BRPI0710226A2

BRPI0710226A2 - princìpio ativo cosmético de ferulato de arginina e de um extrato de microalga e suas utilizações

Info

Publication number: BRPI0710226A2
Application number: BRPI0710226-7A
Authority: BR
Inventors: Nicole Mekideche
Original assignee: Biotechmarine
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2011-08-02
Also published as: US20090130139A1; BRPI0710226B1; JP5081896B2; FR2898808A1; US8017128B2; HK1131333A1; TNSN08381A1; AU2007231265A1; EP2018149A1; FR2898808B1; UA95283C2; ES2366057T3; KR101434839B1; EP2018149B1; KR20090017490A; ZA200808218B; IL194183A0; CN101410089A; CN101410089B; MA30321B1

Abstract

<B>PRINCíPIO ATIVO COSMéTICO COMPOSTO DE FERULATO DE ARGININA E DE UM EXTRATO DE MICROALGA E SUAS UTILIZAçõES<C>. A invenção diz respeito a um princípio ativo cosmético original composto de um extrato de microalgas e de ferulato do argínína, suas utilizações para ativar o proteassoma e a produção de tioredoxina, urna composição cosmética contendo esse princípio ativo e a utilização de tal composição cosmética para lutar contra o envelhecimento cutâneo.

Description

PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO COMPOSTO DE FERULATO DE ARGININA E DEUM EXTRATO DE MICROALGA E SUAS UTILIZAÇÕES

A invenção diz respeito a um princípio ativo cosmético originalcomposto de um extrato de microalgas e de ferulato de arginina, suas utilizaçõespara ativar a tioredoxina, uma composição cosmética contendo esse princípio ativo ea utilização de tal composição cosmética para lutar contra o envelhecimentocutâneo.

O declínio progressivo e irreversível das diferentes funções fisiológicasdo organismo, que chamados de envelhecimento, é um processo complexo sob ocontrole de diversos fatores genéticos, mas também ligado às influências do meioexterior.

Clinicamente, os sinais do envelhecimento se traduzem pela apariçãode rugas, por um relaxamento dos tecidos cutâneos e subcutâneos, pela perda daelasticidade cutânea, por uma atonia da textura da pele, e pela descoloração da peleque se torna mais opaca e sem brilho.

Alguns desses sinais são mais particularmente ligados aoenvelhecimento intrínseco ou fisiológico, isto é, ao envelhecimento ligado à idade,enquanto que outros são mais específicos do envelhecimento extrínseco, isto é, deum envelhecimento provocado de uma maneira geral pelo meio ambiente (poluiçõesdiversas: gás proveniente dos escapamentos dos automóveis, fumaças de cigarros,fumaças de fábricas, produtos químicos...); trata-se mais particularmente do foto-envelhecimento devido à exposição ao sol, à luz ou a qualquer outra radiação.

As mudanças da pele que resultam do envelhecimento intrínseco oufisiológico são a conseqüência de uma senescência geneticamente programada naqual fatores endógenos intervém. Com o passar dos anos, a pele perde suaelasticidade, pois a derme produz cada vez menos fibras de colágeno e de elastina.Por isso, o enfraquecimento progressivo do tecido conjuntivo e o relaxamento dapele. A capacidade de renovação da epiderme também tende a diminuir, torna-semais seca e fina, uma vez que seu metabolismo é alterado. Um dos fatoresendógenos do envelhecimento é a diminuição da produção hormonal que acarreta adiminuição progressiva das funções tissulares, celulares e orgânicas. Hormônioscomo o hormônio do crescimento (HGH), a testosterona, a DHEA e a melatonina sãoproduzidos em grandes quantidades até os 20 anos de idade e favorecem arenovação celular.

O envelhecimento extrínseco, ao contrário, acarreta mudançashistopatológicas tais como a excessiva acumulação de matéria elástica na dermesuperior e uma degeneração das fibras de colágeno.

Um dos mecanismos do envelhecimento é a superprodução de radicaislivres que têm como alvo os diferentes componentes da célula: proteínas, lipídios,açúcares e o DNA. Algumas influências exteriores o levam a entrar em reação, poiseles procuram constantemente outras moléculas com as quais podem se ligar.Assim, atacam as fibras de colágeno, as membranas celulares e a camadagordurosa da pele. Alteram o patrimônio genético das células, de forma que aqualidade das novas células da pele diminui.

O corpo se protege contra esses agressores por sistemas enzimáticosque se opõem a essas reações de oxidação (antioxidantes). Mas, a partir dos 20anos de idade, os mecanismos naturais de defesa enfraquecem-seprogressivamente, de maneira que a pele não pode mais se defender sozinha.

O acúmulo de proteínas danificadas constitui uma das característicasdo envelhecimento celular.O acúmulo de proteínas danificadas com a idade apresenta o problemada eficácia dos sistemas de proteolíticos encarregados da eliminação dessasproteínas e particularmente a do sistema proteassomal, implicado não somente naeliminação das proteínas alteradas, notadamente oxidadas, mas também narenovação contínua das proteínas intracelulares.

Desde 1956, Harman, em "Free radical theory of aging", propunha queos danos dos diferentes componentes celulares, provocados pelas espécies reativasdo oxigênio, representam um fator importante no processo de envelhecimento. Oenvelhecimento celular seria assim dependente da produção de espécies reativas dooxigênio, das defesas antioxidantes, e da eficácia dos sistemas responsáveis pelaeliminação dos componentes celulares danificados.

As proteínas danificadas podem ser reparadas ou degradadas,segundo a natureza da alteração (cf. Figura 1)

Os únicos mecanismos de reparação conhecidos são o sistematioredoxina (T) - tioredoxina redutase (TR) capaz de reduzir os pontos disulfuros e opeptídeo metionina sulfóxido (produto da oxidação da metionina).

Já se verificou anteriormente que a tioredoxina protege contra os danosna pele induzidos pelos UVB.

Em condições normais, a TR reduz a tioredoxina oxidada em presençade NAPDH. A tioredoxina reduzida serve de doador de elétron para a tioredoxinaperoxidase que, conseqüentemente, reduz H202 em H20. A TR é um potenteantioxidante contra os danos causados pelos radicais livres.

A presença de TR integradas à membrana e no citosol foi demonstradana pele humana.

Foi mostrado, nos fibroblastos de pele humanos irradiados pelos UVA,que a tioredoxina impede a perda do potencial da membrana da mitocôndria, oesgotamento do conteúdo em ATP celular e a perda da viabilidade celular devido àirradiação (Didier et al. , Free Radical Biology and Medicine, Vol. 31, no 5, p. 585-598, 2001).

Também foi mostrado que sob condições de estresse oxidativoprovocado pelos UVA, a tioredoxina impede a deterioração do DNA induzido pelosUVA (Didier et al., Free Radical Biology and Medicine, Vol. 30, no 5, p. 537-546,2001). A tioredoxina é, portanto, igualmente importante para a manutenção daintegridade do genoma.

A eliminação dos outros tipos de deterioração é efetuada por via dedegradação intracelular das proteínas dependentes do proteassoma.

O sistema proteassomal é constituído por um complexo catalítico, oproteassoma 20S e por vários componentes reguladores que influem em suaatividade e sua especificidade. O proteassoma é localizado em células de mamíferosao mesmo tempo no citosol e no núcleo. O proteassoma 20S é composto por 14subunidades diferentes codificadas pelos genes de tipo α ou de tipo β, e organizadosem um empilhamento cilíndrico de 4 anéis de 7 subunidades. Há diferentessubunidades proteassomais (20S, 19S, 26S, e PA28, por exemplo) que funcionamsozinhas ou associadas entre elas segundo o metabolismo celular. De fato, pode-setratar ora de subunidades de proteassomas, ora de proteassomas enquanto que taiscuja natureza depende do metabolismo celular.

Esse complexo proteolítico, chamado proteassoma, dividepreferencialmente as proteínas no nível da extremidade carboxi-terminal dosresíduos básicos, hidrófobos e ácidos. Essas atividades peptidases são levadas por3 subunidades β diferentes e estão localizadas no interior da estrutura.A associação do regulador 19S ao proteassoma 20S forma oproteassoma 26S que assegura a degradação das proteínas ubiquitiniladas.

Com a idade, constata-se um acumulo de proteínas deterioradas,fenômeno que parece favorecer uma possível baixa de eficiência do sistemaproteassomal.

Em particular, foi demonstrado, por um lado, um aumento ligado àidade do conteúdo em carbonilo das proteínas em biópsias de epiderme assim comonos queratinócitos em cultura e, por outro lado, uma modificação por aductosderivados dos carboidratos e dos Iipidios das proteínas portadoras de gruposcarbonilos. O aumento da quantidade de proteínas oxidadas com a idade eraacompanhado de uma diminuição da quantidade de proteassoma (Petropoulos et al.,J. Gerontol A Biol Sci 2000; 55A: B220-7).

Dois estudos recentes, um sobre o envelhecimento pós-mitótico decélulas musculares esqueléticas de ratos e outro sobre fibroblastos humanos, onde aexpressão de 6000 genes foi estudada por microarrais, mostraram uma variação daexpressão de menos de 1% dos genes no decorrer do envelhecimento celular, entreos quais os genes do sistema proteassomal cuja expressão estava diminuída. (Leeetal., Science 1999; 285: 1390-3 e Ly et al. , Science 2000; 287: 2486-92)

Foi também demonstrada uma diminuição da expressão de transcritospara as 3 subunidades analisadas do proteassoma (Χ, N3, e C2) nas células dedoadores idosos, enquanto que células em cultura de quatro centenários conservamum nível de expressão e de atividade do proteassoma próximo daquele dos jovensdoadores. (Chondrogianni et al. , EXP Gerontol 2000; 35: 721-8)

O conjunto dos resultados indica claramente que existe uma diminuiçãoda atividade do proteassoma com a idade.Uma outra categoria de proteínas "modificadas" está igualmenteimplicada no mecanismo de envelhecimento. Trata-se de proteínas ditas "glicadas".A glicação é uma modificação pós-tradicional das proteínas iniciada pelacondensação de açúcares redutores com grupos de tipo "amino" via a reação deMaillard. Os produtos obtidos são comumente designados como sendo produtosterminais de glicação (PTG). Os dois principais produtos de glicação, acarboximetilisina (CML) e a pentosidina, acumulam-se no decorrer doenvelhecimento e de maneira acelerada em patologias como a diabetes.

A toxicidade dos produtos glicados é conhecida. Pode-se citar a titulode exemplo seus efeitos nocivos, tais como a alteração de atividades enzimáticas, areticulação das proteínas e a formação de agregados, a alteração da interfaceendotélio-membrana de base, a redução da susceptibilidade na proteólise, a falta dereconhecimento dos sinais moleculares e da endocitose, e a modificação daimunogenicidade.

A glicação das proteínas favorece sua capacidade de oxidação, asproteínas glicadas podendo reagir com o oxigênio para formar radicais livresoxigenados cujos efeitos nefastos foram indicados anteriormente.

Essas proteínas glicadas não podem ser nem destruídas, nemliberadas da célula na qual elas acumulam-se e se revelam resistentes à degradaçãopelo proteassoma. A glicação tem conseqüências em todo o organismo edesempenha particularmente um papel importante na gênese de certas doençasprovocando lesões celulares, tissulares, e um envelhecimento acelerado dos tecidos.

Conseqüentemente, é necessário desenvolver princípios ativos paraevitar uma glicação das proteínas e sua acumulação no sistema celular.

De um modo geral, é particularmente interessante ter acessos apreparação de usos tópicos que permitiriam retardar o envelhecimento cutâneo,particularmente pela melhora de atividade do proteassoma e por redução do númerode proteínas glicadas.

A solicitação de patente FR 2 822 701 descreve a utilização de umextrato de alga Phaeodactylum (microalga), como agente cosmético que favorece aatividade do proteassoma, para a fabricação de uma composição cosmética queprotege a pele contra os efeitos nefastos de uma exposição aos UV ou para prevenire/ou retardar os efeitos de envelhecimento cutâneo.

A solicitação de patente EP 0 629 397 A1 descreve uma composiçãocosmética anti-radicais livres e antiinflamatório que compreende um extratohidroglicólico de algas Chlorella, Scenedesmus, e Spirulina (ARL) e um extrato decafé verde.

Considerando o que foi relatado, o requerente desenvolveu umprincípio ativo resultante de uma combinação sinérgica de composto que respondema um triplo objetivo. O primeiro objetivo responde à necessidade de melhorar aatividade do proteassoma a fim de favorecer a eliminação de proteínas dependentesdele. O segundo tem objetivo de estimular de maneira sinérgica a produção detioredoxina. Finalmente, o terceiro objetivo responde à necessidade de reduzirsensivelmente a produção de proteínas glicadas e, conseqüentemente, seu acumulonas células.

A requerente descobriu de maneira surpreendente um novo princípioativo cosmético composto de ferulato de arginina e de um extrato de microalga, queativa o proteassoma e a produção de tioredoxina, evitando a glicação das proteínas.

Novas preparações cosméticas de uso tópico compreendendo esteprincípio ativo também fazem parte da invenção e podem ser utilizadas para reduziro envelhecimento cutâneo.

Objeto principal da presente invenção é um princípio ativo cosméticocomposto de ferulato de arginina e de um extrato de microalga.

Entende-se por "microalga" uma alga microscópica unicelular oupluricelular indiferenciada, em oposição a uma "macroalga" cujo ciclo de vidacomporta estados diferenciados.

Por "extrato de microalga", entende-se qualquer extrato celularproveniente de uma microalga e suscetível de ser utilizado no principio ativocosmético da invenção. Um tal extrato pode ser, por exemplo, um extratointracelular, membranar ou lipídico.

A cepa de microalga é colocada em cultura em um meio de culturaclássica contendo oligoelementos, assim como, por exemplo, o manganês, o cobre,o silício, o boro, o enxofre, proteínas hidrolizadas, tudo com um pH que se situaentre 7 e 8 e a uma temperatura que favorece seu crescimento, habitualmentecompreendido entre 25 e 30°C. Quando o crescimento chega ao ideal, isto é,quando um número de células não vai mais crescer no meio de cultura, o meio decultura é recuperado e centrifugado. Havendo necessidade, faz-se em seguida essacultura centrifugada sofrer um estresse oxidativo acrescentando-se 1 a 5 ml de águaoxigenada por litro de meio (H202) ou pelo ozônio, que é gerado com a ajuda de umgerador de ozônio pela reação do ar com os raios UV.

A biomassa assim obtida é em seguida centrifugada novamente e aborra é recuperada.

O ferulato de arginina é uma molécula de síntese derivada da arginina.Seu procedimento de fabricação está detalhado no Exemplo 1.

A requerente descobriu de maneira surpreendente que é possível, poruma tal combinação de compostos, melhorar a atividade do proteassoma a fim defavorecer a eliminação de proteínas que dependem dele, estimulando de maneirasinergética a produção de tioredoxina. Essa melhora é superior se comparada com ouso apenas do extrato de microalga.

Além disso, o principio ativo cosmético da invenção permite reduzirsensivelmente a produção de proteínas glicadas e, conseqüentemente seu acumulonas células. Por outro lado, a diminuição das proteínas glicadas acarreta tambémuma melhora da atividade do proteassoma levando a uma eliminaçãosignificativamente mais elevada das proteínas deterioradas.

A requerente observou que é possível obter uma diminuição de 50%das proteínas glicadas pelo tratamento de células com 0,005%-0,02% de ferulato dearginina. Esse teor representa o necessário para inibir 50% da formação deproteínas glicadas nas células.

De fato, aparentemente o principio ativo apresenta particularmente avantagem de associar o extrato de alga e o ferulato de arginina que, quando emcontato com a pele, dissocia-se em arginina e em ácido ferúlico graças a sistemasenzimáticos da pele.

A L-arginina, ácido aminado básico, tem um efeito regenerador sobreas células da pele evitando a glicação das proteínas, mas apresenta, contudo, oinconveniente de ser instável ao contato com o oxigênio do ar, por exemplo, e ela sedegrada em produtos citotóxicos. O ácido ferúlico é, por sua vez, um agenteantioxidante capaz de absorver os raios UV. A requerente mostrou, portanto, que ocomplexo ferulato de arginina (ou complexo ácido ferúlico/arginina) aumenta aestabilidade da arginina formada e melhora, por isso, a atividade dessa arginina. Umtal complexo ferulato de arginina conduz particularmente a uma biodisponibilidadetissular aumentada da arginina, em particular quando de uma aplicação direta sobrea pele.

A melhora da atividade do proteassoma pelo princípio ativo dainvenção, em relação àquela obtida somente com o extrato de microalga, éobservada pela diminuição da taxa de proteínas oxidadas não hidrolizadaspresentes nas células, tais como as células da pele humana ou animal, por exemplo,de tipo queratinócitas, fibroblastas ou melanócitas. Essa diminuição está tipicamentesituada dentro de um quadro de valores compreendidos entre 10% e 25% .

Aliás, a presença de ferulato de arginina, associada ao extrato demicroalga, preferentemente enriquecido de fitoalexinas (ver abaixo), conduz a umaprodução aumentada de tioredoxina nas células, comparado ao uso apenas demicroalga. Desta forma, a título de exemplo, o uso de quantidades crescentes deferulato de arginina compreendidos entre 0,005% e 0,1% , em peso do produto noqual está contido, de preferência entre 0,005% e 0,05%, em particular entre 0,005%e 0,02%, o extrato de microalga estando compreendido entre 0,995% e 0,90%, depreferência entre 0,995% e 0,95%, em particular entre 0,995% e 0,98, permitiumostrar que um crescimento de cerca de 4-20%, de preferência 4-10%, em particularde 4-8%, da produção de tioredoxina pode ser obtido em relação ao extrato demicroalga sozinho contido no mesmo produto segundo os valores precipitados empeso. Isso constitui uma vantagem decisiva da invenção. Por exemplo, entende-sepor "produto no qual ele está contido" uma composição cosmética tal como estádefinida a seguir.

Em um modo de realização particular da invenção, o extrato demicroalga do princípio ativo segundo a invenção está enriquecido com fitoalexinas,por exemplo, colocando as microalgas em uma situação de estresse, de preferênciauma situação de estresse oxidativo por H202 ou pelo Ozônio, conforme indicadoacima.

As fitoalexinas são compostos ditos "de defesa" que são sintetizadospelos vegetais e, particularmente pelas microalgas, quando são colocados emcondições de estresse oxidativo. Essas fitoalexinas podem ser de variada natureza:antibiótica, enzimática, fenólica. No presente caso, trata-se de sistemas enzimáticos,tais como, por exemplo, a ferredoxina-NADP+ oxidoredutase (FNR)1 a superoxidadismutase (SOD) e as glutathion peroxidases.

Em um modo de realização preferido da invenção, o extrato demicroalga do princípio ativo segundo a invenção provém de uma microalga da classedas Clorofíceas. Trata-se de algas verdes que se encontram nos lagos e lagoas quecontêm um grande teor de clorofila. De forma particularmente preferida, a microalgautilizada pertence ao gênero Scenedesmus que é uma alga de água doce e aogênero tetracistis.

O princípio ativo, segundo a invenção, apresenta de preferência umarelação em peso ferulato de arginina: extrato de microalgas compreendido entre 1:1e 1:199, de preferência entre 1:19 e 1:99 de maneira muito preferida de 1:30 e 1:50e, de maneira particularmente preferida, de 1:19.

Um outro objeto da invenção diz respeito à utilização in vitro ou ex-vivode um princípio ativo segundo a invenção para ativar o proteassoma de células, taiscomo células da pele humana ou animal, por exemplo, de tipo queratinócitas,fibroblastas ou melanócitas. Essa ativação traduz-se por uma degradaçãoaumentada das proteínas oxidadas em presença do princípio ativo segundo ainvenção.

Um objeto suplementar da invenção diz respeito à utilização in vitro ouex-vivo de um principio ativo, conforme a invenção, para estimular a produção detioredoxina.

Um outro objeto da presente invenção diz respeito à utilização de umprincipio ativo, segundo a invenção, para a fabricação de uma composiçãocosmética de uso tópico.

Com vantagem, o principio ativo está presente em quantidadescompreendidas entre 0,1% e 2%, de preferência entre 0,5% e 2%, em particularentre 1% e 2% em peso em relação ao peso total da composição cosmética.

A titulo de exemplo, tais composições cosméticas de uso tópico sãosoluções ou dispersões de tipo loção, emulsões de óleo na água (O/A), ou água noóleo (A/O), cremes e géis. Elas podem ser mais especificamente composições ouloções de proteção do rosto, do corpo e das mãos, cremes de dia, cremes anti-solares, leites removedores, cremes anti-rugas e composições para o banho. Alémdo principio ativo da invenção, todas essas composições compreendemvantajosamente ingredientes ativos clássicos e excipientes convencionais utilizadosnas composições cosméticas destinadas à pele. Pode-se citar a Iinoleate detocoferol, os emolientes, os perfumes, os conservadores, as corantes, os agentesemulsificantes, os agentes de textura e, quando for o caso, os filtros solares.

Um objeto suplementar da presente invenção diz respeito a umacomposição cosmética de uso tópico que compreende o princípio ativo, segundo ainvenção, em um meio fisiologícamente aceitável, essa composição cosmética podecorresponder, por exemplo, a creme, loção, gel e máscara ou a outros citadosacima, e o uso de uma tal composição para lutar contra o envelhecimento cutâneo.

Um exemplo de composição cosmética contém 1% de princípio ativocosmético da invenção, 2% de glicerina, 0,80% de Carbomer, 2,00% de sorbitanestearato, 2,00 de polisorbato 60, 8,00% de octilododecanol, 0,80% de Trisamino® eo resto sendo água desmineralizada. As porcentagens são expressas em peso emrelação ao peso total da composição. Os exemplos que seguem ilustram a invençãosem limitar sua abrangência.

Exemplo 1: Procedimento de fabricação do ferulato de argininaO ferulato de arginina é fabricado por mistura de arginina (HN=C (NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2) - COOH) e de ácido ferúlico (=ácido 3-metoxi 4- hidroxicinâmico).

<formula>formula see original document page 14</formula>

A mistura íntima dos dois pós ocorre em um misturador de pó (Lodige)a 20 rotações/min durante cerca de 48 horas.

Exemplo 2: Cultura celular

Primoculturas de queratinócitos são obtidas a partir de uma biópsia depele humana seguida por uma digestão enzimática das membranas das células paraconservar o meio intracelular em um meio de cultura de KGM (meio de culturacompleto, sem soro, cuja concentração final em cálcio é de 0,05 mM) suplementadoem EGF ("Epidermal Growth Factor").

As células foram estudadas após diferentes passagens (P2, P4, P6 eP8) e após irradiação com UVB com o objetivo de avaliar a influência do princípioativo da invenção sobre células senescentes. No âmbito da intenção, o termo"passagem" tem o significado clássico no domínio das culturas celulares. Apassagem P1 representa o tempo necessário para que as células de primoculturacheguem à confluência. Após isso, efetua-se uma repicagem do meio de cultura P1que é colocado em cultura, no meio definido mais acima, o tempo necessário parachegar à fluência que define a passagem P2, e assim por diante, o que permitedefinir as passagens P4, P6 e P8.

Os testes foram realizados com Queratinócitos de doador com 15 anosde idade, que serve de modelo de referência para uma atividade proteassomalotimizada e com doador de 62 anos, cujo sistema proteassomal funciona de maneiramenos eficaz que para o doador de 15 anos. As células do doador de 15 anos foramirradiadas para medir o poder proteassomal e compará-los àquelas do doador de 62anos. De fato, uma irradiação pelos UVB acarreta uma deterioração dofuncionamento do sistema proteassomal

Esses queratinócitos são cultivados no meio KGM suplementado emEGF, definido acima, em presença do principio ativo, denominado "produto B"composto de:

_ 99,5% de um extrato de microalga do gênero Scenedesmus tendo sofrido umestresse oxidativo com H202 ou pelo ozônio, como indicado mais acima, e_ 0,5% ferulato de arginina.

Esses queratinócitos também são cultivados em presença do principioativo composto somente pelo produto A que representa um extrato de microalgapuro do gênero Scenedesmus tendo sofrido um estresse oxidativo supracitado. Asmesmas experiências são efetuadas na ausência de produto A ou B (amostragemque chamamos "testemunho").

Três culturas de queratinócitos foram realizadas no meio KGMsuplementado em EGF:

• Condições normais fisiológicas: células em cultura de um doador com 15 anosde idade.

• Condições de senescência celular fisiológicas: células em cultura de um doadorcom 62 anos de idade.

• Condições de senescência fotoinduzida: células em cultura de um doador com15 anos de idade irradiadas com UVB em razão de 100-150 mJ/cm2 de meio decultura. A fonte dos UVB é obtida graças à lâmpada UV (Biosun, Viber Lourmat-France), o comprimento de onda de irradiação sendo de cerca de 315 nm.

Exemplo 3: Medida da viabilidade celular

As células obtidas nas condições do Exemplo 2 são estudadas naspassagens P2, P4, P6 e P8. As diferentes passagens permitem constatar oenvelhecimento celular do doador assim como o envelhecimento devido àscondições de cultura após as diferentes passagens celulares. De fato, após a coletade células a partir da epiderme, uma diferença na viabilidade celular é observadaassim que é colocada em cultura (amostragem "testemunho"). Essa diferença éacentuada após diferentes passagens celulares.

As conseqüências da senescência celular foram estudadas medindo-sea viabilidade celular que foi avaliada pelo teste de redução do Azul de Formazan(MMT). O sal de tetrazólio (MTT) tem a propriedade de ser reduzido em cristais azuisde formazan pela sucinato desidrogenada mitocondrial das células. Essa enzima,que desempenha um papel importante no ciclo de Krebs, catalisa adesidrogenização de sucinato em fumarato.

Atividade dessa enzima, uma flavoproteína muito ligada à membranainterna mitocondrial, é medida pela redução do MTT. Absorvência (ou densidadeótica) diretamente ligada à atividade dos sucinatos desidrogenases, ela próprialigada à viabilidade celular, é medida por dosagem espectrofotométrica a 595 nm porintermédio de um dispositivo clássico, tal como um espectrofotômetro munido de umsistema informatizado de tratamento de dados. Quanto mais o valor de absorvênciafor elevado, mais as células são viáveis.

As 3 condições de cultura do Exemplo 2 são estudadas.As mesmas experiências foram retomadas com apenas o produto Aque representa um extrato de microalga puro do gênero Scenedesmus tendo sofridoum estresse oxidativo definido anteriormente.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos de idade)

<table>table see original document page 17</column></row><table>

Resultados em condições fisiológicas de senescência (doador com 62 anos de idade)<table>table see original document page 18</column></row><table>

Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador com 15 anos deidade + UVB mJ/cm2 de cultura)

<table>table see original document page 18</column></row><table>

5% V: % de viabilidade,% em produto AeB: teor em produto A ou B por 100g de meio de cultura

Os resultados mostram que no decorrer das diferentes passagens aviabilidade celular diminui de maneira mais rápida no doador de 62 anos que nodoador de 15 anos.

Por outro lado, a diminuição da viabilidade celular consecutiva nairradiação pelos UVB de células provenientes de um doador de 15 anos écomparável à diminuição fisiológica no doador de 62 anos.

A viabilidade das células tratadas pelo produto B é significativamentemais elevada que aquela das células tratadas pelo produto A, e isso,independentemente das condições de envelhecimento:

- Que se trate de um envelhecimento celular que se produz no decorrer da cultura(doador com 15 anos de idade),

- Que se trate de um envelhecimento celular dependendo do estado inicial dascélulas e persistindo num decorrer da cultura (doador com 62 anos),

- Que se trate de um envelhecimento fotoinduzido.

Exemplo 4: Purificação de três subunidades do proteassoma, respectivamente 20S,26S e PA28

No quadro desse exemplo, os proteassomas 20S, 26S e PA28representam subunidades.

Extratos de células cultivadas no meio definido anteriormente segundoo Exemplo 2, nas 2 condições fisiológicas, as quais correspondem a célulasfisiológicas normais (doador de 15 anos) e a células normais senescentes (doadorde 62 anos), são centrifugadas a 10000 g durante 16 horas a 4 °C. Essa borra édissolvida em um tampão Tris-HCL (25 mM, pH 7,5), depois é colocada em umacoluna CNBr Sepharose (sobre a qual é transplantado um anticorpo monoclonaldirigido contra a subunidade do proteassoma humano a ser purificado) previamenteequilibrada com o tampão Tris-HCL (25 mM, pH 7,5). A coluna é em seguida lavadacom o mesmo tampão. Depois, a subunidade do proteassoma é eluída pelo Tris-HCL contendo NaCL 2M (pH8) e é dialisada durante 16 horas a 4°C (ou colocadasobre uma coluna de filtração com gel (PD 10 Sephadex)).

Uma amostra da subunidade de proteassoma purificado é misturadacom o tampão de carga modificada (SDS 0,1%) depois incubado a IOO0C durante 5minutos. As proteínas contidas no eluente são separadas por eletroforese em um gelde acrilamida (SDS-PAGE) a 12%. A migração é efetuada em temperatura ambienteem uma tensão constante de 80V durante 30 minutos, depois 120V durante 2 horas.Exemplo 5: Medida da atividade do proteassoma por medida da atividade das trêssubunidades do proteassoma (20S, 26S, PA28) nas 3 condições de cultura doExemplo 2

As atividades peptidásicas do proteassoma foram medidas pelautilização de um substrato formado por peptídeos sintéticos cujas extremidades N-terminais são bloqueadas e cujas extremidades C-terminais são ligadas por umaligação isopeptídica a um radical fluorescente: a 7-amido-4-metil-cumarina (MCA).Esses radicais não fluorescentes quando são ligados aos peptídeos, tornam-sefluorescentes em estado livre após clivagem proteolítica. A mistura, contendo 50 pgde homogenato bruto de proteínas totais, representando a borra do Exemplo 4, ou 3pg de proteassoma purificado (no Tris-HCL 25 mM, pH 7,5) está incubada a 37°Ccom o substrato peptídico em um volume final de 200 μl durante 30 minutos.

A reação é interrompida ao acrescentar-se 300 μΙ de um ácido, ácidoclorídrico, por exemplo, ou de etanol? Após a adição de 2 ml de água destilada, afluorescência é medida com a ajuda de um leitor de microplacas disponível nocomércio, com comprimento de ondas de excitação e de emissão 350/440 nm paraos MCA. As atividades do proteassoma são determinadas como a diferença entre aatividade total, isto é, aquela medida no início da experiência, antes do substrato seracrescentado, e a atividade restante do extrato bruto, isto é, após o substrato terreagido e após purificação.

As atividades são expressas em ng de proteassoma/min/mg deproteínas totais presentes no extrato celular.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos de idade,passagem P2)

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Resultados em condições fisiológicas de senescência (doador de 62 anos)<table>table see original document page 22</column></row><table>

Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador de 15 anos, UVB100mJ/cm2)

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Os resultados mostram uma atividade superior das três subunidadesdo proteassoma nas condições fisiológicas normais em relação às condições desenescência fisiológica e fotoinduzida.O tratamento das células pelo produto B acarreta um restabelecimentoda atividade das três subunidades do proteassoma nas condições de senescência.Atividade é restaurada para atingir globalmente o nível daquela que é medida nascondições fisiológicas não senescentes.

Os resultados são dados particularmente nas Figuras 2, 3 e 4, que representam:

Figura 2: doador com 15 anos de idade

Figura 3: doador com 62 anos de idade

Figura 4: doador com 15 anos de idade + condições de senescência fotoinduzida(UVB)

As três figuras acima representam a medida de fluorescência de umaamostragem em função das frações de purificação recolhidas.

Exemplo 6: Medida da atividade do proteassoma por dosagem da quantidade deproteínas oxidadas não hidrolizadas nas três condições de cultura do Exemplo 2

A detecção das proteínas oxidadas foi realizada utilizando-se o kitOxyblot® (Oxidised Protection Detection Kit, Chemicon International). Os extratoscitosólicos de queratinócitos, isto é, os extratos intracelulares obtidos após digestãoenzimática definidos segundo o exemplo 2, em presença do produto B1 são tratados15 minutos por 2,4 - dinitrofenilidrazina, depois são separados por eletroforese comgel acrilamida à 12% (SDS-PAGE) em razão de 10 pg de proteínas colocadas porvão. Os géis são em seguida transferidos sobre uma membrana de nitrocelulose(Nitrocelulose Hybond). As hidrazonas formadas são imunodetectadas com a ajudade anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra o radical 2,4-dinitrofenil (Sigma,Ref. D9656). Para detectar as proteínas ubiquitinadas ou modificadas pelo aducto 4-hidroxi-2-noneral, 20 pg de proteínas são colocadas no gel de poliacrilamida 12% eos Western-blots correspondentes são revelados utilizando-se anticorpos policlonaisdirigidos contra a ubiquitina. A detecção dos complexos antigenes-anticorpos éefetuada com anticorpos secundários de coelho reunidos com a peroxidase.

As mesmas experiências são conduzidas com o produto A definidoanteriormente.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador de 15 anos)

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Resultados em condições fisiológicas de senescência (doador de 62 anos)<table>table see original document page 25</column></row><table>

Mm2: mm2 de meio de cultura

Os resultados mostram que o produto B acarreta uma clara diminuiçãoda quantidade de proteínas oxidadas tanto no caso do doador de 15 anos quanto nocaso do doador de 62 anos. O efeito é mais visível no caso em que as experiênciassão feitas com o produto B. Pode-se estimar em cerca de 12% - 15% a redução daquantidade dessas proteínas em relação com o caso em que somente o produto A éutilizado.

Exemplo 7: Medida da atividade da tioredoxina redutase (TrxR)

A atividade da TrxR nos extratos celulares de células cultivadassegundo o exemplo 2, tratadas ou não tratadas (Testemunho) com o produto B, édeterminada pela medida da concentração em TrxR pelo método Biuret após reaçãocom a tioredoxina (TrxR) e em comparação com a atividade conhecida de uma TrxRpurificada.

Um volume correspondente a 50 pg de proteínas de cada extratocelular é incubado com uma mistura HEPES1 80mM pH 7,5, 0,9 mg/ml de NAPDH,EDTA 6 mM, 2 mg/ml de insulina e 10 μΜ de Trx de E. coli, a 37° C durante 20minutos em um volume final de 120 μΙ. A reação é parada com a adição de 500μΙ_ deDTNB (ácido ditiobis- nitrobenzóico) (0,4mg/ml) em cloridrato de guanidina 6 M/Tris-CL 0,2 M (pH 8,0) . Uma amostra testemunho contendo tudo exceto a Trx estáincubada e tratada da mesma maneira que cada amostra.

Absorvência a 412 nm é medida e o valor do testemunho subtraído dovalor da absorvência correspondente da amostra. Uma curva padrão é preparadautilizando TrxR de thymus de novilho purificada, com uma atividade especificadefinida.

Os valores de absorvência das amostras são comparados à curvastandard e a atividade é deduzida.

As mesmas experiências são feitas com o Produto A.

As atividades são expressas em ng de TrxR/mg de proteínas totaispresentes no extrato celular. ^

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos)

Activité (ng de TrxR/mg de protéines totales) = Atividade (ng de TrxR/mg deproteínas totais)<table>table see original document page 27</column></row><table>

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos) em presençade acroleína, um inibidor da tioredoxina redutase

<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>

Acroleina (25μΜ): Concentração de acroleína no meio de cultura

Resultados em condições de senescência fisiológica (doador com 62 anos) <table>table see original document page 28</column></row><table>

Observa-se que a presença do produto B nos extratos celulares taiscomo definidos mais acima aumenta a atividade da tioredoxina redutase (TrxR) emrelação a um testemunho que não a contenha. Por outro lado, atividade da TrxRaumenta proporcionalmente na quantidade de produto B acrescido.Esta atividade com o produto B é mais significativa do que quando taisextratos celulares são tratados somente com produto A.

Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador de 15 anos de idade,UVB 100 mJ/cm2 de cultura)

<table>table see original document page 29</column></row><table>

As mesmas conclusões desenvolvidas mais acima se aplicam aqui.

Exemplo 8: Medida da taxa de tioredoxina

A taxa de tioredoxina nos extratos celulares de células cultivadassegundo o Exemplo 2, tratadas ou não tratadas (testemunho) com o produto B ouapenas com o produto A é medido por ELISA. Placas de 96 vãos incubadas com100μL por vão do anticorpo monoclonal anti-Trx clone 2G11 (5pg/ml; BDPharmingen) no tampão carbonato, pH 9,6 durante 16 horas a 4°C. As placas sãoenxaguadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) e bloqueadas com 200μl de PBS contendo 3% de BSA (PBS-BSA) durante 1 hora. Os vãos sãoenxaguados 4 vezes com PBS-T e incubados com 100 μl de amostra ou de Trxstandard diluídos de maneira seriada no PBS-TB contendo DTT (DitiotreitoI) 1 mM,durante 2 horas a 4°C. As placas são cobertas com uma folha de alumínio. Os vãossão enxaguados quatro vezes com PBS-T e em seguida incubados com 10ΟμΙ deIgG biotiniladas de cabra anti-Trx humano (IMCO Co), 75 ng/ml, durante 1 hora atemperatura ambiente sobre uma plataforma agitadora.

Os vão são em seguida enxaguados quatro vezes em PBS-T eincubados com 100 μΙ de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (AX02-0402x; 1 : 4000) (Amersham Biosciences) em PBS-BSA-T (0,1% BSA, 0,05% Tween20) sobre uma plataforma agitadora.

As placas são lavadas 4 vezes em PBS-T e incubadas com fosfato P-nitrofenílico (Sigma Chem Co) na dietanolamina, pH 9,0, contendo MgCI2 0,5mM, e0,02% de NaN3 durante 40 minutos.A absorvência é medida a 405 nm.

A Trx recombinante humana (IMCO Co) é utilizada como standard nointervalo 100 - 0,41 ng/ml.

As taxas são expressas em ng de Trx/mg de proteínas totais presentesno extrato celular.

Resultados em condições fisiológicas normais (doador de 15 anos)

<table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table>

Resultados em condições fisiológicas normais (doador com 15 anos) em presençade N-acetil - cisteína (NAC), um inibidor da tioredoxina

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Resultados em condições de senescência fisiológica (doador com 62 anos de idade)<table>table see original document page 32</column></row><table>

Resultados em condições de senescência fotoinduzida (doador com 15 anos deidade, UVB 100mJ/cm2 de cultura)

<table>table see original document page 32</column></row><table>Em presença do produto B1 observa-se um aumento da taxa detiroredoxina mais significativa que aquela obtida somente com o produto A.Exemplo 9: Medida das atividades enzimáticas das fitoalexinas produzidas pelascélulas cultivadas nas condições de estresse segundo o Exemplo 2

A atividade da ferredoxina-NADP+ oxiredutase (FNR) é determinadapor um método colorimétrico baseado na redução do citocroma c.A redução do citocroma c, medida no espectrofotômetro com um comprimento deonda de 550nm, está diretamente proporcional à atividade da enzima.

Uma unidade de FNR reduz 1 milimole de citocroma c por minuto compH 7,5, a 25°C em presença de ferrodoxina e de NADPH.

A atividade da superoxida dismutase (SOD) é avaliada por suacapacidade de inibir um fluxo de anions superóxidos gerados pelo sistema Xantina-xantina oxidase. Os radicais superóxidos produzidos por esse sistema reduzem onitroazul de tetrazólio (NTB) em azul de formazan estável a 560nm. Uma unidadeenzimática de SOD corresponde à quantidade de extrato vegetal suscetível deinduzir uma inibição de 50% da redução do NBT.

A glutação redutase regenera a glutação reduzida em glutação que setorna disponível para a célula.

Resultados:

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Claims

1. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, caracterizado por ser composto de ferulatode arginina e de um extrato de microalga.

2. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que esse mesmo extrato de microalga do princípio ativo é enriquecidocom fitoalexinas.

3. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que essa microalga pertence à classe das Clorofíceas.

4. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que essa microalga pertence ao gênero Scenedesmus.

5. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo uma ou várias das reivindicações-1 a 4, caracterizado pelo fato de que a relação em peso ferulato de arginina: extratode microalgas vai de 1:1 a 1:199, de preferência de 1:19 a 1:99.

6. PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a relação em peso ferulato de arginina: extrato de microalgas ser de 1:19.

7. UTILIZAÇÃO IN VITRO OU EX-VIVO DE UM PRINCIPIO ATIVOCOSMÉTICO, segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado porativar o proteassoma das células.

8. UTILIZAÇÃO IN VITRO OU EX-VIVO DE UM PRINCIPIO ATIVOCOSMÉTICO, segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado porestimular a produção de tioredoxina.

9. UTILIZAÇÃO DE UM PRINCÍPIO ATIVO COSMÉTICO, segundo uma ouvárias das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela fabricação de uma composiçãocosmética de uso tópico.

10. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA DE USO TÓPICO, compreendendo umprincipio ativo segundo uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado porum meio fisiologicamente aceitável.

11. UTILIZAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, segundo areivindicação 10, caracterizado por lutar contra o envelhecimento cutâneo.