JP2009530325A - ポリラクチドナノ粒子 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬理活性物質を哺乳動物の中枢神経系にその血液脳関門を越えて投与するための、活性物質の標的化された送達のためのシステムであって、標的化された薬物送達のためのシステムが、ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）のナノ粒子と、このナノ粒子に吸収された、このナノ粒子上に吸着された、またはこのナノ粒子中に組み込まれた少なくとも１種の薬理活性物質とを含み、かつ、ＴＰＧＳを含むか、または活性物質が装填されたナノ粒子上に堆積した表面活性物質ポロキサマー１８８のコーティングを含む前記システム、ならびに、この活性物質の標的化された送達のためのシステムを製造するための方法、および、この活性物質の標的化された送達のためのシステムの、中枢神経系の疾患または異常の処置のための使用に関する。

Description

本発明は、哺乳動物の中枢神経系に薬理活性物質を標的化するためのシステムに関する。特に本発明は、哺乳動物の血液脳関門を通過することができるナノ粒子薬物標的化システムに関する。より具体的には、本発明は、ポリラクチドおよび／またはポリラクチド−コグリコリドをベースとする薬物装填ナノ粒子（drug-loaded nanoparticle）、ポリラクチドおよび／またはポリラクチド−コグリコリドをベースとする薬物装填ナノ粒子を製造する方法、および、中枢神経系の疾患または障害の処置のための、特に神経がん（neuronal cancer）の処置のためのポリラクチドおよび／またはポリラクチド−コグリコリドをベースとする薬物装填ナノ粒子の使用に関する。

中枢神経系（ＣＮＳ）の病気および障害は、神経系の機能に影響を及ぼす薬物を投与することによる処置することができる。これらの薬物は通常、それを必要とする患者に、慣用の内服または注射によって与えられる。残念なことに、多くの薬物、例えばアデノシン、β−エンドルフィン、内因性ペプチドの合成アナログ、興奮性アミノ酸および抑制性アミノ酸、ならびに栄養因子は、全く血液脳関門を通過しないか、または、処置的に有効であるには不十分な量でしか血液脳関門を通過しない。かかる薬物は、脳に直接、例えばＣＮＳへの直接注入により投与した場合にのみ治療的に有効である。

ＣＮＳへの直接注入に代わるものとして、米国特許第6,117,454号は、ナノ粒子を用いて、薬物または診断剤を、血液脳関門を通過させることによってＣＮＳに標的化する、医薬活性物質を哺乳動物の血液脳関門を越えて送る方法を提案する。米国特許第6,117,454号によれば、好適なモノマー、例えばブチルシアノアクリレートなどの重合中または重合後に薬物を加え、得られたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子の表面にこれを組み込むかまたは表面上に吸着させる。これらのナノ粒子−薬物複合体は、それが適切な界面活性剤で被覆されている場合に、血液脳関門を通過して、ＣＮＳに薬物を標的化することができるといわれている。ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート（Tween（登録商標） 20）、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノパルミテート（Tween（登録商標） 40）、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノステアレート（Tween（登録商標） 60）、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエート（Tween（登録商標） 80）およびその混合物が、薬物装填ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子の血液脳関門の通過を可能にする適切な界面活性剤であることが主張されている。

この文献では、基本的に任意の薬物を界面活性剤で被覆されたナノ粒子に組み込むか、または結合させることができ、薬物の構造を変える必要なく脳に送達し得ることが提唱されている。それゆえに、米国特許第6,117,454号は、血液脳関門を通過することによってＣＮＳに薬物を標的化する最初の一般的な方法を提供しているようにみえる。

得られたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子を被覆する界面活性剤の毒性副作用の可能性に対する懸念、および、薬物装填ナノ粒子の製造方法を簡素化する願望は、WO 98/56361に開示されている、簡素化された、潜在的により毒性の低いナノ粒子製造の方法の開発を導いた。

WO 98/56361は、デキストラン１２，０００またはポリソルベート８５（ポリオキシエチレン２０ソルビタントリオレエート、Tween（登録商標） 85）を、ブチルシアノアクリレートモノマーの重合中に安定剤として用いてナノ粒子を調製すると、界面活性剤がもはや必要でなくなることを教示する。安定化ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子上に吸着されたダラルギン（dalargin）が血液脳関門を通過することができ、ポリソルベート８５で安定化したナノ粒子に吸着されたアミトリプチリンが、そのままのアミトリプチリンよりも脳により高い濃度で集積したことが示されている。

しかしながら、有効性、特異性、毒性および調製の簡素性を改善するために、血液脳関門を越えて哺乳動物のＣＮＳに薬物を標的化するための薬物装填ナノ粒子の代替的なシステムに対する要求が依然存在する。

したがって、哺乳動物の中枢神経系に、この哺乳動物の血液脳関門を越えて薬理活性物質を投与するための改善された薬物標的化システムを提供することが本発明の目的であった。

この目的は、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＬＡ）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧＡ）をベースとするナノ粒子を含む薬物標的化システムであって、薬理活性物質がナノ粒子に吸収され、ナノ粒子に吸着され、および／またはナノ粒子中に組み込まれており、ナノ粒子が、ＴＰＧＳを含有するか、または、薬物装填ナノ粒子上に堆積したポロキサマー１８８界面活性剤コーティングを含む薬物標的化システムによって達成された。

本明細書で用いる用語「薬物装填ナノ粒子」は、薬理活性物質を含むナノ粒子を指すと解すべきである。薬理活性物質は、治療剤または診断剤であってもよい。それゆえ、本発明の「薬物装填ナノ粒子」は、該ナノ粒子に吸収された、該ナノ粒子に吸着された、および／または該ナノ粒子中に組み込まれた少なくとも１種の治療剤および／または少なくとも１種の診断剤を含む。

本明細書で用いる用語「血液脳関門」は、血液脳関門それ自体、すなわち、脳脈管の内皮、基底膜および神経膠細胞を指す。血液脳関門は、脳内への物質の移動をコントロールする役割を果たす。本明細書で用いる用語「血液脳関門」は、血液脊髄関門および血液網膜関門をも指す

ポリ乳酸とも称されるポリラクチド（ＰＬＡ）は、乳酸をベースとするポリエステルである。ポリラクチドはポリヒドロキシ酸である。これらは生体適合性であり、生分解性である。

ポリラクチドの特性は主にその分子量、結晶化度、および該当する場合は、コポリマーの割合に依存する。ポリラクチドの分子量が増加すると、ポリラクチドのガラス転移温度、融点、抗張力およびＥモジュール（E-module）は増加するが、破断伸びは減少する。

ポリラクチドは、ラクチドの開環重合によって得ることができる。開環重合は、オクタン酸第一スズ（stannous octoate）触媒の存在下、１４０〜１８０℃の温度で行われる。高分子量のポリラクチドは、この方法によって簡単に製造することができる。

さらに、高分子量で純粋なポリラクチドを、いわゆる縮合重合によって乳酸から直接生成することができる。

ポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧＡ）は、グリコール酸に結合した乳酸からなる生分解性ポリマーであり、そのそれぞれのパーセンテージが薬物放出の速度を主に左右する。ラクチドのグリコリドに対する比率は９０：１０〜１０：９０であってもよく、２０：８０〜８０：２０の比率が好ましく、６０：４０〜４０：６０の比率がより好ましく、５０：５０の比率が最も好ましい。ラクチドは光学活性であり、純粋なＤ−ラクチドから純粋なＬ−ラクチドに及ぶ、ＤおよびＬ異性体の任意の割合が存在し得、ラセミ体は５０％のＤ−ラクチドおよび５０％のＬ−ラクチドを含む。

ポロキサマーは、一般式ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（−Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａＨの非イオンポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーである。これらは、液体から固体までの種々の等級で入手できる。ポロキサマーは、乳化剤、可溶化剤、界面活性剤、および、抗生物質のために湿潤剤として用いられる。

ポロキサマー１８８（Pluronic（登録商標） F68（BASF Corp.））は、第一級水酸基で終わる二官能性ブロックコポリマー界面活性剤である。これは比較的無毒な非イオン界面活性剤である。ポロキサマー１８８は、８，４００の平均分子量、７７℃で１，０００ｃｐｓの粘性、＞１００℃の曇り点（１０％水溶液）、および、＞２４のＨＬＢ値を有する。

ポロキサマー１８５（Pluronic（登録商標） P65（BASF Corp.））は、第一級水酸基で終わる二官能性ブロックコポリマー界面活性剤である。これは比較的無毒な非イオン界面活性剤である。Pluronic（登録商標） P65は、３，４００の平均分子量、６０℃で１８０ｃｐｓの粘性、８０〜８４℃の曇り点（１０％水溶液）、および、１２〜１８のＨＬＢ値を有する。

ポロキサマー２３５とも称するPluronic（登録商標） P85（BASF Corp.）は、第一級水酸基で終わる二官能性ブロックコポリマー界面活性剤である。これは比較的無毒な非イオン界面活性剤である。Pluronic（登録商標） P85は、４，６００の平均分子量、６０℃で３１０ｃｐｓの粘性、８３〜８９℃の曇り点（１０％水溶液）、および、１２〜１８のＨＬＢ値を有する。

ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノオレエート、Tween（登録商標） 80）は、非イオン界面活性剤である。ポリソルベート８０は、１，３００の平均分子量、２５℃で３７５〜４８０ｍＰａ・ｓの粘性、および、１４〜１６のＨＬＢ値を有する。

ＴＰＧＳ（Ｄ−α−コハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００）は、ｄ−α−コハク酸トコフェリルの水溶性誘導体である。ＴＰＧＳは、脂肪吸収不良症候群、例えば慢性小児胆汁うっ滞を呈する者のためのビタミンＥの水溶性送達形態として用いられている。これはまた、水不溶性ＨＩＶプロテアーゼインヒビターのアンプレナビルおよび脂溶性ビタミン、例えばビタミンＤなどのための吸収およびバイオアベイラビリティ増強剤としても用いられている。ＴＰＧＳは、ｄ−α−コハク酸トコフェリルをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００（ＰＥＧ１０００の分子量はおよそ１，０００ダルトンである）でエステル化することによって合成される。その分子量はおよそ１，５１３ダルトンである。それは、両親媒性かつ親水性であり、淡黄色でろう様の固体物質である。ＴＰＧＳの薬物動態は依然研究中である。ＴＰＧＳは、ビタミンＥの他の形態よりも、摂取後に小腸の内腔からより効率的に吸収される。腸細胞へのその吸収のメカニズムは依然不明である。ＴＰＧＳは、その両親媒性（親水性および親油性の両方の末端を有する）のため、それ自身のミセルを形成し、そのために胆汁塩を要求しない。ＴＰＧＳは、親油性薬物と共に製剤した場合、これらの薬物の吸収を強化することができる。さらに、ＴＰＧＳと共投与した場合のある種の薬物の経口バイオアベイラビリティの強化は、部分的に、腸におけるＰ糖タンパク質の抑制による可能性がある。

本発明の薬物装填ＰＬＡナノ粒子およびＰＬＧＡナノ粒子は、薬物を血液脳関門を越えて中枢神経系に標的化するため、および中枢神経系の疾患または障害を処置するため、または、中枢神経系の疾患または障害を処置するための薬物を製造するために用いることができる。

本発明の薬物装填ＰＬＡナノ粒子およびＰＬＧＡナノ粒子は、ａ）高圧均質化−溶媒蒸発技法、またはｂ）ダブルエマルション技法（水中油中水型乳剤）のいずれかにより製造することができる。

ａ）高圧均質化−溶媒蒸発技法
典型的には、ポリマーと薬物とを有機溶媒に溶解する。この有機相を、安定化剤の水溶液中に、撹拌下ゆっくりと注ぐ。その後、混合物を高速剪断ホモジナイザーを用いて乳化する。得られた一次乳剤を次に、高圧で高圧ホモジナイザーに通す。有機溶媒は、周囲温度および常圧での遅い蒸発により、または、減圧下での迅速な蒸発により除去する。処理の間に、ナノ液滴が水溶液系で固化する。

得られたナノ懸濁液を、ガラス焼結フィルターで濾過する。保存のために、凍結保護剤、好ましくは５％ｗ／ｖのマンニトールを添加する。その後、懸濁物をバイアルに充填し、−３５℃で凍結し、次いで凍結乾燥する。

追加の化合物、例えば、リン酸セチル、コレステリル硫酸カリウム（potassium cholesteryl sulphate）またはコハク酸トコフェリルなどを、薬物標的化システムの調製において乳化剤および／または対イオンとして用いる場合、ポリマーと脂質化合物とを有機溶媒中で可溶化し、薬物を水に溶解する。有機溶液と水溶液とを混合し、周囲温度でインキュベートする。その後、混合物を、安定化剤を含有する撹拌されている水溶液中に注ぎ、次いで上述のとおりにさらに処理する。

ｂ）ダブルエマルション技法
典型的には、ポリマーは有機溶媒に溶解し、薬物は水に溶解する。水溶液を、有機相に加える。混合を乳化する。得られたｗ／ｏエマルションを安定化剤の水溶液に加え、次いでさらに乳化する。得られた粗エマルションを、高圧ホモジナイザーに通す。均質化工程を数回繰り返し、安定なｗ／ｏ／ｗエマルションを製造する。その後、有機溶媒は周囲温度および常圧での遅い蒸発によって除去する。

溶液を有機相に加える前に、薬物と、追加の乳化剤、例えばγ−シクロデキストリンとを水に溶解することが可能である。

得られたナノ懸濁液を、ガラス焼結フィルターで濾過する。保存のために、凍結保護剤を添加し、ナノ懸濁液をバイアルに充填し、凍結させ、次いで凍結乾燥する。

得られたナノ粒子製剤は、再懸濁性、粒径、薬物装填（理論上の）および薬物含量について検査する。

詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施例を示しているが、本発明の精神および範囲の中の種々の変更および改変が本明細書および添付図面ならびに特許請求の範囲から当業者に明らかになるため、これらは例示の目的でのみ与えられていると解すべきである。

本発明の薬物標的化システムは、ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）をベースとするナノ粒子と、少なくとも１種の薬理活性物質とを含み、かつ、ＴＰＧＳを含有するか、または、薬物装填ナノ粒子上に堆積した界面活性剤コーティングを含み、該界面活性剤はポロキサマー１８８である。

好ましい態様において、薬物標的化システムのナノ粒子は、１，０００ｎｍ以下の直径、好ましくは１００〜８００ｎｍの直径、最も好ましくは１３０〜１６０ｎｍの直径を有する。

本発明のＰＬＡベースおよび／またはＰＬＧＡベースのナノ粒子には、実質的に任意の薬理活性物質を、該薬理活性物質、すなわち治療剤または診断剤を、哺乳動物のＣＮＳにその哺乳動物の血液脳関門を越えて投与するために装填することができる。

治療剤は、シナプスおよび神経効果器接合部位に作用する薬物、全身および局所鎮痛剤および麻酔薬、催眠剤および鎮静剤、精神障害、例えばうつ病および精神分裂症の処置のための薬物、抗癲癇薬および抗痙攣薬、ハンチントン病、老化およびアルツハイマー病の処置のための薬物、興奮性アミノ酸拮抗薬、神経栄養因子および神経再生剤、栄養因子、ＣＮＳ外傷または卒中の処置のための薬物、薬物中毒および薬物乱用の処置のための薬物、オータコイドおよび抗炎症薬、寄生虫感染症および微生物疾患のための化学療法剤、

免疫抑制因子および抗がん薬、ホルモンおよびホルモン拮抗薬、重金属および重金属拮抗薬、非金属毒物のための拮抗薬、がんの処置のための細胞増殖抑制剤、核医学用の診断物質、免疫活性剤および免疫反応性剤、伝達物質およびそのそれぞれの受容体作用薬および受容体拮抗薬、そのそれぞれの前駆体または代謝物、抗生物質、抗痙攣薬、抗ヒスタミン剤、制吐薬、弛緩薬、興奮剤、「センス」および「アンチセンス」オリゴヌクレオチド、脳血管拡張剤（cerebral dilator）、向精神剤、抗躁病薬、血管拡張剤および収縮剤、抗高血圧剤、片頭痛処置剤、催眠剤、血糖上昇剤または血糖降下剤、ミネラルまたは栄養剤、抗肥満薬、同化剤および喘息治療剤、およびこれらの混合物からなる群から選択され得る。

好ましい治療剤は、抗がん薬、好ましくは抗新生物薬である。抗新生物薬は、アルカロイド、アルキル化剤、例えばスルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質およびアナログ、好ましくはアントラサイクリン、代謝拮抗物質、例えば葉酸アナログ、葉酸拮抗剤、プリンアナログおよびピリミジンアナログ、酵素、免疫調節剤、イムノトキシン、モノクローナル抗体および白金錯体からなる群から選択され得る。

特に好ましい抗新生物薬は、９−アミノカンプトテシン、ドセタキセル、エクチナサイジン、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、ルビテカン、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン（piposulfan）、カルボコン、ウレデパ（uredepa）、アルトレタミン（altretamine）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、ペルホスファミド、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トリクロルメチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、

マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミド、アクラシノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カルビシン（carubicin）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ＴＮＰ−４７０、ツベルシジン、バルルビシン、ジノスタチン、ゾルビシン、デノプテリン（denopterin）、エダトレキサート、メトトレキサート、ノラトレキセド、ペメトレキセド、ピリトレキシム（piritrexim）、プテロプテリン、ラリトレキセド（ralitrexed）、トリメトレキサート、クラドリビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン、チアゾフリン、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カペシタビン、カルモフール、シタラビン、デシタビン、

ドキシフルリジン、エミテフール、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、Ｌ−アスパラギナーゼ、ランピルナーゼ、ブロピリミン、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、レンチナン、プロパゲルマニウム、ＰＳＫ（登録商標）、ロキニメクス（roquinimex）、シゾフィラン、ウベニメクス、デニロイキン ディフチトクス、アレムツズマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、イブリツモマブ チウキセタン、リツキシマブ、トシツモマブ^１３１Ｉ、トラスツズマブ、カルボプラチン、シスプラチン、ロバプラチン、ミボプラチン、オキサリプラチン、アムサクリン、三酸化ヒ素、ビサントレン、デホスファミン（defosfamine）、デメコルチン、ジアジコン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）、エトグルシド、フェンレチニド、フラボピリドール、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、イマチニブ、リアロゾール、ロニダミン、ミルテフォシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン（nitracrine）、ペントスタチン、フェナメト（phenamet）、ポドフイル酸２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、ソブゾキサン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、チラパザミン、トリアジクオンおよびウレタンからなる群から選択することができる。

本発明の薬物標的化システムは、高圧均質化−溶媒蒸発技法によって、あるいは、ダブルエマルション技法によって製造することができる。

ＴＰＧＳを含有する薬物装填ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡナノ粒子薬物標的化システムを調製する好ましい方法は、以下の工程を含む：
−ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）、少なくとも１種の薬理活性物質、および任意に脂質化合物を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
−有機相を、ＴＰＧＳを含有する水溶液に注ぐ工程、
−混合物を乳化して１次エマルション（primary emulsion）を得る工程、
−１次エマルションを均質化する工程、
−１次エマルションから有機溶媒を除去する工程、および
−得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程。

ＴＰＧＳを含有する薬物装填ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡナノ粒子薬物標的化システムを調製する別の好ましい方法は、以下の工程を含む：
−ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
−少なくとも１種の薬理活性物質を水溶液に溶解する工程、
−水溶液を有機相へ注ぐ工程、
−混合物を乳化して１次エマルションを得る工程、
−１次エマルションをＴＰＧＳの水溶液に注ぐ工程、
−１次エマルションとＴＰＧＳの水溶液との混合物を均質化する工程、
−１次エマルションと安定化剤の水溶液との混合物から有機溶媒を除去する工程、
−得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程。

ポロキサマー１８８で被覆された薬物装填ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡナノ粒子薬物標的化システムを調製する好ましい方法は、以下の工程を含む：
−ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）、少なくとも１種の薬理活性物質、および任意に脂質化合物を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
−有機相を、任意に安定化剤を含む水溶液に注ぐ工程、
−混合物を乳化して１次エマルションを得る工程、
−１次エマルションを均質化する工程、
−１次エマルションから有機溶媒を除去する工程、
−得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程、および
−ナノ粒子をポロキサマー１８８で被覆する工程。

ポロキサマー１８８で被覆された薬物装填ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡナノ粒子薬物標的化システムを調製する別の好ましい方法は、以下の工程を含む：
−ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
−少なくとも１種の薬理活性物質を水溶液に溶解する工程、
−水溶液を有機相に注ぐ工程、
−混合物を乳化して１次エマルションを得る工程、

−１次エマルションを安定化剤の水溶液へ注ぐ工程、
−１次エマルションと安定化剤の水溶液との混合物を均質化する工程、
−１次エマルションと安定化剤の水溶液との混合物から有機溶媒を除去する工程、
−得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程、および
−ナノ粒子をポロキサマー１８８で被覆する工程。

本発明の薬物標的化システムの製造のための好ましい診断剤および治療剤、特に、抗新生物薬は、上記に特定した。

本発明の薬物標的化システムの製造のための好ましい有機溶媒は、ジクロロメタンおよびクロロホルムからなる群から選択される。ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡナノ粒子の製造のための溶媒として、任意選択の安定化剤が酢酸エチルに溶けることを条件として、酢酸エチルを用いることも可能である。ジクロロメタンと酢酸エチルとの混合物を用いることもさらに可能である。

好ましい脂質化合物は、リン酸セチル、コレステリル硫酸カリウムおよびコハク酸トコフェリルからなる群から選択される。

好ましい安定化剤は、乳化剤、界面活性剤または対イオンである。好ましい安定化剤はポリビニルアルコール、血清アルブミン、γ−シクロデキストリン、およびコハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００（ＴＰＧＳ）からなる群から選択され、ここでポリビニルアルコールは好ましくは３０〜７０ｋＤａの分子量を有し、特に好ましい血清アルブミンはヒト血清アルブミンである。

保存のために、得られた薬物装填ナノ粒子のナノ懸濁液は、ナノ粒子をポロキサマー１８８で被覆する前に凍結乾燥することができる。好ましくは、ナノ懸濁液を凍結乾燥する前に凍結保護剤をそれに添加する。好適な凍結保護剤はマンニトールであり、好ましくはこれを５％（ｗ／ｖ）の量でナノ懸濁液に添加する。

薬物装填ナノ粒子の被覆は、好ましくはポロキサマー１８８の溶液を用いて、溶液中、界面活性剤が薬物装填ナノ粒子を被覆することができる十分な時間をかけることによって行う。

薬理活性物質を哺乳動物の中枢神経系にその血液脳関門を越えて投与するための薬物標的化システムであって、薬物標的化システムが、ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）製のナノ粒子、治療剤、およびＴＰＧＳもしくは薬物装填ナノ粒子上に堆積したポロキサマー１８８界面活性剤コーティングを含むものは、哺乳動物の中枢神経系の疾患または障害を処置するのに用いることができる。本薬物標的化システムは、中枢神経系作用を有するが、修飾するか、または担体と会合させなければ哺乳動物の血液脳関門を通過することができない薬理活性物質を投与するのに特に適している。

本発明の薬物標的化システムは、抗新生物薬を血液脳関門を越えて送達し、これらの抗がん薬をＣＮＳに標的化することができるため、神経がんの処置に特に有用である。

本発明の薬物標的化システムは、それが血流に入り、それによって薬物が血液脳関門に到達し、これを通過することができるように投与する。好ましくは、本発明の薬物標的化システムは、経口的に、または注入によって、最も好ましくは静脈内注入によって投与する。

例
１．ナノ粒子製剤の調製
種々の等級のLactel（登録商標）ポリマー−ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＬＡ）およびポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧＡ）−はAbsorbable Polymers, USAから購入し、塩酸ドキソルビシンはSicor, Rho, Italyからの寄贈であり、リン酸セチル、コレステリル硫酸カリウム、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（ＭＷ３０〜７０ｋＤａ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はSigmaから購入し、Ｄ−α−コハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００（ＴＰＧＳ）はEastman Chemical Company, USAから購入した。

薬物装填ＰＬＡおよびＰＬＧＡナノ粒子は、高圧均質化−溶媒蒸発技法か、または、ダブルエマルション技法のいずれかを用いて製造した。

高圧均質化−溶媒蒸発のために、ポリマーおよび薬物は、通常はジクロロメタン中に溶解した。この有機相を、安定剤（ＰＶＡまたはＨＳＡ）の水溶液に攪拌下ゆっくり注いだ。混合物を、高速剪断ホモジナイザー（Ultra-Turrax T-25（IKA））を用いて乳化した。得られた１次エマルションを、次いで、高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40; Gaulin GmbH, Germany）に４００バールで通した。有機溶媒を、周囲温度および常圧における攪拌下での遅い蒸発（３時間）によって、または、減圧下での速い蒸発（ロータリーエバポレーターBUCHI R-200）によって除去した。この処理の間、ナノ液滴が水溶液系中で固化した。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、５％ｗ／ｖのマンニトールを凍結保護剤として添加した。次いで、ナノ懸濁液をバイアルに充填し、−３５℃で凍結させ、凍結乾燥した。

リン酸セチル、コレステリル硫酸カリウムまたはコハク酸トコフェリルなどの脂質化合物を、一部の製剤で乳化剤および／または対イオンとして用いた。この場合、ポリマーおよび脂質成分は有機溶媒（ジクロロメタンまたはクロロホルム）中で可溶化し、薬物は水に溶解した。有機溶液と水性溶液とを混合し、周囲温度で１２時間インキュベートした。次いで、混合物を、安定剤を含有する攪拌されている水溶液（２５ｍｌ）に注ぎ、その後、上述のとおりにさらに処理した。

ダブルエマルション技法のために、ポリマー（５００ｍｇ）を通常はジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解した（マグネチックスターラーによる攪拌下で１時間）。薬物（５０ｍｇ）は、水（２ｍｌ）に溶解した。水溶液を有機相に滴加した。混合物を、Ultra-Turrax T-25を用いて乳化した（１９，５００ｒｐｍで２分）。得られたｗ／ｏエマルションを、安定化剤（ＰＶＡ、ＨＳＡまたはＴＧＰＳ）の１％水溶液２５ｍｌに加え、次いで、Ultra-Turrax T-25を用いて乳化した。得られた粗エマルションを、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールの圧力で通した。均質化工程を数回繰り返し、安定したｗ／ｏ／ｗエマルションを製造した。有機溶媒を、周囲温度および常圧での遅い蒸発（マグネチックスターラー、３時間）によりｗ／ｏ／ｗエマルションから除去した。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、５％ｗ／ｖのマンニトールを凍結保護剤として添加した。次いで、エマルションをバイアルに充填し（１ｍｌ／バイアル）、凍結させ（−３５℃）、凍結乾燥した。

ジクロロメタンは、ＰＬＡ／ＰＬＧＡナノ粒子の調製に用いる典型的な溶媒である。しかしながら、酢酸エチルまたはジクロロメタンと酢酸エチルとの混合物を用いることも可能である。しかしながら、ある種の対イオンは、酢酸エチルに溶けない。これらの場合、酢酸エチルはＰＬＡ／ＰＬＧＡナノ粒子を製造するには不適切な溶媒である。

得られた製剤は、再懸濁性、粒径、薬物装填量（理論上の）および薬物含量について試験した。

得られたナノ粒子製剤は、均一で安定したコロイド系が、凍結乾燥ナノ粒子の水による再構成後に観察された場合に適切であるとみなした。ナノ粒子の再懸濁性は、視覚的に評価した。そのため、冷凍乾燥した製剤を含有するバイアルの内容物を、水で最初の容量（２ｍｌ）に再構成し、バイアルを２〜４分間穏やかに振盪した。適切な再構成された製剤は、可視的な集塊または沈殿のない乳白色の液体となる。可視的な集塊または沈殿を含有するサンプルは廃棄した。

ナノ粒子のサイズは、再構成した製剤のアリコート（５０μｌ）を、３ｍｌの再蒸留水を含有するNanosizer試験管に移し、光子相関分光法（ＰＣＳ）で測定した。試験管を振盪し、次いでCoulter N4MD Nanosizer（Coulter Electronics, U.K）に挿入した。作動パラメーターは、以下のとおりであった：
散乱角：９０°
温度：２５°
粘度：０．０１ポアズ
屈折率：１．３３３

薬物装填量は、濾過工程後の反応混合物、または、再構成後の凍結乾燥製剤において測定した。薬物装填量を決定する方法は、限外濾過によるナノ粒子の分離と、引き続く濾物中の遊離した薬物の分光光度法による定量分析とを含む。

ナノ粒子製剤の薬物装填量を決定するために、凍結乾燥製剤を含むバイアルの内容物を１ｍｌの水に再構成し、４００μｌをマイクロ遠心フィルター（Microcon 30 kDa, Millipore）に移し、ナノ粒子を、５０分間、１６，０００ｒｐｍの遠心分離により分離した。１００μｌの透明な濾液を３ｍｌの再蒸留水を含有するキュベットに移し、吸光を水に対して４８０ｎｍで分光光度計（Spectronics Helios, Thermospectronic, GB）を用いることにより測定した。サンプル中の薬物の濃度は、適切なキャリブレーショングラフを用いて決定した。

相対的な薬物装填量（総薬物量に対する％）は、以下のとおりに計算した：

式中、
Ｃ_ｉ＝重合媒体中の薬物初期濃度（ｍｇ／ｍｌ）、
Ｃ_ｆ＝濾液中の薬物濃度（ｍｇ／ｍｌ）。

薬物内容量（ｍｇ／バイアル）の決定のための方法は、凍結乾燥製剤の完全溶解後の定量分析である。溶液中の薬物の濃度は、分光光度法により検量線を用いて測定する。

薬物内容量を決定するために、凍結乾燥製剤を含むバイアルの内容物を２ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解し（３時間、周囲温度）、この溶液の１００μｌを３ｍｌの再蒸留水を含有する分光光度計キュベットに移し、吸光を分光光度計（Spectronics Helios, Thermospectronic, GB）を用いることにより水に対して４８０ｎｍで測定した。サンプル中の薬物の濃度は、適切なキャリブレーショングラフを用いて決定した。

製剤１
ナノ粒子を、高圧均質化−溶媒蒸発技法によって調製した。２５０ｍｇのポリマー（ＰＬＧＡ７５：２５、ＭＷ９０，０００〜１２６，０００Ｄａ）と、２５ｍｇのドキソルビシンとを、５ｍｌのジクロロメタンに溶解した。有機相を、０．５％のＰＶＡを安定化剤として含有する撹拌されている水溶液（２５ｍｌ）に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１５，１００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）を用いて、４００バールでさらに均質化した。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた（ロータリーエバポレーターBUCHI R-200）。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１４０〜２２０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は４０％であった。

製剤２
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡ、固有粘度：η＝０．２０ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，５００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＰＶＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで３回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１１０〜１６０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は７５％であった。

製剤３
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（ＰＬＧＡ７５：２５、ＭＷ９０，０００〜１２６，０００Ｄａ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、この混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，５００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＰＶＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１６０〜３３０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は４７％であった。

製剤４
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（ＰＬＡ、η＝０．３６ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，５００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＰＶＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１２６〜２１０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は４２％であった。

製剤５
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡ、η＝０．２０ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，５００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＰＶＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで３回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１４０〜２００ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は７３％であった。

製剤６
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡ５０：５０、η＝０．２０ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，５００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＰＶＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで３回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１３０〜１９０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は６７％であった。

製剤７
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡ５０：５０、η＝０．２０ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、２０，１００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＰＶＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１２５〜１８５ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は６９％であった。

製剤８
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡ５０：５０、η＝０．２０ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、２２，６００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＨＳＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１００〜２００ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は４０％であった。

製剤９
ナノ粒子を、高圧均質化−溶媒蒸発技法によって調製した。２５０ｍｇのポリマー（ＰＬＡ、ＭＷ９０，０００〜１２６，０００Ｄａ）と、１５．１ｍｇのリン酸セチルとを、４ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。８ｍｇの塩酸ドキソルビシンを２ｍｌの水に溶解した。有機溶液と水溶液とを混合し、周囲温度で１２時間インキュベートした。次いで、混合物を、１％のＨＳＡを安定化剤として含有する撹拌されている水溶液（２５ｍｌ）に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，１００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた（ロータリーエバポレーターBUCHI R-200）。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は１６０〜２４０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は６０％であった。

製剤１０
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡ５０：５０、η＝０．２０ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを、２ｍｌの０．００１Ｎ ＨＣｌに溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，９００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの１％ＴＧＰＳ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は３００〜３８０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は４５％であった。

製剤１１
ナノ粒子を、高圧均質化−溶媒蒸発技法によって調製した。２５０ｍｇのポリマー（ＰＬＡ、０．３６ｄｌ／ｇ）と、２１．２ｍｇのコレステリル硫酸カリウムとを、５ｍｌのクロロホルム中で可溶化した。２１．８ｍｇの塩酸ドキソルビシンを２ｍｌの水に溶解した。有機溶液と水溶液とを混合し、周囲温度で１２時間インキュベートした。次いで、混合物を、１％のＰＶＡを安定化剤として含有する撹拌されている水溶液（２３ｍｌ）に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、１９，１００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた（ロータリーエバポレーターBUCHI R-200）。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は５００〜６００ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は８９％であった。

製剤１２
ナノ粒子を、高圧均質化−溶媒蒸発技法によって調製した。２５０ｍｇのポリマー（ＰＬＡ、０．３６ｄｌ／ｇ）と、２２．９ｍｇのＤ−α−コハク酸トコフェリルとを、５ｍｌのクロロホルム中で可溶化した。２５．４ｍｇの塩酸ドキソルビシンを２ｍｌの水に溶解した。有機溶液と水溶液とを混合し、周囲温度で１２時間インキュベートした。次いで、混合物を、０．５％のＰＶＡを安定化剤として含有する撹拌されている水溶液（２３ｍｌ）に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、２３，６００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。クロロホルムを減圧下で蒸発させた（ロータリーエバポレーターBUCHI R-200）。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は２２４〜３６８ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は５０％であった。

製剤１３
ナノ粒子を、高圧均質化−溶媒蒸発技法によって調製した。２５０ｍｇのポリマー（ＰＬＡ、０．３６ｄｌ／ｇ）と、１４．９ｍｇのリン酸セチルとを、５ｍｌのクロロホルム中で可溶化した。２４．５ｍｇの塩酸ドキソルビシンを２ｍｌの水に溶解した。有機相と水相とを混合し、周囲温度で１２時間インキュベートした。次いで、混合物を、０．５％のＰＶＡを安定化剤として含有する撹拌されている水溶液（２３ｍｌ）に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、２３，６００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。クロロホルムを減圧下で蒸発させた（ロータリーエバポレーターBUCHI R-200）。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は２００〜２５０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は５３％であった。

製剤１４
ナノ粒子を、ダブルエマルション技法によって調製した。５００ｍｇのポリマー（酸末端基を有するＰＬＧＡ５０：５０、η＝０．６７ｄｌ／ｇ）を３ｍｌのジクロロメタン中で可溶化した。２０ｍｇの塩酸ドキソルビシンと、４５ｍｇのγ−シクロデキストリンとを、３ｍｌの水に溶解した。水溶液を有機相に注ぎ、混合物をUltra-Turrax T-25を用いて乳化した（２分、２３，６００ｒｐｍ）。得られた１次エマルションを、２５ｍｌの０．５％ＰＶＡ水溶液に注ぎ、混合物を再度Ultra-Turrax T-25を用いて均質化し、次いで高圧ホモジナイザー（APV Micron Lab 40）に６００バールで４回通した。ジクロロメタンは、エマルションを周囲温度で３時間攪拌することにより蒸発させた。得られたナノ懸濁液をガラス焼結フィルターで濾過し、凍結保護剤としての５％ｗ／ｖのマンニトールの添加後に凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は完全に再懸濁可能だった。ＰＣＳで測定した粒径は２００〜２５０ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は４４％であった。

２．動物実験
同所性腫瘍モデル系。実験系は、ラットにおける頭蓋内に移植された１０１／８神経膠芽腫に基づくものであった。この腫瘍は、まず最初にウィスターラット小脳へのα−ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）ペレットの局所注入によって生成し、脳内移植による連続継代により維持した。長期保存のために、腫瘍組織を−１９６℃に維持し、ラットの脳への注入によって増殖させた。

１０１／８神経膠芽腫は、以前、表面修飾ポリ（ブチルシアノアクリレートナノ粒子）に装填したドキソルビシンを用いた実験的化学療法のために用いられた。この腫瘍は安定した単形性の構造を有しており、脳実質における迅速なびまん性増殖および低めの壊死傾向を伴う侵襲性神経膠芽腫の特徴的な組織像を示す。腫瘍の可移植性は約１００％であり、接種後に予測可能な無症状の寿命をもたらした。本研究における１０１／８神経膠芽腫の移植は、新鮮な腫瘍組織を用いて行った。この技法は、親腫瘍の主要な典型的特徴、特にその抗原構造および分化を保全するために選択した。

体重２００〜２５０ｇの成体雄ウィスターラットを１週間順化させ、５頭の群でケージに入れた。ラットには、標準的な研究用飼料および水を不断給餌した。腫瘍移植のために、動物をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によって深麻酔した。正中矢状切開を通して、直径１．５ｍｍのドリル孔を、歯科用ドリルで、右の冠状縫合の後方２ｍｍ、矢状正中線の側方２ｍｍの部位に形成した。凍結ストックからの腫瘍材料（およそ１０^６細胞）を、２１ゲージ針に連結したツベルクリンシリンジに導入した。先端を骨面の４ｍｍ下方に配置し、腫瘍組織を右側脳室の底部に注入した。頭皮の切開は縫合するか、接着剤で閉鎖した。疾患の顕著な臨床徴候の発症後（通常は１４日目）、動物を二酸化炭素窒息により犠牲にし、次いで断首した。脳を直ちに取り出した。腫瘍を摘出してメスで細切し、上記のとおりに、腫瘍移植片（５ｍｇ）を、新たな実験動物の脳に接種した。適切な座標（coordinates）を確認し、パイロット実験を繰り返すことにより技法を洗練した。

動物実験のために用いるナノ粒子は、酸末端基を有する低分子ＰＬＧＡ５０：５０（η＝０．２０ｄｌ／ｇ）をベースとし、塩酸ドキソルビシンによりドキソルビシンを装填したものであった。１：１０の薬物対ポリマー比を、ドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子の調製に用いた。測定した粒径は１４４±１２ｎｍであり、ドキソルビシン装填量は７５．５％であった。

界面活性剤被覆粒子を得るために、凍結乾燥製剤を、いずれかの界面活性剤（Pluronic（登録商標） F68、Pluronic（登録商標） P85およびポリソルベート８０）の１％水溶液に再懸濁した。次いで、得られた製剤を攪拌下で３０分間インキュベートし、２時間以内に用いた。

担腫瘍ラットを、６群（ｎ＝１０）に無作為に分け、以下の製剤の１つを与えた：１）無処置対照、２）生理食塩水中のドキソルビシン（ＤＯＸ）、３）１％のPluronic（登録商標） F68中のドキソルビシン（Ｄｏｘ／Ｆ６８）、４）、ドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子（ＤＯＸ−ＰＬＧＡ）、５）Pluronic（登録商標） F68で被覆したドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子（ＤＯＸ−ＰＬＧＡ／Ｆ６８）、６）ポリソルベート８０で被覆したドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子（図示せず）、７）Pluronic（登録商標） P85で被覆したドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子（結果は図１に図示せず）。

これらの製剤を、静脈内に、以下の用量レジメンで尾静脈に静脈内注入した：腫瘍移植後２日目、５日目、および８日目に３×１．５ｍｇ／ｋｇ。

動物は、処置後１００日間追跡調査した後、生存動物を犠牲にし、剖検した。結果を図１に示す。

対照群では、全ての動物が、腫瘍移植後１９日以内に死亡した。ポロキサマー１８８で被覆したドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子は、担腫瘍ラットの生存を高めた：４０％の動物（４／１０）が１００日間生存した。ポロキサマー１８８の１％溶液中のドキソルビシンで処置した群では、１頭の動物のみが生き残った。これらの動物に腫瘍が存在しないことは、形態学的検討により確認した。

ポロキサマー１８８で被覆したドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子により得られた結果とは対照的に、ドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子のポリソルベート８０またはPluronic（登録商標） P85による被覆は、ナノ粒子結合ドキソルビシンの効力を強化することができなかった（データは示さず）。

第２の一連の実験では、酸末端基を有するＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ）をベースとするドキソルビシン装填ＰＬＧＡナノ粒子を含む製剤であって、安定剤としてＴＰＧＳを含むもの（Ｄｏｘ／ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ／ＴＰＧＳ、製剤１０）、またはＴＰＧＳで被覆したもの（Ｄｏｘ／ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ＋ＴＰＧＳ）を、１０１／８神経膠芽腫担持ラットに対するそのin-vivo作用について調査した。後者の製剤は、製剤５によるナノ粒子を、ナノ粒子を動物に注入する前に０．５％のＴＰＧＳに再懸濁することによって得た。

この一連の実験の結果を図２に示す。製剤１０によるナノ粒子、すなわち、ＴＰＧＳを安定剤として含むものが、担腫瘍ラットの生存期間を顕著に延長し、この実験のために用いた担腫瘍ラットの２０％の長期生存を可能にしたことをみることができる。使用の前にＴＰＧＳで被覆した製剤５によるナノ粒子は有効ではなかった。

ドキソルビシンを含む種々のナノ粒子製剤による化学療法後の、頭蓋内に１０１／８神経膠芽腫を有するラットの生存を例証するグラフである。 ドキソルビシンとＴＰＧＳとを含む種々のナノ粒子製剤による化学療法後の、頭蓋内に１０１／８神経膠芽腫を有するラットの生存を例証するグラフである。

Claims (26)

1. 哺乳動物の中枢神経系にその血液脳関門を越えて薬理活性物質を投与するための薬物標的化システムであって、該薬物標的化システムが、ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）製のナノ粒子と、該ナノ粒子に吸収された、該ナノ粒子に吸着された、および／または該ナノ粒子中に組み込まれた少なくとも１種の薬理活性物質とを含み、該システムが、ＴＰＧＳを含有するか、または薬物装填ナノ粒子上に堆積したポロキサマー１８８界面活性剤コーティングを含む、前記薬物標的化システム。
2. ナノ粒子が、１，０００ｎｍ以下の直径、好ましくは１００〜８００ｎｍの直径、最も好ましくは１５０〜６００ｎｍの直径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬物標的化システム。
3. 薬理活性物質が、治療剤または診断剤であることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬物標的化システム。
4. 治療剤が、シナプスおよび神経効果器接合部位に作用する薬物、全身および局所鎮痛剤および麻酔薬、催眠剤および鎮静剤、精神障害、例えばうつ病および精神分裂症の処置のための薬物、抗癲癇薬および抗痙攣薬、ハンチントン病、老化およびアルツハイマー病の処置のための薬物、興奮性アミノ酸拮抗薬、神経栄養因子および神経再生剤、栄養因子、ＣＮＳ外傷または卒中の処置のための薬物、薬物中毒および薬物乱用の処置のための薬物、オータコイドおよび抗炎症薬、寄生虫感染症および微生物疾患のための化学療法剤、免疫抑制因子および抗がん薬、ホルモンおよびホルモン拮抗薬、重金属および重金属拮抗薬、非金属毒物のための拮抗薬、がんの処置のための細胞増殖抑制剤、核医学用の診断物質、免疫活性剤および免疫反応性剤、伝達物質およびそのそれぞれの受容体作用薬および受容体拮抗薬、そのそれぞれの前駆体または代謝物、抗生物質、抗痙攣薬、抗ヒスタミン剤、制吐薬、弛緩薬、興奮剤、「センス」および「アンチセンス」オリゴヌクレオチド、脳血管拡張剤、向精神剤、抗躁病薬、血管拡張剤および収縮剤、抗高血圧剤、片頭痛処置剤、催眠剤、血糖上昇剤または血糖降下剤、ミネラルまたは栄養剤、抗肥満薬、同化剤および喘息治療剤、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の薬物標的化システム。
5. 抗がん薬が、アルカロイド、アルキル化剤、例えばスルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質およびアナログ、好ましくはアントラサイクリン、代謝拮抗物質、例えば葉酸アナログ、葉酸拮抗剤、プリンアナログおよびピリミジンアナログ、酵素、免疫調節剤、イムノトキシン、モノクローナル抗体および白金錯体からなる群から選択される抗新生物薬であることを特徴とする、請求項４に記載の薬物標的化システム。
6. 診断剤が、核医学および／または放射線療法のための診断に有用であることを特徴とする、請求項３に記載の薬物標的化システム。
7. 哺乳動物の中枢神経系にその血液脳関門を越えて薬理活性物質を投与するための薬物標的化システムの製造方法であって、以下の工程：
   −ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）、少なくとも１種の薬理活性物質、および任意に脂質化合物を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
   −有機相をＴＰＧＳを含有する水溶液に注ぐ工程、
   −混合物を乳化して１次エマルションを得る工程、
   −１次エマルションを均質化する工程、
   −１次エマルションから有機溶媒を除去する工程、および
   −得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程
   を含む、前記方法。
8. 哺乳動物の中枢神経系にその血液脳関門を越えて薬理活性物質を投与するための薬物標的化システムの製造方法であって、以下の工程：
   −ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）、少なくとも１種の薬理活性物質、および任意に脂質化合物を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
   −有機相を任意に安定化剤を含む水溶液に注ぐ工程、
   −混合物を乳化して１次エマルションを得る工程、
   −１次エマルションを均質化する工程、
   −１次エマルションから有機溶媒を除去する工程、
   −得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程、および
   −ナノ粒子をポロキサマー１８８で被覆する工程
   を含む、前記方法。
9. 脂質化合物が、リン酸セチル、コレステリル硫酸カリウムおよびコハク酸トコフェリルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
10. 哺乳動物の中枢神経系にその血液脳関門を越えて薬理活性物質を投与するための薬物標的化システムの製造方法であって、以下の工程：
    −ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
    −少なくとも１種の薬理活性物質を水溶液に溶解する工程、
    −水溶液を有機相へ注ぐ工程、
    −混合物を乳化して１次エマルションを得る工程、
    −１次エマルションをＴＰＧＳの水溶液に注ぐ工程、
    −１次エマルションとＴＰＧＳの水溶液との混合物を均質化する工程、
    −１次エマルションと安定化剤の水溶液との混合物から有機溶媒を除去する工程、
    −得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程
    を含む、前記方法。
11. 哺乳動物の中枢神経系にその血液脳関門を越えて薬理活性物質を投与するための薬物標的化システムの製造方法であって、以下の工程：
    −ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）を有機溶媒中で可溶化し、有機相を得る工程、
    −少なくとも１種の薬理活性物質を水溶液に溶解する工程、
    −水溶液を有機相に注ぐ工程、
    −混合物を乳化して１次エマルションを得る工程、
    −１次エマルションを安定化剤の水溶液へ注ぐ工程、
    −１次エマルションと安定化剤の水溶液との混合物を均質化する工程、
    −１次エマルションと安定化剤の水溶液との混合物から有機溶媒を除去する工程、
    −得られた薬物装填ナノ粒子を含むナノ懸濁液を濾過する工程、および
    −ナノ粒子をポロキサマー１８８で被覆する工程
    を含む、前記方法。
12. 安定化剤が、ポリビニルアルコール、血清アルブミン、ＴＰＧＳ、およびγ−シクロデキストリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
13. ポリビニルアルコールが３０〜７０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. 血清アルブミンがヒト血清アルブミンであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
15. 薬理活性物質が、治療剤または診断剤であることを特徴とする、請求項７〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 治療剤が、シナプスおよび神経効果器接合部位に作用する薬物、全身および局所鎮痛剤および麻酔薬、催眠剤および鎮静剤、精神障害、例えばうつ病および精神分裂症の処置のための薬物、抗癲癇薬および抗痙攣薬、ハンチントン病、老化およびアルツハイマー病の処置のための薬物、興奮性アミノ酸拮抗薬、神経栄養因子および神経再生剤、栄養因子、ＣＮＳ外傷または卒中の処置のための薬物、薬物中毒および薬物乱用の処置のための薬物、オータコイドおよび抗炎症薬、寄生虫感染症および微生物疾患のための化学療法剤、免疫抑制因子および抗がん薬、ホルモンおよびホルモン拮抗薬、重金属および重金属拮抗薬、非金属毒物のための拮抗薬、がんの処置のための細胞増殖抑制剤、核医学用の診断物質、免疫活性剤および免疫反応性剤、伝達物質およびそのそれぞれの受容体作用薬および受容体拮抗薬、そのそれぞれの前駆体または代謝物、抗生物質、抗痙攣薬、抗ヒスタミン剤、制吐薬、弛緩薬、興奮剤、「センス」および「アンチセンス」オリゴヌクレオチド、脳血管拡張剤、向精神剤、抗躁病薬、血管拡張剤および収縮剤、抗高血圧剤、片頭痛処置剤、催眠剤、血糖上昇剤または血糖降下剤、ミネラルまたは栄養剤、抗肥満薬、同化剤および喘息治療剤、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 抗がん薬が、アルカロイド、アルキル化剤、例えばスルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質およびアナログ、好ましくはアントラサイクリン、代謝拮抗物質、例えば葉酸アナログ、葉酸拮抗剤、プリンアナログおよびピリミジンアナログ、酵素、免疫調節剤、イムノトキシン、モノクローナル抗体および白金錯体からなる群から選択される抗新生物薬であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 診断剤が、核医学および／または放射線療法のための診断に有用であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
19. 有機溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルおよびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７〜１８のいずれかに記載の方法。
20. ナノ懸濁液が、凍結保護剤の添加後に凍結乾燥されることを特徴とする、請求項７〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 凍結保護剤がマンニトールであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
22. 凍結保護剤がナノ懸濁液に５％（ｗ／ｖ）の量で添加されることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 哺乳動物の中枢神経系の疾患または障害を処置する方法であって、以下の工程：
    −ポリ（ＤＬ−ラクチド）および／またはポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）製の薬物装填ナノ粒子を調製する工程、
    −薬物装填ＰＬＧＡナノ粒子をポロキサマー１８８で被覆する工程、
    −ポロキサマー１８８で被覆された薬物装填ナノ粒子を哺乳動物の血流中に投与する工程、および、
    −薬物にその薬理効果を達成させる工程
    を含む、前記方法。
24. 投与工程が、経口または静脈内投与を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
25. 請求項１〜６のいずれかに記載の薬物標的化システムの、哺乳動物の中枢神経系の疾患または障害を処置するための使用。
26. 請求項１〜６のいずれかに記載の薬物標的化システムの、哺乳動物の中枢神経系の疾患または障害を処置するための医薬を製造するための使用。

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