本発明の７−置換されたテトラサイクリン化合物はまた、Ｓｔｉｌｌｅのクロス（ｃｒｏｓｓ）カップリングを用いて合成され得る。Ｓｔｉｌｌｅクロスカップリングは、適切なスズ試薬（例えば、Ｒ−ＳｎＢｕ_３）およびハロゲン化されたテトラサイクリン化合物（例えば、７−ヨードサンサイクリン）を用いて行ってもよい。このスズ試薬およびヨードサンサイクリン化合物は、パラジウム触媒（例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_２Ｃｌ_２またはＰｄ（ＡｓＰｈ_３）_２Ｃｌ_２）を用いて、必要に応じてさらなる銅塩、例えば、ＣｕＩを用いて処理されてもよい。次いでこの得られた化合物を、当該分野で公知の技術を用いて精製してもよい。

本発明の化合物はまた、Ｈｅｃｋ−型クロスカップリング反応を用いて合成されてもよい。スキーム６に示されるとおり、Ｈｅｃｋ−型クロスカップリングは、ハロゲン化されたテトラサイクリン化合物（例えば、７−ヨードサンサイクリン、６Ａ）および適切なパラジウムまたは他の遷移金属触媒（例えば、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２およびＣｕＩ）を適切な溶媒（例えば、脱気したアセトニトリル）中に懸濁することによって行ってもよい。次いで、基質、反応アルケン（６Ｂ）またはアルキン（６Ｄ）、およびトリエチルアミンを添加し、そしてその混合物を数時間加熱して、その後に室温まで冷却する。次いで、得られた７−置換のアルケニル（６Ｃ）または７−置換のアルキニル（６Ｅ）テトラサイクリン化合物を当該分野で公知の技術を用いて精製してもよい。

７−（２’−クロロ−アルケニル）−テトラサイクリン化合物を調製するために、適切な７−（アルキニル）−サンサイクリン（７Ａ）を、飽和メタノールおよび塩酸中に溶解して、攪拌する。次いで、その溶媒を除去して、生成物（７Ｂ）を得る。

スキーム８に示されるとおり、９−置換のテトラサイクリン化合物の５−エステルを、強力な酸（例えば、ＨＦ、メタンスルホン酸およびトリフルオロメタンスルホン酸）中に９置換化合物（８Ａ）を溶解すること、および適切なカルボン酸を添加することによって形成して、対応するエステルを得てもよい（８Ｂ）。

スキーム９に示されるとおり、メタサイクリン（９Ａ）を、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２のようなパラジウム触媒の存在下でフェニルボロン酸と反応させて、１３アリール置換されたメタサイクリン化合物を形成したもよい。次いで、得られた化合物を、分取ＨＰＬＣのような当該分野で公知の技術を用いて精製して、特徴付けてもよい。

下のスキーム１０に示されるとおり、７および９アミノメチルテトラサイクリンは、試薬、例えば、ヒドロキシメチル−カルバミン酸ベンジルエステルを用いて合成し得る。

３、１０または１２ａの位置で置換された置換されたテトラサイクリン化合物は、テトラサイクリン化合物と塩基とを接触させて、ヒドロキシル基を脱プロトン化することによって合成してもよい。用いられ得る塩基の例としては、水素化カリウムおよび水素化ナトリウムが挙げられる。次いで、テトラサイクリンをハロゲン化物および当該分野で公知の他の反応種を用いることによってさらに誘導体化してもよい。

化学合成の他の例は、ＷＯ０３／０７９９８４、ＷＯ０３／０７５８５７、ＷＯ０３／０５７１６９、および米国特許出願第１０／６１９，６５３号（各々の内容全体が、参照によって本明細書に援用される）に記載される。

「アルキル（ａｌｋｙｌ）」という用語には飽和脂肪族基であって、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（例えば、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基が包含される。アルキルという用語にはさらに、炭化水素骨格の１つ以上の炭素の代わりに酸素、窒素、イオウ、またはリン原子をさらに含み得るアルキル基を包含する。特定の実施形態において、直鎖または分枝鎖アルキルはその骨格に２０個以下の、そしてより好ましくは４個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖についてはＣ_１−Ｃ_２０、分枝鎖についてはＣ_３−Ｃ_２０）、。シクロアルキルは、その環構造に３〜８個の炭素原子を有し、より好ましくはその環構造に炭素５または６個を有し得る。Ｃ_１−Ｃ_６という用語は、炭素原子１〜６個を含むアルキル基を包含する。

さらに、アルキルという用語は、「非置換アルキル（ｕｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄａｌｋｙｌｓ）」と「置換アルキル（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄａｌｋｙｌｓ）」の両方を包含し、この後者は炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素の代わりに置換基を有するアルキル部分を意味する。そのような置換基としては、例えばアルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。シクロアルキルはさらに、例えば上記の置換基によって置換されてもよい。「アルキルアリール（ａｌｋｙｌａｒｙｌ）」または「アリールアルキル（ａｒｙｌａｌｋｙｌ）」部分は、アリールによって置換したアルキルである（例えば、フェニルメチル（ベンジル））。「アルキル」という用語にはまた、天然および非天然のアミノ酸の側鎖を包含する。

「アリール」という用語には、０〜４個のヘテロ原子を含み得る５−および６−員環の単環式芳香族基を包含する基、例えばベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどが包含される。さらに、「アリール」という用語には、多環式アリール基、例えば、三環式、二環式、例えばナフタレン、ベンズオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキソフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフスリジン（ｎａｐｈｔｈｒｉｄｉｎｅ）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、またはインドリジンが包含される。環構造にヘテロ原子を有するそれらのアリール基はまた、「アリール複素環（ａｒｙｌｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ）」「複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ）」、「ヘテロアリール（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌｓ）」、または「ヘテロ芳香族（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃｓ）」とも呼ばれてもよい。芳香環は、上記のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アリールアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分によって１つ以上の環の位置で置換されてもよい。アリール基は、多環（例えばテトラリン）を形成するために、芳香族でない脂環式または複素環と縮合または架橋されてもよい。

「アルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）」という用語には、上記のアルキルと長さおよび可能性がある置換が類似しているが、少なくとも１つの二重結合を含む不飽和脂環式基が包含される。

例えば、「アルケニル」という用語は、直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキル、またはアルケニル置換シクロアルケニル基およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を包含する。アルケニルという用語は、さらに、炭化水素骨格の１つ以上の炭素の代わりに酸素、窒素、イオウ、またはリン原子を含むアルケニル基を包含する。特定の実施形態において、直鎖または分枝鎖のアルケニル基は、その骨格に２０個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖についてＣ_２−Ｃ_２０、分枝鎖についてＣ_３−Ｃ_２０）。同様に、シクロアルケニル基は、その環構造に３〜８個の炭素原子を有してもよく、より好ましくは環構造に５または６個の炭素を有する。Ｃ_２−Ｃ_２０という用語は、２〜２０個の炭素原子を含むアルケニル基を包含する。

さらに、アルケニルという用語は、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を包含し、この後者は炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素の代わりに置換基を有するアルケニル部分を意味する。このような置換基としては例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルフィニル、スルホニル、チオ、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。

「アルキニル（ａｌｋｙｎｙｌ）」という用語には、長さおよび可能性のある置換が上記のアルキルと類似しているが、少なくとも１つの三重結合を含む不飽和脂肪族基が包含される。

例えば、「アルキニル」という用語には、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、へプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基が包含される。アルキニルという用語にはさらに、炭化水素骨格の１つ以上の炭素の代わりに酸素、窒素、イオウ、またはリン原子を含むアルキニル基が包含される。特定の実施形態において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、その骨格に２０個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖についてはＣ_２−Ｃ_２０、分枝鎖についてはＣ_３−Ｃ_２０）。Ｃ_２−Ｃ_６という用語は、炭素原子２〜６個を含むアルキニル基を包含する。

さらに、アルキニルという用語には、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方が包含され、この後者は炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素の代わりに置換基を有するアルキニル基を意味する。このような置換基としては、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。

炭素数が他に特定されていなければ、本明細書において用いる「低級アルキル」とは、上記で定義したアルキル基であるが、その骨格構造に１〜５個の炭素原子を有する基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば炭素原子２〜５個の鎖長を有する。

「アシル」という用語には、アシル基（ＣＨ_３ＣＯ−）またはカルボニル基を含む化合物および部分が包含され、そして「非置換アシル」基および「置換アシル」基の両方が包含される。「置換アシル基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄａｃｙｌｇｒｏｕｐ）」という用語は、１つ以上の水素原子が、例えば、アルキル基、アルケニル、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分によって置換されているアシル基を指す。

「アシルアミノ」という用語には、アシル部分がアミノ基に結合している部分が包含される。例えば、この用語には、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイド基が包含される。

「アルコキシ」という用語には、酸素原子に共有結合した置換および非置換のアルキル、アルケニル、およびアルキニル基が包含される。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が挙げられる。置換アルコキシ基の例としては、ハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの基によって置換されてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例としては、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどが挙げられる。

「アルコキシアルキル」、「アルキルアミノアルキル」および「チオアルコキシアルキル」という用語には、炭化水素骨格の１つ以上の炭素の代わりに酸素、窒素、またはイオウ原子、例えば、酸素、窒素またはイオウ原子をさらに含む、上記のアルキル基が包含される。

「アミド」または「アミノカルボキシ」という用語には、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素に結合される窒素原子を含む化合物または部分が包含される。この用語には、カルボキシ基に結合したアミノ基に結合したアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を含む「アルカミノカルボキシ」基が包含される。これには、カルボニルまたはチオカルボニル基の炭素に結合されるアミノ基に結合したアリールまたはヘテロアリール部分を含むアリールアミノカルボキシ基が包含される。「アルキルアミノカルボキシ」、「アルケニルアミノカルボキシ」、「アルキニルアミノカルボキシ」、および「アリールアミノカルボキシ」という用語には、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリール部分がそれぞれ窒素原子に結合することでカルボニル基の炭素と結合している部分が包含される。

「アミン」または「アミノ」という用語には、窒素原子が少なくとも１つの炭素またはヘテロ原子に共有結合されている化合物が包含される。「アルキルアミノ」という用語には、窒素原子が少なくとも１つのさらなるアルキル基に結合している基および化合物が包含される。「ジアルキルアミノ」という用語には、窒素原子が少なくとも二つのさらなるアルキル基に結合されている基が包含される。「アリールアミノ」および「ジアリールアミノ」という用語には、窒素原子がそれぞれ、少なくとも１つまたは二つのアリール基に結合されている基が包含される。「アルキルアリールアミノ」「アルキルアミノアリール」、または「アリールアミノアルキル」という用語は、少なくとも１つのアルキル基および少なくとも１つのアリール基に結合されているアミノ基を指す。「アルカミノアルキル」という用語は、アルキル基にも結合されている窒素原子に結合したアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を意味する。

「アロイル」という用語には、カルボニル基に結合したアリールまたはヘテロ芳香族部分を有する化合物および部分が包含される。アロイル基の例としては、フェニルカルボキシ、ナフチルカルボキシなどが挙げられる。

「カルボニル」または「カルボキシ」という用語には、二重結合によって酸素原子に結合された炭素を含む化合物および部分が包含される。カルボニルを含む部分の例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アミド、エステル、無水物などが包含される。カルボニル基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィナート（ｐｈｏｓｐｈｉｎａｔｏ）、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくは複素環式芳香族の部分などの基で置換されてもよい。

「エステル」という用語には、カルボニル基の炭素に結合されている酸素原子に結合した炭素またはヘテロ原子を含む化合物および部分が包含される。「エステル」という用語には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニルなどのようなアルコキシカルボニル基が包含される。アルキル、アルケニル、またはアルキニル基は上記の定義のとおりである。

「エーテル」という用語は、２つの異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含有する化合物または部分を包含する。例えばこの用語は、「アルコキシアルキル」を包含し、このアルコキシアルキルとは、酸素原子に共有結合したアルキル、アルケニル、またはアルキニル基であって、その酸素原子が別のアルキル基に共有結合されているものを指す。

「ハロゲン」という用語には、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などが包含される。「過ハロゲン化（ｐｅｒｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ）」という用語は一般的に、全ての水素がハロゲン原子に置換されている部分を指す。

「ヘテロ原子」という用語には、炭素または水素以外の任意の元素の原子が包含される。好ましいヘテロ原子は窒素、酸素、イオウ、およびリンである。

「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語には、−ＯＨまたは−Ｏ⁻Ｘ^＋を有しており、ここでＸ^＋が対イオンである基が包含される。

「ポリシクリル」または「多環式基（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃｒａｄｉｃａｌ）」という用語は、２つ以上の炭素が２つの隣接する環と共通している、例えば環が「縮合環（ｆｕｓｅｄｒｉｎｇｓ）」である２つ以上の環状環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／またはヘテロシクリル）を指す。非隣接原子に結合している環は「架橋した（ｂｒｉｄｇｅｄ）」環と呼ばれる。多環の環の各々は、上記のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アリールアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分によって置換されてもよい。

「チオカルボニル」または「チオカルボキシ」という用語には、二重結合によってイオウ原子に結合した炭素を含む化合物および部分が包含される。

「チオエーテル」という用語には、異なる２つの炭素またはヘテロ原子に結合されたイオウ原子を含む化合物および部分が包含される。チオエーテルの例として限定はしないが、アルクチオアルキル、アルクチオアルケニル、およびアルクチオアルキニルが挙げられる。「アルクチオアルキル」という用語には、アルキル基に結合されているイオウ原子に結合したアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を有する化合物が包含される。同様に、「アルクチオアルケニル」および「アルクチオアルキニル」という用語は、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基がイオウ原子に結合されており、このイオウ原子がアルキニル基に共有結合されている化合物または部分を指す。

「オキシミル」という用語は、オキシム基を含有する部分を包含する。

「二量体部分（ｄｉｍｅｒｉｃｍｏｉｅｔｙ）」という用語は、二級テトラサイクリンの４環構造を含有する部分を包含する。二量体部分は、原子１〜３０個の鎖を通じて置換テトラサイクリンに結合されてもよい。この鎖は、単結合、二重結合、および三重結合を通じて一緒に共有結合された原子から構成されてもよい。二量体部分のテトラサイクリン環構造は、さらに置換されても、または置換されなくてもよい。これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１１ａ、１２、１２ａ、および／または１３位で結合されてもよい。

「プロドラッグ部分」という用語には、インビボで代謝され得る部分が包含される。一般に、プロドラッグ部分は、インビボでエステラーゼによって、または他の機構によって、ヒドロキシル基または他の有益な基に代謝される。プロドラッグおよびその使用の例は当該分野で周知である（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７）、「ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９を参照のこと）。プロドラッグは、化合物の最終的な単離および精製の間にインサイチュで、またはその遊離の酸型の精製化合物もしくはヒドロキシルと、適切なエステル化剤とを個々に反応させることによって調製することができる。ヒドロキシル基は、カルボン酸による処理を介してエステルに変換されてもよい。プロドラッグ部分の例としては、置換および非置換の、分枝または非分枝の低級アルキルエステル部分（例えば、プロピオン酸エステル）、低級アルケニルエステル、ジ−低級アルキル−アミノ低級アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（例えば、アセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、置換（例えば、メチル、ハロ、またはメトキシ置換基による）アリールおよびアリール−低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ−低級アルキルアミド、およびヒドロキシアミドが挙げられる。好ましいプロドラッグ部分は、プロピオン酸エステルおよびアシルエステルである。インビボで他の機構によって活性型に変換されるプロドラッグも含まれる。

本発明の方法および組成物において用いられる置換されたテトラサイクリン化合物のいくつかの構造は、不斉炭素原子を含む。キラル原子から生じる異性体（例えば、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー）は、他に示さない限り、本発明の範囲に包含される。そのような異性体は、古典的な分離技術および立体化学的に制御された合成によって実質的に純粋な形態で得ることができる。さらに、本出願において考察される構造および他の化合物および部分も、その全ての互変異性体を包含する。

（ＩＩ．テトラサイクリン誘導性の転写調節因子）
テトラサイクリン調節性の遺伝子発現系では、遺伝子の転写は、転写調節因子によって調節される、例えば、活性化因子タンパク質（または逆トランス活性化因子タンパク質）によって活性化されるか、または転写サイレンサータンパク質によって阻害される。本発明のトランス活性化因子およびサイレンサーは、融合タンパク質または非共有結合的に会合したタンパク質である。従って、本発明の特定の方法は、融合タンパク質、および融合タンパク質または非共有結合的に会合されたタンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を特徴とする。

一実施形態では、遺伝子または遺伝子産物の転写は、両方とも本明細書においては単にトランス活性化因子と呼ばれる、テトラサイクリン制御の転写活性化因子タンパク質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ）（ｔＴＡ）またはリバーステトラサイクリン制御転写活性化因子タンパク質（ｒｅｖｅｒｓｅｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ）（ｒｔＴＡ）によって活性化される。テトラサイクリンの非存在下で、ｔＴＡは、ＴＲＥに結合して、標的核酸配列からの発現を活性化する。逆に、ｒｔＴＡは、テトラサイクリンの存在下でのみＴＲＥを認識し、従って、標的核酸配列の転写は、テトラサイクリンの存在下でのみｒｔＴＡによって刺激される。

本発明の方法はまた、転写サイレンサー融合タンパク質を特徴とし得る。本発明の方法のインヒビター融合タンパク質は、本発明の転写調節因子融合タンパク質と同様に構築されるが、細胞中で転写を刺激するポリペプチドドメインを含む代わりに、このインヒビター融合タンパク質は、真核生物細胞中で転写を阻害するポリペプチドドメインを含む。このインヒビター融合タンパク質は、ｔｅｔＯ配列に対して作動可能に連結された遺伝子または遺伝子産物の発現を下方制御するために用いられる。例えば、ｔｅｔＯ連結遺伝子が宿主細胞または動物に導入されるとき、この遺伝子の基礎レベルの構成的発現は、この遺伝子が導入される細胞または組織のタイプ、およびこの遺伝子の組み込みの部位に依存して変化し得る。あるいは、ｔｅｔＯ配列が導入されている内因性遺伝子の構成的発現は、近傍のさらなる内因性の調節性配列の強度に依存して変化し得る。本明細書に記載されるインヒビター融合タンパク質によって、制御された方式でこのようなｔｅｔＯ連結遺伝子の発現を阻害するために用いられ得る組成物が得られる。

例えば、本発明の方法のインヒビター融合タンパク質は、真核生物細胞で転写を阻害する異種の第二のポリペプチドに作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合するが、存在下では結合しない第一のポリペプチドを含んでもよい。あるいは、このインヒビター融合タンパク質は、真核生物細胞で転写を阻害する異種の第二のポリペプチドに作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合するが、非存在下では結合しない第一のポリペプチドを含んでもよい。

（Ａ．トランス活性化因子またはインヒビター融合タンパク質の第一のポリペプチド）
一実施形態では、本発明の特定の方法で特徴付けられたトランス活性化因子融合タンパク質は、その一部が本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下においてｔｅｔオペレーター配列に結合する第一のポリペプチドから構成される。

一実施形態では、例えば、ｔＴＡ融合タンパク質を作製する場合、この第一のポリペプチドは、野性型Ｔｅｔリプレッサーである（これは、テトラサイクリンの非存在下ではｔｅｔオペレーター配列に結合するが、テトラサイクリンの存在下では結合しない）。任意のクラスの野性型Ｔｅｔリプレッサー（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ）が、第一のポリペプチドとして用いられ得る。Ｔｅｔリプレッサーの各々のクラスのメンバーの間での高い程度の配列保存（少なくとも８０％）に照らして、本明細書ではＴｅｔリプレッサーの各々のクラスの単一のメンバーを、クラス全体の代表として用いる。従って、Ｔｅｔリプレッサークラスの特定のメンバーに関する本発明の教示は、そのクラスの全てのメンバーに対して直接適用可能である。

本明細書において用いる場合、ＴｅｔＲ（Ａ）クラスは、Ｔｎ１７２１トランスポゾンに担持されるＴｅｔリプレッサーに代表される（Ａｌｌｍｅｉｒら、（１９９２）Ｇｅｎｅ１１１（１）：１１〜２０；ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＬｉｂｒａｒｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）アクセッション番号Ｘ６１３６７およびコードされるタンパク質配列ＧＩ：４８１９８についてのデータベース相互参照番号（ＧＩ：））。

ＴｅｔＲ（Ｂ）クラスは、Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性決定因子によってコードされるＴｅｔリプレッサーに代表される（Ｐｏｓｔｌｅら、（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２（１２）：４８４９〜６３，アクセッション番号Ｘ００６９４，ＧＩ：４３０５２）。

ＴｅｔＲ（Ｃ）クラスは、プラスミドｐＳＣ１０１のテトラサイクリンリプレッサーに代表される（Ｂｒｏｗら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２（１）：１〜１２，アクセッション番号Ｍ３６２７２，ＧＩ：１５０４９６）。

ＴｅｔＲ（Ｄ）クラスは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｏｒｄｏｎｅｚにおいて特定されたＴｅｔリプレッサーに代表される（Ａｌｌａｒｄら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３７（１−２）：３０１〜５，アクセッション番号Ｘ６５８７６，ＧＩ：４９０７５）。

ＴｅｔＲ（Ｅ）クラスは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのメンバーから単離されたＴｅｔリプレッサーに代表される（Ｔｏｖａｒら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５（１）：７６〜８０，アクセッション番号Ｍ３４９３３，ＧＩ：１５５０２０）。

ＴｅｔＲ（Ｇ）クラスは、Ｖｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍにおいて特定されたＴｅｔリプレッサーに代表される（Ｚｈａｏら、（１９９２）ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ３６（１０）：１０５１〜６０，アクセッション番号Ｓ５２４３８，ＧＩ：２６２９２９）。

ＴｅｔＲ（Ｈ）クラスは、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａから単離されたプラスミドｐＭＶ１１１によってコードされるＴｅｔリプレッサーに代表される（Ｈａｎｓｅｎら、（１９９３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７（１２）：２６９９〜７０５，アクセッション番号Ｕ００７９２，ＧＩ：３９２８７２）。

ＴｅｔＲ（Ｊ）クラスは、ＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓからクローニングされたＴｅｔリプレッサーに代表される（Ｍａｇａｌｈａｅｓら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４４３（１−２）：２６２〜６６，アクセッション番号ＡＦ０３８９９３，ＧＩ：４１０４７０６）。

ＴｅｔＲ（Ｚ）クラスは、グラム陽性の細菌であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたｐＡＧ１プラスミドによってコードされるＴｅｔリプレッサーに代表される（Ｔａｕｃｈら、（２０００）Ｐｌａｓｍｉｄ４４（３）：２８５〜９１，アクセッション番号ＡＡＤ２５０６４，ＧＩ：４５８３４００）。

好ましくは、野性型Ｔｅｔリプレッサーは、クラスＢのｔｅｔリプレッサー、例えば、Ｔｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサーである。

別の実施形態では、本発明の特定の方法で特徴づけられたトランス活性化因子融合タンパク質は、その一部が本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の存在下においてｔｅｔオペレーター配列に結合する第一のポリペプチドから構成される。従って、一実施形態では、例えば、ｒｔＴＡ融合タンパク質を作製する場合、この融合タンパク質の第一のポリペプチドは、変異されたＴｅｔリプレッサーである。変異されたＴｅｔリプレッサーと野性型Ｔｅｔリプレッサーとの間のアミノ酸の相違は、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の欠失、または１つ以上のアミノ酸の付加であってもよい。好ましくは、本発明の変異されたＴｅｔリプレッサーは、以下の機能的な特性を有する。すなわち、１）このポリペプチドは、ｔｅｔオペレーター配列に結合し得る、すなわち、これは野性型ＴｅｔリプレッサーのＤＮＡ結合特異性を保持している、２）これは、野性型のＴｅｔリプレッサーに比較して置換されたテトラサイクリン化合物によって逆方式（ｒｅｖｅｒｓｅｍａｎｎｅｒ）で調節される、すなわち、変異されたＴｅｔリプレッサーは、置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下ではなく、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でのみｔｅｔオペレーター配列に結合する。

一実施形態では、上記の機能的特性を有する変異されたＴｅｔリプレッサーは、野性型Ｔｅｔリプレッサーの配列中のアミノ酸残基の置換によって作成される。例えば、米国特許第５，７８９，１５６号に記載のとおり、アミノ酸位置７１、９５、１０１および１０２にアミノ酸置換を有するＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーは、所望の機能的特性を有し、従って、本発明の転写調節因子融合タンパク質における第一のポリペプチドとして用いられ得る。これらのアミノ酸位置４つの全てよりも少ない変異が、所望の機能的特性を有するＴｅｔリプレッサーを達成するのに十分であり得る。従って、この実施形態では、Ｔｅｔリプレッサーは好ましくは、これらの位置のうち少なくとも１つで変異される。変異されたＴｅｔリプレッサーの所望の機能的特性を保持する、これらまたは他のアミノ酸位置での他のアミノ酸置換、欠失または付加は、本発明の方法の範囲内である。Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｗ．ら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：４１８〜４２０に記載のようなＴｅｔリプレッサー−テトラサイクリン複合体の結晶構造が、変異されたＴｅｔリプレッサーの合理的設計について用いられ得る。この構造に基づけば、アミノ酸位置７１は、テトラサイクリン結合ポケットの外側に位置し、このことは、この部位での変異が、本発明の変異されたＴｅｔリプレッサーの所望の機能的特性を達成するのに必要ではないかもしれないことを示唆している。対照的に、アミノ酸位置９５、１０１および１０２は、保存されたテトラサイクリン結合ポケット内に位置する。従って、Ｔｅｔリプレッサーのテトラサイクリン結合ポケットは、本発明の変異されたＴｅｔリプレッサーを作製するための変異の標的とされ得る。

本発明の方法の融合タンパク質への組み込みのためのさらなる変異されたＴｅｔリプレッサーは、本発明の教示に従って作成され得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ（そのうちＴｎ１０コードリプレッサーは、クラスＢのリプレッサーである）などの異なるクラスのＴｅｔリプレッサーが多数記載されている。種々のクラスのＴｅｔリプレッサーのアミノ酸配列は、上記の変異体を包含する領域を包含する、高い程度の相同性（すなわち、タンパク質の長さにわたり４０〜６０％）を共有している。米国特許第５，７８９，１５６（図４）において種々のクラスのＴｅｔリプレッサーのアミノ酸配列が示され、比較されており、そしてまたＴｏｖａｒ，Ｋ．ら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：７６〜８０に記載される。従って、Ｔｎ−１０由来のＴｅｔリプレッサーについて上述した変異体に等価な変異体が、本発明の融合タンパク質に含まれるために他のクラスのＴｅｔリプレッサーにおいて作成されてもよい。例えば、５つ全てのリプレッサークラスにおいてアスパラギン酸であるアミノ酸位置９５は、任意のクラスのリプレッサーでは、アスパラギンに変異されてもよい。同様に、５つのリプレッサークラスの全てでグリシンである、位置１０２は、任意のクラスのリプレッサーではアスパラギン酸に変異されてもよい。さらなる適切な等価な変異体は、当業者には明らかであって、本明細書に記載される手順によって作成され、機能について試験され得る。Ａ，Ｃ、ＤおよびＥクラスのＴｅｔリプレッサーのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、それぞれ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｓ．Ｈ．ら、（１９８３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ１１：６０８９〜６１０５，Ｕｎｇｅｒ，Ｂ．ら、（１９８４）Ｇｅｎｅ３：１０３〜１０８，Ｕｎｇｅｒ，Ｂ．ら、（１９８４）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：７６９３〜７７０３およびＴｏｖａｒ，Ｋ．ら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：７６〜８０に開示される。これらの野性型配列は、本明細書に記載される誘導性の調節性システムにおける使用について、本発明の教示に従って変異されてもよい。

上記の変異体とは別に、さらなる適切な変異されたＴｅｔリプレッサー（例えば、上記の所望の機能的特性を有する）を、米国特許第５，７８９，１５６号（実施例１）に記載のように、野生型Ｔｅｔリプレッサーの変異誘発および選択によって作成してもよい。野性型のクラスＢのＴｅｔリプレッサーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．およびＳｃｈｏｌｌｍｅｉｅｒ，Ｋ．（１９８３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：５２５〜５３９、ならびにＰｏｓｔｌｅ，Ｋ．ら、（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：４８４９〜４８６３に開示される。野性型のクラスＡ、Ｃ、ＤおよびＥ型のリプレッサーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列についての参考文献は上記に引用される。変異されたＴｅｔリプレッサーは、例えば、以下のように作成および選択され得る：野性型Ｔｅｔリプレッサーをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を、ランダム変異導入法に供し、そしてその得られた変異された核酸を発現ベクターに組み込み、そしてスクリーニングのために宿主細胞に導入する。例えば置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でのみＴｅｔオペレーター配列に結合するＴｅｔリプレッサーの選択を可能にするスクリーニングアッセイを用いてもよい。例えば、発現ベクター中の変異された核酸のライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ株であって、Ｔｅｔオペレーター配列がＬａｃリプレッサーをコードする遺伝子の発現を制御し、かつＬａｃリプレッサーが選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性）をコードする遺伝子の発現を制御するＥ．ｃｏｌｉ株中に導入してもよい。細菌中でのＴｅｔオペレーター配列に対するＴｅｔリプレッサーの結合は、Ｌａｃリプレッサーの発現を阻害し、それによって選択可能なマーカー遺伝子の発現を誘導する。マーカー遺伝子を発現する細胞は、選択可能な表現型（例えば、薬物耐性）に基づいて選択される。野性型Ｔｅｔリプレッサーについては、選択可能なマーカー遺伝子の発現は、テトラサイクリンの非存在下で生じる。変異Ｔｅｔリプレッサーをコードする核酸は、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でのみ細菌中で選択可能なマーカー遺伝子の発現を誘導するこの核酸の能力に基づいて、この系を用いて選択され得る。

クラスＡのｔｅｔオペレーターに結合する変異されたＴｅｔリプレッサーを作成するための別のアプローチは、本明細書に記載される既に変異されたＴｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサー（クラスＢのリプレッサー）をさらに変異させ、これがもはやクラスＢ型のオペレーターには効率的に結合しないが、代わりにクラスＡ型のオペレーターには効率的に結合するように変異させることである。クラスＡまたはＢ型のオペレーターのヌクレオチド位置６は、その相補性リプレッサーによってオペレーターの認識について重要なヌクレオチドであることが見出されている（位置６は、クラスＢのオペレーターではＧ／Ｃ対であり、そしてクラスＡのオペレーターではＡ／Ｔ対である）（Ｗｉｓｓｍａｎら、（１９８８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２：３９７〜４０６を参照のこと）。クラスＡまたはクラスＢのＴｅｔリプレッサーのアミノ酸位置４０は、オペレーターの６位置の認識のための重要なアミノ酸残基であることも見出されている（アミノ酸位置４０は、クラスＢのリプレッサーではトレオニンであるが、クラスＡのリプレッサーではアラニンである）。ＡｌａによるクラスＢのリプレッサーのＴｈｒ４０の置換は、その結合特異性を変化させ、その結果このリプレッサーはいまや、クラスＡのオペレーターに結合できる（同様に、ＴｈｒによるクラスＡのリプレッサーのＡｌａ４０の置換は、その結合特異性を変化させ、その結果このリプレッサーはいまや、クラスＢのオペレーターに結合できる）ということがやはり見出されている（Ａｌｔｓｃｈｍｉｅｄら、（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７：４０１１〜４０１７を参照のこと）。従って、当業者は、標準的な分子生物学の技術（例えば、部位特異的突然変異誘発）により、ＴｈｒからＡｌａにアミノ酸残基４０をさらに変化させることによって、本明細書に開示される変異されたＴｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサーの結合特異性を変更し得る。

例えば、特異的な変異（例えば、上述のように、位置、７１、９５、１０１および／または１０２に）を有する、変異されたＴｅｔリプレッサーは、ヌクレオチド変異を組み込んでいるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的な分子生物学技術、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発により、野性型リプレッサーをコードする核酸中にヌクレオチドの変化を導入することによって、作成され得る。あるいは、変異されたＴｅｔリプレッサーが、ライブラリーからの選択によって特定されるとき、この変異された核酸は、ライブラリーベクターから回収され得る。本発明の転写調節因子融合タンパク質を作成するために、次いで、変異されたＴｅｔリプレッサーをコードする核酸を、転写活性化ドメインをコードする別の核酸にインフレームで連結して、その融合構築物を、組み換え発現ベクター中に組み込む。この転写調節因子融合タンパク質は、宿主細胞または動物中に組み換え発現ベクターを導入することによって発現され得る。

（Ｂ．トランス活性化因子融合タンパク質の第二のポリペプチド）
トランス活性化融合タンパク質の第一のポリペプチドを、真核生物細胞において転写を直接または間接的に活性化する第二のポリペプチドに対して作動可能に連結する。この第一および第二のポリペプチドを作動可能に連結するために、代表的には、この第一および第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、お互いにインフレームで連結して、融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を作成する。しかし、この第一および第二のポリペプチドは、お互いのポリペプチドの機能を保存する他の方法で作動可能に連結されてもよい（例えば、化学的に架橋される）。このトランス活性化因子の第二のポリペプチドはそれ自体、転写活性化活性を保有し得る（すなわち、第二のポリペプチドが転写を直接活性化する）。この第二のポリペプチドはまた、融合タンパク質と相互作用する転写活性化タンパク質の補充を通して、間接的な機構によって転写を活性化し得る。

真核生物細胞において転写を活性化するように機能し得るポリペプチドは、当該分野で周知である。詳細には、多くのＤＮＡ結合タンパク質の転写活性化ドメインが記載されており、そしてこのドメインは異種タンパク質に移入されるとき、それらの活性化機能を保持することが示されている。本発明の方法の融合タンパク質における使用のための好ましいポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６である（本明細書においては、ＶＰ１６と呼ばれ、そのアミノ酸配列は、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ら、（１９８８）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２：７１８〜７２９に開示される）。

真核生物細胞で転写活性化能力を有する他のポリペプチドは、本発明の方法の融合タンパク質で用いられ得る。種々のタンパク質内で見出される転写活性化ドメインは、類似した構造的特徴に基づいてカテゴリーに分類されている。転写活性化ドメインのタイプは、酸性の転写活性化ドメイン、プロリンリッチな転写活性化ドメイン、セリン／トレオニンリッチな転写活性化ドメインおよびグルタミンリッチな転写活性化ドメインを包含する。酸性の転写活性化ドメインの例としては、既に記載されたＶＰ１６領域およびＧＡＬ４のアミノ酸残基７５３〜８８１が挙げられる。プロリンリッチな活性化ドメインの例としては、ＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９〜４９９、およびＡＰ２のアミノ酸残基３１〜７６が挙げられる。セリン／トレオニンリッチな転写活性化ドメインの例としては、ＩＴＦ１のアミノ酸残基１〜４２７、およびＩＴＦ２のアミノ酸残基２〜４５１が挙げられる。グルタミンリッチな活性化ドメインの例としては、ＯｃｔＩのアミノ酸残基１７５〜２６９、およびＳｐ１のアミノ酸残基１３２〜２４３が挙げられる。上記の領域の各々のアミノ酸配列および他の有用な転写活性化ドメインのアミノ酸配列は、Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら、（ＥＭＢＯＪ．（１９９２）１３：４９６１〜４９６８）に開示されている。

前に記載された転写活性化ドメインに加えて、標準的な技術で特定され得る新規な転写活性化ドメインが本発明の方法の範囲内である。ポリペプチドの転写活性化能力は、ＤＮＡ結合活性を有する別のポリペプチドに対してポリペプチドを結合すること、およびこの融合タンパク質によって刺激される標的配列の転写の量を決定することによってアッセイされ得る。例えば、当該分野で用いられる標準的なアッセイは、推定の転写活性化ドメインおよびＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、アミノ酸残基１〜９３）の融合タンパク質を利用する。次いで、この融合タンパク質を用いて、ＧＡＬ４結合部位に結合されたレポーター遺伝子の発現を刺激する（例えば、Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．ら、（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：４９６１〜４９６８およびそこに引用された参考文献を参照のこと）。

融合タンパク質の第二のポリペプチドは、この融合タンパク質と相互作用する転写活性化因子を補充することによって間接的に転写を活性化し得る。例えば、本発明のＴｅｔＲまたは変異ＴｅｔＲは、宿主細胞に存在する内因性の活性化因子のような、転写活性化タンパク質とのタンパク質間相互作用を媒介し得るポリペプチドドメイン（例えば、二量体化ドメイン）に対して融合され得る。ＤＮＡ結合ドメインと、トランス活性化ドメインとの間の機能的な会合は、共有結合である必要はないことが実証されている（例えば、ＦｉｅｌｄｓａｎｄＳｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５〜２４７；Ｃｈｉｅｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ３１：９５７８〜９５８２；Ｇｙｕｒｉｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ７５：７９１〜８０３；およびＺｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．（１９９３）Ｃｅｌｌ７２：２２３〜２３２を参照のこと）。従って、この融合タンパク質の第二のポリペプチドは、転写を直接活性化しなくてもよく、むしろ、適合性のタンパク質間相互作用ドメインとトランス活性化ドメインとを保有する内因性のポリペプチドとの安定した相互作用を形成してもよい。適切な相互作用（または二量体化）ドメインの例としては、ロイシンジッパー（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：１６８１〜１６８８）、らせん−ループ−らせん（ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）ドメイン（Ｍｕｒｒｅ，Ｃ．ら、（１９８９）Ｃｅｌｌ５８：５３７〜５４４）および亜鉛フィンガードメイン（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４：７０〜７３）が挙げられる。融合タンパク質に存在する二量体化ドメインの、内因性の核因子との相互作用によって、この核因子のトランス活性化ドメインが融合タンパク質に対して補充され、そしてそれによって、融合タンパク質が結合されるｔｅｔオペレーター配列に対しても補充される。

（Ｃ．転写サイレンサー融合タンパク質の第二のポリペプチド）
一実施形態では、転写サイレンサー融合タンパク質の第一のポリペプチドを、真核生物細胞における転写を直接または間接的に阻害する第二のポリペプチドに対して作動可能に連結する。すなわち、本明細書に記載されるとおり、そして当該分野で公知のとおり、融合タンパク質の第一および第二のポリペプチドを作動可能に連結するためには、代表的には、第一および第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をお互いとインフレームで連結して、融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を作成する。しかし、この第一および第二のポリペプチドは、各々のポリペプチドの機能を保存する他の方法で作動可能に連結されてもよい（例えば、化学的に架橋される）。代表的には、融合タンパク質であって、その融合タンパク質のアミノ末端に第一のポリペプチドを、そしてその融合タンパク質のカルボキシ末端に第二のポリペプチドを有する融合タンパク質が本明細書で記載されるが、反対方向（すなわち、アミノ末端に第二のポリペプチド、およびカルボキシ末端に第一のポリペプチド）も本発明によって考慮されることが当業者には理解されるであろう。

真核生物細胞において転写を阻害するように機能し得るタンパク質およびタンパク質内のポリペプチドドメインは、当該分野で記載されている（概説については、例えば、Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．（１９９０）ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ６：１９２〜１９７；ならびにＨｅｒｓｃｈｂａｃｈ，Ｂ．Ｍ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：４７９〜５０９を参照のこと）。このような転写サイレンサードメインは、当該分野では「サイレンシングドメイン（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ）」または「リプレッサードメイン（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｄｏｍａｉｎｓ）」と呼ばれている。これらのポリペプチドドメインの多くが転写を阻害する正確な機構は未知である（そして本発明は、機構によって限定されることはないものとする）が、リプレッサードメインが転写を阻害し得るいくつかの可能性のある方法が存在し、これには以下が挙げられる。すなわち、１）いずれかの活性化因子タンパク質の結合または一般的転写機構の競合的阻害、２）ＤＮＡに結合した活性化因子の活性の防止、および３）一般的転写機構の機能的な前開始複合体のアセンブリとの負の干渉、である。従って、リプレッサードメインは、転写機構に対して直接の阻害効果を有してもよいし、または活性化因子タンパク質の活性を阻害することによって間接的に転写を阻害してもよい。従って、「真核生物細胞において転写を阻害するポリペプチド（ａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｔｈａｔｉｎｈｉｂｉｔｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ）」という用語は、本明細書において用いる場合、転写を直接または間接的に阻害するように作用するポリペプチドを包含するものとする。本明細書において用いる場合、転写の「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」とは、転写サイレンサータンパク質による調節の前の転写のレベルまたは量に比較した、標的核酸配列の転写のレベルまたは量における減少を意味するものとする。転写阻害は、部分的であっても完全であってもよい。「サイレンサー（ｓｉｌｅｎｃｅｒ）」、「リプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）」および「インヒビター（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、転写を阻害し得る調節性タンパク質またはそのドメインについて述べている。

本明細書に記載されるような転写の「リプレッサー」または「サイレンサー」ドメインとは、そのドメインが異種タンパク質に移入される場合その転写リプレッサー機能を保持するポリペプチドドメインである。異種タンパク質に移入された場合機能し得るリプレッサードメインを有することが実証されているタンパク質としては、ｖ−ｅｒｂＡ癌遺伝子産物（Ｂａｎｉａｈｍａｄ，Ａ．ら、（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：１０１５〜１０２３）、甲状腺ホルモン受容体（Ｂａｎｉａｈｍａｄ、前出）、レチノイン酸受容体（Ｂａｎｉａｈｍａｄ，前出）、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＫｒｕｅｐｐｅｌ（Ｋｒ）タンパク質（Ｌｉｃｈｔ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４６：７６〜７９；Ｓａｕｅｒ，Ｆ．およびＪａｃｋｌｅ，Ｈ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ２：５６３〜５６６；Ｌｉｃｈｔ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４０５７〜４０６６）が挙げられる。真核生物細胞において転写リプレッサー活性を有する他のタンパク質の非限定的な例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのホメオドメインタンパク質イーブン・スキップド（ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄ）（ｅｖｅ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳｓｎ６／Ｔｕｐ１タンパク質複合体（ＨｅｒｓｃｈｂａｃｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，前出を参照のこと）、酵母ＳＩＲ１タンパク質（Ｃｈｉｅｎ，ら、（１９９３）Ｃｅｌｌ７５：５３１〜５４１を参照のこと）、ＮｅＰ１（Ｋｏｈｎｅ，ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３２：７４７〜７５５を参照のこと）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｄｏｒｓａｌのタンパク質（Ｋｉｒｏｖ，ら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７１３〜７２２；Ｊｉａｎｇ，ら、（１９９３）ＥＭＢＯＪ．１２：３２０１〜３２０９を参照のこと）、ＴＳＦ３（Ｃｈｅｎ，ら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：８３１〜８４０を参照のこと）、ＳＦ１（Ｔａｒｇａ，ら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８８：４１６〜４２３を参照のこと）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｈｕｎｃｈｂａｃｋのタンパク質（Ｚｈａｎｇ，ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７５１１〜７５１５を参照のこと）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｋｎｉｒｐｓのタンパク質（Ｇｅｒｗｉｎ，ら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７８９９〜７９０８を参照のこと）、ＷＴ１タンパク質（ウィルムス腫瘍遺伝子産物）（Ａｎａｎｔ，ら、（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ９：３１１３〜３１２６；Ｍａｄｄｅｎら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：１７１３〜１７２０を参照のこと）、Ｏｃｔ−２．１（Ｌｉｌｌｙｃｒｏｐ，ら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７６３３〜７６４２を参照のこと）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのエングレイルド（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）タンパク質（Ｂａｄｉａｎｉ，ら、（１９９４）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．８：７７０〜７８２；ＨａｎおよびＭａｎｌｅｙ，（１９９３）ＥＭＢＯＪ．１２：２７２３〜２７３３を参照のこと）、Ｅ４ＢＰ４（ＣｏｗｅｌｌおよびＨｕｒｓｔ，（１９９４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２：５９〜６５を参照のこと）およびＺＦ５（Ｎｕｍｏｔｏ，ら、（１９９３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：３７６７〜３７７５を参照のこと）が挙げられる。

本発明の方法の転写のサイレンサー融合タンパク質の第二のポリペプチドは、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＫｒｕｅｐｐｅｌタンパク質の転写サイレンサードメインであってもよい。リプレッサー活性を有するＣ末端領域、例えば、天然タンパク質のアミノ酸４０３〜４６６が用いられ得る（Ｓａｕｅｒ，Ｆ．およびＪａｃｋｌｅ，Ｈ．，前出を参照のこと）。この領域は、Ｃ６４ＫＲと呼ばれる。ＴｅｔＲ−Ｃ６４ＫＲ融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築は、米国特許第５，７８９，１５６号に記載される。あるいは、やはりリプレッサー活性を有しているＫｒのアラニンリッチなアミノ末端領域も、融合タンパク質の第二のポリペプチドとして用いられ得る。例えば、Ｋｒのアミノ酸２６〜１１０（Ｌｉｃｈｔ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９０）前出を参照のこと）を第二のポリペプチドとして用いてもよい。あるいは、完全なまたは部分的なインヒビター活性を依然として保持するいずれかのＫｒサイレンサードメインを包含する、より長いかまたはより短いポリペプチドフラグメントも考えられる（例えば、Ｎ末端サイレンサードメインのアミノ酸６２〜９２；Ｌｉｃｈｔ，ら、（１９９４）前出）。

本発明の方法の転写サイレンサー融合タンパク質の第二のポリペプチドは、ｖ−ｅｒｂＡ癌遺伝子産物の転写サイレンサードメインであってもよい。ｖ−ｅｒｂＡのサイレンサードメインは、天然のｖ−ｅｒｂＡ癌遺伝子産物のアミノ酸残基３６２〜６３２におおよそマップしている（Ｂａｎｉａｈｍａｄ，ら、前出を参照のこと）。従って、この領域を包含するフラグメントを、サイレンサードメインの第二のポリペプチドとして用いる。天然のｖ−ｅｒｂＡタンパク質のアミノ酸残基３６４〜６３５を用いてもよい。あるいは、完全または部分的なインヒビター活性を依然として保持するｖ−ｅｒｂＡサイレンサー領域を包含する、より短いまたはより長いポリペプチドフラグメントも考えられる。例えば、ｖ−ｅｒｂＡのアミノ酸残基３４６〜６３９、３６２〜６３９、３４６〜６３２、３４６〜６１６および３６２〜６１６を用いてもよい。さらに、やはり依然として完全にまたは部分的にインヒビター活性を保持する、内部欠失を有するこれらの領域を包含するポリペプチドフラグメント、例えば、ｖ−ｅｒｂＡのアミノ酸残基３６２〜４６８／５０８〜６３９が、本発明によって包含される。さらに、サイレンサードメインの２つ以上のコピー、例えば、ｖ−ｅｒｂＡのアミノ酸残基３６２〜６１６の２つのコピーがこの融合タンパク質に含まれてもよい。ｖ−ｅｒｂＡの適切なサイレンサーポリペプチドドメインは、さらに、Ｂａｎｉａｈｍａｄ，Ａ．ら、（前出）に記載される。

他のサイレンサードメインも用いてもよい。用いられ得るポリペプチドドメインの非限定的な例としては、以下が挙げられる：甲状腺ホルモン受容体α（ＴＨＲα）のアミノ酸残基１２０〜４１０、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）のアミノ酸残基１４３〜４０３、クニルプス（ｋｎｉｒｐｓ）のアミノ酸残基１８６〜２３２、ＷＴ１のＮ末端領域（Ａｎａｎｔ，前出を参照のこと）、Ｏｃｔ−２．１のＮ末端領域（Ｌｉｌｌｙｃｒｏｐ，前出を参照のこと）Ｅ４ＢＰ４の６５アミノ酸ドメイン（ＣｏｗｅｌｌおよびＨｕｒｓｔ，前出を参照のこと）およびＺＦ５のＮ末端ジンクフィンガードメイン（Ｎｕｍｏｔｏ，前出を参照のこと）。さらに、完全または部分的なインヒビター活性を依然として保持するこれらの領域を包含する、より短いまたはより長いポリペプチドフラグメントも考慮される。

前に記載された転写サイレンサードメインに加えて、標準的な技術によって特定され得る、新規な転写サイレンサードメインも本発明の方法の範囲内である。ポリペプチドの転写サイレンサー能力は、以下によってアッセイされ得る。すなわち、１）ＤＮＡ結合活性を有する別のポリペプチドに連結された試験サイレンサーポリペプチドをコードする発現ベクターを構築する工程（すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン−サイレンサードメイン融合タンパク質を構築する）、２）この発現ベクターを、宿主細胞で正常に構成的に発現され、かつまたＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含むレポーター遺伝子構築物と一緒に宿主細胞中に同時トランスフェクトする工程、および３）宿主細胞におけるこの融合タンパク質の発現によって阻害されるレポーター遺伝子構築物の転写の量を決定する工程、である。例えば、当該分野で用いられる標準的なアッセイは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、アミノ酸残基１〜１４７）および試験サイレンサードメインの融合タンパク質を利用する。次いで、この融合タンパク質を用いて、正の調節性配列（構成的な転写を正常に刺激する）、およびＧＡＬ４結合部位（例えば、Ｂａｎｉａｈｍａｄ，前出を参照のこと）を含む、レポーター遺伝子構築物の発現を阻害する。

（Ｄ．トランス活性化因子またはインヒビター融合タンパク質の任意の第三のポリペプチド）
ＴｅｔＲまたは変異されたＴｅｔＲおよび転写活性化またはインヒビタードメインに加えて、本発明の方法の融合タンパク質は、細胞の核に対する融合タンパク質の輸送を促進する作動可能に連結された第三のポリペプチドを含み得る。タンパク質に含まれる場合、核に対するこのタンパク質の輸送を促進するように機能するアミノ酸配列は、当該分野で公知であり、そして核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌｓ）（ＮＬＳ）と呼ばれる。核局在化シグナルは代表的には、塩基性アミノ酸のストレッチから構成される。異種タンパク質（例えば、本発明の融合タンパク質）に結合される場合、この核局在化シグナルは、細胞核に対するタンパク質の輸送を促進する。この核局在化シグナルは、異種タンパク質の表面上に曝されてそのタンパク質の機能を妨害しないように、その異種タンパク質に結合される。好ましくは、ＮＬＳは、そのタンパク質の一端、例えば、Ｎ末端に結合される。本発明の方法の融合タンパク質に含まれ得るＮＬＳの非限定的な例のアミノ酸配列は、米国特許第５，７８９，１５６号に見出され得る。好ましくは、核局在化シグナルをコードする核酸は、融合タンパク質をコードする核酸に対してインフレームで標準的な組換えＤＮＡ技術によってスプライシングされる（例えば、５’末端で）。

（ＩＩＩ．トランスサイクリン調節可能系によって制御される標的転写単位）
一実施形態では、本発明の方法は、標的ヌクレオチド配列の転写を調節するための融合タンパク質の調節を特徴づける。この標的ヌクレオチド配列は、ＴＲＥに作動可能に連結され得る。従って、本発明の別の態様は、ＴＲＥに作動可能に連結された転写されるべきヌクレオチド配列を含む標的核酸（例えば、ＤＮＡ分子）に関する。このような核酸分子はまた、本明細書においてｔｅｔ調節された転写単位（または単に転写単位）と呼ばれる。

転写単位内では、「転写されるべきヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｂｅｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）」とは代表的に、それ自体転写されないが、転写のための転写機構を位置付けるように（少なくとも一部において）機能する最少プロモーター配列を包含する。この最少プロモーター配列は、ホスホジエステル結合によって５’〜３’方向で転写配列に連結され（すなわち、プロモーターは、転写された配列の上流に位置する）、連続したヌクレオチド配列を形成する。従って、「転写されるべきヌクレオチド配列」または「標的ヌクレオチド配列」という用語は、ｍＲＮＡに転写されるヌクレオチド配列、および作動可能に連結された上流の最少プロモーター配列の両方を含む。「最少プロモーター」という用語は、転写されるべき連結された配列の転写の開始部位を規定するが、それ自体は、仮にあったとしても、転写を効率的に開始できない部分的プロモーター配列を包含する。従って、このような最少プロモーターの活性は、作動可能に連結された調節性配列（例えば、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列）に対する転写活性化因子（例えば、本発明のテトラサイクリン誘導性融合タンパク質）の結合に依存する。一実施形態では、この最少プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス由来である（Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）Ｃｅｌｌ４１：５２１〜５３０に記載されるとおり）。好ましくは、ほぼ＋７５〜−５３と＋７５〜−３１との間のヌクレオチド位置を用いる。他の適切な最少プロモーターは、当該分野で公知であるか、または標準的な技術によって特定され得る。例えば、連続的に連結されたレポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）の転写を活性化する機能的プロモーターは、レポーター遺伝子単独の発現をもはや活性化しなくなるまで徐々に欠失されてもよいが、さらなる調節性配列の存在はむしろ必要とする。

転写単位内では、標的ヌクレオチド配列（転写されたヌクレオチド配列およびその上流の最少プロモーター配列を含む）が、少なくとも１つのＴＲＥ、例えば、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結される。一実施形態では、ＴＲＥは、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列の複数のコピー（例えば、多量体化またはコンカテマー化されたコピー）を含んでもよい。代表的な立体配置では、ｔｅｔオペレーター配列は、適切な距離のホスホジエステル結合を通じて最少プロモーター配列の上流（すなわち、５’側）に作動可能に連結されて、ｔｅｔオペレーター配列に対する調節性タンパク質（例えば、転写調節性融合タンパク質）の結合の際の標的ヌクレオチド配列の転写が可能になる。すなわち、この転写単位は、５’から３’方向で以下から構成される。すなわち、ｔｅｔオペレーター配列−最少プロモーター−転写されたヌクレオチド配列である。ｔｅｔオペレーター配列とこの最少プロモーターとの間の許容できる距離に、ある程度の可塑性が存在することが当業者には理解されるが、代表的には、このｔｅｔオペレーター配列は、最少プロモーターの約２００〜４００塩基対上流内に位置する。

本発明で用いられ得る、最少プロモーターに連結されたｔｅｔオペレーター配列を含むｔｅｔ−調節性プロモーターの例示的なヌクレオチド配列の例は、当該分野で公知である。例えば、１０個のｔｅｔオペレーター配列に連結されたサイトメガロウイルス最少プロモーターが用いられ得る。あるいは、１０個のｔｅｔオペレーター配列に連結された単純ヘルペスウイルス最少ｔｋプロモーターが用いられ得る。例示的なプロモーターは、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７〜５５５１に記載される。

あるいは、調節性エレメントは、転写されるべき配列の下流で機能することが当該分野で観察されているので、ｔｅｔオペレーター配列は、転写されたヌクレオチド配列の下流（すなわち、３’）側に作動可能に連結されてもよいと思われる。従って、この構造では、転写単位は、５’〜３’方向に、以下から構成される。すなわち、最少プロモーター−転写されたヌクレオチド配列−ｔｅｔオペレーター配列である。ここでも、ｔｅｔオペレーター配列が連結され得る下流の許容できる距離ではある程度の可塑性が存在する可能性が高いということが理解される。

ｔｅｔ−調節性転写単位はさらに、標準的な組換えＤＮＡ技術によって組み換えベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）に組み込まれ得る。この転写単位、またはそれが含まれる組み換えベクターは、上述した技術などの標準的なトランスフェクション技術によって宿主細胞に導入され得る。宿主細胞の集団への転写単位の導入後、ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の低い基礎発現を示す宿主細胞クローンを選択（すなわち、ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の低い基礎的発現を生じる部位に転写単位を組み込んでいる宿主細胞についての選択）する必要があるかもしれないことが理解されるべきである。さらに、ｔｅｔ調節性転写単位を、本明細書に記載される手順によって、胚形成期に非ヒト動物のゲノムに、または植物細胞に導入して、その細胞のいくつかまたは全てにおいて転写単位を担持するトランスジェニックまたは相同組み換えの生物体を作成してもよい。ここでも、目的の細胞においてｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の低い基礎的発現が存在する、トランスジェニックまたは相同な生物を選択する必要性があり得ることが理解されるべきである。

ｔｅｔ−調節性転写単位の標的ヌクレオチド配列は、目的のタンパク質をコードし得る。従って、本発明のトランス活性化因子によるヌクレオチド配列の転写の誘導、および得られたｍＲＮＡの翻訳の際、目的のタンパク質を、宿主細胞または動物中で生成する。あるいは、転写されるべきヌクレオチド配列は、活性なＲＮＡ分子、例えば、アンチセンスＲＮＡ分子またはリボザイムをコードし得る。宿主細胞および動物における活性なＲＮＡ分子の発現を用いて、宿主内の機能を調節し（例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより目的のタンパク質の産生を妨げ）てもよい。

本発明の方法の転写調節因子は、宿主細胞または動物中に導入された外因性ヌクレオチド配列の転写を調節するために用いられ得る。「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」ヌクレオチド配列とは、宿主細胞に導入されかつ代表的には、宿主のゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列である。この外因性のヌクレオチド配列とは、宿主のゲノムのほかの場所に存在しなくてもよい（例えば、外来のヌクレオチド配列）し、または宿主のゲノム内に存在するが、そのゲノムの異なる部位に組み込まれている配列のさらなるコピーであってもよい。転写されるべき外因性のヌクレオチド配列および作動可能に連結されたｔｅｔオペレーター配列は、宿主細胞または動物中に導入される単一の核酸分子内に含まれてもよい。

あるいは、本発明の方法の転写調節性因子は、ｔｅｔオペレーター配列が連結されている内因性のヌクレオチド配列の転写を調節するために用いられ得る。「内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」ヌクレオチド配列とは、宿主のゲノム内に存在するヌクレオチド配列である。内因性遺伝子は、ｔｅｔＯ含有組み換えベクターと内因性の遺伝子の配列との間の相同組み換えによってｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結され得る。例えば、内因性遺伝子の実際のプロモーター領域を排除することによって、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列、および内因性遺伝子のコード領域に相当する配列によってその３’末端で隣接されかつ内因性遺伝子の上流領域由来の配列によって５’末端で隣接される最少プロモーター配列を含む、相同組み換えベクターが調製され得る。この隣接する配列は、内因性遺伝子を有するベクターＤＮＡの首尾よい相同組み換えのために十分な長さの配列である。好ましくは、数キロベースの隣接ＤＮＡが、相同組み換えベクターに含まれる。宿主細胞におけるベクターＤＮＡと内因性遺伝子との間の相同組み換えの際、内因性プロモーターの領域は、最少プロモーターに作動可能に連結された１つ以上のｔｅｔオペレーター配列を含むベクターＤＮＡによって置換される。従って、内因性遺伝子の発現は、もはやその内因性プロモーターの制御下ではなく、むしろｔｅｔオペレーター配列および最少プロモーターの制御下に置かれる。

別の実施形態では、ｔｅｔオペレーター配列は、内因性遺伝子内のいずれかに、好ましくは、５’または３’の調節性領域内に、相同組み換えを介して挿入されて、内因性遺伝子であってその発現が本明細書に記載されるような置換されたテトラサイクリン化合物調節性融合タンパク質によって調節され得る内因性遺伝子が作成され得る。例えば、プロモーターまたはエンハンサーの機能が維持されるように、１つ以上のｔｅｔＯ配列を内因性遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー領域内に挿入してもよい（すなわち、ｔｅｔＯ配列が、プロモーター／エンハンサー機能に重要ではないプロモーター／エンハンサー領域の部位に導入される）。プロモーター／エンハンサー機能の欠失なしで変更され得るプロモーターまたはエンハンサー内の領域は、多くの遺伝子について当該分野で公知であるか、または重要な調節性領域を分析するための標準的な技術によって決定され得る。重要でない調節性領域中に挿入されるｔｅｔＯ配列を有する内因性遺伝子は、その正常な構成的および／または組織特異的方式で発現される能力を保持するが、さらに、制御された方式で置換されたテトラサイクリン化合物制御の転写サイレンサータンパク質によって下方制御され得る。例えば、このような改変された内因性遺伝子の構成的発現は、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でｔｅｔＯ配列に結合するインヒビター融合タンパク質を用いて、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下において阻害され得る。

（ＩＶ．転写調節性分子の感度の変更）
一実施形態では、本発明の転写調節性因子は、テトラサイクリンの非存在下における基礎的転写活性の減少、テトラサイクリンの存在下での誘導された転写活性の増大、またはテトラサイクリンおよびテトラサイクリンのアナログによる種々の誘導のような、新規な表現型を有する。

本発明の一態様では、特定の変異または変更が、転写調節性タンパク質に導入される。別の態様では、選択またはスクリーニングの系とカップリングしたランダム突然変異誘発技術を用いて、多数の変異を転写調節性タンパク質に導入する。次いで、無作為に変異されたタンパク質の得られたコレクションを、所望の表現型の選択またはスクリーニングに供するが、ここでは所望の表現型が、所望されない表現型のバックグラウンドに対して観察され得る。

ランダム突然変異誘発法によれば、本発明の一態様では当業者は、分子全体を変異誘発させてもよいし、または、カセット突然変異誘発によって処理してもよい。前者の場合、分子の全コード領域は、いくつかの方法（化学的、ＰＣＲ、ドープオリゴヌクレオチド合成）のうちの１つによって突然変異誘発し、そしてランダムに変異された分子の得られたコレクションを選択またはスクリーニング手順に供する。ランダム突然変異は、この方式で適用され得、この場合研究される分子は比較的小さく、そして、必然的に生じる変異体表現型の種々のクラスを識別するのに利用可能な強力でありかつストリンジェントな選択またはスクリーニングが存在する。

ランダム突然変異誘発は、以下を含む多くの方法によって達成され得る。
１．ＰＣＲ突然変異誘発。ここでは、カップリングする能力について酵母中で直接アッセイされる、転写調節タンパク質の変異体対立遺伝子を生成するために誤りがちな（ｅｒｒｏｒｐｒｏｎｅ）Ｔａｑポリメラーゼが開発されている。
２．化学的突然変異誘発。ここでは、転写調節性タンパク質をコードする発現カセットが、変異誘発物質に曝されて、変異体配列のタンパク質産物が、カップリングする能力について酵母中で直接アッセイされる。
３．転写調節性タンパク質遺伝子のオリゴヌクレオチドコード部分のドープ合成。
４．インビボの突然変異誘発。ここでは、ランダム突然変異を、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異誘発株ＸＬ１−Ｒｅｄ（ｍｕｔＤ５ｍｕｔＳｍｕｔＴ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｍｅｎａｓａ，Ｗｉｓ．）を通じた継代によって転写調節性タンパク質のコード領域中に導入する。転写調節性タンパク質中の機能的ドメインの変異体ペプチド配列の置換によって、機能の達成のための特定の配列要件の決定が可能になる。

本発明の特定の突然変異誘発態様によれば、既定の構造的な決定因子（すなわち、α−らせん、β−シート、ターン、表面ループ）または機能的な決定因子（例えば、ＤＮＡ結合決定因子、転写調節性ドメイン）のいずれかに対応する、タンパク質の別個の領域を飽和またはセミランダム突然変異誘発に供する。得られた突然変異誘発されたカセットを、他の野生型対立遺伝子の環境に再導入する。カセット突然変異誘発は、分子のある領域について特定の機能を示唆するために利用可能な実験的証拠が存在し、かつ目的の変異体と目的でない変異体とを識別するために利用可能な選択および／またはスクリーニングのアプローチが存在する場合有用である。カセット突然変異誘発はまた、親分子が比較的大きく、かつ、段階的方式で分子を突然変異誘発すること、すなわち、ある時点で残基の１つの直線的カセットを変異させ、次いで機能についてアッセイすることによって分子の機能的ドメインをマッピングすることが所望される場合にも有用である。

ｒＴＡまたはｒｔＴＡコード配列の突然変異誘発によって、種々のエフェクター分子と示差的に相互作用する転写調節因子の特定が容易になる。例えば、突然変異誘発は、エフェクター結合ポケットを形成することを担う配列の一部に制限され得る。このような特性は、転写調節因子およびエフェクターの特定のセットを介して異なる遺伝子を制御するために開発され得る（Ｂａｒｏｎら、１９９９を参照のこと）。エフェクター結合ポケットの改変は骨組織に沈着されないテトラサイクリンの検出のための必要条件である可能性が最も高い。遺伝子治療に関しては、ヒトの医薬で用いられるテトラサイクリンに感受性のない転写調節因子を用いることが有利である。

一実施形態では、変異されたｒｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリンまたはそのアナログの非存在下で変更された基礎的転写活性を有する。好ましい実施形態では、ｒｔＴＡタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン内に少なくとも１つの変化されたアミノ酸を有する。好ましい実施形態では、この変異は、以下からなる群より選択される。すなわち、Ｓ１２Ｇ、Ｅ１９Ｇ、およびＴ２６Ａである。別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン内の変異によって、テトラサイクリンまたはそのアナログの非存在下でｔｅｔオペレーターについて増大または減少された基礎的親和性が付与される。

別の実施形態では、変異されたｒｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリンまたはそのアナログの存在下で増大または減少された誘導された転写活性を有する。好ましい実施形態では、本発明のｒｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有する。好ましい実施形態では、この変異は、以下からなる群より選択される。すなわち、Ａ５６Ｐ、Ｒ８７Ｓ、欠失Ｃ８８、Ｄ９５Ｇ、Ｇ９６Ｒ、Ｖ９９Ｅ、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ、およびＥ２０４Ｋである。別の実施形態では、テトラサイクリン結合ドメイン内の変異によって、ドキシサイクリンまたはそのアナログに対する増大または減少された感度が付与される。

本発明の別の局面では、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質は、ｔＴＡタンパク質の配列改変体である。ｔＴＡタンパク質の配列改変体は、タンパク質に対して新規な表現型を付与する少なくとも１つの変異を含む。

一実施形態では、この変異されたｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリンまたはそのアナログによる示差的誘導を示す。好ましい実施形態では、本発明のｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリン結合ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有する。好ましい実施形態では、この変異は、以下からなる群より選択される。すなわち、Ａ５６Ｖ、Ｆ７８Ｓ、Ｓ８５Ｇ、Ｓ８５Ｒ、Ｙ１１０Ｃ、Ｌ１１３Ｈ、Ｙ１３２Ｃ、Ｉ１６４Ｌ、Ｐ１６７Ｓ、Ｌ１７０Ｖ、Ｉ１７４Ｖ、Ｉ１７４Ｔ、またはＥ１８３Ｋである。別の実施形態では、テトラサイクリン結合ドメイン内の変異によって、テトラサイクリンまたはそのアナログに対する増大または減少された感度が付与される。

例示的な変異は、例えば、米国特許出願公開第２００３０２０８７８３号のような公開特許出願において教示される。変異されたｔＴＡまたはｒｔＴＡタンパク質の所望の機能的特性を保持する、これらまたは他のアミノ酸位置での他のアミノ酸の置換、欠失または付加は本発明の範囲内である。

（Ｖ．核酸分子の発現）
Ａ．発現ベクター
本発明の核酸分子は、上述のように、転写調節因子融合タンパク質および／またはＴＲＥに作動可能に連結された標的核酸配列をコードしてもよく、そして当該分野で公知の方法を用いて宿主細胞における融合タンパク質の発現のために適切な形態で１つ以上の組み換え発現ベクター中に組み込まれてもよい。

哺乳動物細胞で用いられる場合、組み換え発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの遺伝物質によって提供される。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳｉｍｉａｎＶｉｕｓ４０由来である。融合タンパク質の発現を指向するウイルスの調節性エレメントの使用によって、種々の宿主細胞における融合タンパク質の高レベルの構成的な発現が可能になり得る。好ましい組み換え発現ベクターでは、融合タンパク質をコードする配列には、上流（すなわち５’）ではヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモーターが、そして下流（すなわち３’）ではＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルが隣接する。ヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモーターは、Ｂｏｓｈａｒｔら、（１９８５）Ｃｅｌｌ４１：５２１〜５３０に記載される。用いられ得る他の偏在性発現プロモーターとしては、ＨＳＶ−Ｔｋプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８４）Ｃｅｌｌ３７：２５３〜２６２に開示される）およびβ−アクチンプロモーター（例えば、Ｎｇら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７２０〜２７３２に記載されるようなヒトβ−アクチンプロモーター）が挙げられる。

あるいは、組み換え発現ベクターの調節性配列は、特定の細胞タイプにおいて優先的に融合タンパク質の発現を指向し得、すなわち、組織特異的な調節性エレメントが用いられ得る。用いられ得る組織特異的なプロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１：２６８〜２７７）、リンパ球特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅａｎｄＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５）、詳細には、Ｔ細胞レセプターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：７２９〜７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉら、（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：９１２〜９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生上調節されるプロモーター、例えば、マウスのホックス（ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４〜３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．３：５３７〜５４６）も包含される。

あるいは、転写調節因子融合タンパク質をコードする自己調節性構築物が作成され得る。これを達成するために、この融合タンパク質をコードする核酸を、最少プロモーター配列および少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結する。このような核酸を細胞中に導入するとき（例えば、組み換え発現ベクターにおいて）、転写調節因子遺伝子の少量の基礎的な転写が、「漏出（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）」に起因して生じる可能性が高い。置換されたテトラサイクリン化合物の存在下では、この少量の転写調節因子融合タンパク質は、この転写調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流のｔｅｔオペレーター配列に結合して、転写調節因子をコードするヌクレオチド配列のさらなる転写を刺激し、それによって、細胞中でこの転写調節因子融合タンパク質のさらなる産生をもたらす。このような自己調節性のプロモーターはまた、他のテトラサイクリン調節性転写調節因子、例えば、テトラサイクリンの非存在下でｔｅｔオペレーターに結合する、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７〜５５５１に記載の野生型Ｔｅｔリプレッサー融合タンパク質（ｔＴＡ）と組み合わせて用いられ得るということが当業者に理解されるであろう。このトランス活性化因子と組み合わせて用いる場合、このトランス活性化因子をコードするヌクレオチド配列の自己調節性の転写は、本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で刺激される。

本発明の組み換え発現ベクターは、米国特許第５，７８９，１５６号に記載されるようなプラスミドであってもよい。あるいは、本発明の組み換え発現ベクターは、ウイルスまたはその一部であって、そのウイルス核酸に導入された核酸の発現を可能にするものであってもよい。例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが用いられてもよい。組み換えレトロウイルスを生成するため、およびこのようなウイルスを用いてインビトロまたはインビボで細胞を感染させるためのプロトコールは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（編）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０−９．１４および他の標準的な実験マニュアルに見出され得る。適切なレトロウイルスの例としては、当業者に周知である、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。適切なパッケージングウイルス株の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。アデノウイルスのゲノムは、転写調節因子融合タンパク質をコードし、かつ発現するが、正常な溶解性のウイルスのライフサイクルで複製する能力に関しては不活性であるように操作されてもよい。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１〜４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３〜１５５を参照のこと。アデノウイルスの株Ａｄの５型ｄｌ３２４または他の株のアデノウイルス（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。あるいは、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０に記載されるベクターのようなアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、転写調節因子融合タンパク質を発現してもよい。

Ｂ．宿主細胞
テトラサイクリン化合物を用いて、細胞または生物体中で転写を調節してもよい。一実施形態では、細胞は真核生物細胞である。別の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。本発明の方法は広範に適用可能であり、そして非哺乳動物真核生物細胞および非真核生物細胞を同様に包含する。いくつかの例としては、以下が挙げられる。すなわち、細菌、昆虫（例えば、Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ；Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．（１９９２）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３（５）：４８６〜４９６）に一般的に概説されるとおり）、真菌および植物細胞、である。酵母のＳ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅでの発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ．ら，（１９８７）ＥｍｂｏＪ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３〜１２３）、およびｐＹＥＳ２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。この融合タンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現されてもよい（例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、（１９９２）ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓに記載されるとおり）。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１〜３９）が挙げられる。

一実施形態では、本発明の方法の融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入することによって細胞中で発現され、ここでこの核酸は、宿主細胞における融合タンパク質の発現に適切な形態である。例えば、融合タンパク質をコードする本発明の方法の組み換え発現ベクターを、宿主細胞に導入する。あるいは、調節性配列（例えば、プロモーター配列）に作動可能に連結されているがさらなるベクター配列のない融合タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入してもよい。

細胞株に加えて、本発明の方法は、正常な細胞、例えば、遺伝子治療目的で改変されるべき細胞、またはトランスジェニックもしくは相同組み換え動物を作成するように改変された真核生物細胞に適用可能である。遺伝子治療目的のための特定の目的の細胞タイプの例としては、造血幹細胞、筋芽細胞、肝細胞、リンパ球、神経細胞および皮膚上皮および気道上皮が挙げられる。さらに、トランスジェニック動物または相同組み換え動物については、胚性幹細胞および受精卵母細胞が、転写調節因子融合タンパク質をコードする核酸を含むように改変されてもよい。さらに、トランスジェニック植物を作成するように植物細胞を改変してもよい。

（Ｃ．宿主細胞への核酸分子の導入）
融合タンパク質をコードする核酸分子は、従来の形質転換またはトランスフェクションの技術を介して胚細胞または真核生物細胞中に導入してもよい。「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）という用語は、宿主細胞中に外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための当該分野で認識される種々の技術を包含し、これには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、および他の実験マニュアルに見出され得る。

本発明の方法の核酸で形質転換された宿主細胞の数は、少なくとも一部は、用いられる組み換え発現ベクターのタイプ、および用いられるトランスフェクション技術のタイプに依存する。核酸分子は、一時的に宿主細胞に導入されてもよく、またはさらに代表的には、遺伝子発現の長期調節にわたって、核酸は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれるか、または宿主細胞中の安定なエピソームとして残る。哺乳動物細胞に導入されたプラスミドベクターは代表的には、低頻度でのみ宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。これらの組み込み体を特定するために、選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性）を含む遺伝子を、一般には目的の核酸とともに宿主細胞に導入する。好ましい選択可能マーカーとしては、Ｇ４１８およびハイグロマイシンのような特定の薬物に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。選択可能マーカーは、目的の核酸から別のプラスミドに導入するか、または同じプラスミドに導入する。本発明の核酸（例えば、組み換え発現ベクター）および選択可能マーカーのための遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞を、選択可能マーカーを用いて細胞について選択することによって特定してもよい。例えば、選択可能マーカーが、ネオマイシン耐性を付与する遺伝子をコードする場合、核酸を取り込んでいる宿主細胞は、Ｇ４１８で選択され得る。選択マーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生存するが、他の細胞は死滅する。

本発明の融合タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた宿主細胞は、融合タンパク質の標的として機能する１つ以上の核酸でさらにトランスフェクトされてもよい。この標的核酸は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結される転写されるべきヌクレオチド配列を含む。

核酸分子は、従来のトランスフェクション技術（例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーションなど）によって、インビトロにおいて培養中で増殖している真核生物細胞に導入されてもよい。核酸分子はまた、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、Ｆｅｒｒｙ，Ｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７〜８３８１；およびＫａｙ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９２）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：６４１〜６４７を参照のこと）、アデノウイルスベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３〜１５５；ならびにＨｅｒｚ，Ｊ．およびＧｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２８１２〜２８１６）、レセプター媒介性ＤＮＡ取り込み（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６．９６３〜９６７；および米国特許第５，１６６，３２０号を参照のこと）、ＤＮＡの直接注入（例えば、Ａｃｓａｄｉら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３３２：８１５〜８１８；およびＷｏｌｆｆら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５〜１４６８を参照のこと）、または微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ
ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４４５５〜４４５９；およびＺｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら、（１９９３）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３１５：２９〜３２を参照のこと）などのインビボにおける細胞への核酸の導入に適切な送達機構の適用によって、インビボで細胞に移されてもよい。従って、遺伝子治療目的のためには、細胞をインビトロで改変して被験体に投与してもよく、あるいは細胞をインビボで直接改変してもよい。

（Ｄ．トランスジェニック生物体）
本発明の１つ以上の融合タンパク質をコードする核酸分子を、非ヒト動物の受精卵母細胞に移して、１つ以上の細胞タイプにおいて本発明の融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物を作成してもよい。トランスジェニック動物とは、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、この導入遺伝子は、出生前、例えば胚形成期に動物または動物の祖先に導入されたものである。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発達する細胞のゲノムに組み込まれており、成熟動物のゲノムに残っており、それによってこのトランスジェニック動物の１つ以上の細胞タイプまたは組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指向するＤＮＡである。一実施形態では、この非ヒト動物はマウスであるが、本発明はそれに限定されない。他の実施形態では、トランスジェニック動物はヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシまたは他の家畜である。このようなトランスジェニック動物はタンパク質の大規模な生成に有用である（いわゆる、「ジーン・ファーミング（ｇｅｎｅｐｈａｒｍｉｎｇ）」。

トランスジェニック動物は、例えば、受精した卵母細胞の雄性前核中に融合タンパク質をコードする核酸（代表的には、構成的エンハンサーまたは組織特異的エンハンサーのような、適切な調節性エレメントに連結された）を、例えば、マイクロインジェクションによって導入すること、およびこの卵母細胞を偽妊娠の雌性の仮親動物で発育させることによって、作成され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、導入遺伝子に含ませて、その導入遺伝子の発現の効率を増大してもよい。トランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を生成するための方法は、当該分野では慣例になってきており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．ら、（１９８６）ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。トランスジェニックの創始動物を用いて、導入遺伝子を担持するさらなる動物を育種してもよい。本発明の融合タンパク質をコードする導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物に対して、例えば、ｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された遺伝子を含むトランスジェニック動物に対してさらに交配してもよい。

トランスジェニック動物に加えて、本明細書に記載される調節性の系は、他のトランスジェニック生物体、例えば、トランスジェニック植物に適用可能であることが理解される。トランスジェニック植物は、当該分野で公知の従来の技術によって作成され得る。従って、本発明は、非ヒトトランスジェニック生物体を包含し、この生物体としては、本発明の転写調節性融合タンパク質を発現する細胞を含む（すなわち、転写調節因子をコードする核酸を、トランスジェニック生物体の細胞において１つ以上の染色体に組み込む）、動物および植物が挙げられる。

（Ｅ．相同組み換え生物体）
本発明の方法はまた、本発明の融合タンパク質を発現する相同組み換え非ヒト生物体であって、これに対して置換されたテトラサイクリン化合物が投与され得る相同組み換え生物体を特徴とする。「相同組み換え生物体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語には、遺伝子と動物の細胞、例えば、動物の胚細胞に導入されたＤＮＡ分子との間の相同組み換えによって改変されている遺伝子を含む生物体、例えば、動物または植物が包含される。一実施形態では、この非ヒト動物はマウスであるが、本発明はそれに限定されない。融合タンパク質をコードする核酸がゲノムの特定の部位に導入されている、すなわち、核酸が内因性遺伝子と相同的に組み換えられている動物が作成されてもよい。

このような相同組み換え動物を作成するには、相同組み換えが生じる真核生物遺伝子のさらなる核酸によってその５’および３’末端で隣接される融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターが調製される。その融合タンパク質をコードするさらなる核酸隣接物は、真核生物遺伝子との首尾よい相同組み換えに十分な長さの核酸である。代表的には、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’端および３’端の両方）が、ベクターに含まれる（例えば、相同組み換えベクターの説明については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ５１：５０３を参照のこと）。このベクターを、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入して、この導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組み換えされている細胞を選択する（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら、（１９９２）Ｃｅｌｌ６：９１５を参照のこと）。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注射して、凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．ｉｎＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）ｐｐ．１１３〜１５２を参照のこと）。次いで、キメラ胚を適切な偽妊娠の雌性仮親動物に移植して、その胚に満期をもたらす。相同組み換えされたＤＮＡをその生殖細胞に保有する子孫を用いて、動物の全細胞が相同組み換えＤＮＡを含む動物を育種してもよい。これらの「生殖細胞系伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）」動物をさらに、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された遺伝子を担持する動物に対して交配させてもよい。

上記の相同組み換えアプローチに加えて、酵素補助された部位特異的組み込み系は、当該分野で公知であって、本発明の方法の調節系の成分に適用して、第二の標的ＤＮＡ分子中における所定の位置でＤＮＡ分子を組み込むことが可能である。このような酵素補助組み込み系の例としては、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えば、Ｂａｕｂｏｎｉｓ，Ｗ．およびＳａｕｅｒ，Ｂ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：２０２５〜２０２９；ならびにＦｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ，およびＳａｕｅｒ，Ｂ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７９０５〜７９０９に記載される）およびＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えば、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．およびＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９２）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６７〜３７５；ならびにＦｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９：８４６９〜８４７３に記載される）が挙げられる。

（ＶＩ．標的ヌクレオチド配列の発現の調節）
標的ヌクレオチド配列の発現は、上記のような転写調節性タンパク質によって調節される。従って、融合タンパク質および標的核酸分子が両方とも宿主細胞または生物体に存在する。同じ宿主細胞または生物体における転写調節因子融合タンパク質および標的転写単位の両方の存在は、多数の異なる方法で達成され得る。例えば、発現系の１つの核酸（例えば、転写調節因子融合タンパク質をコードする）を、宿主細胞中に導入し、次いで他の核酸分子を、同じ宿主細胞に導入してもよい。２つの別個の選択可能マーカーを選択のために用いてもよい。例えば、第一の核酸の取り込みは、Ｇ４１８で選択され得、そして第二の核酸の取り込みは、ハイグロマイシンで選択され得る。あるいは、細胞の単一の集団を、この系の両方の成分に相当する核酸でトランスフェクトしてもよい。

従って、本発明の方法で、以下を含む核酸組成物が得られる。

−転写を調節する融合タンパク質をコードする第一の核酸であって、この融合タンパク質が、真核生物細胞における転写を活性化する第二のポリペプチドに対して作動可能に連結された置換されたテトラサイクリン化合物の有無においてｔｅｔオペレーター配列に結合する第一のポリペプチドを含む、第一の核酸、および
−少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された、転写されるべきヌクレオチド配列を含む第二の核酸。

この２つの核酸は、２つの別の分子（例えば、２つの異なるベクター）上に存在してもよい。この場合、宿主細胞を、２つの核酸分子で同時トランスフェクトするか、または最初に１つの核酸分子で次いで他の核酸分子で、連続してトランスフェクトする。別の実施形態では、２つの核酸分子を同じ分子（例えば、単一のベクター）中で連結（すなわち、同一直線上）させる。この場合、宿主細胞は、単一の核酸分子でトランスフェクトされる。

宿主細胞は、インビトロで培養された細胞であっても、インビボで存在する細胞であってもよい（例えば、遺伝子治療について標的化された細胞）。宿主細胞は、さらに、受精された卵母細胞、胚性幹細胞または非ヒトのトランスジェニック動物もしくは相同組み換え動物の作成に用いられる任意の他の胚性細胞であってもよい。発現系の両方の核酸成分を含むトランスジェニック動物または相同組み換えの動物を、胚形成期に同じ細胞に両方の核酸を導入することによって作成してもよいし、またはより好ましくは、ゲノム中にこの系の１つの核酸成分を担持する動物を、ゲノム中にこの系の他の核酸成分を含む動物に対して交配させる。次いで、両方の核酸成分が遺伝されている子孫を標準的な技術によって特定してもよい。

（Ａ．２つのヌクレオチド配列の発現の協調的な調節）
単一の転写されたヌクレオチド配列の発現を調節するための系を提供することに加えて、本発明の方法はさらに、同じｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された２つのヌクレオチド配列の発現の協調的な調節を可能にする。従って、本発明の方法はまた、２つの遺伝子の協調的調節のための新規なｔｅｔ−調節性転写単位に関与し得る。この転写単位では、同じｔｅｔオペレーター配列が、２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を調節し、この配列は、この共通のｔｅｔオペレーター配列から反対方向に転写される。従って、１つのヌクレオチド配列は、ｔｅｔオペレーター配列の一方の側（例えば、ＤＮＡのトップ鎖上の５’末端）に作動可能に連結され、そして他のヌクレオチド配列が、このｔｅｔオペレーター配列の反対側（例えば、ＤＮＡのトップ鎖上の３’末端）に作動可能に連結される。さらに、転写されるべき各々のヌクレオチド配列は、転写されるべきヌクレオチド配列とｔｅｔオペレーター配列との間に位置する、作動可能に連結された最小プロモーター配列を含むことが理解されるべきである。

このような転写単位の代表的な例は、米国特許第５，７８９，１７６号の図６に模式的に示されている。このベクターでは、同じｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された２つのヌクレオチド配列は、ｔｅｔオペレーター配列に対して反対方向に転写される（すなわち、この配列は、本発明の転写活性化因子融合タンパク質による活性化の際に多様な方式で転写される）。「ｔｅｔオペレーター配列に対して反対方向で転写される（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｉｎｏｐｐｏｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓｒｅｌａｔｉｖｅｔｏｔｈｅｔｅｔｏｐｅｒａｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｓ））」とは、第一のヌクレオチド配列が、ＤＮＡの１つの鎖（例えば、ボトム鎖）から５’から３’に転写され、そして第二のヌクレオチド配列が、ＤＮＡのもう１方の鎖（例えば、トップ鎖）から５’から３’に転写され、ｔｅｔオペレーター配列と離れた双方向性転写を生じるということを意味する。

従って、本発明の方法は、協調的に調節された、２つのヌクレオチド配列の双方向性の転写のための組み換えベクターを特徴とし得る。このベクターは、ホスホジエステル結合によって結合されるヌクレオチド配列を含んでもよく、この配列は、５’から３’方向に以下を含む。すなわち、転写されるべき第二のヌクレオチド配列に対して作動可能に連結された、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された、転写されるべき第一のヌクレオチド配列であって、ここでは、この第一および第二のヌクレオチド配列の転写が、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列から反対方向に進行する（すなわち、この第一および第二のヌクレオチド配列は、多様な方式で転写される）ヌクレオチド配列。

このベクターはまた、転写されるべき第一および第二のヌクレオチド配列を含まなくてもよいが、代わりに、目的のヌクレオチド配列のベクター中への導入を可能にするクローニング部位を含み得る。従って、このベクターは、５’から３’方向に以下を含むヌクレオチド配列を含んでもよい。すなわち、転写されるべき第二のヌクレオチド配列の導入のための第二のクローニング部位に対して作動可能に連結された、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された、転写されるべき第一のヌクレオチド配列の導入のための第一のクローニング部位であって、ここで、このベクターに導入された第一および第二のヌクレオチド配列の転写は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列から反対方向に進行するクローニング部位。このタイプの「クローニングベクター」は、最小プロモーター配列をやはり含む形態であってもよく、その結果、この第一のクローニング部位に導入された第一のヌクレオチド配列は、第一の最小プロモーターに対して作動可能に連結され、そしてこの第二のクローニング部位に導入された第二のヌクレオチド配列は、第二の最小プロモーターに対して作動可能に連結されることが当業者には理解されるであろう。あるいは、この「クローニングベクター」は、最小プロモーター配列を含まない形態であってもよく、その代わり、連結された最小プロモーター配列を含むヌクレオチド配列は、そのベクターのクローニング部位に導入される。

「クローニング部位（ｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）」という用語は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を包含する。代表的には、複数の異なる制限エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ポリリンカー）が核酸内に含まれる。

２つのヌクレオチド配列の協調的、双方向性の転写のためのベクターはまた、検出可能マーカー（例えば、ルシフェラーゼまたはβガラクトシダーゼ）をコードするヌクレオチドのような、転写されるべき第一のヌクレオチド、および目的の第二のヌクレオチド配列の導入のためのクローニング部位を含んでもよい。

転写されるべき２つのヌクレオチド配列の協調的調節のためのベクターにおける使用のための双方向性のプロモーター領域の適切な例は、米国特許第５，７８９，１５６号に記載される。

（Ｂ．複数のヌクレオチド配列の発現の独立した調節）
本発明の方法によってさらに、転写されるべき２つ以上のヌクレオチド配列の独立したかつ反対の調節が可能になる。従って、２つ以上の遺伝子の独立した調節のためのｔｅｔ−調節性転写単位が用いられ得る。転写されるべき２つのヌクレオチド配列の発現を独立して調節するために、１つのヌクレオチド配列を１つのクラスタイプのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結したままで、他のヌクレオチド配列を、他のクラスタイプのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結してもよい。

従って、２つのヌクレオチド配列の転写の独立した調節のためのベクターを用いてもよい。このようなベクターは以下を含み得る。すなわち、第一のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された転写されるべき第一のヌクレオチド配列、および第二のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された転写されるべき第二のヌクレオチド配列である。この２つの、独立して調節される転写単位は、単一のベクターに含まれてもよく、あるいは、２つの別のベクターに含まれてもよい。転写されるべきヌクレオチド配列を含む組み換えベクターは、前に記載のとおり宿主細胞または動物に導入され得る。

このベクターはまた、転写されるべき第一および第二のヌクレオチド配列を含まなくてもよいが、代わりに、目的のヌクレオチド配列のベクター中への導入を可能にするクローニング部位を含み得る。従って、このベクターは、以下を含み得る。

−第一のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された転写されるべき第一のヌクレオチド配列の導入のための第一のクローニング部位、および
−第二のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された転写されるべき第二のヌクレオチド配列の導入のための第二のクローニング部位。

このクローニングベクターは、それぞれ第一および第二のクローニング部位に対して作動可能に連結された第一および第二の最小プロモーターを既に含む形態であってもよい。あるいは、作動可能に連結された最小プロモーターを含む転写されるべきヌクレオチド配列が、クローニングベクターに導入されてもよい。

２つのヌクレオチド配列の独立した調節のためのベクターはまた、第一のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された、検出可能なマーカーまたは自殺遺伝子をコードするヌクレオチドのような、転写されるべき第一のヌクレオチド、および第二のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結されるような、目的の第二のヌクレオチドの導入のためのクローニング部位を含んでもよい。

ｔｅｔオペレーター配列のクラスの多様な組み合わせが、２つのヌクレオチド配列の独立した調節のために用いられ得ることが当業者には理解されるであろう。例えば、第一のｔｅｔオペレーター配列がクラスＡ型の配列であって、第二は、クラスＢ型の配列であってもよく、または第一のｔｅｔオペレーター配列がクラスＢ型の配列で、第二がクラスＣ型の配列であってもよい、などである。好ましくは、用いられる２つのｔｅｔオペレーターに対する１つは、クラスＢ型のオペレーターである。

第一および第二のヌクレオチド配列の独立した転写は、異なるクラスタイプのｔｅｔオペレーター配列に対して独立して結合する２つの異なる転写調節因子融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を宿主細胞中にさらに導入することによって、宿主細胞中で調節される。この第一の融合タンパク質は、真核生物細胞中で転写を活性化するポリペプチドに作動可能に連結された、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログの存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合するポリペプチドを含む（例えば、ＶＰ１６活性化領域に連結された変異されたＴｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサーのような、本発明のトランス活性化因子融合タンパク質）。この第二の融合タンパク質は、真核生物細胞中で転写を活性化するポリペプチドに作動可能に連結された、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログの非存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合するポリペプチドを含む（例えば、ＶＰ１６活性化領域に連結された野性型Ｔｎ１０由来Ｔｅｔリプレッサー、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８：５５４７〜５５５１に記載されるｔＴＡ）。この第一の融合タンパク質は、転写単位で用いられる第一のクラスタイプのｔｅｔオペレーター配列に結合し得、そしてこの第二の融合タンパク質は、この転写単位において用いられる第二のクラスタイプのｔｅｔオペレーター配列に結合し得る。あるいは、別の実施形態では、この第一の融合タンパク質は、第二のクラスタイプのｔｅｔオペレーターに結合し、そしてこの第二の融合タンパク質は、第一のクラスタイプのｔｅｔオペレーターに結合する。

例えば、転写されるべき第一のヌクレオチド配列は、クラスＡのｔｅｔオペレーターに連結され得、そして第一の融合タンパク質は、クラスＡのオペレーターに結合し得るが、転写されるべき第二のヌクレオチド配列は、クラスＢのｔｅｔオペレーターに連結され得、そして第二の融合タンパク質は、クラスＢのオペレーターに結合し得る。従って、この実施形態では、この第一のヌクレオチド配列の転写は、テトラサイクリン（またはそのアナログ）の存在下で活性化されるが、第二のヌクレオチド配列の転写は、テトラサイクリン（またはそのアナログ）の非存在下で活性化される。あるいは、別の実施形態では、この第一の融合タンパク質は、クラスＢのオペレーターに結合し、そして第二の融合タンパク質が、クラスＡのオペレーターに結合する。この場合、この第二のヌクレオチド配列の転写は、テトラサイクリン（またはそのアナログ）の存在下で活性化されるが、第一のヌクレオチド配列の転写は、テトラサイクリン（またはそのアナログ）の非存在下で活性化される。この系での使用に適切なトランス活性化タンパク質は、当該分野で公知であるとおり、例えば、本明細書に引用されるＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９２）にあるように設計され得る。同じ細胞に存在する２つの異なるタイプのＴｅｔリプレッサー融合タンパク質の間のヘテロ二量体化を阻害するために、転写調節性融合タンパク質の一方または両方の二量体化領域を変異させることが必要となり得る。変異は、二量体化に関与することが公知であるＴｅｔＲのＣ末端領域に標的化され得る。この二量体化領域は、ＴｅｔＲの結晶構造に基づいて詳細に記載されている（Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｗ．ら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：４１８〜４２０を参照のこと）。

この系は、置換されたテトラサイクリン化合物により２つの遺伝子の発現の独立したかつ反対の調節を可能にする。誘導剤としての種々の置換されたテトラサイクリン化合物の使用によって、種々の配列の高レベル、低レベルまたは中間的なレベルの発現がさらに可能になり得る。２つの遺伝子の発現を独立して調節するための本発明の方法の転写単位は、上述のように２つの遺伝子産物が同じ細胞で発現されるべきであるが、１つの遺伝子産物を発現する一方で他の遺伝子産物の発現は「オフ（ｏｆｆ）」にすること（逆もまた同様）が、所望される状況で用いられ得る。例えば、この系は同じ宿主細胞において、治療遺伝子または自殺遺伝子のいずれかを発現するために特に有用である（すなわち、細胞を破壊するために用いられ得る産物、例えば、リシンまたは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子）。多くの遺伝子治療状況では、宿主細胞で治療目的のための遺伝子を発現できるが、また一旦その治療が終了すれば宿主細胞を破壊する能力を有することが所望される。これは、１クラスのｔｅｔオペレーターに対して治療遺伝子を、そして自殺遺伝子を別のクラスのｔｅｔオペレーターに対して結合することによって、上記の系を用いて達成され得る。従って、宿主細胞における治療遺伝子の発現は、置換されたテトラサイクリン化合物によって刺激され得る（自殺遺伝子の発現が存在しない場合）。次いで、治療が終了すれば、この置換されたテトラサイクリン化合物は除去され、これが細胞において治療遺伝子の発現をオフにして自殺遺伝子の発現をオンにする。

（Ｃ．複数のヌクレオチド配列の複合的な協調および独立した調節）
２対の配列が協調的に調節されるが、１対は他の対から独立して調節されるように上記の２つの系に記載された系を組み合わせることによって、４つのヌクレオチド配列の発現を調節することがさらに可能である。従って、以下を含む２つの標的転写単位を設計してもよい。

−第一の核酸であって、５’〜３’方向に転写されるべき第一のヌクレオチド配列、第一のクラスタイプのｔｅｔオペレーター配列、および転写されるべき第二のヌクレオチド配列、を含む第一の核酸、および
−第二の核酸配列であって、５’〜３’方向に転写されるべき第三のヌクレオチド配列、第二のクラスタイプのｔｅｔオペレーター配列、および転写されるべき第四のヌクレオチド配列を含む第二の核酸。

第一の核酸における第一および第二のヌクレオチド配列の転写は、第一のクラスのｔｅｔオペレーター配列から多様な方式で進行する。同様に、第二の核酸における第三および第四のヌクレオチド配列の転写は、第二のクラスのｔｅｔオペレーター配列から多様な方式で進行する。従って、第一および第二のヌクレオチド配列の発現が協調的に調節され、そして第三および第四のヌクレオチド配列の発現が協調的に調節される。しかし、第一および第二の配列の発現は、上述のように、２つの異なるトランス活性化融合タンパク質の使用を通じて、第三および第四の配列に比較して独立して（かつ反対に）調節され、一方は、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で転写を活性化し、もう一方は、置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で転写を活性化する。１つのトランス活性化因子は、第一のクラスタイプのｔｅｔオペレーターに結合するように設計され、そしてもう一方は、第二のクラスタイプのｔｅｔオペレーターに結合するように設計される。他の実施形態では、転写されるべき第一、第二、第三および／または第四のヌクレオチド配列を既に含むのではなく、これらの転写単位は、転写されるべき第一、第二、第三および／または第四のヌクレオチド配列の導入を可能にするクローニング部位を含み得る。

（ＶＩＩ．本発明のキット）
本発明の別の態様は、本発明の誘導性の調節系の構成要素を備えるキットに関連する。このようなキットは、標的転写単位にクローニングされ得る目的の遺伝子（すなわち、転写されるべき目的のヌクレオチド配列）の発現を調節するために用いられ得る。このキットは、転写活性化因子融合タンパク質または転写サイレンサー融合タンパク質または両方をコードする核酸を備えてもよい。あるいは、真核生物細胞中でトランス活性化因子および／またはインヒビター融合タンパク質が発現されるように、そこに安定に組み込まれたトランス活性化因子および／またはインヒビター融合タンパク質をコードする核酸を有する真核生物細胞が、このキットで提供され得る。

一実施形態では、このキットは、その中に少なくとも２つの容器を閉じた拘束状態で有する担持方法を備える。すなわち、第一の容器であって、本発明の転写調節因子融合タンパク質をコードする第一の核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、真核生物細胞における転写を活性化する第二のポリペプチドに作動可能に連結されたテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合する第一のポリペプチドをコードする組み換え発現ベクター）を含む第一の容器と、第二の容器であって、目的のヌクレオチド配列がクローニングされ得る転写調節因子についての第二の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む第二の容器とである。この第二の核酸は代表的には、転写されるべきヌクレオチド配列の導入のためのクローニング部位（必要に応じて、作動可能に連結された最小プロモーター配列を含む）と、少なくとも１つの作動可能に連結されたｔｅｔオペレーター配列とを含む。「クローニング部位（ｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）」という用語は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を包含するものとする。代表的には、複数の異なる制限エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ポリリンカー）が、この核酸に含まれる。

このキットの成分を用いて目的のヌクレオチド配列の発現を調節するために、従来の組み換えＤＮＡ技術によってこのキットの標的ベクターのクローニング部位にヌクレオチド配列をクローニングし、次いで第一および第二の核酸を宿主細胞または動物中に導入する。次いで、この宿主細胞または動物中で発現された転写調節因子融合タンパク質は、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で目的のヌクレオチド配列の転写を調節する。

あるいは、別の実施形態では、このキットは、本発明の転写調節因子融合タンパク質をコードする核酸で安定にトランスフェクトされており、その結果この転写調節因子がこの細胞中で発現される真核生物細胞を備える。従って、核酸を単独で含むのではなく、上記の第一の容器は、転写調節因子をコードする第一の核酸が安定に導入されている（例えば、リン酸カルシウム沈殿またはエレクトロポレーションなどのような従来の方法を用いた安定なトランスフェクションによる）真核生物細胞株を含み得る。この実施形態では、目的のヌクレオチド配列が、このキットの標的ベクターのクローニング部位にクローニングされ、次いでこの標的ベクターが、転写調節因子融合タンパク質を発現する真核生物細胞中に導入される。

あるいは、またはさらに、２つのヌクレオチド配列の発現の協調的調節のための本発明の組み換えベクターも、本発明のキット中に組み込まれてもよい。このベクターは、目的の２つのヌクレオチド配列のベクター中への導入を可能にする形態でキット中に含まれてもよい。従って、別の実施形態では、本発明のキットは、１）本発明の転写調節因子融合タンパク質をコードする第一の核酸（または核酸が安定に導入されている真核生物細胞）と、２）５’から３’方向に以下のヌクレオチド配列、すなわち目的の第二のヌクレオチド配列の導入のための第二のクローニング部位に作動可能に連結された少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された目的の第一のヌクレオチド配列の導入のための第一のクローニング部位を含む第二の核酸とを含み、この第一および第二のヌクレオチド配列の転写は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列から反対方向に進行する。必要に応じて、このベクターは、作動可能に連結された最小プロモーター配列を含んでもよい。別の実施形態では、このベクターは、転写されるべき１つのヌクレオチド配列（例えば、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼまたはＣＡＴのような検出可能マーカーをコードする）、および転写されるべき目的の第二のヌクレオチド配列の導入のためのクローニング部位を既に含む形態であってもよい。

転写されるべき２つのヌクレオチド配列の発現の独立した調節のための本発明の転写単位および転写調節因子も、本発明のキット中に組み込まれてもよい。標的転写単位は、転写されるべき目的のヌクレオチド配列の転写単位への導入を可能にする形態であってもよい。従って、別の実施形態では、本発明のキットは、１）置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で、第一のクラスタイプのｔｅｔオペレーターに結合する転写調節因子をコードする第一の核酸と、２）第一のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーターに対して作動可能に連結された転写されるべき第一のヌクレオチド配列の導入のための第一のクローニング部位を含む第二の核酸と、３）置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で第二のクラスタイプのｔｅｔオペレーターに結合する転写調節因子をコードする第三の核酸と、４）第二のクラスタイプの少なくとも１つのｔｅｔオペレーターに対して作動可能に連結された転写されるべき第二のヌクレオチド配列の導入のための第二のクローニング部位を含む第四の核酸と、を備える。（必要に応じて、最小プロモーター配列が、この第二および第四の核酸に含まれる）。別の実施形態では、転写されるべき１ヌクレオチド配列（例えば、自殺遺伝子をコードする）は既に、この第二または第四の核酸のいずれかに含まれる。さらに別の実施形態では、この転写調節因子をコードする核酸（例えば、上記の第一および第三の核酸）は、キットに提供される真核生物細胞株に安定に導入され得る。

なお別の実施形態では、本発明のキットは、本発明の転写サイレンサー融合タンパク質（例えば、この融合タンパク質は、テトラサイクリンの存在下でのみ、またはテトラサイクリンの非存在下でのみ真核生物細胞における転写を阻害する）をコードする第一の核酸を含む第一の容器と、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された転写されるべきヌクレオチド配列の導入のためのクローニング部位を含む第二の核酸を含む第二の容器とを備える。このキットはさらに、テトラサイクリンの存在下でのみ、またはテトラサイクリンの非存在下でのみｔｅｔＯ配列に結合するトランス活性化融合タンパク質をコードする第三の核酸を備えてもよい。あるいは、この第一および／または第三の核酸（すなわち、インヒビターまたはトランス活性化融合タンパク質をコードする）は、このキットに提供される真核生物宿主細胞中に安定に組み込まれ得る。

さらに別の実施形態では、本発明のキットは、少なくとも１つの置換されたテトラサイクリン化合物を備えてもよい。例えば、このキットは、本明細書に記載される置換されたテトラサイクリン化合物を含む容器を備えてもよい。

（ＶＩＩＩ．置換されたテトラサイクリン化合物による遺伝子発現の調節）
（Ａ．トランス活性化因子融合タンパク質による遺伝子発現の刺激）
本発明のトランス活性化因子融合タンパク質をコードする核酸およびｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結されたヌクレオチド配列（すなわち、転写されるべき目的の遺伝子）を担持する宿主細胞では、ｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結されたヌクレオチド配列の高レベルの転写は、本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下では生じない。ヌクレオチド配列の基礎的転写のレベルは、宿主細胞および配列の組み込み部位に依存して変化し得るが、一般に本発明の置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下ではかなり低いか、検出可能でさえない。宿主細胞での転写を誘導するには、宿主細胞を、本発明の置換されたテトラサイクリン化合物と接触させる。この置換されたテトラサイクリン化合物を、細胞を含む被験体に投与してもよい。

インビトロにおいて細胞中で遺伝子発現を誘導するために、置換されたテトラサイクリン化合物を含有する培地中でこの細胞を培養することによって、この細胞を置換されたテトラサイクリン化合物と接触させる。置換されたテトラサイクリン化合物の存在下においてインビトロで細胞を培養する場合、誘導剤のために好ましい濃度範囲は、約１０〜約１０００ｎｇ／ｍｌである。この置換されたテトラサイクリン化合物は、細胞が既に培養されている培地中に直接添加されてもよいし、またはより好ましくは、高レベルの遺伝子誘導のためには、細胞を、置換されたテトラサイクリン化合物を含まない培地から回収して、所望の置換されたテトラサイクリン化合物を含む新鮮な培地中で培養する。

インビボで遺伝子発現を誘導するために、被験体内の細胞と、本発明の置換されたテトラサイクリン化合物とを、被験体に対してこの化合物を投与することによって接触させる。例示的な実施形態では、誘導剤をヒトまたは動物被験体に投与する場合、この投薬量は、好ましくは、約０．０００５〜１．０μｇ／ｍｌの血清濃度を得るように調整する。この置換されたテトラサイクリン化合物は、遺伝子導入に十分なインビボ濃度を達成するために有効な任意の方法で被験体に投与され得る。適切な投与方式の例としては、経口投与（例えば、飲料水に誘導剤を溶解する）、徐放性ペレットおよび拡散ポンプの移植が挙げられる。トランスジェニック植物に対して本発明の置換されたテトラサイクリン化合物を投与するには、誘導剤を植物に投与される水に溶解してもよい。

本発明の方法で特徴付けられるのは、このような発現系が実現され得る正確性をさらに増強する置換されたテトラサイクリン化合物である。この系での誘導剤として種々のテトラサイクリンアナログを用いる能力によって、ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現のレベルの調節が可能になる。米国特許第５，７８９，１５６号に実証されるとおり、無水テトラサイクリンおよびドキシサイクリンは、強力な誘導剤であることが見出されている。標的配列の転写における増大は代表的には、１０００〜２０００倍程度高く、そして２０，０００倍程度の高さのインダクション係数が達成され得る。テトラサイクリン、クロロテトラサイクリンおよびオキシテトラサイクリンは、より弱い誘導剤であることが見出されており、すなわちこの場合、標的配列の転写における増大は、約１０倍の範囲である。従って、適切な置換されたテトラサイクリン化合物は、遺伝子発現の誘導の所望のレベルに基づいて誘導剤として選択される。誘導剤として用いられる置換されたテトラサイクリン化合物を変化させることによって経時的に宿主細胞または動物における遺伝子発現のレベルを変化させることも可能である。例えば、最初に遺伝子発現の強力なバーストを有し、次いでより低いレベルの遺伝子発現を維持することが所望される状況があり得る。その状況に応じて、高レベルの転写を刺激する置換されたテトラサイクリン化合物が、誘導剤として最初に用いられ、次いで誘導剤が、より低いレベルの転写を刺激するアナログに切り替えられてもよい。さらに、複数のヌクレオチド配列の発現を調節する場合（例えば、１つの配列が１クラスのｔｅｔオペレーター配列によって調節され、そして他方が別のクラスのｔｅｔオペレーター配列によって調節される場合）、本明細書に記載されるように、転写を調節するためにどのトランス活性化融合タンパク質が用いられるか、そして誘導剤としてどの置換されたテトラサイクリン化合物が用いられるか次第で、各々の配列の発現のレベルを独立して変化させることが可能であり得る。種々のトランス活性化融合タンパク質は、置換されたテトラサイクリン化合物に対して種々のレベルの応答性示す可能性が高い。トランス活性化因子融合タンパク質および誘導剤（テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログ）の特定の組み合わせによる遺伝子発現の誘導のレベルは、本明細書に記載される技術によって決定され得る（例えば、実施例２を参照のこと）。さらに、遺伝子発現のレベルは、誘導剤の濃度を変化させることによって調節され得る。従って、本発明の方法の発現系で、用いられる置換されたテトラサイクリン化合物のタイプおよび濃度に依存して、遺伝子発現のオンまたはオフの切り替えのみならず、中間レベルで遺伝子発現のレベルを「微調整（ｆｉｎｅｔｕｎｉｎｇ）」する機構も得られる。

（Ｂ．転写サイレンサー融合タンパク質による遺伝子発現の阻害）
本発明の方法はまた、転写サイレンサー融合タンパク質を用いる遺伝子発現の阻害を特徴とする。これらの方法は、目的のｔｅｔＯ連結遺伝子の基礎的、構成的または組織特異的な転写を下方制御するために用いられ得る。例えば、ｔｅｔＯ配列およびさらなる正の調節性エレメント（例えば、構成的または組織特異的なエンハンサー配列）に作動可能に連結される目的の遺伝子は、主に宿主細胞における正の調節性エレメントの強度によって決定されるレベルで、宿主細胞中で転写される。さらに、ｔｅｔＯ配列に対して作動可能に連結される目的の遺伝子および唯一最小プロモーター配列が、宿主細胞もしくは組織、および／または配列の組み込みの部位に依存して基礎的なレベルの転写の種々の程度を示し得る。このような標的配列を含み、かつ本発明のインヒビター融合タンパク質を発現する宿主細胞では、標的配列の転写は、宿主細胞と接触している置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を変更することによって制御される方式で下方制御され得る。例えば、インヒビター融合タンパク質が、置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下でｔｅｔＯに結合する場合、宿主細胞と接触している置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を、標的核酸配列の発現を阻害するために減少させる。好ましくは、宿主細胞は、標的核酸配列発現の抑制を維持したままにするために置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で培養される。同様に、置換されたテトラサイクリン化合物は、標的核酸配列発現の抑制を維持するために宿主生物体に投与されない。あるいは、インヒビター融合タンパク質が置換されたテトラサイクリン化合物の存在下でｔｅｔＯに結合する場合、この宿主細胞と接触している置換されたテトラサイクリン化合物の濃度を増大させて、標的核酸配列の発現を阻害させる。例えば、この置換されたテトラサイクリン化合物を宿主細胞の培養培地に添加するか、または置換されたテトラサイクリン化合物を、宿主生物体に投与して、標的核酸配列発現を抑制する。

インヒビター融合タンパク質は、ｔｅｔＯ配列が、最小プロモーター配列の５’に位置する目的のｔｅｔＯ連結遺伝子を阻害し得る（例えば、上記のような置換されたテトラサイクリン化合物調節性転写単位）。さらに、インヒビター融合タンパク質は、ｔｅｔ−Ｏ結合配列が、プロモーター配列の５’ではなく転写開始部位の３’に位置する目的の遺伝子の発現を阻害するために用いられ得る。なおさらに、このインヒビター融合タンパク質は、ｔｅｔＯ結合配列が転写開始部位の３’に位置する目的の遺伝子の発現を阻害するために用いられ得る。

（Ｃ．遺伝子発現の正および負の複合調節）
転写活性化因子またはインヒビター融合タンパク質のいずれかを単独で用いる遺伝子発現の調節に加えて、宿主細胞における１つ以上の標的核酸配列の発現の正および負の調節の両方を可能にするために２タイプの融合タンパク質を組み合わせて用いてもよい。従って、ｔｅｔＯに対して、（ｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下では結合するが存在下では結合しない、または（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の存在下では結合するが、非存在下では結合しない、いずれかの転写サイレンサータンパク質を、ｔｅｔＯに対して、（ｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下では結合するが存在下では結合しない、または（ｉｉ）置換されたテトラサイクリン化合物の存在下では結合するが、非存在下では結合しない、いずれかのトランス活性化タンパク質と組み合わせて用いてもよい。ｔｅｔＯに対して、置換されていないテトラサイクリン化合物の非存在下では結合するが存在下では結合しないトランス活性化タンパク質（例えば、野性型ＴｅｔＲ活性化因子融合タンパク質）は、米国特許出願第０８／０７６，７２６号、米国特許出願第０８／０７６，３２７号および米国特許出願第０８／２６０，４５２号にさらに詳細に記載される。ｔｅｔＯに対して、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下では結合するが非存在下では結合しないトランス活性化融合タンパク質（例えば、変異されたＴｅｔＲ活性化因子融合タンパク質）は、当該分野で公知である。

本明細書に記載されるとおり、２つ以上のＴｅｔＲ融合タンパク質が宿主細胞または生物体で発現される場合、異なるＴｅｔＲ融合タンパク質の間でのヘテロ二量体化を阻害するためにはさらなる工程がとられるかもしれない。例えば、１クラスのＴｅｔＲからなるトランス活性化因子を、第一のクラスのＴｅｔＲとヘテロ二量体化しない第二の異なるクラスのＴｅｔＲからなる転写サイレンサーと組み合わせて用いてもよい。あるいは、二量体化に関与するＴｅｔＲのアミノ酸残基を変異させて、ヘテロ二量体化を阻害してもよい。しかし、トランス活性化因子とインヒビター融合タンパク質との間のある程度のヘテロ二量体化が宿主細胞で生じる場合でさえ、本明細書に記載されるように効率的な正および負の調節を可能にするために十分な量のホモ二量体を生成しなければならない。

本明細書に記載の技術を用いて、正および負の両方の方式で目的の単一のｔｅｔＯ結合遺伝子を調節するか、または協調方式もしくは独立した方式で目的の複数のｔｅｔＯ連結遺伝子を調節するために、種々の組み合わせの活性化因子およびインヒビタータンパク質を用い得ることが当業者には理解されるであろう。利用される正確な調節性成分は、調節されるべき遺伝子および所望の調節のタイプに依存する。トランス活性化因子およびインヒビター融合タンパク質を組み合わせてどのように用い得るかといういくつかの非限定的な例は、下にさらに記載される。しかし、多くの他の可能な組み合わせが、本明細書の教示を参照することにより当業者には明らかであり、そして本発明によって包含されるものとする。

（ＩＸ．本発明の例示的な適用）
本発明は、遺伝子発現をオンおよびオフにできること、または遺伝子発現のレベルを急速、効率的かつ制御された方式で、多面発現効果（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃｅｆｆｅｃｔ）も細胞毒性も生じることなく調節することが所望される種々の当該分野で認識される状況に対して広範に適用可能である。従って、本発明の方法の系は、真核生物細胞、植物および動物における細胞の発達および分化の研究のために、広範な適用性を有する。例えば、癌遺伝子の発現は、その機能を研究するために細胞中で制御された方式で調節され得る。さらに、この系は、ＣＲＥまたはＦＬＰのような部位特異的なリコンビナーゼの発現を調節するために、それによって、発生の特定の段階で制御された条件でトランスジェニック生物体の遺伝子型の不可逆的な改変を可能にするために用いられ得る。例えば、特定のトランスジェニック植物の選択を可能にするトランスジェニック植物のゲノムに挿入された薬物耐性マーカーは、置換されたテトラサイクリン化合物調節性の部位特異的リコンビナーゼを介して不可逆的に除去され得る。本発明の方法の調節系の他の適用としては以下が挙げられる。

（Ａ．遺伝子治療）
本発明の方法は、遺伝疾患または後天的疾患のいずれかについての処置における、遺伝子治療アプローチで用いられ得る。遺伝子治療の一般的アプローチは、機能的な活性を修復または増強するために、導入された遺伝物質によってコードされる１つ以上の遺伝子産物が細胞中で生成されるような、細胞への核酸の導入を包含する。遺伝子治療アプローチに対する概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８〜８１３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５〜４６０；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２７５〜１２８１；およびＣｏｕｒｎｏｙｅｒ，Ｄ．，ら、（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：１９６〜２０８を参照のこと。しかし、現在の遺伝子治療ベクターは代表的には、内因性の転写因子に応答性である構成的な調節性エレメントを利用する。これらのベクター系では、被験体における遺伝子発現のレベルを調整する能力は可能にならない。対照的に、本発明の方法の誘導性の調節系では、この能力が得られる。

本発明の置換されたテトラサイクリン化合物制御の調節系は、遺伝子治療に適用するのに特に適するようにする多数の有利な特性を有する。例えば、この系では、被験体における遺伝子産物の調節された投薬を可能にする遺伝子発現のための「オン」／「オフ」スイッチが得られる。単に設定されたレベルで遺伝子産物を構成的に発現するのではなく、特定のレベルおよび／または時間で、調節された方式で、遺伝子産物を得ることができることが所望されるいくつかの状況がある。例えば、目的の遺伝子は、有効時間の大部分で目的の遺伝子産物の最も有効なレベルを提供するように、固定間隔（例えば、毎日、隔日、毎週など）で「オン」に切り替えられ得る。被験体中で生成される遺伝子産物のレベルは、標準的な方法によってモニターされ得る（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのような免疫学的アッセイを用いる直接モニタリング、または目的の遺伝子産物の機能に依存する臨床検査値、例えば、血糖値などのモニタリングによって間接的に）。被験体中において離れた時間間隔で遺伝子の発現を「オン」にするが、また他の時間では遺伝子を「オフ」に維持できるこの能力によって、間欠的な間隔での目的の遺伝子産物の連続投与の必要性が回避される。このアプローチで、疼痛があり得るか、および／または副作用を生じ得、そして連続的に医師の診察を受ける必要が生じる可能性が高い、遺伝子産物の反復注射の必要性が回避される。対照的に、本発明のシステムによって、これらの欠点は回避される。さらに、被験体で離れた時間間隔で遺伝子の発現を「オン」にする能力によって、疼痛および症状が明らかな急性期の間に処置が必要な時だけ活性の「激発（フレア・アップ）（ｆｌａｒｅｕｐ）」を伴う疾患（例えば、多くの自己免疫疾患）の集中的な処置が可能になる。このような疾患が寛解される時点で、発現系は、「オフ」状態に保持され得る。

離れた時間間隔の間に遺伝子発現を調節するこの能力から特に恩恵を受ける可能性がある遺伝子治療の適用としては、以下の非限定的な例が挙げられる。

関節リウマチ−炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−１２）の産生を阻害する遺伝子産物をコードする遺伝子が、被験体で発現され得る。このようなインヒビターの例としては、サイトカインの可溶型のレセプターが挙げられる。さらに、あるいは、サイトカインＩＬ−１０および／またはＩＬ−４（防御的なＴｈ２型の応答を刺激する）が発現され得る。さらに、グルココルチコ模倣薬レセプター（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｍｉｍｅｔｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＧＣＭＲ）が発現され得る。

下垂体機能不全（ｈｙｐｏｐｉｔｕｉｔａｒｉｓｍ）−ヒト成長ホルモンの遺伝子は、このような被験体では小児期早期においてのみ発現され得、小児期早期においては、ある正常な身長が得られるまで、遺伝子発現が必須であり、その時点で遺伝子発現が下方制御され得る。

創傷治癒／組織再生−治癒過程に必須である因子（例えば、成長因子、血管新生因子など）は、必要である場合のみ発現され、次いで下方制御され得る。

抗癌療法−抗癌療法に有用な遺伝子産物の発現は、腫瘍増殖の遅延が得られる（この時点で遺伝子産物の発現が下方制御され得る）まで治療期に限定され得る。可能な全身的な抗癌治療としては、免疫刺激分子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２など）、血管形成阻害薬（ＰＦ４、ＩＬ−１２など）、ヘレグリン（Ｈｅｒｒｅｇｕｌｉｎ）、ロイコレグリン（Ｌｅｕｋｏｒｅｇｕｌｉｎ）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８５／０４６６２）、および骨髄支持（補助）療法（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｕｐｐｏｒｔｔｈｅｒａｐｙ）の成長因子、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦを発現する腫瘍浸潤性リンパ球の使用が挙げられる。後者に関して、骨髄支持（補助）療法のための因子を発現するための本発明の調節系の使用によって、化学療法から骨髄支持療法への一定間隔の単純な治療的な切り替えが可能になる（同様に、このようなアプローチはまた、ＡＩＤＳ治療に適用されてもよい、例えば、抗ウイルス療法から骨髄支持療法への単純な切り替え）。さらに、抗癌治療の制御された局所標的化も可能である。例えば、本発明の調節因子による自殺遺伝子の発現であり、ここで調節因子自体は、例えば、腫瘍特異的プロモーターまたは放射線誘発性プロモーターによって制御される。

本発明の方法の調節系を用いて制御された方式で自殺遺伝子（例えば、アポトーシス遺伝子、ＴＫ遺伝子など）を発現する能力によって、この系の一般的な安全性および有用性が加えられる。例えば、所望の治療の終わりに、自殺遺伝子の発現を誘発して、遺伝子治療ベクターを担持する細胞、例えば、生体で不活性なインプラントにおける細胞、意図されるもとの位置を超えて広められている細胞などを排除してもよい。さらに、移植片が腫瘍になるか、または副作用を有する場合、この細胞は、自殺遺伝子の誘導によって急速に排除され得る。２つ以上の置換されたテトラサイクリン化合物（１つの細胞における制御された「オン」／「オフ」切り替え）の使用によって、治療目的の遺伝子の調節に比較して自殺遺伝子の完全に独立した調節が可能になる（本明細書に詳細に記載されるとおり）。

（Ｂ．インビトロにおけるタンパク質の産生）
目的のタンパク質の大規模産生は、以下を含むように改変されている培養細胞をインビトロで用いて達成され得る。すなわち、１）細胞における転写調節因子の発現に適切な形態で本発明の転写調節因子融合タンパク質をコードする核酸と、２）ｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結された目的のタンパク質をコードする遺伝子、である。例えば、哺乳動物、酵母または真菌細胞は、本明細書に記載されるようなこれらの核酸成分を含むように改変されてもよい。次いでこの改変された細胞を、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で標準的なファーメンテーション技術によって培養して、遺伝子の発現を誘導しかつ目的のタンパク質を生成してもよい。従って、本発明の方法は、目的のタンパク質を単離するための産生過程を操作するために用いられ得る。この過程では、本発明の方法の転写調節因子融合タンパク質をコードする核酸と、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸の両方が導入されている宿主細胞（例えば、酵母または真菌）を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列（すなわち、ｔｅｔオペレーター配列に対して作動可能に連結されたヌクレオチド配列）の転写を刺激するために、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下において培養培地中において生産規模で増殖させ、そして目的のタンパク質を、回収された宿主細胞から、または培養培地から単離する。標準的なタンパク質精製技術は、この培地から、または回収された細胞から目的のタンパク質を単離するために用いられ得る。

（Ｃ．インビボにおけるタンパク質の産生）
本発明の方法はまた、動物における、例えば、トランスジェニックの家畜における目的のタンパク質の大規模産生を増強し得る。トランスジェニック技術における利点によって、トランスジェニックの家畜、例えば、ウシ、ヤギ、ブタおよびヒツジを産生できるようになった（Ｗａｌｌ，Ｒ．Ｊ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３〜１２０；およびＣｌａｒｋ，Ａ．Ｊ．ら、（１９８７）ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２０〜２４に概説される）。従って、トランスジェニック家畜のゲノム中に本発明の方法の誘導性調節系の成分を担持するトランスジェニックの家畜であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子が少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に作動可能に連結されているトランスジェニック家畜が構築されてもよい。遺伝子発現は、従ってタンパク質産生は、トランスジェニック動物に対して置換されたテトラサイクリン化合物を投与することによって誘発される。タンパク質産生は、特定の細胞に対して転写調節因子の発現を制限する適切な組織特異的調節性エレメントに対して転写調節因子融合タンパク質をコードする核酸を連結することによって特定の組織に対して標的化され得る。例えば、乳腺特異的調節性エレメント、例えば、乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）を、転写調節因子導入遺伝子に連結し、乳房組織に対して転写調節因子の発現を限定し得る。従って、置換されたテトラサイクリン化合物の存在下では、目的のタンパク質は、トランスジェニック動物の哺乳動物組織で生成される。このタンパク質は、トランスジェニック動物の乳汁に分泌されるように設計されてもよく、そして所望の場合、次いで、このタンパク質は、乳汁から単離され得る。

（Ｄ．インビボにおける調節性遺伝子発現の画像化）
本発明の方法は、細胞、細胞株および／または生きている被験体における調節された遺伝子発現をモニターするために、侵襲性またはより好ましくは、非侵襲性の画像化技術と組み合わせて使用され得る。例えば、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＣＡＴなど）と目的のヌクレオチド配列の両方が、双方向性のｔｅｔオペレーター（例えば、Ｐ_{ｔｅｔｂｉ−}１）の制御下に置かれてもよく、それによって、レポーター遺伝子および置換されたテトラサイクリン化合物制御のトランス活性化因子（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）に応答性の目的のヌクレオチド配列の発現が得られる。このような遺伝子構築物の使用を通じて、トランスジェニック動物および細胞株が誘導され得、その中でルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子の発現および／または活性が、ｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現の間接的な非侵襲性のマーカーとして働く。生きている被験体における非侵襲性の画像化の実現のためのこのような方法の使用は、Ｈａｓａｎ，ＭＴら、Ｇｅｎｅｓｉｓ２９（３）：１１６〜２２に記載される。

（Ｅ．ヒト疾患の動物モデル）
本発明の方法の転写活性化因子およびインヒビタータンパク質を単独でまたは組み合わせて用いて、動物における特定の遺伝子の発現を刺激または阻害して、ヒト疾患の病態生理学を模倣し、それによってヒト疾患の動物モデルを作成してもよい。例えば、宿主動物では、疾患に関与すると考えられる目的の遺伝子を、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列の転写制御下においてもよい（例えば、本明細書において記載されるような相同組み換えによる）。このような動物を、トランス活性化因子融合タンパク質および／またはインヒビター融合タンパク質の１つ以上の導入遺伝子を担持する第二の動物と交配させて、置換されたテトラサイクリン化合物調節性の融合タンパク質遺伝子と、ｔｅｔ調節性標的配列の両方を担持する子孫を作成してもよい。これらの子孫における目的の遺伝子の発現は、置換されたテトラサイクリン化合物を用いて調節され得る。例えば、目的の遺伝子の発現を、転写サイレンサー融合タンパク質を用いて下方調節して、遺伝子発現と疾患との間の関係を検査してもよい。このようなアプローチは、疾患の動物モデルを作成する上で相同組み換えによる遺伝子「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」を上回る利点を有し得る。なぜなら、本明細書に記載されるｔｅｔ調節性の系によって、目的の遺伝子の発現のレベルおよび遺伝子発現が下方制御または上方制御されるときのタイミングの両方に対する制御が可能になるからである。

（Ｆ．遺伝子クローニングおよび他の用途のための安定な細胞株の産生）
本発明の方法で用いられる転写サイレンサー系は、遺伝子発現を「オフ」（すなわち、発現される）に維持し得、これによって、そうでなければ生成できない安定な細胞株の生成を可能にする。例えば、細胞に対して細胞毒性である遺伝子を担持する安定な細胞株は、毒性遺伝子の発現における「漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）」に起因して、作成することが困難であるか、または不可能であり得る。本発明の転写サイレンサー融合タンパク質を用いてこのような毒性遺伝子の遺伝子発現を抑制することによって、毒性遺伝子を担持する安定な細胞株を作成してもよい。次いで、このような安定な細胞株を用いて、このような毒性遺伝子をクローニングし得る（例えば、置換されたテトラサイクリン化合物を用いて制御条件下で毒性遺伝子の発現を誘導する）。本発明の転写サイレンサー系が適用できる遺伝子の発現クローニングのための一般的な方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｐ．およびＡｒｕｆｆｏ，Ａ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５５８〜５６３）。さらに、転写サイレンサー系を適用して他の細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞における遺伝子の基礎的発現を阻害して、安定な細胞株を作成してもよい。ＥＳ幹に導入される特定の遺伝子の残留発現は、安定にトランスフェクトされたクローンを単離することを不可能にするかもしれない。本明細書に記載される転写サイレンサー系を用いるこのような遺伝子の転写の阻害は、この問題を克服するのに有用であり得る。

（Ｇ．脳における置換されたテトラサイクリン化合物調節性遺伝子の誘導）
本発明の方法の特定の置換されたテトラサイクリン化合物は、発明の方法において特徴付けられる誘導性の調節系を調節するために好ましい薬剤として例えば、ドキシサイクリンを使用する際に改善される。ドキシサイクリンが示す血液脳関門の浸透は限られており、これによって、脳の誘導性の調節系の調節を惹起するためには処置された被験体の末梢血でドキシサイクリンをかなり高レベルまで上昇させることが必要であることが記載されている（参照によって本明細書に援用される、ＭａｎｓｕｙおよびＢｕｊａｒｄＣｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：５９３〜９６を参照のこと）。本明細書に記載される特定の置換されたテトラサイクリン化合物を用いる本発明の方法の実行を通じて、特徴づけられた誘導性の調節系の機能の改善が、生きている被験体の脳および脊髄で達成され得る。

（Ｈ．阻害性ＲＮＡの発現）
別の実施形態では、本発明は、当該分野で公知の方法を用いて標的遺伝子の発現を妨げる、核酸分子、例えば二本鎖ＲＮＡ分子の誘導性発現および／または特異的な発現のための組み換えベクターに関する。特定の実施形態では、本発明は、組み込まれた遺伝子または内因性の遺伝子の特定の細胞における誘導性のノックダウンを指向するためのＴｅｔ（テトラサイクリン）応答性のＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーター（例えば、ＴｅｔＯＮまたはＴｅｔＯＦＦ）の使用に関する。本発明はまた、テトラサイクリン調節性の可逆性および／または組織特異的な核酸分子、例えば標的遺伝子の発現を妨げる二本鎖ＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生成するための方法に関する。

（Ｘ．利点）
本明細書に記載される方法によって、特徴づけられた誘導性の調節系の増強された使用が可能になる。本発明の方法の置換されたテトラサイクリン化合物によって、ドキシサイクリンで用いられた濃度よりも１０倍程度低い濃度での置換されたテトラサイクリン化合物誘発性の応答の誘導が可能になる。特定の実施形態では、本発明の方法はまた、ドキシサイクリンよりも１００倍低いエフェクター濃度で遺伝子のインビボ誘導を可能にし得る。

本発明の方法で特徴づけられる特定の化合物はまた、低濃度での化合物投与で被験体における誘導応答の実現を可能にする、血液脳関門を横切る分配の改善を示す。この利点は、経済的かつ治療的である。なぜなら、本発明の特徴づけられた化合物の循環濃度が低いほど、投与後に所望されない副作用が誘発される可能性が少ないからである。本発明の特定の特徴づけられた化合物はまた、例えば、ドキシサイクリンの抗生物質効果に比較して、実際には非抗生物質的であり、従って、ヒトにおける本発明の方法を実施する上でのさらなる利点を呈する。

本発明はさらに、以下の実施例によって例示されるが、この実施例は限定と解釈されるべきではない。本出願全体にわたって引用される全ての引用文献、特許および公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に援用される。

実施例１：置換されたテトラサイクリン化合物によるルシフェラーゼ活性の誘導
置換されたテトラサイクリン化合物がＨＲ５−Ｃ１１細胞においてルシフェラーゼ発現を誘導する能力を試験した。細胞株ＨＲ５−ＣＬ１１細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子およびｒｔＴＡ遺伝子を保有するが、ｔＴＡ遺伝子は保有しない。ＨＲ５−Ｃ１１細胞を約３×１０^４個の細胞／３５ｍｍディッシュという密度でプレートした（約８０％のコンフルエンシー）。細胞の完全な付着後、テトラサイクリン誘導体をこの細胞に対して０、３０〜３０００ｎｇ／ｍＬの濃度で投与した。このルシフェラーゼ活性を３日のインキュベーション後に測定した。

すべてのテトラサイクリン化合物がｌｕｃ（ルシフェラーゼ）活性を増大したことが見出された。９−ｔ−ブチルドキシサイクリンが、ｌｕｃ発現の最高の増大を生じ、その後にペンタサイクリン、９−１’メチルシクロペンチルドキシサイクリン、ドキシサイクリンの５−エステル、７，９−二置換ドキシサイクリンおよび９−アミノ置換ドキシサイクリンが続いたことが見出された。用量応答曲線を図１Ａ−１Ｈに示す（ドキシサイクリン（図１Ａ）；５−シクロブタノエートドキシサイクリン（図１Ｂ）；５−シクロヘキサノエートドキシサイクリン（図１Ｃ）；５−プロピオニル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン（図１Ｄ）；７−アセチルアミノドキシサイクリン（図１Ｅ）；９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン（図１Ｆ）；９−１’−メチルシクロブチルドキシサイクリン（図１Ｇ）；９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリン（図１Ｈ））。

実施例２：置換されたテトラサイクリン化合物を用いるｒｔＴＡ媒介性の遺伝子活性化
２つのルシフェラーゼ陽性細胞株３４ＲおよびＭＴ２は、それぞれ新規なトランス活性化因子ｒｔＴＡ２−３４ＲおよびｒｔＴＡ２−ＭＴ２を産生した。これらの変異体は、テトラサイクリン化合物の存在下における極めて低レベルの残留ＤＮＡ結合によって特徴づけられる。ｒｔＴＡ２−ＭＴ２系では、９−ｔ−ブチルドキシサイクリンは、ＲｔＴＡ−媒介性の遺伝子活性化を１００倍まで増大した。９−ｔ−ブチルドキシサイクリンは、３０〜１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でこの系を活性化した。９−ｔ−ブチルドキシサイクリンは、インビトロで全てのｒｔＴＡをドキシサイクリンよりも１０倍低い濃度で誘導したことが見出された。この系の完全な誘導は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の９−ｔ−ブチルドキシサイクリンで生じた。５−フェニルカルバメートドキシサイクリンもまた、ｒｔＴＡ２ｓ−Ｍ２のドキシサイクリンよりも２倍強い活性化因子であることも見出された。

図２Ａ〜２Ｄは、３４ＲおよびＭＴ２ｒｔＴＡ変異体におけるドキシサイクリンおよび９−ｔ−ブチルドキシサイクリンの比較を示す。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ３４ＲおよびＭＴ２変異体に対するドキシサイクリンの影響を示す。図２Ｃおよび図２Ｄは、それぞれ、３４ＲおよびＭＴ２変異体に対する９−ｔ−ブチルドキシサイクリンの影響を示す。ドキシサイクリンは、ＭＴ２でより大きい特異性およびルシフェラーゼ活性を示したが、９−ｔ−ブチルドキシサイクリンは、両方の系で１０倍以上活性であった。

（実施例３：Ｘ１／５細胞および置換されたテトラサイクリン化合物を用いる用量応答の研究）
ｔＴＡおよびｒｔＴＡに対する置換されたテトラサイクリン化合物の能力。Ｘ１／５細胞での用量応答分析を用いるトランス活性化を研究した。細胞株Ｘ１／５細胞は、テトラサイクリン誘導性のプロモーターによって制御される、染色体に組み込まれたコピーのｔＴＡ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を保有する。細胞の完全な接着後、テトラサイクリン誘導体を、この細胞に対して０、３０〜３０００ｎｇ／ｍＬの濃度で投与した。このルシフェラーゼ活性を３日のインキュベーション後に測定した。

ドキシサイクリンの濃度が増大するにつれて、ｌｕｃ遺伝子がオフに切り替わったことが見出された。全ての試験されたテトラサイクリン化合物がルシフェラーゼ活性を低下させた。９−ｔ−ブチルドキシサイクリンは、ｌｕｃ発現によって測定した場合、最低濃度で有効性を示し、その後にペンタサイクリン、９−１’メチルシクロペンチルドキシサイクリン、ドキシサイクリン、５−ブタノエートドキシサイクリン、５−シクロヘキサノエートドキシサイクリン、５，９−二置換ドキシサイクリン、７，９−二置換ドキシサイクリンおよび９−アミノ置換ドキシサイクリンが続いた。用量応答曲線を図３Ａ−３Ｉに示す（ドキシサイクリン（図３Ａ）；５−シクロブタノエートドキシサイクリン（図３Ｂ）；５−シクロヘキサノエートドキシサイクリン（図３Ｃ）；５−プロピオニル−７−シクロペンチルアセチルアミノドキシサイクリン（図３Ｄ）；７−アセチルアミノドキシサイクリン（図３Ｅ）；９−１’−メチルシクロペンチルドキシサイクリン（図３Ｆ）；９−１’−メチルシクロブチルドキシサイクリン（図３Ｇ）；９−ｔ−ブチル−７−メチルチオメトルドキシサイクリン（図３Ｈ））；および９−ｔ−ブチル−７−メチルドキシサイクリン（図３Ｉ））。

（実施例４：置換されたテトラサイクリン化合物によるインビボでのｒｔＴＡ２ｓ−Ｍ２遺伝子の活性化）
９−ｔ−ブチルドキシサイクリンを、ｒＴＡＭ２ＣａＭＫ−１／ＬＣ１を有するバイトランスジェニック（ｂｉｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）マウスで試験した。このマウスは、前脳特異的なα−ＣａｍＫＩＩプロモーターの制御下でｒｔＴＡ２ｓ−Ｍ２遺伝子を発現した。さらに、ＬＣ１マウスは、双方向性（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）プロモーターの制御下にルシフェラーゼおよびｃｒｅ遺伝子を有した。マウスには、５％スクロースまたは９−ｔ−ブチルドキシサイクリン（０．２および２ｍｇ／ｍＬ）を含む飲用水中で７日間にわたってドキシサイクリン（２ｍｇ／ｍＬ）を投与した。このマウスをアバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔して、ルシフェラーゼ（ＩＰ）を注射し、そして生物発光チャンバに入れて、５分後に測定した。この結果によって、９−ｔ−ブチルドキシサイクリンは、０．２ｍｇ／ｍＬで、ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍＬよりも優れた活性応答を有したことが示された。図４は、マウスでのルシフェラーゼ発現の画像を示す。

実施例５：ＪＥ３０５Ｋ＋ｐＴｅｔＬｕｘ１ｔｅｔ検出系でのテトラサイクリン化合物の用量応答分析
置換されたテトラサイクリン化合物は、ＪＥ３０５Ｋ＋ｐＴｅｔＬｕｘ１ｔｅｔ検出系を用いる用量応答分析で検査した。ＪＥ３０５Ｋは、破壊されたａｃｒＢおよびｗａａＰ遺伝子を有する株である。ｐＴｅｔＬｕｘ１は、ｔｅｔＲを有するプラスミドであり、ｔｅｔＡプロモーター／オペレーターの調節のもとにｌｕｘＣＤＡＢＥオペロン（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来）を有する。このプラスミドは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄから入手した。

９位置にフェニル、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を有する以下のミノサイクリン誘導体は、強力かつ非抗菌性であることが見出された。

１０位置でのアルキル、ベンジルまたは類似の置換基による置換は、活性化の増大および抗菌活性の喪失を生じた。

７−アルキニル、アルケニル、アルキルおよびフェニル置換されたサンサイクリン化合物は、このアッセイで活性であったことが見出された。これらの誘導体は、種々の程度の抗菌活性を保有する。活性な７−アルキニルサンサイクリン化合物の例を下に示す。

さらに、化合物Ａ〜Ｑは、すぐれた活性を示す（例えば、約１３μｇ／ｍＬの濃度で約７０を超えるＫｌｕｘ）：化合物Ｒ−ＢＷは、良好な活性を示し（例えば、約１３μｇ／ｍＬの濃度で約５１〜７０のＫｌｕｘ）、そして化合物ＢＸ−ＬＥは、小さい活性を示した（例えば、５１未満というＫｌｕｘ）
（等価物）
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、慣用的な実験用いるだけで実現もしくは確認できる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。

Claims

細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該置換されたテトラサイクリン化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）細胞中での転写を調節する第二のポリペプチドに作動可能に連結された該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下または非存在下で該ＴＲＥに結合する、第一のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含み、ここで該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：

（式中、
ｐは、単結合または二重結合であり、
Ｘは、ＣＨＣ（Ｒ^１３Ｙ’Ｙ）、ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｃ＝ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｓ、ＮＲ^６、またはＯであり、かつＲ^５’はｐが単結合であるとき水素であり、
ＸはＣＲ^６’’であり、かつＲ^５’はｐが二重結合であるとき存在せず、
Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’、およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ^６およびＲ^６’は各々独立して水素、メチレン、非存在、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ^７ａであり、
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり、
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり、
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ^１１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシルであり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅおよびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^１３は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
ＥはＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆ、またはＳであり、
ＷはＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆであり、
Ｙ’およびＹは各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、スルフヒドリル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルである）
の化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩、エステルまたはエナンチオマーであり、但し、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：

（式中、
ｐは単結合であり；
ＸはＣＲ ^６’ Ｒ ^６であり；
Ｒ ^５’ は水素であり；
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３、Ｒ ^５、Ｒ ^６、Ｒ ^６’ 、Ｒ ^８およびＲ ^１２は、各々水素であり；
Ｒ ^４’ およびＲ ^４” は、各々アルキルであり；
Ｒ ^４は、ＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ であり；
Ｒ ^７は、水素またはアミノであり；
Ｒ ^９は、非置換アルキルアミノメチル、非置換アルキル（アルコキシカルボニル）アミノメチル、ハロゲン置換アルキルアミノメチル、またはピペリジン置換メチルであり；そして
Ｒ ^１０およびＲ ^１１は、各々ヒドロキシルである）
の化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩、エステルまたはエナンチオマーではない、組成物。
前記標的ヌクレオチド配列がタンパク質をコードする、請求項１に記載の組成物。
前記ｔｅｔオペレーター連結核酸分子が、前記細胞中に導入されている外因性の核酸分子である、請求項１または２に記載の組成物。
前記細胞がさらに、第二の標的核酸分子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
前記テトラサイクリン化合物が、抗生物質活性を有さない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
ＸがＣＲ ^６Ｒ ^６’ であり；Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３、Ｒ ^５、Ｒ ^６、Ｒ ^６’ 、Ｒ ^８およびＲ ^１２が各々水素であり；Ｒ ^４がＮＲ ^４Ｒ ^４’ であり；Ｒ ^４およびＲ ^４’ が各々アルキルであり；Ｒ ^７がハロゲンであり；Ｒ ^９がアルキルであり；そしてＲ ^１０およびＲ ^１１が各々ヒドロキシルである、請求項１に記載の組成物。
ｐが単結合であり；ＸがＣＲ^６Ｒ^６’であり；Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３、Ｒ ^５、Ｒ ^６、Ｒ ^６’ 、Ｒ ^８およびＲ ^１２が各々水素であり；Ｒ ^４がＮＲ ^４Ｒ ^４’ であり；Ｒ ^４およびＲ ^４’ が各々アルキルであり；Ｒ ^７がアルキルであり；そしてＲ ^１０およびＲ ^１１が各々ヒドロキシルである、請求項１に記載の組成物。
ｐが二重結合であり；ＸがＣＲ ^６” であり；Ｒ ^６” が水素であり；Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３およびＲ ^１２が各々水素であり；Ｒ ^４がＮＲ ^４Ｒ ^４’ であり；Ｒ ^４およびＲ ^４’ が各々アルキルであり；そしてＲ ^１１がヒドロキシルである、請求項１に記載の組成物。
Ｒ ^８およびＲ ^９が水素であり、Ｒ ^１０がヒドロキシルである、請求項８に記載の組成物。
Ｒ ^７がハロゲンである、請求項９に記載の組成物。
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該置換されたテトラサイクリン化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）細胞中での転写を調節する第二のポリペプチドに作動可能に連結された該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下または非存在下において該ＴＲＥに結合する、第一のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含み、該置換されたテトラサイクリン化合物は：

からなる群から選択される化合物またはその薬学的に受容可能な塩である、組成物。
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該置換されたテトラサイクリン化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）細胞中での転写を調節する第二のポリペプチドに作動可能に連結された該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下または非存在下で該ＴＲＥに結合する、第一のポリペプチドを含む融合タンパク質とを含み、ここで該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（ＩＩ）：

（式中：
Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり；
Ｒ^３、Ｒ^１２およびＲ^１４は各々水素またはプロドラッグ部分であり；
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり；
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり；
Ｒ^６ａは水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり；
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ^７ａであり；
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり；
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり；
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり；
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅおよびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
ＷはＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
Ｅは、ＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆである）
の化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩、エステルまたはエナンチオマーである、組成物。
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該置換されたテトラサイクリン化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で該ＴＲＥに結合するが、非存在下では結合しない、変異されたＴｅｔリプレッサーとを含み、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、式（Ｉ）：

（式中、
ｐは、単結合または二重結合であり、
ＸはＣＨＣ（Ｒ^１３Ｙ’Ｙ）、ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｃ＝ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｓ、ＮＲ^６、またはＯであり、かつＲ^５’はｐが単結合であるとき水素であり、
ＸはＣＲ^６’’であり、かつＲ^５’はｐが二重結合であるとき存在せず、
Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ^６およびＲ^６’は各々独立して水素、メチレン、非存在、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ^７ａであり、
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり、
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり、
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ^１１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシルであり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅおよびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^１３は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
ＥはＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆ、またはＳであり、
ＷはＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆであり、
Ｙ’およびＹは各々独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、スルフヒドリル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルである）
の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの存在下で、該変異されたＴｅｔリプレッサーが該ＴＲＥに選択的に結合するように選択され、但し、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：

（式中、
ｐは単結合であり；
ＸはＣＲ ^６’ Ｒ ^６であり；
Ｒ ^５’ は水素であり；
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３、Ｒ ^５、Ｒ ^６、Ｒ ^６’ 、Ｒ ^８およびＲ ^１２は、各々水素であり；
Ｒ ^４’ およびＲ ^４” は、各々アルキルであり；
Ｒ ^４は、ＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ であり；
Ｒ ^７は、水素またはアミノであり；
Ｒ ^９は、非置換アルキルアミノメチル、非置換アルキル（アルコキシカルボニル）アミノメチル、ハロゲン置換アルキルアミノメチル、またはピペリジン置換メチルであり；そして
Ｒ ^１０およびＲ ^１１は、各々ヒドロキシルである）
の化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩、エステルまたはエナンチオマーではない、組成物。
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該置換されたテトラサイクリン化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）該置換されたテトラサイクリン化合物の存在下で該ＴＲＥに結合するが、非存在下では結合しない変異されたＴｅｔリプレッサーとを含み、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、該変異されたＴｅｔリプレッサーが式（ＩＩ）：

（式中、
Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^３、Ｒ^１２およびＲ^１４は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ^６ａは水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ^７ａであり、
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり、
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり、
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅおよびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
ＷはＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
Ｅは、ＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆである）
の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの存在下で該ＴＲＥに選択的に結合するように選択される、組成物。
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該置換されたテトラサイクリン化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）該置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で該ＴＲＥに結合するが、ただし存在下では結合しない変異されたＴｅｔリプレッサーとを含み、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、該変異されたＴｅｔリプレッサーが式（Ｉ）：

（式中、
ｐは単結合または二重結合であり、
ＸはＣＨＣ（Ｒ^１３Ｙ’Ｙ）、ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｃ＝ＣＲ^６’Ｒ^６、Ｓ、ＮＲ^６、またはＯであり、かつＲ^５’はｐが単結合であるとき水素であり、
ＸはＣＲ^６’’であり、かつＲ^５’はｐが二重結合であるとき存在せず、
Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^３およびＲ^１２は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ^６およびＲ^６’は各々独立して水素、メチレン、非存在、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ^７ａであり、
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり、
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、オキシミル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり、
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ^１１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシルであり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅおよびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^１３は水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｅは、ＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆ、またはＳであり、
ＷはＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆであり、
Ｙ’およびＹは各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、スルフヒドリル、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルである）
の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの非存在下でのみ該ＴＲＥに選択的に結合するように選択され、ここで、該置換されたテトラサイクリン化合物は、式（Ｉ）：

（式中、
ｐは単結合であり；
ＸはＣＲ ^６’ Ｒ ^６であり；
Ｒ ^５’ は水素であり；
Ｒ ^２、Ｒ ^２’ 、Ｒ ^３、Ｒ ^５、Ｒ ^６、Ｒ ^６’ 、Ｒ ^８およびＲ ^１２は、各々水素であり；
Ｒ ^４’ およびＲ ^４” は、各々アルキルであり；
Ｒ ^４は、ＮＲ ^４’ Ｒ ^４’’ であり；
Ｒ ^７は、水素またはアミノであり；
Ｒ ^９は、非置換アルキルアミノメチル、非置換アルキル（アルコキシカルボニル）アミノメチル、ハロゲン置換アルキルアミノメチル、またはピペリジン置換メチルであり；そして
Ｒ ^１０およびＲ ^１１は、各々ヒドロキシルである）
の化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩、エステルまたはエナンチオマーではない、組成物。
細胞内でｔｅｔオペレーター連結ヌクレオチド配列の発現を調節するための置換されたテトラサイクリン化合物を含む組成物であって、該置換されたテトラサイクリン化合物は、（ｉ）テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）に対して作動可能に連結された標的ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）該置換されたテトラサイクリン化合物の非存在下で該ＴＲＥに結合するが、存在下では結合しない変異されたＴｅｔリプレッサーとを含み、ここで該変異されたＴｅｔリプレッサーは、該変異されたＴｅｔリプレッサーが式（ＩＩ）：

（式中、
Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^４’およびＲ^４’’は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^３、Ｒ^１２およびＲ^１４は各々水素またはプロドラッグ部分であり、
Ｒ^４はＮＲ^４’Ｒ^４’’、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、ハロゲン、または水素であり、
Ｒ^５はヒドロキシル、水素、チオール、アルカノイル、アロイル、アルカロイル、アリール、複素環式芳香族、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アルキルカルボニルオキシ、またはアリールカルボニルオキシであり、
Ｒ^６ａは水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、またはアリールアルキルであり、
Ｒ^７は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^７ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｗ’）ＷＲ^７ａであり、
Ｒ^８は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^８ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｅ’）ＥＲ^８ａであり、
Ｒ^９は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環、チオニトロソ、または−（ＣＨ_２）_０−３（ＮＲ^９ｃ）_０−１Ｃ（＝Ｚ’）ＺＲ^９ａであり、
Ｒ^１０は水素、ヒドロキシル、ハロゲン、チオール、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールアルキル、アミノ、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アシル、アミノアルキル、複素環またはチオニトロソであり、
Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂ、Ｒ^７ｃ、Ｒ^７ｄ、Ｒ^７ｅ、Ｒ^７ｆ、Ｒ^８ａ、Ｒ^８ｂ、Ｒ^８ｃ、Ｒ^８ｄ、Ｒ^８ｅ、Ｒ^８ｆ、Ｒ^９ａ、Ｒ^９ｂ、Ｒ^９ｃ、Ｒ^９ｄ、Ｒ^９ｅおよびＲ^９ｆは各々独立して水素、アシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、アリールアルキル、アリール、複素環、複素環式芳香族またはプロドラッグ部分であり、
ＷはＣＲ^７ｄＲ^７ｅ、Ｓ、ＮＲ^７ｂまたはＯであり、
Ｗ’はＯ、ＮＲ^７ｆ、またはＳであり、
Ｅは、ＣＲ^８ｄＲ^８ｅ、Ｓ、ＮＲ^８ｂまたはＯであり、
Ｅ’はＯ、ＮＲ^８ｆ、またはＳであり、
ＺはＣＲ^９ｄＲ^９ｅ、Ｓ、ＮＲ^９ｂまたはＯであり、
Ｚ’はＯ、Ｓ、またはＮＲ^９ｆである）
の置換されたテトラサイクリン化合物、ならびにその薬学的に受容可能な塩、エステルおよびエナンチオマーの非存在下でのみ該ＴＲＥに選択的に結合するように選択される、組成物。
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、表２の化合物である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
前記置換されたテトラサイクリン化合物が、少なくとも約１３μｇ／ｍＬの濃度で５１を超えるＫｌｕｘを示す、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。