WO2006059717A1 - 被検体生物の同定方法、この方法に使用する内部標準用ｄｎａ組成物及びその製造方法 - Google Patents

被検体生物の同定方法、この方法に使用する内部標準用ｄｎａ組成物及びその製造方法 Download PDF

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double
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Keiichi Hamano
Mariko Kozuka
Naimuddin Mohammed
Koichi Nishigaki
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Japan Science And Technology Agency
Saitama University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying a specimen organism, a DNA composition for internal standard used in this method, and a method for producing the same.
  • the present invention is a method for improving the identification accuracy of a subject organism by using two types of internal standard DNA in a method for identifying a subject organism by a genotype combining random PCR and electrophoresis.
  • identification of organisms including microorganisms has been basically performed using phenotypes.
  • phenotypic identification is unsuitable for identification aimed at more precisely distinguishing organisms.
  • identification (specification) by phenotype has a limit as a practical problem.
  • microorganisms are often involved in daily life. For example, there are many diseases caused by microorganisms such as 0157, tuberculosis, MRSA, cholera, etc. In order to establish effective treatments and grasp the infection route, precise identification techniques of microorganisms are necessary.
  • the present inventors first invented a method for identifying species, similarity, etc. of organisms such as microorganisms by genotype that are simple and practical to some extent, and applied for a patent ( JP 2001-299398 A, Patent Document 1). In this method, random PCR and electrophoresis were combined to enable identification of organisms by genotype without comparing the genome sequences of the organisms.
  • two-dimensional gel electrophoresis such as temperature gradient gel electrophoresis or denaturant concentration gradient gel electrophoresis is used.
  • Two-dimensional gel electrophoresis is effective because of its high resolution in nucleic acid and protein analysis.
  • one of the high resolutions is the slight fluctuation of each electrophoresis caused by the temperature accuracy control limit of the temperature gradient apparatus, and the fluctuation of each electrophoresis caused by a change in the minute environmental conditions that cannot be controlled by humans.
  • These fluctuations can be corrected and standardized by using an internal standard sample that co-phores with a sequence of nucleic acids and proteins having a known denaturation temperature and mobility.
  • the method described in Patent Document 1 also proposes normalization of data using an internal standard DNA.
  • an object of the present invention is to provide a method for identifying an organism based on the above genotype, which has a higher standardization accuracy and, as a result, has a higher identification accuracy.
  • Still another object of the present invention is to provide means for increasing the standardization accuracy.
  • the present invention is as follows.
  • Double-strand DNA prepared using the genome of the test organism as a cage is subjected to temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) or denaturant concentration gradient gel electrophoresis (DGGE).
  • TGGE temperature gradient gel electrophoresis
  • DGGE denaturant concentration gradient gel electrophoresis
  • Electrophoretic pattern force of the two internal standard DNAs Extract the melting start points of each internal standard DNA, normalize the feature points using these melting start points as reference points, and
  • Random PCR force PCR in which heat denaturation, annealing and chain extension are repeated, annealing is performed at 25 ° C to 35 ° C for 1 to 2 minutes, and chain extension is performed at 42 ° C to 47 ° C. Performed in 1 to 2 minutes [2].
  • the standard feature point force obtained in (5) is also used to determine the PaSS and / or genome quasi-distance, and the target organism is identified based on the obtained PaSS and / or genome quasi-distance [ [1] to [4], the method according to item 1.
  • a substrate comprising two DNAs having any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 shown in the sequence listing DNA strand for internal standard of specimen organism identification method.
  • a combination of DNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 3 shown in the sequence listing, or DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5 shown in the sequence listing A DNA composition for an internal standard of a specimen organism identification method, including a combination.
  • a method for producing a DNA composition for internal standard comprising DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 shown in the sequence listing and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5,
  • a method comprising carrying out a PCR reaction using PBR322 DNA as a truncated DNA and using a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 4 and a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 4 comprises DNA having the sequences of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, and the primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 5 is SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 The method according to [12].
  • a method for producing an internal standard DNA composition comprising DNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 shown in the sequence listing and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 3, comprising fd (M13) phage DNA And a PCR reaction using a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 1 consists of DNA having the sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and the primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: DNA force having the sequence of 10 and SEQ ID NO: 11 [15] The method described in 1.
  • the conventional standard DNA used in two-dimensional gel electrophoresis such as GP was only one kind of PCR product, and the standard characteristic was performed using the first and second feature points.
  • the position of the second feature point became unstable after each migration, and as a result, it was found that there was an adverse effect on the standard accuracy in GP.
  • the standard DNA set sequence (thing) and its preparation Improved method was devised and, along with the determination of the sequence, a simple preparation method was established.
  • the present invention comprises (1) subjecting a double-stranded DNA prepared using the genome of a test organism to a cage to temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) or denaturant concentration gradient gel electrophoresis (DGGE), and (2) From the obtained electrophoresis pattern of the double-stranded DNA, feature points of the double-stranded DNA are extracted, and (3) a test organism is identified based on the extracted feature points.
  • TGGE temperature gradient gel electrophoresis
  • DGGE denaturant concentration gradient gel electrophoresis
  • the double-stranded DNA in (1) is prepared by random PCR, and one or more double-stranded DNAs are prepared.
  • Random PCR is PCR in which heat denaturation, annealing, and chain extension are repeated, annealing is performed at 25 ° C to 35 ° C in 1 to 2 minutes, and chain extension is performed at 42 ° C to 47 ° C for 1 to 2 minutes. Can be done in 2 minutes.
  • Random PCR repeats heat denaturation, annealing, and strand extension in the same way as ordinary PCR, but reduces the specificity of the hybridization between the primer and the saddle type, which have lower annealing and strand extension temperatures.
  • Heat denaturation may be carried out in the same manner as ordinary PCR.
  • the characteristic point of the double-stranded DNA extracted in (2) can be, for example, the melting start point of each double-stranded DNA.
  • characteristic points other than the melting start point for example, the point where mobility becomes the smallest during the denaturation process of double-stranded DNA or the point where denaturation is completely completed. good.
  • the melting start point of double-stranded DNA is stable for each migration that is not easily affected by the subtle effects of gel composition and electrophoresis environment, the melting start point is used as a feature point from the viewpoint of maintaining accuracy and reproducibility. I like it.
  • the present invention provides a method for identifying a test organism comprising the steps (1), (2) and (3) above, (4) gel electrophoresis of the double-stranded DNA is carried out in two types (5) Electrophoretic pattern power of the two types of internal standard DNAs Extract the melting start points of each internal standard DNA, normalize the feature points using these melting start points as reference points, And (6) the subject organism is identified based on the standardized feature points.
  • gel electrophoresis of double-stranded DNA is performed together with two types of internal standard DNA.
  • the sequence of the internal standard DNA is determined in consideration of the fact that the pattern shape represented by GP can be easily distinguished from the random PCR fragment group.
  • the two internal standard DNAs used at the same time are preferred from the standpoint of increasing the accuracy of normalization because the melting start points are somewhat separated and the number of bases is different. Specifically, it is appropriate that the two types of internal standard DNA are separated by a melting starting point force of 1 ° C or more, preferably 5 ° C or more, more preferably 9 ° C or more.
  • Two internal standard DNs It is appropriate that A is different in the number of bases by 200 or more, preferably 300 or more, more preferably 400 or more.
  • the amount of the two types of internal standard DNA to be electrophoresed is determined so that the random PCR fragment of the target sample does not affect the identification of the random PCR fragment group of the target sample when image detection is performed after electrophoresis. ⁇ that has the same power as the concentration of the fragment group is appropriately determined in consideration of the slightly lower concentration. Specifically, the amounts of the two types of internal standard DNA to be electrophoresed are suitably in the range of 0.3 to 0.6 pmol, for example.
  • the two types of internal standard DNAs can be selected from, for example, two DNAs having any one of the sequence numbers 1 to 5 shown in the sequence listing. More specifically, the two types of internal standard DNAs are a combination of DNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 shown in the sequence listing and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 3, or the sequence of SEQ ID NO: 4 shown in the sequence listing. A combination of DNA having and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5 is preferred.
  • the melting start points of each internal standard DNA are extracted from the electrophoresis patterns of two types of internal standard DNA, and the characteristic points of the double-stranded DNA are determined using these melting start points as reference points.
  • Standardize The standard of the characteristic point of double-stranded DNA can be coordinated by setting a migration gel frame, setting the distance between the migration distances, and then setting the melting start points of the two types of internal standard samples together. After that, by simply hitting the feature point group of each band, it is automatically converted into a standardized feature point group, and comparison between the two is possible in a standardized state.
  • the subject organism is identified based on the standardized feature points. Specifically, the standardized feature point group force obtained in (5) is also used to determine the PaSS and / or genome quasi-distance, and based on the obtained PaSS and / or genome quasi-distance, the subject organism is identified. I do. PaSS and / or genomic quasi-distance can be performed using the method described in Patent Document 1 (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-299398).
  • PaSS is the Pattern Similarity Score
  • the genome near-distance is an index that indicates the similarity of the genome of two types of microorganisms using Pa SS. (1 PaSS) / Expressed as Pa SS.
  • PaSS and genome quasi-distance are obtained by the extraction method as described above, and calculated from the standardized feature points (spiddos: species identification dots) as follows. And can identify microorganisms by genotype using PaSS and Z or genomic subdistances. Microorganisms are identified by comparing the feature points obtained for the target genome and the feature points obtained for the genome of the target microorganism.
  • the species of the microorganism to be identified is previously divided, that species is used as a comparison target. If the species of the microorganism to be identified is unknown, a representative species (for example, several tens of species) selected in advance based on the overall form of the genome profiling image is used as a temporary comparison target. Alternatively, when the species of the sample microorganism is unknown, species having feature points that are similar to the feature points obtained by the feature point extraction process described above are sequentially listed. Then, the listed species are used as temporary comparison targets.
  • the method for calculating PaSS and genome quasi-distance, and the method for identifying the subject organism can be performed with reference to the method described in Patent Document 1.
  • identification of an organism can be species identification or affinity identification of the organism.
  • the species identification of an organism is to identify to which species the organism to be tested belongs. For example, when the PaSS power is .95 or more, the same species can be used.
  • affinity identification is to identify to which species the organism to be tested has an affinity, for example, when the PaSS force is less than 0.95 and is 0.8 or more. There can be. In this case, the larger the value, the more closely related species.
  • the subject organism is not particularly limited, but can be a microorganism.
  • the subject organism is basically an organism with genomic DNA, all organisms can be compared at the genome level.
  • the present invention includes a DNA composition for internal standard used in the above-described method for identifying a subject organism.
  • This internal standard DNA strand composition includes two DNAs having any one of the sequence numbers 1 to 5 shown in the sequence listing. More specifically, the DNA composition for internal standard of the present invention has the combination of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, the combination of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5, and the sequence of SEQ ID NO: 1 shown in the Sequence Listing.
  • a combination of DNA and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 3 or DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 shown in the sequence listing; A combination of DNAs having the sequence of SEQ ID NO: 5 can be included.
  • DNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 3 shown in the sequence listing, or DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 shown in the sequence listing and sequence of SEQ ID NO: 5 is included. It is preferable to include a combination of DNA.
  • the DNA contained in the internal standard DNA composition may be labeled.
  • the label include a fluorescent label and an isotope label.
  • the substance for the fluorescent label is not intended to be limited to these, but examples thereof include fluorescent dyes such as Cy5, Cy3, and FITC. These fluorescent labeling substances have been confirmed to have no effect on DNA migration.
  • two types of internal standard DNA are used in combination, but the two types of internal standard DNA labels may be the same color or different colors. However, it is appropriate that the two types of internal standard DNA labels have different colors from the fluorescent dyes labeled on the sample DNA. Labeling can be introduced into DNA by, for example, labeling a fluorescent dye at the 5 ′ end of one of the primer pairs for preparation.
  • the present invention is a kit for identifying a subject organism, comprising the DNA composition for internal standard of the present invention.
  • This kit can also contain a buffer for use in DNA synthesis and reagents for DNA synthesis, such as DNA polymerase, substrates, primers, and the like.
  • the present invention includes a method for producing an internal standard DNA composition comprising DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 shown in the sequence listing and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5.
  • pBR322 DNA is a vertical DNA
  • a PCR reaction is carried out using a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 4 and a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the pBR322 DNA used as the cage DNA is a DNA widely used in the art as a plasmid.
  • a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 5 is preferably DNA having the sequences of AGTGGTCCTG CAACTTTATC (SEQ ID NO: 12) and AACATGGGGGATCATGTAAC (SEQ ID NO: 13).
  • any of the primers can be modified within a range that allows amplification of DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 5 is preferably composed of GCCGGCATCACCGGCGCC ACAGGTGCGGTTG (SEQ ID NO: 14) and TAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCA GGTC (SEQ ID NO: 15).
  • PCR cycle conditions include, for example, The following conditions are preferably adopted.
  • the PCR cycle conditions are changed as long as the target DNA can be amplified while suppressing the by-production of DNA other than DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5. It is possible.
  • c annealing can be changed in the range of 55 ° C to 65 ° C and 15 seconds to 30 seconds.
  • the method for producing the above internal standard DNA composition is a method of synthesizing at once a composition comprising DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5 shown in the sequence listing. However, it is also possible to synthesize each internal standard DNA individually.
  • DNA having the sequence of SEQ ID NO: 4 shown in the Sequence Listing can be synthesized by using pBR322 DNA as a saddle and performing a PCR reaction using the above-mentioned primer set for DNA amplification.
  • DNA having the sequence of SEQ ID NO: 5 can be synthesized by performing PCR reaction using pBR322 DNA as a saddle and using the above-mentioned primer set for DNA amplification.
  • the internal standard DNA having the sequences of SEQ ID NOS: 1 to 3 shown in the sequence listing can be synthesized by PCR reaction using DNA fd (Ml 3) as a cage. Details of the synthesis method are given in the examples described later. In any case, the internal standard DNA can be prepared by amplifying a specific region of the vertical DNA by PCR.
  • the present invention includes a method for producing an internal standard DNA composition comprising DNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 shown in the sequence listing and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • PCR reaction is carried out using a DNA amplification primer set having the sequence of SEQ ID NO: 3 and a DNA amplification primer set having the sequence of SEQ ID NO: 3 using fd (M13) phage DNA as a saddle type DNA. It is characterized by performing.
  • fd (M13) phage DNA as a saddle type DNA.
  • the fd (M13) phage DNA used for the truncated DNA is a DNA that is widely used in the art as a fuzzy vector suitable for DNA sequencing.
  • a primer for PCR a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 3 are used.
  • the primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably composed of DNA having the sequences of CTACGTCTCTTCCGATGCTGT (SEQ ID NO: 6) and TTGAATTCTATCGGTTTATCA (SEQ ID NO: 7). It is preferable that the primer set for DNA amplification having the sequence of SEQ ID NO: 3 is AAATGCC GATGA (SEQ ID NO: 10) and TAATTGTGCGCT (SEQ ID NO: 11).
  • the PCR reaction can be performed by a conventional method.
  • PCR cycle conditions for example, The following conditions are preferably adopted.
  • the PCR cycle conditions are changed as long as the target DNA can be amplified while suppressing by-production of DNA other than DNA having the sequence of SEQ ID NO: 1 and DNA having the sequence of SEQ ID NO: 3. It is possible.
  • Primer MA1 5'-CTACGTCTCTTCCGATGCTGT-3 (SEQ ID NO: 6) and primer MA2: 5'-TTGAATTCTATCGGTTTATCA-3 (SEQ ID NO: 7) are used to amplify ref 1 with a DNA base length of 200 bp under the following PCR cycle conditions To do.
  • PCR reaction solution composition Tris—HC1 10 mM, KC1 50 mM, MgCl 1.5 mM, dNTP 200 ⁇
  • PCR cycle conditions include: a pre-heat denaturation (95 ° C, 5 minutes), b heat denaturation (94 ° C, 30 seconds), c annealing (50 ° C, 30 seconds), d strand extension (72 ° C, 30 seconds), repeat e-chain extension (72 ° C, 5 minutes) b to d 30 times.
  • Primer Ref3-F ACCTCCTGTCAATGC (SEQ ID NO: 8) and primer ReB-R (cy3): TCACCGGAAC (SEQ ID NO: 9) are used to amplify a £ 3 DNA base length of 1351 ⁇ under the following PCR cycle conditions.
  • PCR reaction solution composition Tris—HC1 10 mM, KC1 50 mM, MgCl 1.5 mM, dNTP 200 ⁇
  • PCR cycle conditions include: a pre-heat denaturation (95 ° C, 5 minutes), b heat denaturation (94 ° C, 30 seconds), c annealing (60 ° C, 30 seconds), d strand extension (74 ° C, 30 seconds), e-Post chain extension (74 ° C, 5 minutes) b to d are repeated 30 times.
  • primer Ref4-F AAATGCCGATGA (SEQ ID NO: 10) and primer Ref4-R: TAATTG TGCGCT (SEQ ID NO: 11), amplify ref4 with a DNA base length of 600 bp under the following PCR cycle conditions.
  • PCR reaction solution composition Tris—HC1 10 mM, KC1 50 mM, MgCl 1.5 mM, dNTP 200 ⁇
  • PCR cycle conditions are as follows: a Pre-heat denaturation (95 ° C, 5 min), b Heat denaturation (94 ° C, 30 sec), c annealing (67.5 ° C, 30 sec), d-strand extension (74 ° C, 30 seconds), e-post chain elongation (74 ° C, 5 minutes) b ⁇ (! Is repeated 25 times.
  • Fig. 1 shows the results of temperature gradient gel electrophoresis (TGG E) of three internal standard DNAs synthesized by the above method.
  • the melting start point of refl is about 60.0 ° C
  • the melting start point of ref3 is about 70.1 ° C
  • the melting start point of ref4 is about 58.0 ° C.
  • the electrophoresis conditions are as follows.
  • reference 5 base sequence: SEQ ID NO: 4
  • reference 6 base sequence: SEQ ID NO: 5
  • primer Ref5F AGTGGTCCTGCAACTTTATC (SEQ ID NO: 12)
  • primer Ref5 R AACATGGGGGATCATGTAAC (SEQ ID NO: 13)
  • DNA base length 200 bp primer ReffiF: GCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTG (SEQ ID NO: 14)
  • primer ReffiR TAGCGAGGTGCCGCCGGCTT
  • PCR reaction solution composition Tris—HC1 10 mM, KC1 50 mM, MgCl 1.5 mM, dNTP 200 ⁇
  • PCR cycle conditions include: a pre-heat denaturation (95 ° C, 2 minutes), b heat denaturation (94 ° C, 15 seconds), c annealing (55 ° C, 30 seconds), d-strand extension (72 ° C, 30 seconds), e-Post chain elongation (72 ° C, 30 seconds) b ⁇ (! Is repeated 25 times.
  • FIG. 2 shows the results of temperature gradient gel electrophoresis (TGG E) of two internal standard DNAs synthesized by the above method.
  • the melting start point of ref5 is about 52.2 ° C
  • the melting start point of reffi is about 61.4 ° C.
  • the electrophoresis conditions are as follows.
  • the test method is actually TGGE with an appropriate random PCR product and an internal standard.
  • TGGE was performed on the same random PCR product using a double internal standard sample (ref5, reffi mixture) and a single internal standard sample (refl). After electrophoresis, use analysis software to mark clear feature points (constant) of random PCR products, and coordinate correction for double internal standard samples. For ref5 and reffi first feature points, use single internal standard samples. The PaSS calculation was performed using the first and second feature points of refl.
  • TGGE is performed 4 times each for double internal standard sample and single internal standard sample (W1 to W4, S1 to S4), and 6 types in double (W1 / W2, W1 / W3, W1 / W4, W2 / WSS, W2 / W4, W3 / W4) and 6 types (S1 / S2, S1 / S3, S1 / S4, S2 / S3, S2 / S4, S3 / S4) within the single PaSS calculation, PaSS calculation result We compared the stability of double and single power. The results are shown in Tables 1 and 2.
  • the double internal standard sample shows a value less than half that of the single internal standard sample. It became clear that it rose.
  • TGGE is performed four times for each of the double internal standard sample and the single internal standard sample.
  • organisms can be identified by genotype.
  • genotype For example, microorganisms and the like can be easily detected, and thus can be widely used in the medical and food fields.
  • FIG. 1 Temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) results of three internal standard DNAs synthesized in Example 1.
  • FIG. 2 shows temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) results of two internal standard DNAs synthesized in Example 2.

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Abstract

遺伝子型による生物の同定方法であって、より規格化精度を高め、その結果、同定精度も高められた方法、及び規格化精度を高めるための手段を提供する。(1)被検体生物のゲノムを鋳型として調製した2本鎖ＤＮＡを温度勾配ゲル電気泳動または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に付し、(2)得られた前記2本鎖ＤＮＡの電気泳動パターンから、前記2本鎖ＤＮＡの特徴点を抽出し、(3)抽出された特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う方法。(4)前記2本鎖ＤＮＡのゲル電気泳動を、2種類の内部標準ＤＮＡとともに行い、(5)前記2種類の内部標準ＤＮＡの電気泳動パターンから各内部標準ＤＮＡの融解開始点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、前記特徴点を規格化し、かつ(6)規格化した特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う。

Description

明 細 書
被検体生物の同定方法、この方法に使用する内部標準用 DNA組成物 及びその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、被検体生物の同定方法、この方法に使用する内部標準用 DNA組成物 及びその製造方法に関する。特に本発明は、ランダム PCRと電気泳動を組み合わせ た遺伝子型による被検体生物の同定方法において、 2種類の内部標準 DNAを用い 、被検体生物の同定精度を高めた方法である。
背景技術
[0002] 従来、微生物を含む生物の同定は、基本的に表現型を用いて行われて来た。しか し、表現型による同定は、生物をより精密に区別することを目的とする同定には不向 きであった。特に、種の数が膨大である微生物においては、表現型による同定 (特定 )には、現実問題として限界があった。一方、日常生活において微生物が係わること は多い。例えば、 0157、結核、 MRSA、コレラなどの微生物が原因となる疾患は多ぐ 有効な治療法の確立や、感染経路の把握のためには、微生物の精密な同定技術が 必要である。また、農産物の生産性や品質に土壌細菌が係わり、あるいは、ヒトの健 康に腸内細菌叢の良否が大きく影響していると言われている。しかるに、農産物の生 産性や品質と土壌細菌の種類や量、組合せとの関係、さらにはヒトの健康と腸内細 菌叢との関係について、精密な検討が行われていないのが現状である。これは、これ までのように表現型による微生物の同定では、精密な同定、判別が不可能であること に起因している。そこで、表現型に代わるものとして遺伝子型による微生物の同定が 提案されている。
[0003] 例えば、各微生物のゲノム (全体)同士を比較することにより微生物の種の同定、判 別をすることは、現在のシーケンス技術レベルでは十分可能である。しかし、相当の 手間と時間を掛ける必要が有り、簡便な方法ではない。従って、ゲノム (全体)同士の 比較による微生物の種の同定、判別は、現実には広汎に行い得る方法ではない。ま た、より簡便な方法として、ゲノムの一部の配列比較をする方法がある。しかし、例え ば、 16S rRNAの配列比較では、種の同定、判別には十分な情報が得られない。
[0004] そこで本発明者らは、ある程度簡便で現実に実行可能である、遺伝子型による微 生物等の生物について、種や類似性等を同定する方法を先に発明し、特許出願し た（特開 2001-299398号公報、特許文献 1)。この方法では、ランダム PCRと電気泳動 を組み合わせ、生物のゲノムの配列を比較することなぐ遺伝子型により生物の同定 を可會 にした。
[0005] 上記方法では、温度勾配ゲル電気泳動法や変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法等 の二次元的ゲル電気泳動が用いられる。二次元的ゲル電気泳動は、核酸やタンパク 質解析においてその分解能の高さゆえに有効である。しかしその分解能の高さの一 方で、温度勾配装置の温度精度制御限界に起因する泳動毎の極わずかなゆらぎや 、人の制御が不可能な極微の環境条件変化による泳動毎ゆらぎがある。これらのゆ らぎに対して、既知の変性温度や移動度をもつシーケンスの核酸やタンパク質を共 泳動させる内部標準試料を用いることで、補正 ·規格ィ匕が可能となる。上記特許文献 1に記載の方法においても、内部標準 DNAを用い、データを規格化することを提案 している。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 特許文献 1に記載の方法においては、 1種類の内部標準 DNAを用い、この内部標 準 DNAの 2つの特徴点を用いて、データの規格ィ匕を行っている。しかるに、その後 の検討において、 2つの特徴点の内、一方が不安定であり、その結果、規格化精度 に問題があることが判明した。
[0007] そこで本発明の目的は、上記遺伝子型による生物の同定方法であって、より規格 化精度を高め、その結果、同定精度も高められた方法を提供することにある。
[0008] さらに本発明の別の目的は、上記規格化精度を高めるための手段を提供すること にある。
[0009] 本発明は以下のとおりである。
[1](1)被検体生物のゲノムを铸型として調製した 2本鎖 DNAを温度勾配ゲル電気泳 動 (TGGE)または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE)に付し、 (2)得られた前記 2本鎖 DNAの電気泳動パターンから、前記 2本鎖 DNAの特徴点を 抽出し、
(3)抽出された特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う方法であって、
(4)前記 2本鎖 DNAのゲル電気泳動を、 2種類の内部標準 DNAとともに行い、
(5)前記 2種類の内部標準 DNAの電気泳動パターン力 各内部標準 DNAの融解開 始点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、前記特徴点を規格化し、かつ
(6)規格ィ匕した特徴点に基づ 、て被検体生物の同定を行う
ことを特徴とする前記方法。
[2](1)前記 2本鎖 DNAの調製は、ランダム PCRにより行われ、 1種又は 2種以上の 2 本鎖 DNAが調製される、 [1]に記載の方法。
[3]ランダム PCR力 熱変性、アニーリング及び鎖伸長を繰り返し行う PCRであって、 アニーリングを 25°C〜35°Cで 1〜2分で行い、かつ鎖伸長を 42°C〜47°Cで 1〜2分 で行う [2]に記載の方法。
[4]前記 2本鎖 DNAの特徴点が、各 2本鎖 DNAの融解開始点である [1]〜 [3]の 、 ずれかに記載の方法。
[5](5)で得られた規格ィ匕した特徴点群力も PaSS及び/又はゲノム準距離を求め、得 られた PaSS及び/又はゲノム準距離に基づいて、被検体生物の同定を行う [1]〜[4 ]の 、ずれか 1項に記載の方法。
[6] 2種類の内部標準 DNA力 配列表に示す配列番号 1〜5のいずれかの配列を有 する 2つの DNA力 選ばれる [1]〜 [5]の!、ずれかに記載の方法。
[7] 2種類の内部標準 DNA力 配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNA及び 配列番号 3の配列を有する DNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号 4の配 列を有する DNA及び配列番号 5の配列を有する DNAの組み合わせである、 [1]〜 [5 ]のいずれかに記載の方法。
[8]生物の同定が、生物の種同定又は類縁性同定である [1]〜 [7]の 、ずれかに記 載の方法。
[9]被検体生物が微生物である [ 1]〜 [8]の 、ずれかに記載の方法。
[10]配列表に示す配列番号 1〜5のいずれかの配列を有する 2つの DNAを含む、被 検体生物同定方法の内部標準用 DNA糸且成物。
[11]配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNA及び配列番号 3の配列を有する DNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び配列 番号 5の配列を有する DNAの組み合わせを含む、被検体生物同定方法の内部標準 用 DNA組成物。
[ 12]配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び配列番号 5の配列を有する DNAを含む内部標準用 DNA組成物の製造方法であって、
PBR322DNAを铸型 DNAとし、配列番号 4の配列を有する DNA増幅用のプライマ 一セット及び配列番号 5の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットを用いて PCR 反応を行うことを特徴とする方法。
[13]配列番号 4の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットが、配列番号 12及び 配列番号 13の配列を有する DNAからなり、配列番号 5の配列を有する DNA増幅用の プライマーセットが、配列番号 14及び配列番号 15力 なる [12]に記載の方法。
[14] PCRサイクル条件として、
a前熱変性 (95°C,2分)、
b熱変性 (94°C,15秒）、
cアニーリング（55°C,30秒）、
d鎖伸長 (72°C,30秒)、
eポスト鎖伸長（72°C,30秒）
を用い、かつ b〜dを 25回繰り返す [12]または [13]に記載の方法。
[15]配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNAおよび配列番号 3の配列を有す る DNAを含む内部標準 DNA組成物の製造方法であって、 fd (M13)ファージ DNAを 铸型 DNAとし、配列番号 1の配列を有する DNA増幅用のプライマーセット及び配列 番号 3の配列を有する DNA増幅用プライマーセットを用いて PCR反応を行うことを特 徴とする方法。
[16]配列番号 1の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットが、配列番号 6及び 配列番号 7の配列を有する DNAからなり、配列番号 3の配列を有する DNA増幅用の プライマーセットが、配列番号 10及び配列番号 11の配列を有する DNA力 なる [15] に記載の方法。
[17] PCRサイクル条件として、
a前熱変性 (94°C, 5分）、
b熱変性 (94°C, 30秒）
cアニーリング（64°C〜65°C, 30秒）
d鎖伸長 (74°C, 30秒）
eポスト鎖伸長 (74°C, 5分）
を用い、かつ b〜dを 30回繰り返す [15]または [16]に記載の方法。
[請求項 18]
[10]または [11]に記載の内部標準用 DNA組成物を含む、被検体生物同定用キッ 発明の効果
[0010] GP等の二次元ゲル電気泳動で使用する従来の標準 DNAは、 1種類の PCR産物 のみで、その第 1特徴点と第 2特徴点を使って規格ィ匕を行っていた。しかし、その後 の検討において、第 2特徴点の位置が泳動毎で不安定になることが判明し、その結 果、 GPにおける規格ィ匕精度にも悪影響があることが分力つた。それに対して、本発 明では、安定な第 1特徴点を 2つ、すなわち 2種類の標準 DNAを用いることで規格 化精度向上を図るために、標準 DNAセットのシーケンス (物）とそれの調製法 (方法） を改良'考案し、シーケンスの決定とともに、簡便な調製法を確立した。本発明で確 立した調製法により作製した標準 DNAセットを用いることで、 GPにおける規格化精 度が従来の 1種類の標準 DNAを用いたときに比べ格段に向上した。
発明を実施するための最良の形態
[0011] [被検体生物の同定方法]
本発明は、 (1)被検体生物のゲノムを铸型として調製した 2本鎖 DNAを温度勾配ゲ ル電気泳動 (TGGE)または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE)に付し、（2)得 られた前記 2本鎖 DNAの電気泳動パターンから、前記 2本鎖 DNAの特徴点を抽出 し、（3)抽出された特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う方法である。上記 (1)、 ( 2)及び (3)の工程を含む被検体生物の同定方法は、前述の特許文献 1に記載されて いる。従って、上記 (1)、（2)及び (3)の工程については、特許文献 1の記載に従って、 実施することができる。
[0012] 具体的には、（1)における 2本鎖 DNAの調製は、ランダム PCRにより行われ、 1種又 は 2種以上の 2本鎖 DNAが調製される。ランダム PCRは、熱変性、アニーリング及び 鎖伸長を繰り返し行う PCRであって、アニーリングを 25°C〜35°Cで 1〜2分で行い、 かつ鎖伸長を 42°C〜47°Cで 1〜2分で行うことができる。ランダム PCRは、通常の P CRと同様に熱変性、アニーリング及び鎖伸長を繰り返し行うが、アニーリング及び鎖 伸長の温度が低ぐプライマーと铸型とのハイブリダィゼーシヨンの特異性を低くして 行われる。熱変性は、通常の PCRと同様に行えばよい。
[0013] (2)において電気泳動パターン力 抽出される 2本鎖 DNAの特徴点は、例えば、各 2本鎖 DNAの融解開始点であることができる。被検体生物の同定においては、融解 開始点以外の特徴点、例えば、 2本鎖 DNAの変性過程途中で移動度が最も小さく なる点や、完全に 1本鎖に変性しきった点を用いても良い。しかし、 2本鎖 DNAの融解 開始点がゲル組成や泳動環境の微妙な影響を受けにくぐ泳動毎に安定であること から、精度保持'再現性という観点から、特徴点として融解開始点を用いることが好ま しい。
[0014] さらに本発明は、上記 (1)、（2)及び (3)の工程を含む被検体生物の同定方法におい て、（4)前記 2本鎖 DNAのゲル電気泳動を、 2種類の内部標準 DNAとともに行い、 (5) 前記 2種類の内部標準 DNAの電気泳動パターン力 各内部標準 DNAの融解開始 点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、前記特徴点を規格化し、かつ (6) 規格化した特徴点に基づいて被検体生物の同定を行うことを特徴とする。
[0015] 本発明においては、 2本鎖 DNAのゲル電気泳動を、 2種類の内部標準 DNAととも に行う。内部標準 DNAの配列は、その配列が GPで表すパターン形状がランダム PC Rの断片群に紛れず、容易に識別できるものであることを考慮して決定される。同時 に使用される 2種類の内部標準 DNAは、それぞれの融解開始点が、ある程度離れ、 かつ塩基数に違 、があることが、規格化の精度を高めると 、う観点からは好ま 、。 具体的には、 2種類の内部標準 DNAは、融解開始点力 1°C以上、好ましくは 5°C以 上、より好ましくは 9°C以上離れていることが適当である。また、 2種類の内部標準 DN Aは、塩基数が 200以上、好ましくは 300以上、より好ましくは 400以上違うことが適 当である。
[0016] 電気泳動させる 2種類の内部標準 DNAの量は、泳動後画像検出した際に、対象 試料のランダム PCR断片群の識別のしゃすさに影響がな ヽように、対象試料のラン ダム PCR断片群の濃度に同等力 ある ヽはそれよりも濃度がわずかに小さくなるよう に考慮して適宜決定される。具体的には、電気泳動させる 2種類の内部標準 DNAの 量は、例えば、それぞれ 0.3〜0.6pmolの範囲であることが適当である。
[0017] 2種類の内部標準 DNAは、例えば、配列表に示す配列番号 1〜5のいずれかの配 列を有する 2つの DNAから選ばれることができる。より具体的には、 2種類の内部標準 DNAは、配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNA及び配列番号 3の配列を有 する DNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び 配列番号 5の配列を有する DNAの組み合わせであることが好ましい。
[0018] 本発明においては、 2種類の内部標準 DNAの電気泳動パターンから各内部標準 DNAの融解開始点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、 2本鎖 DNAの特 徴点を規格化する。 2本鎖 DNAの特徴点の規格ィ匕は、泳動ゲルのフレームを設け 泳動距離間を設定し、その後 2種類の内部標準試料の融解開始点をともに打点して 座標補正を行うことができる。その後は各バンドの特徴点群を打点していくだけで、 自動的に規格化された特徴点群に変換され、標準化された状態で 2者間の比較が可 能となる。
[0019] 規格ィ匕した特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う。具体的には、（5)で得られ た規格ィ匕した特徴点群力も PaSS及び/又はゲノム準距離を求め、得られた PaSS及 び/又はゲノム準距離に基づいて、被検体生物の同定を行う。 PaSS及び/又はゲノ ム準距離は、特許文献 1 (特開 2001-299398号公報）に記載の方法を用いて行うこと ができる。
[0020] PaSSとは、パターン類似度 (Pattern Similarity Score)であり、ゲノム準距離とは、 Pa SSを用 、た 2種の微生物のゲノムの類縁状況を表す指標であり、（ 1 PaSS) /Pa SSで表される。 PaSS及びゲノム準距離は、上記のようにして抽出方法で得られ、か つ規格化された特徴点群（spiddos: species identification dots)から以下のように算 出され、 PaSS及び Z又はゲノム準距離を用いて遺伝子型により微生物を同定するこ とができる。微生物の同定は、比較対象ゲノムについて得られた特徴点群と、同定対 象である微生物のゲノムについて得られた特徴点群とを比較することにより行われる
[0021] 同定対象である微生物の種が予め分力つて 、る場合、その種を比較対象とする。ま た、同定対象である微生物の種が未知である場合、ゲノムプロフィリング画像の全体 的な形態に基づ 、て予め選定された代表種 (たとえば数十種)を仮の比較対象とす る。あるいは、試料微生物の種が未知である場合、上述の特徴点抽出処理により得 られた各特徴点にっ ヽて類似する特徴点を有する種を順次リストアップする。そして 、リストアップされた種を仮の比較対象とする。 PaSS及びゲノム準距離の算出法、並 びに被検体生物の同定方法は、特許文献 1に記載の方法を参照して行うことができ る。
[0022] 本発明の方法において、生物の同定は、生物の種同定又は類縁性同定であること ができる。生物の種同定とは、検定対象の生物が、どの種に属するかを同定すること であり、例えば、 PaSS力 . 95以上である場合を同一種とすることができる。また、類 縁性同定とは、検定対象の生物が、どの種に類縁性を有するかを同定することであり 、例えば、 PaSS力 0. 95未満で、 0. 8以上である場合を類縁性がある、とすること ができる。この場合、数値が大きくなればなるほどそれだけ近縁種といえる。
[0023] さらに、被検体生物は特に限定されないが、微生物であることができる。微生物以 外にも、被検体生物は、基本的にゲノム DNAをもつ生物あれば、すべての生物の比 較がゲノムレベルで可能である。
[0024] [内部標準用 DNA組成物]
本発明は、上記被検体生物の同定方法に用いられる内部標準用 DNA組成物を 包含する。この内部標準用 DNA糸且成物は、配列表に示す配列番号 1〜5のいずれ かの配列を有する 2つの DNAを含む。本発明の内部標準用 DNA組成物は、より具 体的には、配列番号 2と配列番号 3の組み合わせ、配列番号 2と配列番号 5の組み 合わせ、配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNA及び配列番号 3の配列を有 する DNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び 配列番号 5の配列を有する DNAの組み合わせ含むことができる。なかでも、配列表に 示す配列番号 1の配列を有する DNA及び配列番号 3の配列を有する DNAの組み合 わせ、または配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び配列番号 5の配列を 有する DNAの組み合わせ含むことが好まし 、。
[0025] 内部標準用 DNA組成物に含まれる DNAは、ラベルされたものであってもよい。ラベ ルとしては、蛍光ラベルや同位体ラベル等を挙げることができる。但し、これらの DNA が内部標準用であることから、ラベルにより DNAの泳動に影響が出ないようにラベル 物質は選択することが適当である。蛍光ラベル用の物質としては、これらに限定する 意図ではないが、例えば、 Cy5、 Cy3、及び FITC等の蛍光色素を挙げることができ る。これらの蛍光ラベル用の物質については、 DNAの泳動に影響がないことは確認 済みである。尚、本発明の方法では、 2種類の内部標準用 DNAを組み合わせて使 用するが、 2種類の内部標準用 DNAのラベルは同色でも異色でもよい。但し、 2種類 の内部標準用 DNAのラベルは、被検体 DNAにラベルした蛍光色素とは異色にす ることが適当である。また、ラベリングは、例えば、蛍光色素を作製用プライマーペア のどちらか片方の 5'末端にラベルすることで、 DNAに導入することができる。
[0026] 本発明は、上記本発明の内部標準用 DNA組成物を含む、被検体生物同定用キッ ト。このキットには、 DNA合成時に使用するための緩衝液や DNA合成用の試薬、例 えば、 DNAポリメラーゼ、基質、プライマー等を含むこともできる。
[0027] [内部標準用 DNA組成物の製造方法]
本発明は、配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び配列番号 5の配列を 有する DNAを含む内部標準用 DNA組成物の製造方法を包含する。この製造方法 は、 pBR322DNAを铸型 DNAとし、配列番号 4の配列を有する DNA増幅用のプラ イマ一セット及び配列番号 5の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットを用いて PCR反応を行うことを特徴とする。
[0028] 本発明の上記方法によれば、 2種類の内部標準用 DNAを含む組成物を、 1つの铸 型から 1回の PCRによる合成操作で調製することができるという利点がある。
[0029] 铸型 DNAとして用いられる pBR322DNAは、プラスミドとして当該分野で汎用され ている DNAである。 PCR用のプライマーとして、配列番号 4の配列を有する DNA増幅 用のプライマーセットと配列番号 5の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットを用 いる。配列番号 4の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットは、 AGTGGTCCTG CAACTTTATC (配列番号 12)及び AACATGGGGGATCATGTAAC (配列番号 13)の 配列を有する DNA力 なることが好ましい。但し、何れのプライマーも、配列番号 4の 配列を有する DNAを増幅できる範囲で、配列を改変することができる。また、配列番 号 5の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットは、 GCCGGCATCACCGGCGCC ACAGGTGCGGTTG (配列番号 14)及び TAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCA GGTC (配列番号 15)からなることが好ましい。
[0030] PCR反応は、常法により行うことができる。但し、配列番号 4の配列を有する DNA及 び配列番号 5の配列を有する DNA以外の DNAの副生を抑制しつつ、目的とする DNA を増幅されるという観点から、 PCRサイクル条件として、例えば、以下の条件を採用 することが好ましい。尚、 PCRサイクル条件は、配列番号 4の配列を有する DNA及び 配列番号 5の配列を有する DNA以外の DNAの副生を抑制しつつ、目的とする DNAが 増幅できる限りにお 、て、変更することは可能である。
[0031] a前熱変性 (95°C,2分）、
b熱変性 (94°C,15秒）、
cアニーリング（55°C,30秒）、
d鎖伸長 (72°C,30秒)、
eポスト鎖伸長（72°C,30秒）
b〜(！を 25回繰り返す。
但し、 cアニーリングは、 55°C〜65°C、 15秒〜 30秒の範囲で変更することもできる。
[0032] 上記内部標準用 DNA組成物の製造方法は、配列表に示す配列番号 4の配列を有 する DNA及び配列番号 5の配列を有する DNAを含む組成物を一度に合成する方法 である。しかし、各内部標準用 DNAを個別に合成することも可能である。
例えば、配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNAは、 pBR322DNAを铸型と し、上記 DNA増幅用のプライマーセットを用いて PCR反応を行うことで、合成できる。 同様に、配列番号 5の配列を有する DNAも、 pBR322DNAを铸型とし、上記 DNA増 幅用のプライマーセットを用いて PCR反応を行うことで合成できる。 [0033] さらに配列表に示す配列番号 1〜3の配列を有する内部標準用 DNAは、铸型として DNA fd (Ml 3)を用いることで、 PCR反応により合成することができる。合成方法の 詳細は、後述する実施例に示す。いずれにしても、内部標準用 DNAは、铸型 DNA の特定領域を PCR法で増幅することで調製できる。
[0034] 特に、本発明は、配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNAおよび配列番号 3 の配列を有する DNAを含む内部標準 DNA組成物の製造方法を包含する。この製造 方法は、 fd (M13)ファージ DNAを铸型 DNAとし、配列番号 1の配列を有する DNA増 幅用のプライマーセット及び配列番号 3の配列を有する DNA増幅用プライマーセット を用いて PCR反応を行うことを特徴とする。この製造方法によれば、 2種類の内部標 準用 DNAを含む組成物を、 1つの铸型から 1回の PCRによる合成操作で調製するこ とができるという利点がある。
[0035] 铸型 DNAに用いられる fd (M13)ファージ DNAは、 DNAシーケンシングに適したフ ァージベクターとして、当該分野で汎用されている DNAである。 PCR用のプライマー として、配列番号 1の配列を有する DNA増幅用のプライマーセット及び配列番号 3の 配列を有する DNA増幅用のプライマーセットを用いる。配列番号 1の配列を有する D NA増幅用のプライマーセットは、 CTACGTCTCTTCCGATGCTGT (配列番号 6)及 び TTGAATTCTATCGGTTTATCA (配列番号 7)の配列を有する DNAからなることが 好ましい。配列番号 3の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットは、 AAATGCC GATGA (配列番号 10)及び TAATTGTGCGCT (配列番号 11)力 なることが好まし い。
[0036] PCR反応は、常法により行うことができる。但し、配列番号 1の配列を有する DNA及 び配列番号 3の配列を有する DNA以外の DNAの副生を抑制しつつ、目的とする DN Aを増幅させるという観点から、 PCRサイクル条件として、例えば、以下の条件を採用 することが好ましい。尚、 PCRサイクル条件は、配列番号 1の配列を有する DNA及び 配列番号 3の配列を有する DNA以外の DNAの副生を抑制しつつ、目的とする DNAが 増幅できる限りにお 、て、変更することは可能である。
[0037] a前熱変性 (94°C, 5分）、
b熱変性 (94°C, 30秒） cアニーリング（64°C〜65°C, 30秒）
d鎖伸長 (74°C, 30秒）
eポスト鎖伸長 (74°C, 5分）
b〜(！を 30回繰り返す。
実施例
[0038] 以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例 1
内部標準用 DNAの調製方法 (1)
铸型 DNA fd(M13) DNAを用いたレファレンス l (refl)、レファレンス 3 (ref3)、レ ファレンス 4 (ref4)の調製法
[0039] refl (塩 西 R歹 II：西 R列番 1)の 製
プライマー MA1： 5'- CTACGTCTCTTCCGATGCTGT- 3(配列番号 6)とプライマー MA2 : 5'- TTGAATTCTATCGGTTTATCA- 3(配列番号 7)を用い、以下の PCRサイ クル条件により、 DN A塩基長 200bpの ref 1を増幅する。
具体的な実験は以下のように行った。
PCR反応液組成として、 Tris— HC1 10mM、 KC1 50mM、 MgCl 1.5mM、 dNTP 200 μ
2
M、プライマー各 120nM、 fd (M13)ファージ DNA 3.6pM、 Taqポリメラーゼ 0.03U/ μ 1を 調製する。
PCRサイクル条件として、 a前熱変性 (95°C,5分）、 b熱変性 (94°C,30秒）、 cァニーリ ング（50°C,30秒）、 d鎖伸長（72°C,30秒）、 eポスト鎖伸長（72°C,5分）の b〜dを 30回繰 り返す。
[0040] ref 3(塩某配列：配列番号 2)の調製
プライマー Ref3- F： ACCTCCTGTCAATGC (配列番号 8)とプライマー ReB- R (cy3)： TCACCGGAAC (配列番号 9)を用い、以下の PCRサイクル条件により、 DNA塩基長 1351^の £3を増幅する。
具体的な実験は以下のように行った。
PCR反応液組成として、 Tris— HC1 10mM、 KC1 50mM、 MgCl 1.5mM、 dNTP 200 μ
2
M、プライマー各 120nM、 fd (M13)ファージ DNA 3.6pM、 Taqポリメラーゼ 0.03U/ μ 1 を調製する。
PCRサイクル条件として、 a前熱変性 (95°C,5分）、 b熱変性 (94°C,30秒）、 cァニーリ ング (60°C,30秒）、 d鎖伸長（74°C,30秒）、 eポスト鎖伸長（74°C,5分）の b〜dを 30回繰 り返す。
[0041] ref4(塩某配列：配列番号 3)の調製
プライマー Ref4- F： AAATGCCGATGA (配列番号 10)とプライマー Ref4- R： TAATTG TGCGCT (配列番号 11)を用い、以下の PCRサイクル条件により、 DNA塩基長 600b pの ref4を増幅する。
具体的な実験は以下のように行った。
PCR反応液組成として、 Tris— HC1 10mM、 KC1 50mM、 MgCl 1.5mM、 dNTP 200 μ
2
M、プライマー各 120nM、 fd (M13)ファージ DNA 3.6pM、 Taqポリメラーゼ 0.03U/ μ 1を 調製する。
PCRサイクル条件として、 a前熱変性 (95°C,5分）、 b熱変性 (94°C,30秒）、 cァニーリ ング (67.5°C,30秒）、 d鎖伸長（74°C,30秒）、 eポスト鎖伸長（74°C,5分）の b〜(！を 25回 繰り返す。
[0042] 上記方法により合成された 3つの内部標準用 DNAの温度勾配ゲル電気泳動 (TGG E)結果を図 1に示す。尚、 reflの融解開始点は約 60.0°Cであり、 ref3の融解開始点は 約 70.1°Cであり、 ref4の融解開始点は約 58.0°Cである。電気泳動条件は、以下のとお りである。
100V (100mA)
泳動時間 10分
4%ゲノレ、 8M尿素
ΙχΤΒΕバッファー溶液
温度 20〜60°C
[0043] 実施例 2
内部標準用 DNAの調製方法 (2)
铸型 DNA pBR322DNAを用いたレファレンス 5 (ref 5(塩基配列：配列番号 4))、レ ファレンス 6 (ref 6(塩基配列：配列番号 5))の調製法 プライマー Ref5F: AGTGGTCCTGCAACTTTATC (配列番号 12)とプライマー Ref5 R： AACATGGGGGATCATGTAAC (配列番号 13)を用いて DNA塩基長 200bpを、 プライマー ReffiF： GCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTG (配列番号 14) とプライマー ReffiR:TAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTC (配列番号 15 )を用いて 900bpの以下の配列を一括増幅した。
[0044] 具体的な実験は以下のように行った。
PCR反応液組成として、 Tris— HC1 10mM、 KC1 50mM、 MgCl 1.5mM、 dNTP 200 μ
2
M、プライマー各 120nM、 pBR322 DNA 3.6pM、 Taqポリメラーゼ 0.03U/ μ 1を調製す る。
PCRサイクル条件として、 a前熱変性 (95°C,2分）、 b熱変性 (94°C,15秒）、 cァニーリ ング（55°C,30秒）、 d鎖伸長（72°C,30秒）、 eポスト鎖伸長（72°C,30秒）の b〜(！を 25回 繰り返す。
[0045] 上記方法により合成された 2つの内部標準用 DNAの温度勾配ゲル電気泳動 (TGG E)結果を図 2に示す。尚、 ref5の融解開始点は約 52.2°Cであり、 reffiの融解開始点は 約 61.4°Cである。電気泳動条件は、以下のとおりである。
100V
泳動時間 8分
6%(19:1)アクリルアミドゲル、 6.5M尿素
ΙχΤΒΕバッファー溶液
温度 15〜55°C
[0046] 実施例 3
ダブル内部標準試料とシングル内部標準試料の座標補正における安定性の比較テ スト
(テストの目的）
TGGEにおける DNA断片の変性過程は、泳動毎で第一変性 (特徴)点に安定性 あり、第二変性 (特徴)点は不安定であることが経験的にわ力つていた。しかし従来の シングル内部標準試料を用いた座標補正における 2点の特徴点の取り方は、安定な 第一特徴点と不安定な第二特徴点をとつて!、た。そのため泳動毎の座標補正の不 安定性が問題であった。
今回完成したダブル内部標準試料を使用することで、従来型のシングル内部標準 試料に比べ、どの程度安定性が改善されたかを定量的に調べることを目的とした。
[0047] (テスト方法）
テストの方法は、実際に適当なランダム PCR産物を内部標準試料と共に TGGEを 行う。そのときに使用した内部標準試料で規格ィ匕による PaSS計算を行う際、ランダム PCR産物の特徴点の選択はあら力じめ同一の特徴点群を選ぶように決めておく。選 択すべき特徴点群が決まったら、 PaSS計算用ソフトを用いて計算を実行する。同一の ランダム PCR産物で数回 TGGEを行 、、すべての組み合わせで PaSS値のバラツキ度 をみていく。この一連の操作を従来の 1種類のみの内部標準試料と今回開発した 2 種類の内部標準試料につ!、て行 、、 PaSSの平均値と標準偏差で安定性の比較を行
[0048] 同一ランダム PCR産物に対して、ダブル内部標準試料 (ref5、 reffi混合）とシングル 内部標準試料 (refl)それぞれ用いて TGGEを行った。泳動後、解析ソフトを使用し てランダム PCR産物の明瞭な特徴点（一定)を打点し、座標補正をダブル内部標準 試料については ref5、 reffiのそれぞれの第一特徴点を、シングル内部標準試料につ いては reflの第一特徴点と第二特徴点をとり、 PaSS計算を行った。
[0049] TGGEはダブル内部標準試料、シングル内部標準試料それぞれ 4回ずつ（W1〜W 4、 S1〜S4)行い、ダブル内の 6通り（W1/W2, W1/W3, W1/W4, W2/W3, W2/W4, W3/W4)とシングル内の 6通り（S1/S2, S1/S3, S1/S4, S2/S3, S2/S4, S3/S4)の PaSS 計算を行い、 PaSS計算結果力もダブルとシングルの安定度の比較を行った。結果を 表 1及び 2に示す。
[0050] [表 1] (結果）
ダブル内部標準試料
Figure imgf000018_0001
PaSS平均値 0.9898
標準偏差 0.003438
[0051] [表 2] シングル内部標準試料
Figure imgf000018_0002
PaSS平均値 0.9768
標準偏差 0.007727
[0052] (結論）
ダブル内部標準試料とシングル内部標準試料の標準偏差を比較すると、ダブル内 部標準試料はシングル内部標準試料の半分以下の値を示し、泳動毎のデータ処理 におけるバラツキが減少して、データの精度が上昇したことが明らかになった。
[0053] 実施例 4
(テスト方法）
実施例 3と同様にして、同一ランダム PCR産物に対して、ダブル内部標準試料 (ref3 、 ref4混合）とシングル内部標準試料 (relS)それぞれ用いて TGGEを行った。泳動後 、解析ソフトを使用してランダム PCR産物の明瞭な特徴点（一定)を打点し、座標補 正をダブル内部標準試料にっ 、ては refi、 ref4のそれぞれの第一特徴点を対角形に とり、シングル内部標準試料については relSの第一特徴点と第二特徴点を対角形に とった。
[0054] TGGEはダブル内部標準試料、シングル内部標準試料についてそれぞれ 4回ずつ
(W1〜W4、 S1〜S4)行った。ダブル内の 6通り（W1/W2, W1/W3, W1/W4, W2/W3, W2/W4, W3/W4)とシングル内の 6通り（S1/S2, S1/S3, S1/S4, S2/S3, S2/S4, S3/S4 )の相同性 (PaSS)計算を行!、、 PaSS計算結果力 ダブルとシングルの安定度の比較 を PaSSの平均値と標準偏差で行った。つまり同一サンプルを用いて同一操作で繰り 返しているので、理想的には PaSS平均値は 1により近づき、標準偏差はより 0に近づく ことが望ましい。結果を表 3及び 4に示す。
[0055] [表 3]
(結果）
ダブル内部標準試料
Figure imgf000019_0001
PaSS平均値 0.9859
標準偏差 0.005581
[0056] [表 4] シングル内部標準試料
Figure imgf000020_0001
PaSS平均値 0.9404
標準偏差 0.02099
[0057] (結論）
まずダブル内部標準試料とシングル内部標準試料の平均値を比較すると、前実施 例同様ダブルのほうが大きぐ同一サンプルを使用したときの一致度が高い。一方標 準偏差を比較すると、ダブル内部標準試料はシングル内部標準試料の約 1Z4の値 を示し、泳動毎のデータ処理におけるバラツキが減少して、データの精度が上昇した ことが明らかになった。
産業上の利用可能性
[0058] 本発明の方法によれば、遺伝子型により生物の同定が可能であり、例えば、微生物 等の検出が容易に行えるため、医療や食品分野において、広く利用可能である。 図面の簡単な説明
[0059] [図 1]実施例 1において合成された 3つの内部標準用 DNAの温度勾配ゲル電気泳動（ TGGE)結果。
[図 2]実施例 2において合成された 2つの内部標準用 DNAの温度勾配ゲル電気泳動（ TGGE)結果。

Claims

請求の範囲
[1] (1)被検体生物のゲノムを铸型として調製した 2本鎖 DNAを温度勾配ゲル電気泳動（ TGGE)または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE)に付し、
(2)得られた前記 2本鎖 DNAの電気泳動パターンから、前記 2本鎖 DNAの特徴点を 抽出し、
(3)抽出された特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う方法であって、
(4)前記 2本鎖 DNAのゲル電気泳動を、 2種類の内部標準 DNAとともに行い、
(5)前記 2種類の内部標準 DNAの電気泳動パターン力 各内部標準 DNAの融解開 始点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、前記特徴点を規格化し、かつ
(6)規格ィ匕した特徴点に基づ 、て被検体生物の同定を行う
ことを特徴とする前記方法。
[2] (1)前記 2本鎖 DNAの調製は、ランダム PCRにより行われ、 1種又は 2種以上の 2本鎖
DNAが調製される、請求項 1に記載の方法。
[3] ランダム PCR力 熱変性、アニーリング及び鎖伸長を繰り返し行う PCRであって、ァ ニーリングを 25°C〜35°Cで 1〜2分で行い、かつ鎖伸長を 42°C〜47°Cで 1〜2分で 行う請求項 2に記載の方法。
[4] 前記 2本鎖 DNAの特徴点が、各 2本鎖 DNAの融解開始点である請求項 1〜3のい ずれか 1項に記載の方法。
[5] (5)で得られた規格ィ匕した特徴点群カゝら PaSS及び/又はゲノム準距離を求め、得られ た PaSS及び/又はゲノム準距離に基づいて、被検体生物の同定を行う請求項 1〜4 の!、ずれか 1項に記載の方法。
[6] 2種類の内部標準 DNA力 配列表に示す配列番号 1〜5のいずれかの配列を有する
2つの DNAから選ばれる請求項 1〜5のいずれ力 1項に記載の方法。
[7] 2種類の内部標準 DNA力 配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNA及び配列 番号 3の配列を有する DNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号 4の配列を 有する DNA及び配列番号 5の配列を有する DNAの組み合わせである、請求項 1〜5 の!、ずれか 1項に記載の方法。
[8] 生物の同定が、生物の種同定又は類縁性同定である請求項 1〜7のいずれか 1項に 記載の方法。
[9] 被検体生物が微生物である請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の方法。
[10] 配列表に示す配列番号 1〜5のいずれかの配列を有する 2つの DNAを含む、被検体 生物同定方法の内部標準用 DNA組成物。
[11] 配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNA及び配列番号 3の配列を有する DNA の組み合わせ、または配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び配列番号 5 の配列を有する DNAの組み合わせを含む、被検体生物同定方法の内部標準用 DN
A組成物。
[12] 配列表に示す配列番号 4の配列を有する DNA及び配列番号 5の配列を有する DNA を含む内部標準用 DNA組成物の製造方法であって、
PBR322DNAを铸型 DNAとし、配列番号 4の配列を有する DNA増幅用のプライマ 一セット及び配列番号 5の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットを用いて PCR 反応を行うことを特徴とする方法。
[13] 配列番号 4の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットが、配列番号 12及び配列 番号 13の配列を有する DNAからなり、配列番号 5の配列を有する DNA増幅用のプラ イマ一セットが、配列番号 14及び配列番号 15の配列を有する DNAからなる請求項 12 に記載の方法。
[14] PCRサイクル条件として、
a前熱変性 (95°C,2分)、
b熱変性 (94°C,15秒）、
cアニーリング（55°C,30秒）、
d鎖伸長 (72°C,30秒)、
eポスト鎖伸長（72°C,30秒）
を用い、かつ b〜dを 25回繰り返す請求項 12または 13に記載の方法。
[15] 配列表に示す配列番号 1の配列を有する DNAおよび配列番号 3の配列を有する DN Aを含む内部標準 DNA組成物の製造方法であって、 fd (M13)ファージ DNAを铸型 DNAとし、配列番号 1の配列を有する DNA増幅用のプライマーセット及び配列番号 3 の配列を有する DNA増幅用プライマーセットを用いて PCR反応を行うことを特徴とす る方法。
[16] 配列番号 1の配列を有する DNA増幅用のプライマーセットが、配列番号 6及び配列 番号 7の配列を有する DNAからなり、配列番号 3の配列を有する DNA増幅用のプライ マーセットが、配列番号 10及び配列番号 11の配列を有する DNAからなる請求項 15 に記載の方法。
[17] PCRサイクル条件として、
a前熱変性 (94°C, 5分）、
b熱変性 (94°C, 30秒）
cアニーリング（64°C〜65°C, 30秒）
d鎖伸長 (74°C, 30秒）
eポスト鎖伸長 (74°C, 5分）
を用い、かつ b〜dを 30回繰り返す請求項 15または 16に記載の方法。
[18] 請求項 10または 11に記載の内部標準用 DNA組成物を含む、被検体生物同定用キ ッ卜。
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