JP2009531396A - フェルラ酸アルギニン及び微細藻類抽出物を含んでなる美容有効成分及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】プロテアソーム活性を向上させて、それに依存性のタンパク質の除去を促進するニーズに応えること。チオレドキシンの産生を相乗的に刺激するニーズに応えること。実質的に、糖化されたタンパク質の産生を減少させ、その結果として、細胞内へのそれらの蓄積を減少させるニーズに応えること。
【解決手段】微細藻類抽出物及びフェルラ酸アルギニンからなる新規な美容有効成分、プロテアソームを活性化させ、チオレドキシンを産生させるためのその使用、それを含有する化粧用組成物、及び皮膚老化を抑止するためのかかる化粧用組成物の使用
【選択図】なし

Description

本発明は、微細藻類抽出物及びフェルラ酸アルギニンからなる新規な美容有効成分、プロテアソームを活性化させ、チオレドキシンを産生させるためのその使用、それを含有する化粧用組成物、並びに皮膚老化を抑止するためのかかる化粧用組成物の使用に関する。

生物体の様々な生理機能の、亢進的及び不可逆的な減退（老化として公知）は、様々な遺伝要因や、その他の外部環境からの影響などにより複合的に制御されるプロセスである。

老化の徴候は臨床的には、皮膚のしわの出現、皮膚及び皮下組織のたるみ、皮膚の弾力性の消失、皮膚テクスチャのアトニー、及び皮膚の黄変として観察され、それにより皮膚の張りや艶が失われる。

これらの兆候は、特に固有の若しくは生理的な老化（すなわち時間経過による老化）に関連するものであるが、それ以外にも外部要因に関連する老化（すなわち環境要因（様々な形での環境汚染：排出ガス、たばこの煙、工場の臭気、化学物質など）によって生じる老化）である場合もあり、更には、日光、光又は他の何らかの放射線への暴露の結果として生じる光誘発型の老化も挙げられる。

固有の若しくは生理的な老化の結果として生じる皮膚の変化は、内在性の因子が関与する、遺伝的にプログラムされた老衰の結果である。年月の経過により、真皮におけるコラーゲン及びエラスチン繊維の産生が徐々に減少することにより、皮膚は弾力性を失う。それにより、結合組織が徐々に脆弱化し、皮膚の張りがなくなる。表皮が自ら再生する能力も減弱する傾向があり、その代謝の変化に伴い、乾燥が進み、また層厚も薄くなる。老化に関連する内因性の要因の１つとしてホルモン産生の減少が挙げられ、それにより組織、細胞及び器官の機能が次第に弱体化する。成長ホルモン（ＨＧＨ）、テストステロン、ＤＨＥＡ及びメラトニンなどのホルモンは２０歳までは多量に産生され、それにより細胞の再生産が促進される。

対照的に、外部要因による老化は、組織病理学的変化（例えば上皮における弾力性物質の過剰な蓄積及びコラーゲン線維の分解）を生じさせる。

老化機構の１つとして、フリーラジカルの過剰生産が挙げられる。フリーラジカルは様々な細胞構成要素（例えばタンパク質、脂質、糖及びＤＮＡ）を標的にする。フリーラジカルは、結合できる他の分子を常に探しているため、ある特定の外側からの影響力により、そのような反応が活性化される場合が生じる。それにより、コラーゲン線維、細胞膜及び皮膜の脂肪層がアタックを受ける。それにより細胞の遺伝が変化し、それにより新しい皮膚細胞の質が低下する。

生体内では、これらの酸化反応を抑止する酵素システム（抗酸化物質）により、これらのアタックに対する防御がなされる。しかしながら、２０歳を過ぎると固有の防衛機構が次第に弱まり、それにより皮膚は、独力でもはや自らを防御することができなくなる。

損傷を受けたタンパク質の蓄積もまた、細胞老化の１つの特徴である。

すなわち、長年にわたり損傷を受けたタンパク質の蓄積は、これらのタンパク質の除去に関与するタンパク分解システムの効率、及び特にプロテアソームシステムの効率に対する妨害要因となる。これらのシステムは、変質した、特に酸化されたタンパク質の除去のみならず、細胞内タンパク質の連続的な再生産においても関与するため、かかる事態は問題となる。

１９５６年、Ｈａｒｍａｎは、「Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ」において、活性酸素によって生じる様々な細胞構成要素の損傷が、老化現象の重要な要因となることを示している。したがって、細胞老化は、活性酸素の産生、抗酸化物質による防御、及び損傷を受けた細胞構成要素の除去に関与するシステムの効率により大きく左右される。

損傷を受けたタンパク質は、生体内の代謝機構により、修復又は分解される（図１を参照）。

公知の唯一の修復メカニズムは、ジスルフィド架橋を還元できるチオレドキシン（Ｔ）−チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）システム、及びメチオニンスルホキシド（メチオニンの酸化生成物）の還元を可能にするペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼである。

チオレドキシンは、ＵＶＢにより誘発される皮膚の損傷に対する保護作用を発揮する物質として知られている。

標準条件下では、ＴＲは、ＮＡＰＤＨの存在下で酸化型チオレドキシンを還元する。還元型チオレドキシンは、チオレドキシンペルオキシダーゼへの電子供与体として機能し、結果的にはＨ_２Ｏ_２をＨ_２Ｏに還元する。ＴＲは、フリーラジカルによる損傷を防止する強力な抗酸化物質である。

ヒトの皮膚における、細胞膜及び細胞質ゾル中のＴＲの存在が示されている。

ＵＶＡ照射を受けたヒト皮膚線維芽細胞において、チオレドキシンが、当該照射による、ミトコンドリア膜電位の消失、細胞ＡＴＰ含量の減少、及び細胞活性の消失を防止することが示されている（非特許文献１）。

またチオレドキシンが、ＵＶＡによって生じる酸化的ストレス条件下で、ＵＶＡにより誘導されるＤＮＡへの損害を防止することも示されている（非特許文献２）。したがって、チオレドキシンもまた、ゲノムの健全性の維持にとって重要である。

他のタイプの損傷を除去する機構は、プロテアソーム依存性のタンパク質細胞内消化の経路によりなされる。

プロテアソーム系は、触媒的な複合体、２０Ｓプロテアソームと、その活性及びその特異性に影響する幾つかの調節因子により構成される。プロテアソームは、哺乳類の細胞では細胞質ゾル及び核内に存在する。２０Ｓプロテアソームは、αタイプ又はβタイプのいずれかの遺伝子によってコードされる、１４の異なるサブユニットから構成され、７つのサブユニットからなる４つのリングが円筒状に重なることにより形成される。異なるプロテアソームサブユニットが存在し（例えば２０Ｓ、１９Ｓ、２６Ｓ及びＰＡ２８）、細胞代謝の種類に応じてそれ単独で、又は各々の組み合わせにより機能を発揮する。事実、それらはいかなるプロテアソームサブユニット又はプロテアソームであってもよく、その性質は細胞代謝により各々異なる。

このタンパク分解に関与する複合体（プロテアソームとして公知）は、塩基性、疎水性及び酸性残基を有するカルボキシ末端のレベルで優先的にタンパク質を切断する。これらのペプチダーゼ活性は、３つの異なるβサブユニットにより、当該構造の内部に保持されている。

２０Ｓプロテアソームと１９Ｓのレギュレータとの組合せにより、ユビキチン化されたタンパク質分解２６Ｓプロテアソームが形成される。

加齢に伴い傷害を有するタンパク質の蓄積が生じ、その現象により、プロテアソームシステムの効果が次第に減少すると考えられる。

具体的には、一方では培養組織のケラチノサイトと同様に、表皮生検におけるタンパク質のカルボニル含量の年齢に伴う増加が示され、また他方では、カルボニル基を担持しているタンパク質の、炭水化物及び脂質に由来する付加物による修飾が示されている。加齢に伴う酸化型のタンパク質の増加では、プロテアソーム量の減少による、プロテアソーム活性の減少を伴うことが報告されている（非特許文献３）。

最近の２つの研究（１つは有糸分裂後のラットの骨格筋細胞の加齢、及びもう１つはヒト線維芽細胞における当該加齢を解析。６０００遺伝子の発現をマイクロアレイにより解析している。）では、細胞の加齢の間に、遺伝子発現が１％以上低下するものに関して解析しており、例えばプロテアソームシステム遺伝子はその発現減少の一例である（非特許文献４及び５）。

初老のヒトのドナーの細胞を解析した結果、３つのプロテアソームサブユニット（Ｘ、Ｎ３及びＣ２）の転写レベルの減少が示されたが、４人の百歳以上のヒトの培養細胞では、若いドナーのそれと同等のレベルの発現レベル及びプロテアソーム活性レベルが保持されていた（非特許文献６）。

これらの結果は全て、加齢によりプロテアソーム活性が減少することを明らかに示している。

他のカテゴリの「修飾」タンパク質もまた、加齢の機構に関与している。すなわち、「糖化（グリケーション）」されたタンパク質と言われるものである。グリケーションは、メイラード反応による、「アミノ」タイプの基による還元糖の縮合反応により行われるタンパク質の翻訳後修飾である。得られる生成物は一般に最終糖化産物（ＡＧＥｓ）と呼ばれる。２つの主要な糖化産物（カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）及びベントシジン）は、加齢の間に蓄積し、また病理状態（例えば糖尿病）においてはそれが促進される。

糖化産物は、毒性を有することが公知である。それらの悪影響としては、例えば酵素活性の修飾、タンパク質の架橋及び凝集物の形成、内皮−基底膜インターフェイスの修飾、タンパク質分解に対する感受性の低下、分子シグナル及びエンドサイトーシスの認識不能、並びに免疫原性の修飾などが挙げられる。

タンパク質の糖化により酸化に対する感受性が増加し、糖化タンパク質は酸素と反応して、酸化されたフリーラジカルとなる（その有害性は上記した通りである）。

これらの糖化タンパク質は分解若しくは細胞から放出されることがないため、蓄積し、プロテアソームによる分解に対する抵抗性を示すようになる。糖化は生物体全体にわたって行われ、細胞及び組織の病巣を引き起こすことによって、また組織の加齢を加速することによって、特に特定の疾患の発症に重要な役割を果たす。

したがって、タンパク質の糖化及び細胞系におけるそれらの蓄積を回避するための有効成分の開発に対するニーズが存在する。

一般的には、特にプロテアソーム活性を増加させることによって、また糖化タンパク質の量を減少させることによって、皮膚の老化の遅延を可能とする、局所適用用の調製物を提供することが特に大きな関心事である。

特許文献１では、プロテアソーム活性を活性化するための化粧料としての、藻類ファエオダクティラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（微細藻類）の抽出液の使用、並びに、紫外線への暴露による悪影響から皮膚を防止するための、又は皮膚の加齢を防止及び／若しくは遅延させるための化粧用組成物の製造へのその使用に関して記載している。

特許文献２は、クロレラ、センデスムス及びスピルリナなどの藻類（ＡＲＬ）のハイドログリコール抽出物、及び未加工コーヒー抽出物を含んでなる抗フリーラジカル及び抗炎症効果を有する化粧用組成物に関して記載している。
仏国特許出願公開第２８２２７０１号 欧州特許出願公開第０６２９３９７Ａ１号 Ｄｉｄｉｅｒら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．５，ｐ５８５−５９８，２００１ Ｄｉｄｉｅｒら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．５，ｐ５３７−５４６，２００１ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ２０００、５５Ａ：Ｂ２２０−７ Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９、２８５：１３９０−３ Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００、２８７：２４８６−９２ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｉａｎｎｉら、Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ ２０００、３５．７２１−８

上記を踏まえ、出願人は化合物を組合せることにより新規な有効成分を開発し、それを用いることにより３種類の効果を発揮させることができることを見出した。

第１の目的は、プロテアソーム活性を向上させて、それに依存性のタンパク質の除去を促進するニーズに応えることである。第２の目的は、チオレドキシンの産生を相乗的に刺激するニーズに応えることである。最後に第３の目的は、実質的に、糖化されたタンパク質の産生を減少させ、その結果として、細胞内へのそれらの蓄積を減少させるニーズに応えることである。

出願人は驚くべきことに、タンパク質の糖化を回避する間、微細藻類の抽出物及びフェルラ酸アルギニンを含んでなる新規な美容有効成分が、プロテアソーム及びチオレドキシンの産生を活性化させることを見出し、本発明を完成させるに至った。

この有効成分を含有する新規な局所適用用の化粧用組成物もまた本発明の一部を構成し、皮膚の老化遅延に使用できる。

本発明の主要な目的は、微細藻類の抽出物及びフェルラ酸アルギニンを含んでなる美容有効成分の提供である。

「微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａ）」という用語は、未分化の、単細胞若しくは多細胞の、顕微鏡により観察しうる藻類のことを意味し、分化段階の「大型藻類（ｍａｃｒｏａｌｇａ）」とは反対の意味を有する。

「微細藻類抽出物」とは、微細藻類に由来する、本発明の美容有効成分として使用できるあらゆる細胞抽出物のことを意味する。例えば、かかる抽出物は細胞内、膜又は脂質抽出物であってもよい。

微細藻類は、微量元素（例えばマンガン、銅、ケイ素、ホウ素、硫黄、タンパク質加水分解物）を含有し、ｐＨが７〜８の間であり、その増殖にとり好適な温度（通常２５〜３０℃）の標準培地で培養することができる。増殖が最高に達したとき、すなわち培養液中で細胞数がもはや増加しなくなったとき、培養液を回復し、遠心分離する。適当な場合、この遠心分離後の培養物を更に溶媒１Ｌあたり１〜５ｍｌの過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を添加するか、又はＵＶと空気との反応によって、オゾン発生器から発生させたオゾンを用いて酸化的ストレスを付加する。このように得られたバイオマスを再度遠心分離し、ペレットを回収する。

フェルラ酸アルギニンは、アルギニンに由来する合成分子である。その調製方法を下記の実施例１において詳述する。

発明者らは驚くべきことに、化合物のかかる組合せによって、プロテアソーム活性を向上させることが可能となることを見出し、それにより、プロテアソーム依存性のタンパク質除去を促進し、一方で、チオレドキシンの産生を相乗的に刺激することが可能となった。このような改良により、微細藻類の抽出物単独の場合よりも顕著な効果が奏される。

更に、本発明の美容有効成分は、実質的に糖化されたタンパク質の産生、及びその結果として細胞中でのそれらの蓄積を減少させることを可能にする。糖化されたタンパク質の減少は更にプロテアソーム活性の改善効果をもたらし、損傷を受けたタンパク質がより顕著に除去されることとなる。

発明者らは、細胞を０．００５％〜０．０２％のフェルラ酸アルギニンで処理することにより、糖化されたタンパク質を５０％減少させることが可能であることを見出した。これは、細胞の糖化されたタンパク質形成の５０％阻害に必要となる量を示すものである。

実際、藻類の抽出物とフェルラ酸アルギニンを組み合わせることにより、当該有効成分は、皮膚と接触したときに、皮膚の酵素系の作用によりアルギニンとフェルラ酸に分解されるため、顕著な効果が生ずると考えられる。

Ｌ−アルギニン（塩基性アミノ酸）はタンパク質の糖化を防止することによって、皮膚細胞を再生させる効果を発揮するが、但しそれは不安定である欠点が存在し、例えば空気中で酸素と接触することにより分解し、細胞毒性を有する生成物に変化する。しかしながらフェルラ酸は、紫外線を吸収できる抗酸化剤である。ゆえに発明者らは、フェルラ酸アルギニン錯体（又はフェルラ酸／アルギニン錯体）が、形成されるアルギニンの安定性を増加させ、それによりこのアルギニンの活性を改善することを見出した。ゆえにかかるフェルラ酸アルギニン錯体は、特に直接皮膚に塗布したときに、組織中のアルギニンの生物学的利用能の増強をもたらす。

本発明の有効成分によるプロテアソーム活性の改良は、微細藻類の抽出物の単独使用により得られるそれと比較し、ヒト又は動物由来の皮細胞（例えばケラチノサイト、線維芽細胞又はメラノサイトなどの細胞）に存在する加水分解されていない酸化型のタンパク質レベルの減少として観察される。この減少レベルは、典型的には１０〜２５％の範囲である。

更に、微細藻類の抽出物の単独使用の場合と比較し、微細藻類の抽出物とフェルラ酸アルギニンとの組み合わせ（好ましくはフィトアレキシン（下記参照）リッチな条件）により、細胞内のチオレドキシンの産生量が増加する。

すなわち、例としては、フェルラ酸アルギニンの含有量は、生成物に対して０．００５％〜０．１重量％、好ましくは０．００５％〜０．０５％、特に好ましくは０．００５％〜０．０２％であり、一方微細藻類の抽出物の含有量は、０．９９５％〜０．９０％、好ましくは０．９９５％〜０．９５％、特に好ましくは０．９９５％〜０．９８％である。それを用いることにより、微細藻類の抽出物を単独で、上述した値（重量％）で含有する同一の生成物と比較し、チオレドキシンの産生レベルを約４〜２０％、好ましくは４〜１０％、特に好ましくは４〜８％増加させることが可能となる。これはすなわち本発明により得られる顕著な効果といえる。例えば、「生成物」とは、以下に定義するような化粧用組成物のことを意味する。

本発明の具体的実施形態では、本発明の有効成分である微細藻類の抽出物はフィトアレキシンがリッチな抽出物であり、例えば、上記のようなストレス条件（好ましくはＨ_２Ｏ_２又はオゾンによる酸化的ストレス条件）に微細藻類を暴露することにより設定できる。

フィトアレキシンは植物により、特に微細藻類により合成されるいわゆる「防御」物質であり、それらがストレス状態下、好ましくは酸化的ストレス状態下に置かれたときに合成される。これらのフィトアレキシンには、抗菌性物質、酵素、フェノール類など、様々な性質の物質が存在する。本発明の場合は、酵素システム（例えばフェレドキシン−ＮＡＤＰ^＋オキシドレダクターゼ（ＦＮＲ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びグルタチオンペルオキシダーゼ）が包含される。

本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る有効成分である微細藻類の抽出物は、緑藻類に属する微細藻類から調製する。これらの緑藻類は葉緑素含有量が高く、湖及び池において増殖する。特に好ましい方法では、淡水藻であるセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、及びテトラシスティス属の微細藻類を使用する。

本発明に係る有効成分は、フェルラ酸アルギニン：微細藻類抽出物の比率が、重量ベースで、１：１〜１：１９９、好ましくは１：１９〜１：９９、より好ましくは１：３０〜１：５０、特に好ましくは１：１９である。

本発明の別の目的は、ヒト又は動物由来の皮細胞（例えばケラチノサイト、線維芽細胞又はメラノサイトなどのタイプの細胞）のプロテアソームを活性化させるための、本発明に係る有効成分のｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏでの使用方法の提供に関する。このような活性化は、本発明にかかる有効成分の存在による、酸化型タンパク質の分解の増強として反映される。

本発明の更なる目的は、チオレドキシンの産生を刺激するための、本発明に係る有効成分のｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏでの使用方法の提供に関する。

本発明の別の目的は、局所適用用の化粧用組成物の調製への、本発明に係る有効成分の使用方法の提供に関する。

好適な態様では、当該有効成分は、化粧用組成物の総重量に対して、０．１重量％〜２重量％、好ましくは０．５重量％〜２重量％、特に好ましくは１重量％〜２重量％で含まれる。

例えば、局在適用用のかかる化粧用組成物は、ローションタイプの溶液又は分散液、水中油（Ｏ／Ｗ）又は油中水（Ｗ／Ｏ）エマルジョン、クリーム及びゲルの形態である。より詳しくは、顔、身体及び手に使用するプロテクション用の組成物若しくはローション、クリーム、日焼け止めクリーム、クレンジング用乳液、リンクルケア用クリーム及び入浴剤などであってもよい。好適には、これらの組成物は全て、本発明の有効成分とは別に、皮膚への適用用の化粧用組成物において使用される標準的な有効成分、及び従来公知の医薬用添加剤などを含有してもよい。例えばリノール酸トコフェロール、緩和剤、香料、保存料、着色料、乳化剤、粘着防止剤、及び適切な場合にはサンフィルターを含有してもよい。

本発明の更なる目的は、生理的に許容できる溶媒中に本発明の有効成分を含有する、局所適用用の化粧用組成物、並びに、かかる組成物の使用方法の提供に関する。この化粧用組成物は、例えばクリーム、ローション、ゲル及びマスク、又は上記した他の形態の、皮膚老化を抑止するための組成物でありうる。

例示的な化粧用組成物は、１％の本発明の美容有効成分、２％のグリセリン、０．８０％のカルボマー、２．００％のソルビタンステアレート、２．００％のポリソルベート６０、８．００％のオクチルドデカノール、０．８０％のＴｒｉｓａｍｉｎｏ（登録商標）と、残りの脱塩水から構成される。上記のパーセンテージは、組成物の総重量に対する重量として表示している。

以下の実施例において、本発明の非限定的な態様を例示する。

実施例１：フェルラ酸アルギニンの調製方法
アルギニン（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ_２）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＯＯＨ）と、フェルラ酸（３−メトキシ４−ヒドロキシケイ皮酸）を混合し、フェルラ酸アルギニンを調製した。

２つの粉体を、粉体用のミキサー（Ｌｏｅｄｉｇｅ社製）を用い、２０回転／分で、約４８時間にわたり混合した。

実施例２：セル培養組織
ヒト皮膚生検を用いて、細胞膜を酵素的に消化してケラチノサイトの初代培養液を得、更にＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）を補充したＫＧＭ培地（完全培地、血清なし、０．０５ｍＭの最終カルシウム濃度）中に、細胞内媒体を保存した。

異なる時間経過（Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６及びＰ８）後に、細胞をＵＶＢ照射し、老化細胞に対する本発明の有効成分の効果を解析した。本発明における用語「時間経過」とは、細胞培養の分野における標準的な意味を有する。時間経過Ｐ１とは、初代培養細胞がコンフルエンスとなるのに必要な時間のことを指す。この後、培地Ｐ１のサブカルチャーを実施し、上記の培地中で、コンフルエンスとなるまでの時間経過をＰ２とし、更に同様の操作を繰り返してＰ４、Ｐ６及びＰ８として定義することができる。

上記の試験は、最適プロテアソーム活性としての対照としての、１５歳のドナー由来のケラチノサイト、及び１５歳のドナーよりプロテアソームシステムの機能が低い６２歳のドナー由来のケラチノサイトを用いて実施した。１５歳のドナーの細胞を照射してプロテアソームのキャパシティを測定し、更にそれを６２歳のドナーのそれと比較した。実際、ＵＶＢ照射により、プロテアソームシステムの機能は低下した。

これらのケラチノサイトを、上記のＥＧＦで補充したＫＧＭ培地で、有効成分の存在下で培養した。本発明では、上記有効成分を「生成物Ｂ」と称し、それは上記のように、Ｈ_２Ｏ_２又はオゾンによる酸化的ストレスを受けたセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属の微細藻類の抽出物を９９．５％、及びフェルラ酸アルギニンを０．５％含有する。

これらのケラチノサイトは、上述のような酸化的ストレスを受けたＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属の微細藻類の抽出物（生成物Ａ）のみを含有する有効成分の存在下でも培養できる。

また、生成物Ａ又はＢを含まないサンプル（いわゆる「コントロール」サンプル）を用いて同じ実験を行った。

ＥＧＦで補充したＫＧＭ培地中で、３つのケラチノサイトの培養を実施した：
− 標準的な生理的条件：１５歳のドナーの培養細胞、
− 老化細胞における生理的条件：６２歳のドナーの培養細胞、
− 光誘導による老化条件：１００〜１５０ｍＪ／ｃｍ^２培地の率でＵＶＢ照射した、１５歳のドナーの培養細胞。
ＵＶＢ源としてＵＶランプ（Ｂｉｏｓｕｎ社製、Ｖｉｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ−Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。照射波長は約３１５ｎｍである。

実施例３：細胞生存率の測定
実施例２の条件下で得られた細胞を、時間経過Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６及びＰ８で試験した。異なる時間経過におけるデータを取ることにより、それぞれの細胞における時間経過後の、ドナー細胞の加齢、及び培養条件による老化を明瞭に示すことが可能となる。実際、細胞生存率の違いは、表皮から細胞を除去した後の、細胞培養の開始時（「コントロール」サンプル）から観察を行った。この違いは、それぞれの細胞の時間経過後に強調された。

細胞老化の結果は、細胞生存度の測定により得た。当該測定は、ブルーホルマザン（ＭＭＴ）を用いた還元試験による評価により行った。テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）は、細胞のミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼの作用により還元され、ブルーホルマザンの結晶となる性質を有する。この酵素はクレブス回路において重要な役割を果たし、コハク酸からフマル酸への脱水素反応を触媒する。

この酵素は、ミトコンドリアの内部膜に非常に強固に結合する黄色タンパク質であり、その活性はＭＴＴの還元に基づいて測定できる。その際の吸光度（又は光学密度）は、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性に直接関連、すなわちそれ自体細胞生存度に関連するものであり、従来公知の装置（例えばデータ処理計算機システムを備えた分光光度計）を用いて、５９５ｎｍで分光光度測定により測定される。吸光度の数値の増加は、細胞生存度の増加を意味する。

実施例２の３つの培養条件を検討した。

生成物Ａ単独（上記の酸化的ストレスを受けたＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属の微細藻類の純粋な抽出物）による同じ実験を繰り返した。

通常の生理的条件（１５歳のドナー由来の細胞）における結果

老化時の生理的条件（６２歳のドナー由来の細胞）における結果

光誘導による老化条件（１５歳のドナー由来の細胞＋ＵＶＢ １００ｍＪ／ｃｍ ^２ 培養液）における結果

％Ｖ：生存率（％）、
生成物Ａ及びＢの％：１００ｇの培地あたりの、生成物Ａ又はＢの含有量。

試験の結果、異なる時間経過において、６２歳のドナーの場合では、１５歳のドナーの場合よりも急速に細胞生存度が減少することが示された。

更に、１５歳のドナー由来の細胞の、ＵＶＢ照射後における細胞生存度の減少は、６２歳のドナーの減少度と同等であった。

生成物Ｂで処理した細胞の生存度は、老化条件とは無関係に、生成物Ａで処理した細胞のそれより著しく高かった：
− 細胞培養（１５歳のドナー由来）の間に生じる細胞の老化の問題であるか、
− 細胞培養（６２歳のドナー由来）の初期の状態、及びその後の培養時の細胞老化の問題であるか、
− 又は光誘導による細胞老化の問題であると考えられる。

実施例４：それぞれ３つのプロテアソームサブユニット（２０Ｓ、２６Ｓ及びＰＡ２８）の精製
この実施例では、２０Ｓ、２６Ｓ及びＰＡ２８プロテアソームはサブユニットを示す。

実施例２に従い、２つの生理的条件（通常の生理的条件の細胞（１５歳のドナー由来）、及び通常の老齢細胞（６２歳のドナー由来）に対応）下で、上記の培地で培養した細胞を、４℃で１６時間、１００００ｇで遠心分離し、抽出物を得た。

得られたペレットをトリス−ＨＣｌバッファ（２５ｍＭ、ｐＨ７．５）中に分散させ、上記のトリス−ＨＣｌバッファ（２５ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したＣＮＢｒセファロースカラム（精製ヒトプロテアソームのサブユニットと反応するモノクローナル抗体を結合させた）にアプライした。次にカラムを同じバッファで洗浄し、プロテアソームサブユニットを２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８）を含有するトリス−ＨＣｌで溶出し、４℃で１６時間透析した（又はゲル濾過カラム（ＰＤ１０セファデックス）にアプライした）。

次に精製されたプロテアソームサブユニットのサンプルを、変性ローディングバッファ（０．１％ ＳＤＳ）と混合し、１００℃で５分間インキュベートした。溶出液に含まれるタンパク質を、１２％アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。常温で、８０Ｖの定電圧で３０分移動させ、更に１２０Ｖで２時間移動させた。

実施例５：実施例２の３つの培養組織条件下での、３つのプロテアソームサブユニット（２０Ｓ、２６Ｓ、ＰＡ２８）の活性測定によるプロテアソーム活性の測定
プロテアソームのペプチダーゼ活性は、Ｎ末端基がブロックされ、Ｃ末端が蛍光基：７−アミド−４−メチル−クマリン（ＭＣＡ）とイソペプチド結合して形成されている基質を用いて測定した。これらの非蛍光性ラジカルがペプチドに結合しているときにタンパク分解を受けると遊離された状態となり、蛍光を発する。全タンパク量の粗製ホモジネートを５０μｇ含有する、又は精製されたプロテアソームを３μｇ含有する、実施例４にかかるペレットを示す混合物（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中）を、３７℃で３０分間、２００μｌの最終液量において、ペプチド基質とインキュベートした。

酸（例えば塩酸）又はエタノールを３００μｌ添加し、反応を停止させた。２ｍｌの蒸留水を添加した後、ＭＣＡを、３５０／４４０ｍの励起波長及び放出波長で、市販のマイクロプレートリーダーを使用して蛍光測定した。プロテアソーム活性を全活性の差（実験の開始時と基材の添加前との差）として測定し、また残存活性を粗抽出液の活性（すなわち基質と反応させ、洗浄した後）として測定した。

上記の活性を、プロテアソーム（ｎｇ）／分／ｍｇの細胞抽出物中の全タンパク量として表した。

通常の生理的条件（１５歳のドナー由来細胞、時間経過Ｐ２）における結果

老化時の生理的条件（６２歳のドナー由来細胞）における結果

光誘導による浄化条件（１５歳のドナー由来細胞、ＵＶＢ １００ｍＪ／ｃｍ ^２ ）における結果

上記の結果は、生理的及び光誘導による老化条件と比較し、通常の生理的条件下では、３つのプロテアソームサブユニットの活性が高いことを示す。

生成物Ｂによる細胞の処理により、老化条件下で、３つのプロテアソームサブユニット活性が復活した。当該活性の回復により、全体的に、非老化条件でない生理的条件下で測定したレベルに近づいた。

上記の結果を図２、３及び４に示す。図２：１５歳のドナー由来細胞の結果。図３：６２歳のドナー由来細胞の結果。図４：１５歳のドナー由来細胞＋光誘導（ＵＶＢ）による老化の結果。

これらの３つの図は、回収された精製フラクションの関数としての、サンプルの蛍光測定結果を表す。

実施例６：実施例２の３つの培養条件下における、非加水分解酸化型タンパク質の質量分析による、プロテアソーム活性の測定
酸化型のタンパク質の検出は、Ｏｘｙｂｌｏｔ（登録商標）キット（酸化型タンパク質検出キット、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を使用して実施した。ケラチノサイトの細胞内可溶質抽出物（すなわち実施例２に記載の酵素処理の後に得られた細胞抽出物）を、生成物Ｂの存在下で、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンで１５分間処理し、更にウェルあたり１０μｇのタンパク質量を用い、ＳＤＳ−１２％ ＰＡＧＥによるアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。次にゲルをニトロセルロース膜（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｈｙｂｏｎｄ）上へ転移させた。形成されるヒドラゾンを、２，４−［アルファ］ジニトロフェニル基を認識するウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製、Ｒｅｆ Ｄ−９６５６）を用いて免疫的に検出した。ユビキチン結合若しくは付加した４−ヒドロキシ−２−ノネナールにより修飾されたタンパク質を検出するために、２０μｇのタンパク質を１２％のポリアクリルアミドゲルにロードし、ユビキチンを認識するポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットを実施した。抗原抗体複合体の検出は、ペルオキシダーゼコンジュゲートしたウサギ二次抗体を用いて実施した。

同じ実験を、上記の生成物Ａに関しても実施した。

通常の生理的条件（１５歳のドナー由来細胞）における結果

老化時の生理的条件（６２歳のドナー由来細胞）における結果

ｍｍ^２：培地ｍｍ^２

上記の結果は、生成物Ｂが、１５歳のドナー由来細胞及び６２歳のドナー由来細胞において、酸化型タンパク質の量を顕著に減少させることを示す。生成物Ｂを用いて実験を行った場合に、顕著な効果が観察された。これらのタンパク質の量の減少は、生成物Ａを単独で使用した場合と比較し、約１２％〜１５％と推定することができる。

実施例７：チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）活性の測定
実施例２に従い培養した細胞（生成物Ｂで処理、又は無処理（コントロール））に由来する細胞抽出物のＴｒｘＲ活性を、チオレドキシン（Ｔｒｘ）と反応させた後、ＴｒｘＲをビウレット方法で測定し、更に既知の濃度の精製ＴｒｘＲ活性と比較することにより測定した。

各細胞抽出物のタンパク質５０μｇに対応する溶液を、３７℃で２０分間、１２０μＬの最終量において、ＨＥＰＥＳ（８０ｍＭ、ｐＨ７．５）、０．９ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰ、６ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｌのインシュリン及び１０μＭの大腸菌由来Ｔｒｘの混合物と共にインキュベートした。６Ｍ 塩酸グアニジン／０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）中のＤＴＮＢ（ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸）（０．４ｍｇ／ｍｌ）溶液を５００μＬ添加し、反応を停止させた。Ｔｒｘを除き全てを含有するコントロール試料をインキュベートし、各サンプルを同様に処理した。

４１２ｎｍの吸光度を測定し、コントロールの値を、サンプルの対応する吸光度の値から減算した。

定義済みの比活性を有する、子牛胸腺由来の精製ＴｒｘＲを使用して、標準曲線を作成した。

サンプルの吸光度値を標準曲線と比較し、活性を算出した。

同じ実験を、生成物Ａに関しても実施した。

活性を、ＴｒｘＲ（ｎｇ）／細胞抽出物に存在する全タンパク量（ｍｇ）として表した。

通常の生理的条件（１５歳のドナー由来細胞）における結果

アクロレイン（チオレドキシンレダクターゼ阻害剤）の存在下の、通常の生理的条件（ドナー老人１５）における結果

アクロレイン（２５μＭ）：培地中のアクロレインの濃度。

老化時の生理的条件（６２歳のドナー由来細胞）における結果

細胞抽出物中の生成物Ｂの存在により、それを含まないコントロールと比較して、上記の通り、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）の活性を増加させることは注目に値する。更に、ＴｒｘＲの活性は、添加する生成物Ｂの量に比例して増加した。

生成物Ａのみを有する細胞抽出物で処理した場合と比較し、生成物Ｂの活性はより高かった。

光誘導による老化条件（１５歳のドナー由来細胞、ＵＶＢ １００ｍＪ／ｃｍ ^２ 培養組織）における結果

上記と同様の結果が得られた。

実施例８：チオレドキシンレベルの測定
実施例２に従って培養した細胞から得た細胞抽出物中のチオレドキシンレベルを、生成物Ｂ又は生成物Ａ単独による処理、又は未処理（コントロール）に関して、ＥＬＩＳＡで測定した。

９６穴プレートに、炭酸バッファ（ｐＨ９．６）中の抗Ｔｒｘモノクローナル抗体クローン２Ｇ１１溶液（５μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をウェルあたり１００μｌ添加し、４℃で１６時間インキュベートした。プレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）２００μｌで１時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μｌのサンプル、又はスタンダードのＴｒｘ（１ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含有するＰＢＳ−ＴＢで連続希釈）で４℃で２時間にわたりインキュベートした。プレートをアルミニウム箔で覆った。オービタルシェーカーを用い、常温で１時間、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、更にビオチン化ヤギ抗ヒトＴｒｘ ＩｇＧ（ＩＭＣＯ Ｃｏ）（７５ｎｇ／ｍｌ）の１００μｌとインキュベートした。

更にウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、オービタルシェーカーを用い、ＰＢＳ−ＢＳＡ−Ｔ（０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中のストレプトアビジンコンジュゲートしたアルカリホスファターゼ（ＡＸ０２−０４０２Ｘ、１：４０００）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｌでインキュベートした。

プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ジエタノールアミン中のｐ−ニトロフェニルホスファート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ Ｃｏ）（ｐＨ９．０、０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び０．０２％のＮａＮ_３を含有）で４０分間インキュベートした。

４０５ｎｍの吸光度を測定した。

ヒト組換えＴｒｘ（ＩＭＣＯ Ｃｏ）を、１００〜０．４１ｎｇ／ｍｌの範囲のスタンダードとして用いた。

活性レベルを、のＴｒｘ（ｎｇ）／細胞抽出物に存在する全タンパク量（ｍｇ）として表す。

通常の生理的条件（１５歳のドナー由来細胞）における結果

Ｎ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）（チオレドキシン阻害剤）の存在下、通常の生理的条件（１５歳のドナー由来細胞）における結果

老化時の生理的条件（６２歳のドナー由来細胞）における結果

光誘導による老化条件（１５歳のドナー由来細胞、ＵＶＢ １００ｍＪ／ｃｍ ^２ 培養液）における結果

生成物Ｂの存在により、生成物Ａ単独の場合と比較し、チオレドキシンレベルの上昇が観察された。

実施例９：実施例２に従うストレス条件下で培養した細胞において産生されるフィトアレキシンの酵素活性の測定
フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素（ＦＮＲ）の活性は、チトクロームｃの還元に基づく比色法により測定した。

チトクロームｃの還元レベルは酵素活性活性に正比例し、５５０ｎｍの波長で分光光度測定することができる。

ＦＮＲ １単位とは、フェロドキシン及びＮＡＤＰの存在下、２５℃、ｐＨ７．５の条件で、１分あたり１ｍｍｏｌのチトクロームｃを還元する酵素単位を指す。

スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の活性は、キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系によって発生するスーパーオキシドアニオンのフローを阻害する能力に基づき評価する。この反応系において生じるスーパーオキシドラジカルは、５６０ｎｍで、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を安定なブルーホルマザンに還元する。ＳＯＤの１酵素単位とは、ＮＢＴの還元の５０％阻害を誘導できる植物抽出物の量に対応する。

グルタチオンレダクターゼは、還元グルタチオンを再生して、細胞が利用できるグルタチオンを生成させる酵素である。

結果：

損傷を受けたタンパク質の修復又は分解に関与する、生体内の代謝機構を示す。 生成物Ｂによる細胞の処理により、老化条件下で、３つのプロテアソームサブユニット活性が復活した様子を示す（１５歳のドナー由来細胞）。 生成物Ｂによる細胞の処理により、老化条件下で、３つのプロテアソームサブユニット活性が復活した様子を示す（６２歳のドナー由来細胞）。 生成物Ｂによる細胞の処理により、老化条件下で、３つのプロテアソームサブユニット活性が復活した（１５歳のドナー由来細胞＋光誘導（ＵＶＢ）による老化条件）

Claims (11)

1. フェルラ酸アルギニン及び微細藻類抽出物を含有する美容有効成分。
2. 前記美容有効成分中の前記微細藻類抽出物がフィトアレキシンリッチである、請求項１記載の美容有効成分。
3. 前記微細藻類が緑藻類に属する、請求項１又は２記載の美容有効成分。
4. 前記微細藻類がセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属である、請求項３記載の美容有効成分。
5. フェルラ酸アルギニン：微細藻類抽出物の比率が、１：１〜１：１９９、好ましくは１：１９〜１：９９の重量比の範囲である、請求項１から４のいずれか１項記載の美容有効成分。
6. フェルラ酸アルギニン：微細藻類抽出物の比率が、１：９である、請求項５項記載の美容有効成分。
7. 細胞内のプロテアソームを活性化させるための、請求項１から６のいずれか１項記載の美容有効成分の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏでの使用。
8. チオレドキシンの産生を刺激するための、請求項１から６のいずれか１項記載の美容有効成分の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏでの使用。
9. 局所適用用の化粧用組成物の製造への、請求項１から６のいずれか１項記載の美容有効成分の使用。
10. 生理的に許容できる溶媒中に、請求項１から６のいずれか１項記載の有効成分を含有する、局所適用用の化粧用組成物。
11. 皮膚の老化の抑止への、請求項１０記載の化粧用組成物の使用。

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