BRPI0710226B1 - Princípio ativo cosmético composto de ferulato de arginina e de um extrato de microalga e suas utilizações. - Google Patents

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PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO COMPOSTO DE FERULATO DE ARGININA E DE

UM EXTRATO DE MICROALGA E SUAS UTILIZAÇÕES A invenção diz respeito a um princípio ativo cosmético original composto de um extrato de microalgas e de ferulato de arginina, suas utilizações para ativar a tioredoxina, uma composição cosmética contendo esse princípio ativo e a utilização de tal composição cosmética para lutar contra o envelhecimento cutâneo. O declínio progressivo e irreversível das diferentes funções fisiológicas do organismo, que chamados de envelhecimento, é um processo complexo sob o controle de diversos fatores genéticos, mas também ligado às influências do meio exterior.

Clinicamente, os sinais do envelhecimento se traduzem pela aparição de rugas, por um relaxamento dos tecidos cutâneos e subcutâneos, pela perda da elasticidade cutânea, por uma atonia da textura da pele, e pela descoloração da pele que se torna mais opaca e sem brilho.

Alguns desses sinais são mais particularmente ligados ao envelhecimento intrínseco ou fisiológico, isto é, ao envelhecimento ligado à idade, enquanto que outros são mais específicos do envelhecimento extrínseco, isto é, de um envelhecimento provocado de uma maneira geral pelo meio ambiente (poluições diversas: gás proveniente dos escapamentos dos automóveis, fumaças de cigarros, fumaças de fábricas, produtos químicos...); trata-se mais particularmente do foto-envelhecimento devido à exposição ao sol, à luz ou a qualquer outra radiação.

As mudanças da pele que resultam do envelhecimento intrínseco ou fisiológico são a conseqüência de uma senescência geneticamente programada na qual fatores endógenos intervém. Com o passar dos anos, a pele perde sua elasticidade, pois a derme produz cada vez menos fibras de colágeno e de elastina. Por isso, o enfraquecimento progressivo do tecido conjuntivo e o relaxamento da pele. A capacidade de renovação da epiderme também tende a diminuir, torna-se mais seca e fina, uma vez que seu metabolismo é alterado. Um dos fatores endógenos do envelhecimento é a diminuição da produção hormonal que acarreta a diminuição progressiva das funções tissulares, celulares e orgânicas. Hormônios como o hormônio do crescimento (HGH), a testosterona, a DHEA e a melatonina são produzidos em grandes quantidades até os 20 anos de idade e favorecem a renovação celular. O envelhecimento extrínseco, ao contrário, acarreta mudanças histopatológicas tais como a excessiva acumulação de matéria elástica na derme superior e uma degeneração das fibras de colágeno.

Um dos mecanismos do envelhecimento é a superprodução de radicais livres que têm como alvo os diferentes componentes da célula: proteínas, lipídios, açúcares e o DNA. Algumas influências exteriores o levam a entrar em reação, pois eles procuram constantemente outras moléculas com as quais podem se ligar. Assim, atacam as fibras de colágeno, as membranas celulares e a camada gordurosa da pele. Alteram o patrimônio genético das células, de forma que a qualidade das novas células da pele diminui. O corpo se protege contra esses agressores por sistemas enzimáticos que se opõem a essas reações de oxidação (antioxidantes). Mas, a partir dos 20 anos de idade, os mecanismos naturais de defesa enfraquecem-se progressivamente, de maneira que a pele não pode mais se defender sozinha. O acúmulo de proteínas danificadas constitui uma das características do envelhecimento celular. O acúmulo de proteínas danificadas com a idade apresenta o problema da eficácia dos sistemas de proteolíticos encarregados da eliminação dessas proteínas e particularmente a do sistema proteassomal, implicado não somente na eliminação das proteínas alteradas, notadamente oxidadas, mas também na renovação contínua das proteínas intracelulares.

Desde 1956, Harman, em “Free radical theory of aging”, propunha que os danos dos diferentes componentes celulares, provocados pelas espécies reativas do oxigênio, representam um fator importante no processo de envelhecimento. O envelhecimento celular seria assim dependente da produção de espécies reativas do oxigênio, das defesas antioxidantes, e da eficácia dos sistemas responsáveis pela eliminação dos componentes celulares danificados.

As proteínas danificadas podem ser reparadas ou degradadas, segundo a natureza da alteração (cf. Figura 1) Os únicos mecanismos de reparação conhecidos são o sistema tioredoxina (T) - tioredoxina redutase (TR) capaz de reduzir os pontos disulfuros e o peptídeo metionina sulfóxido (produto da oxidação da metionina). Já se verificou anteriormente que a tioredoxina protege contra os danos na pele induzidos pelos UVB.

Em condições normais, a TR reduz a tioredoxina oxidada em presença de NAPDH. A tioredoxina reduzida serve de doador de elétron para a tioredoxina peroxidase que, conseqüentemente, reduz H202 em FI20. A TR é um potente antioxidante contra os danos causados pelos radicais livres. A presença de TR integradas à membrana e no citosol foi demonstrada na pele humana.

Foi mostrado, nos fibroblastos de pele humanos irradiados pelos UVA, que a tioredoxina impede a perda do potencial da membrana da mitocôndria, o esgotamento do conteúdo em ATP celular e a perda da viabilidade celular devido à irradiação (Didier et al. , Free Radical Biology and Medicine, Vol. 31, no 5, p. 585-598,2001).

Também foi mostrado que sob condições de estresse oxidativo provocado pelos UVA, a tioredoxina impede a deterioração do DNA induzido pelos UVA (Didier et al., Free Radical Biology and Medicine, Vol. 30, no 5, p. 537-546, 2001). A tioredoxina é, portanto, igualmente importante para a manutenção da integridade do genoma. A eliminação dos outros tipos de deterioração é efetuada por via de degradação intracelular das proteínas dependentes do proteassoma. O sistema proteassomal é constituído por um complexo catalítico, o proteassoma 20S e por vários componentes reguladores que influem em sua atividade e sua especificidade. O proteassoma é localizado em células de mamíferos ao mesmo tempo no citosol e no núcleo. O proteassoma 20S é composto por 14 subunidades diferentes codificadas pelos genes de tipo α ou de tipo β, e organizados em um empilhamento cilíndrico de 4 anéis de 7 subunidades. Há diferentes subunidades proteassomais (20S, 19S, 26S, e PA28, por exemplo) que funcionam sozinhas ou associadas entre elas segundo o metabolismo celular. De fato, pode-se tratar ora de subunidades de proteassomas, ora de proteassomas enquanto que tais cuja natureza depende do metabolismo celular.

Esse complexo proteolítico, chamado proteassoma, divide preferencialmente as proteínas no nível da extremidade carboxi-terminal dos resíduos básicos, hidrófobos e ácidos. Essas atividades peptidases são levadas por 3 subunidades β diferentes e estão localizadas no interior da estrutura. A associação do regulador 19S ao proteassoma 20S forma o proteassoma 26S que assegura a degradação das proteínas ubiquitiniladas.

Com a idade, constata-se um acumulo de proteínas deterioradas, fenômeno que parece favorecer uma possível baixa de eficiência do sistema proteassomal.

Em particular, foi demonstrado, por um lado, um aumento ligado à idade do conteúdo em carbonilo das proteínas em biópsias de epiderme assim como nos queratinócitos em cultura e, por outro lado, uma modificação por aductos derivados dos carboidratos e dos lipídios das proteínas portadoras de grupos carbonilos. O aumento da quantidade de proteínas oxidadas com a idade era acompanhado de uma diminuição da quantidade de proteassoma (Petropoulos et al., J. Gerontol A Biol Sei 2000; 55A: B220-7).

Dois estudos recentes, um sobre o envelhecimento pós-mitótico de células musculares esqueléticas de ratos e outro sobre fibroblastos humanos, onde a expressão de 6000 genes foi estudada por microarrais, mostraram uma variação da expressão de menos de 1% dos genes no decorrer do envelhecimento celular, entre os quais os genes do sistema proteassomal cuja expressão estava diminuída. (Leeet al., Science 1999; 285: 1390-3 e Ly et al. , Science 2000; 287: 2486-92) Foi também demonstrada uma diminuição da expressão de transcritos para as 3 subunidades analisadas do proteassoma (X, N3, e C2) nas células de doadores idosos, enquanto que células em cultura de quatro centenários conservam um nível de expressão e de atividade do proteassoma próximo daquele dos jovens doadores. (Chondrogianni et al. , EXP Gerontol 2000; 35: 721-8) O conjunto dos resultados indica claramente que existe uma diminuição da atividade do proteassoma com a idade.

Uma outra categoria de proteínas “modificadas” está igualmente implicada no mecanismo de envelhecimento. Trata-se de proteínas ditas “glicadas”. A glicação é uma modificação pós-tradicional das proteínas iniciada pela condensação de açúcares redutores com grupos de tipo “amino” via a reação de Maillard. Os produtos obtidos são comumente designados como sendo produtos terminais de glicação (PTG). Os dois principais produtos de glicação, a carboximetilisina (CML) e a pentosidina, acumulam-se no decorrer do envelhecimento e de maneira acelerada em patologias como a diabetes. A toxicidade dos produtos glicados é conhecida. Pode-se citar a titulo de exemplo seus efeitos nocivos, tais como a alteração de atividades enzimáticas, a reticulação das proteínas e a formação de agregados, a alteração da interface endotélio-membrana de base, a redução da susceptibilidade na proteólise, a falta de reconhecimento dos sinais moleculares e da endocitose, e a modificação da imunogenicidade. A glicação das proteínas favorece sua capacidade de oxidação, as proteínas glicadas podendo reagir com o oxigênio para formar radicais livres oxigenados cujos efeitos nefastos foram indicados anteriormente.

Essas proteínas glicadas não podem ser nem destruídas, nem liberadas da célula na qual elas acumulam-se e se revelam resistentes à degradação pelo proteassoma. A glicação tem conseqüências em todo o organismo e desempenha particularmente um papel importante na gênese de certas doenças provocando lesões celulares, tissulares, e um envelhecimento acelerado dos tecidos.

Consequentemente, é necessário desenvolver princípios ativos para evitar uma glicação das proteínas e sua acumulação no sistema celular.

De um modo geral, é particularmente interessante ter acessos a preparação de usos tópicos que permitiríam retardar o envelhecimento cutâneo, particularmente pela melhora de atividade do proteassoma e por redução do número de proteínas glicadas. A solicitação de patente FR 2 822 701 descreve a utilização de um extrato de alga Phaeodactylum (microalga), como agente cosmético que favorece a atividade do proteassoma, para a fabricação de uma composição cosmética que protege a pele contra os efeitos nefastos de uma exposição aos UV ou para prevenir e/ou retardar os efeitos de envelhecimento cutâneo. A solicitação de patente EP 0 629 397 A1 descreve uma composição cosmética anti-radicais livres e antiinflamatório que compreende um extrato hidroglicólico de algas Chlorella, Scenedesmus, e Spirulina (ARL) e um extrato de café verde.

Considerando o que foi relatado, o requerente desenvolveu um princípio ativo resultante de uma combinação sinérgica de composto que respondem a um triplo objetivo. O primeiro objetivo responde à necessidade de melhorar a atividade do proteassoma a fim de favorecer a eliminação de proteínas dependentes dele. O segundo tem objetivo de estimular de maneira sinérgica a produção de tioredoxina. Finalmente, o terceiro objetivo responde à necessidade de reduzir sensivelmente a produção de proteínas glicadas e, consequentemente, seu acumulo nas células. A requerente descobriu de maneira surpreendente um novo princípio ativo cosmético composto de ferulato de arginina e de um extrato de microalga, que ativa o proteassoma e a produção de tioredoxina, evitando a glicação das proteínas.

Novas preparações cosméticas de uso tópico compreendendo este princípio ativo também fazem parte da invenção e podem ser utilizadas para reduzir o envelhecimento cutâneo.

Objeto principal da presente invenção é um princípio ativo cosmético composto de ferulato de arginina e de um extrato de microalga.

Entende-se por “microalga” uma alga microscópica unicelular ou pluricelular indiferenciada, em oposição a uma “macroalga" cujo ciclo de vida comporta estados diferenciados.

Por “extrato de microalga”, entende-se qualquer extrato celular proveniente de uma microalga e suscetível de ser utilizado no principio ativo cosmético da invenção. Um tal extrato pode ser, por exemplo, um extrato intracelular, membranar ou lipídico. A cepa de microalga é colocada em cultura em um meio de cultura clássica contendo oligoelementos, assim como, por exemplo, o manganês, o cobre, o silício, o boro, o enxofre, proteínas hidrolizadas, tudo com um pH que se situa entre 7 e 8 e a uma temperatura que favorece seu crescimento, habitualmente compreendido entre 25 e 30°C. Quando o crescimento chega ao ideal, isto é, quando um número de células não vai mais crescer no meio de cultura, o meio de cultura é recuperado e centrifugado. Havendo necessidade, faz-se em seguida essa cultura centrifugada sofrer um estresse oxidativo acrescentando-se 1 a 5 ml de água oxigenada por litro de meio (H202) ou pelo ozônio, que é gerado com a ajuda de um gerador de ozônio pela reação do ar com os raios UV. A biomassa assim obtida é em seguida centrifugada novamente e a borra é recuperada. O ferulato de arginina é uma molécula de síntese derivada da arginina. Seu procedimento de fabricação está detalhado no Exemplo 1. A requerente descobriu de maneira surpreendente que é possível, por uma tal combinação de compostos, melhorar a atividade do proteassoma a fim de favorecer a eliminação de proteínas que dependem dele, estimulando de maneira sinergética a produção de tioredoxina. Essa melhora é superior se comparada com o uso apenas do extrato de microalga.

Além disso, o principio ativo cosmético da invenção permite reduzir sensivelmente a produção de proteínas glicadas e, conseqüentemente seu acumulo nas células. Por outro lado, a diminuição das proteínas glicadas acarreta também uma melhora da atividade do proteassoma levando a uma eliminação significativamente mais elevada das proteínas deterioradas. A requerente observou que é possível obter uma diminuição de 50% das proteínas glicadas pelo tratamento de células com 0,005%-0,02% de ferulato de arginina. Esse teor representa o necessário para inibir 50% da formação de proteínas glicadas nas células.

De fato, aparentemente o principio ativo apresenta particularmente a vantagem de associar o extrato de alga e o ferulato de arginina que, quando em contato com a pele, dissocia-se em arginina e em ácido ferúlico graças a sistemas enzimáticos da pele. A L-arginina, ácido aminado básico, tem um efeito regenerador sobre as células da pele evitando a glicação das proteínas, mas apresenta, contudo, o inconveniente de ser instável ao contato com o oxigênio do ar, por exemplo, e ela se degrada em produtos citotóxicos. O ácido ferúlico é, por sua vez, um agente antioxidante capaz de absorver os raios UV. A requerente mostrou, portanto, que o complexo ferulato de arginina (ou complexo ácido ferúlico/arginina) aumenta a estabilidade da arginina formada e melhora, por isso, a atividade dessa arginina. Um tal complexo ferulato de arginina conduz particularmente a uma biodisponibilidade tissular aumentada da arginina, em particular quando de uma aplicação direta sobre a pele. A melhora da atividade do proteassoma pelo princípio ativo da invenção, em relação àquela obtida somente com o extrato de microalga, é observada pela diminuição da taxa de proteínas oxidadas não hidrolizadas presentes nas células, tais como as células da pele humana ou animal, por exemplo, de tipo queratinócitas, fibroblastas ou melanócitas. Essa diminuição está tipicamente situada dentro de um quadro de valores compreendidos entre 10% e 25% .

Aliás, a presença de ferulato de arginina, associada ao extrato de microalga, preferentemente enriquecido de fitoalexinas (ver abaixo), conduz a uma produção aumentada de tioredoxina nas células, comparado ao uso apenas de microalga. Desta forma, a título de exemplo, o uso de quantidades crescentes de ferulato de arginina compreendidos entre 0,005% e 0,1% , em peso do produto no qual está contido, de preferência entre 0,005% e 0,05%, em particular entre 0,005% e 0,02%, o extrato de microalga estando compreendido entre 0,995% e 0,90%, de preferência entre 0,995% e 0,95%, em particular entre 0,995% e 0,98, permitiu mostrar que um crescimento de cerca de 4-20%, de preferência 4-10%, em particular de 4-8%, da produção de tioredoxina pode ser obtido em relação ao extrato de microalga sozinho contido no mesmo produto segundo os valores precipitados em peso. Isso constitui uma vantagem decisiva da invenção. Por exemplo, entende-se por “produto no qual ele está contido” uma composição cosmética tal como está definida a seguir.

Em um modo de realização particular da invenção, o extrato de microalga do princípio ativo segundo a invenção está enriquecido com fitoalexinas, por exemplo, colocando as microalgas em uma situação de estresse, de preferência uma situação de estresse oxidativo por H202 ou pelo Ozônio, conforme indicado acima.

As fitoalexinas são compostos ditos “de defesa” que são sintetizados pelos vegetais e, particularmente pelas microalgas, quando são colocados em condições de estresse oxidativo. Essas fitoalexinas podem ser de variada natureza: antibiótica, enzimática, fenólica. No presente caso, trata-se de sistemas enzimáticos, tais como, por exemplo, a ferredoxina-NADP+ oxidoredutase (FNR), a superoxida dismutase (SOD) e as glutathion peroxidases.

Em um modo de realização preferido da invenção, o extrato de microalga do princípio ativo segundo a invenção provém de uma microalga da classe das Clorofíceas. Trata-se de algas verdes que se encontram nos lagos e lagoas que contêm um grande teor de clorofila. De forma particularmente preferida, a microalga utilizada pertence ao gênero Scenedesmus que é uma alga de água doce e ao gênero tetracistis. O princípio ativo, segundo a invenção, apresenta de preferência uma relação em peso ferulato de arginina: extrato de microalgas compreendido entre 1:1 e 1:199, de preferência entre 1:19 e 1:99 de maneira muito preferida de 1:30 e 1:50 e, de maneira particularmente preferida, de 1:19.

Um outro objeto da invenção diz respeito à utilização in vitro ou ex-vivo de um princípio ativo segundo a invenção para ativar o proteassoma de células, tais como células da pele humana ou animal, por exemplo, de tipo queratinócitas, fibroblastas ou melanócitas. Essa ativação traduz-se por uma degradação aumentada das proteínas oxidadas em presença do princípio ativo segundo a invenção.

Um objeto suplementar da invenção diz respeito à utilização in vitro ou ex-vivo de um principio ativo, conforme a invenção, para estimular a produção de tioredoxina.

Um outro objeto da presente invenção diz respeito à utilização de um principio ativo, segundo a invenção, para a fabricação de uma composição cosmética de uso tópico.

Com vantagem, o principio ativo está presente em quantidades compreendidas entre 0,1% e 2%, de preferência entre 0,5% e 2%, em particular entre 1% e 2% em peso em relação ao peso total da composição cosmética. A titulo de exemplo, tais composições cosméticas de uso tópico são soluções ou dispersões de tipo loção, emulsões de óleo na água (O/A), ou água no óleo (A/O), cremes e géis. Elas podem ser mais especificamente composições ou loções de proteção do rosto, do corpo e das mãos, cremes de dia, cremes anti-solares, leites removedores, cremes anti-rugas e composições para o banho. Além do principio ativo da invenção, todas essas composições compreendem vantajosamente ingredientes ativos clássicos e excipientes convencionais utilizados nas composições cosméticas destinadas à pele. Pode-se citar a linoleate de tocoferol, os emolientes, os perfumes, os conservadores, as corantes, os agentes emulsificantes, os agentes de textura e, quando for o caso, os filtros solares.

Um objeto suplementar da presente invenção diz respeito a uma composição cosmética de uso tópico que compreende o princípio ativo, segundo a invenção, em um meio fisiologicamente aceitável, essa composição cosmética pode corresponder, por exemplo, a creme, loção, gel e máscara ou a outros citados acima, e o uso de uma tal composição para lutar contra o envelhecimento cutâneo.

Um exemplo de composição cosmética contém 1% de princípio ativo cosmético da invenção, 2% de glicerina, 0,80% de Carbomer, 2,00% de sorbitan estearato, 2,00 de polisorbato 60, 8,00% de octilododecanol, 0,80% de Trisamino® e o resto sendo água desmineralizada. As porcentagens são expressas em peso em relação ao peso total da composição. Os exemplos que seguem ilustram a invenção sem limitar sua abrangência.

Exemplo 1: Procedimento de fabricação do ferulato de arginina O ferulato de arginina é fabricado por mistura de arginina (HN=C (NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2) - COOH) e de ácido ferúlico (=ácido 3-metoxi 4- hidroxicinâmico). Ácido Ferúlico A mistura íntima dos dois pós ocorre em um misturador de pó (Lodige) a 20 rotações/min durante cerca de 48 horas.

Exemplo 2: Cultura celular Primoculturas de queratinócitos são obtidas a partir de uma biópsia de pele humana seguida por uma digestão enzimática das membranas das células para conservar o meio intracelular em um meio de cultura de KGM (meio de cultura completo, sem soro, cuja concentração final em cálcio é de 0,05 mM) suplementado em EGF (“Epidermal Growth Factor”).

As células foram estudadas após diferentes passagens (P2, P4, P6 e P8) e após irradiação com UVB com o objetivo de avaliar a influência do princípio ativo da invenção sobre células senescentes. No âmbito da invenção, o termo “passagem” tem o significado clássico no domínio das culturas celulares. A passagem P1 representa o tempo necessário para que as células de primocultura cheguem à confluência. Após isso, efetua-se uma repicagem do meio de cultura P1 que é colocado em cultura, no meio definido mais acima, o tempo necessário para chegar à fluência que define a passagem P2, e assim por diante, o que permite definir as passagens P4, P6 e P8.

Os testes foram realizados com Queratinócitos de doador com 15 anos de idade, que serve de modelo de referência para uma atividade proteassomal otimizada e com doador de 62 anos, cujo sistema proteassomal funciona de maneira menos eficaz que para o doador de 15 anos. As células do doador de 15 anos foram irradiadas para medir o poder proteassomal e compará-los àquelas do doador de 62 anos. De fato, uma irradiação pelos UVB acarreta uma deterioração do funcionamento do sistema proteassomal Esses queratinócitos são cultivados no meio KGM suplementado em EGF, definido acima, em presença do principio ativo, denominado “produto B” composto de: _ 99,5% de um extrato de microalga do gênero Scenedesmus tendo sofrido um estresse oxidativo com H202 ou pelo ozônio, como indicado mais acima, e _ 0,5% ferulato de arginina.

Esses queratinócitos também são cultivados em presença do principio ativo composto somente pelo produto A que representa um extrato de microalga puro do gênero Scenedesmus tendo sofrido um estresse oxidativo supracitado. As mesmas experiências são efetuadas na ausência de produto A ou B (amostragem que chamamos “testemunho”).

Três culturas de queratinócitos foram realizadas no meio KGM suplementado em EGF: • Condições normais fisiológicas: células em cultura de um doador com 15 anos de idade. o Condições de senescência celular fisiológicas: células em cultura de um doador com 62 anos de idade. o Condições de senescência fotoinduzida: células em cultura de um doador com 15 anos de idade irradiadas com UVB em razão de 100-150 mJ/cm2 de meio de cultura. A fonte dos UVB é obtida graças à lâmpada UV (Biosun, Viber Lourmat-France), o comprimento de onda de irradiação sendo de cerca de 315 nm.

Exemplo 3: Medida da viabilidade celular As células obtidas nas condições do Exemplo 2 são estudadas nas passagens P2, P4, P6 e P8. As diferentes passagens permitem constatar o envelhecimento celular do doador assim como o envelhecimento devido às condições de cultura após as diferentes passagens celulares. De fato, após a coleta de células a partir da epiderme, uma diferença na viabilidade celular é observada assim que é colocada em cultura (amostragem “testemunho”). Essa diferença é acentuada após diferentes passagens celulares.

As conseqüências da senescência celular foram estudadas medindo-se a viabilidade celular que foi avaliada pelo teste de redução do Azul de Formazan (MMT). O sal de tetrazólio (MTT) tem a propriedade de ser reduzido em cristais azuis de formazan pela sucinato desidrogenada mitocondrial das células. Essa enzima, que desempenha um papel importante no ciclo de Krebs, catalisa a desidrogenização de sucinato em fumarato.

Atividade dessa enzima, uma flavoproteína muito ligada à membrana interna mitocondrial, é medida pela redução do MTT. Absorvência (ou densidade ótica) diretamente ligada à atividade dos sucinatos desidrogenases, ela própria ligada à viabilidade celular, é medida por dosagem espectrofotométrica a 595 nm por intermédio de um dispositivo clássico, tal como um espectrofotômetro munido de um sistema informatizado de tratamento de dados. Quanto mais o valor de absorvência for elevado, mais as células são viáveis.

As 3 condições de cultura do Exemplo 2 são estudadas.

As mesmas experiências foram retomadas com apenas o produto A que representa um extrato de microalga puro do gênero Scenedesmus tendo sofrido um estresse oxidativo definido anteriormente.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos de idade) Resultados em condições fisiológicas de senescência (doador com 62 anos de idade) Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador com 15 anos de idade + UVB mJ/cm2 de cultura) % V: % de viabilidade, % em produto A e B: teor em produto A ou B por 100g de meio de cultura Os resultados mostram que no decorrer das diferentes passagens a viabilidade celular diminui de maneira mais rápida no doador de 62 anos que no doador de 15 anos.

Por outro lado, a diminuição da viabilidade celular consecutiva na irradiação pelos UVB de células provenientes de um doador de 15 anos é comparável à diminuição fisiológica no doador de 62 anos. A viabilidade das células tratadas pelo produto B é significativamente mais elevada que aquela das células tratadas pelo produto A, e isso, independentemente das condições de envelhecimento: - Que se trate de um envelhecimento celular que se produz no decorrer da cultura (doador com 15 anos de idade), - Que se trate de um envelhecimento celular dependendo do estado inicial das células e persistindo num decorrer da cultura (doador com 62 anos), - Que se trate de um envelhecimento fotoinduzido.

Exemplo 4: Purificação de três subunidades do proteassoma, respectivamente 20S, 26Se PA28 No quadro desse exemplo, os proteassomas 20S, 26S e PA28 representam subunidades.

Extratos de células cultivadas no meio definido anteriormente segundo o Exemplo 2, nas 2 condições fisiológicas, as quais correspondem a células fisiológicas normais (doador de 15 anos) e a células normais senescentes (doador de 62 anos), são centrifugadas a 10000 g durante 16 horas a 4 °C. Essa borra é dissolvida em um tampão Tris-HCL (25 mM, pH 7,5), depois é colocada em uma coluna CNBr Sepharose (sobre a qual é transplantado um anticorpo monoclonal dirigido contra a subunidade do proteassoma humano a ser purificado) previamente equilibrada com o tampão Tris-HCL (25 mM, pH 7,5). A coluna é em seguida lavada com o mesmo tampão. Depois, a subunidade do proteassoma é eluída pelo Tris-HCL contendo NaCL 2M (pH8) e é dialisada durante 16 horas a 4°C (ou colocada sobre uma coluna de filtração com gel (PD10 Sephadex)).

Uma amostra da subunidade de proteassoma purificado é misturada com o tampão de carga modificada (SDS 0,1%) depois incubado a 100°C durante 5 minutos. As proteínas contidas no eluente são separadas por eletroforese em um gel de acrilamida (SDS-PAGE) a 12%. A migração é efetuada em temperatura ambiente em uma tensão constante de 80V durante 30 minutos, depois 120V durante 2 horas. Exemplo 5: Medida da atividade do proteassoma por medida da atividade das três subunidades do proteassoma (20S, 26S, PA28) nas 3 condições de cultura do Exemplo 2 As atividades peptidásicas do proteassoma foram medidas pela utilização de um substrato formado por peptídeos sintéticos cujas extremidades N-terminais são bloqueadas e cujas extremidades C-terminais são ligadas por uma ligação isopeptídica a um radical fluorescente: a 7-amido-4-metil-cumarina (MCA). Esses radicais não fluorescentes quando são ligados aos peptídeos, tornam-se fluorescentes em estado livre após divagem proteolítica. A mistura, contendo 50 pg de homogenato bruto de proteínas totais, representando a borra do Exemplo 4, ou 3 pg de proteassoma purificado (no Tris-HCL 25 mM, pH 7,5) está incubada a 37°C com o substrato peptídico em um volume final de 200 pl durante 30 minutos. A reação é interrompida ao acrescentar-se 300 pl de um ácido, ácido clorídrico, por exemplo, ou de etanol. Após a adição de 2 ml de água destilada, a fluorescência é medida com a ajuda de um leitor de microplacas disponível no comércio, com comprimento de ondas de excitação e de emissão 350/440 nm para os MCA. As atividades do proteassoma são determinadas como a diferença entre a atividade total, isto é, aquela medida no início da experiência, antes do substrato ser acrescentado, e a atividade restante do extrato bruto, isto é, após o substrato ter reagido e após purificação.

As atividades são expressas em ng de proteassoma/min/mg de proteínas totais presentes no extrato celular.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos de idade, passagem P2) Resultados em condições fisiológicas de senescência (doador de 62 anos) Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador de 15 anos, UVB 100mJ/cm2) Os resultados mostram uma atividade superior das três subunidades do proteassoma nas condições fisiológicas normais em relação às condições de senescência fisiológica e fotoinduzida. O tratamento das células pelo produto B acarreta um restabelecimento da atividade das três subunidades do proteassoma nas condições de senescência. Atividade é restaurada para atingir globalmente o nível daquela que é medida nas condições fisiológicas não senescentes.

Os resultados são dados particularmente nas Figuras 2, 3 e 4, que representam: Figura 2: doador com 15 anos de idade Figura 3: doador com 62 anos de idade Figura 4: doador com 15 anos de idade + condições de senescência fotoinduzida (UVB) As três figuras acima representam a medida de fluorescência de uma amostragem em função das frações de purificação recolhidas.

Exemplo 6: Medida da atividade do proteassoma por dosagem da quantidade de proteínas oxidadas não hidrolizadas nas três condições de cultura do Exemplo 2 A detecção das proteínas oxidadas foi realizada utilizando-se o kit Oxyblot® (Oxidised Protection Detection Kit, Chemicon International). Os extratos citosólicos de queratinócitos, isto é, os extratos intracelulares obtidos após digestão enzimática definidos segundo o exemplo 2, em presença do produto B, são tratados 15 minutos por 2,4 - dinitrofenilidrazina, depois são separados por eletroforese com gel acrilamida à 12% (SDS-PAGE) em razão de 10 pg de proteínas colocadas por vão. Os géis são em seguida transferidos sobre uma membrana de nitrocelulose (Nitrocelulose Hybond). As hidrazonas formadas são imunodetectadas com a ajuda de anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra o radical 2,4-dinitrofenil (Sigma, Ref. D9656). Para detectar as proteínas ubiquitinadas ou modificadas pelo aducto 4-hidroxi-2-noneral, 20 pg de proteínas são colocadas no gel de poliacrilamida 12% e os Western-blots correspondentes são revelados utilizando-se anticorpos policlonais dirigidos contra a ubiquitina. A detecção dos complexos antigenes-anticorpos é efetuada com anticorpos secundários de coelho reunidos com a peroxidase.

As mesmas experiências são conduzidas com o produto A definido anteriormente.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador de 15 anos) Resultados em condições fisiológicas de senescência (doador de 62 anos) Mm2: mm2 de meio de cultura Os resultados mostram que o produto B acarreta uma clara diminuição da quantidade de proteínas oxidadas tanto no caso do doador de 15 anos quanto no caso do doador de 62 anos. O efeito é mais visível no caso em que as experiências são feitas com o produto B. Pode-se estimar em cerca de 12% - 15% a redução da quantidade dessas proteínas em relação com o caso em que somente o produto A é utilizado.

Exemplo 7: Medida da atividade da tioredoxina redutase (TrxR) A atividade da TrxR nos extratos celulares de células cultivadas segundo o exemplo 2, tratadas ou não tratadas (Testemunho) com o produto B, é determinada pela medida da concentração em TrxR pelo método Biuret após reação com a tioredoxina (TrxR) e em comparação com a atividade conhecida de uma TrxR purificada.

Um volume correspondente a 50 pg de proteínas de cada extrato celular é incubado com uma mistura HEPES, 80mM pH 7,5, 0,9 mg/ml de NAPDH, EDTA 6 mM, 2 mg/ml de insulina e 10 μΜ de Trx de E. coli, a 37° C durante 20 minutos em um volume final de 120 pl. A reação é parada com a adição de 500pL de DTNB (ácido ditiobis- nitrobenzóico) (0,4mg/ml) em cloridrato de guanidina 6 M/Tris-CL 0,2 M (pH 8,0) . Uma amostra testemunho contendo tudo exceto a Trx está incubada e tratada da mesma maneira que cada amostra.

Absorvência a 412 nm é medida e o valor do testemunho subtraído do valor da absorvência correspondente da amostra. Uma curva padrão é preparada utilizando TrxR de thymus de novilho purificada, com uma atividade especifica definida.

Os valores de absorvência das amostras são comparados à curva standard e a atividade é deduzida.

As mesmas experiências são feitas com o Produto A.

As atividades são expressas em ng de TrxR/mg de proteínas totais presentes no extrato celular.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos) Activité (ng de TrxR/mg de protéines totales) = Atividade (ng de TrxR/mg de proteínas totais) Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos) em presença de acroleína, um inibidor da tioredoxina redutase Acroleina (25μΜ): Concentração de acroleína no meio de cultura Resultados em condições de senescência fisiológica (doador com 62 anos) Observa-se que a presença do produto B nos extratos celulares tais como definidos mais acima aumenta a atividade da tioredoxina redutase (TrxR) em relação a um testemunho que não a contenha. Por outro lado, atividade da TrxR aumenta proporcionalmente na quantidade de produto B acrescido.

Esta atividade com o produto B é mais significativa do que quando tais extratos celulares são tratados somente com produto A.

Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador de 15 anos de idade, UVB 100 mJ/cm2 de cultura) As mesmas conclusões desenvolvidas mais acima se aplicam aqui.

Exemplo 8: Medida da taxa de tioredoxina A taxa de tioredoxina nos extratos celulares de células cultivadas segundo o Exemplo 2, tratadas ou não tratadas (testemunho) com o produto B ou apenas com o produto A é medido por ELISA. Placas de 96 vãos incubadas com 100pL por vão do anticorpo monoclonal anti-Trx clone 2G11 (5pg/ml; BD Pharmingen) no tampão carbonato, pH 9,6 durante 16 horas a 4°C. As placas são enxaguadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) e bloqueadas com 200 pl de PBS contendo 3% de BSA (PBS-BSA) durante 1 hora. Os vãos são enxaguados 4 vezes com PBS-T e incubados com 100 μΙ de amostra ou de Trx standard diluídos de maneira seriada no PBS-TB contendo DTT (Ditiotreitol) 1 mM, durante 2 horas a 4°C. As placas são cobertas com uma folha de alumínio. Os vãos são enxaguados quatro vezes com PBS-T e em seguida incubados com 10ΟμΙ de IgG biotiniladas de cabra anti-Trx humano (IMCO Co), 75 ng/ml, durante 1 hora a temperatura ambiente sobre uma plataforma agitadora.

Os vão são em seguida enxaguados quatro vezes em PBS-T e incubados com 100 μΙ de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (AX02-0402x; 1 : 4000) (Amersham Biosciences) em PBS-BSA-T (0,1% BSA, 0,05% Tween 20) sobre uma plataforma agitadora.

As placas são lavadas 4 vezes em PBS-T e incubadas com fosfato P-nitrofenílico (Sigma Chem Co) na dietanolamina, pH 9,0, contendo MgCI2 0,5mM, e 0,02% de NaN3 durante 40 minutos. A absorvência é medida a 405 nm. A Trx recombinante humana (IMCO Co) é utilizada como standard no intervalo 100 - 0,41 ng/ml.

As taxas são expressas em ng de Trx/mg de proteínas totais presentes no extrato celular.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador de 15 anos) Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos) em presença de N-acetil - cisteína (NAC), um inibidor da tioredoxina Resultados em condições de senescência fisiológica (doador com 62 anos de idade) Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador com 15 anos de idade, UVB 100mJ/cm2 de cultura) Em presença do produto B, observa-se um aumento da taxa de tiroredoxina mais significativa que aquela obtida somente com o produto A.

Exemplo 9: Medida das atividades enzimáticas das fitoalexinas produzidas pelas células cultivadas nas condições de estresse segundo o Exemplo 2 A atividade da ferredoxina-NADP+ oxiredutase (FNR) é determinada por um método colorimétrico baseado na redução do citocroma c. A redução do citocroma c, medida no espectrofotômetro com um comprimento de onda de 550nm, está diretamente proporcional à atividade da enzima.

Uma unidade de FNR reduz 1 milimole de citocroma c por minuto com pH 7,5, a 25°C em presença de ferrodoxina e de NADPH. A atividade da superoxida dismutase (SOD) é avaliada por sua capacidade de inibir um fluxo de anions superóxidos gerados pelo sistema Xantina-xantina oxidase. Os radicais superóxidos produzidos por esse sistema reduzem o nitroazul de tetrazólio (NTB) em azul de formazan estável a 560nm. Uma unidade enzimática de SOD corresponde à quantidade de extrato vegetal suscetível de induzir uma inibição de 50% da redução do NBT. A glutação redutase regenera a glutação reduzida em glutação que se torna disponível para a célula.

Claims (11)

1. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, caracterizado por ser composto de ferulato de arginina e de um extrato de microalga.

2. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que esse mesmo extrato de microalga do princípio ativo é enriquecido com fitoalexinas.

3. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que essa microalga pertence à classe das Clorofíceas.

4. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que essa microalga pertence ao gênero Scenedesmus.

5. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a relação em peso ferulato de arginina: extrato de microalgas vai de 1:1 a 1:199, de preferência de 1:19 a 1:99.

6. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a relação em peso ferulato de arginina: extrato de microalgas ser de 1:19.

7. UTILIZAÇÃO IN VITRO OU EX-VIVO DE UM PRINCIPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ativar o proteassoma das células.

8. UTILIZAÇÃO IN VITRO OU EX-VIVO DE UM PRINCIPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado por estimular a produção de tioredoxina.

9. UTILIZAÇÃO DE UM PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela fabricação de uma composição cosmética de uso tópico.

10. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA DE USO TÓPICO, compreendendo um principio ativo segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado por um meio fisiologicamente aceitável.

11. UTILIZAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, segundo a reivindicação 10, caracterizado por lutar contra o envelhecimento cutâneo.