JP2009520703A - 給血者の血、血漿、または、赤血球濃縮物中の病原体を柔軟な容器中で動かしながら不活化するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、光力学的な処理および／または紫外光の照射によって、給血者の血、血漿、および、赤血球濃度中のバクテリアおよびウイルスなどの病原体を柔軟な感光袋中で動かしながら不活化するための方法に関する。

Description

本発明は、光力学的な処理および／または紫外光の照射によって、給血者の血（血液）、血漿（プラズマ）、および／または、赤血球濃縮物（ＥＣ）中のバクテリアやウイルスなどの病原体を不活化するための方法に関するものである。

血液および血液調合剤の治療上の使用は受容者がウイルスおよびバクテリアに感染するリスクを生じる、ということが知られている。例として、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、並びに、エイズ病原菌ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が挙げられる。相当する製剤の製造時に病原体を不活化または除去するための工程が行なわれなければ、このリスクは常にある。

血液調合剤を光力学的な方法で除染するためには多くの手間がかかっていた、または、かかっている。原則は、相当する製品を光活動性の物質（光増感剤）の存在下で感光させる、ということに基づいている。入射光は、光増感剤によって吸収され且つ光増感剤を活性化することのできる波長域を含んでいる必要がある。吸収されたエネルギーは、相当する標的構造（例えば、ウイルスの核酸または表面蛋白質）へ直接伝えられて標的構造を破壊するか、または、溶存酸素分子へ伝えられて溶存酸素分子を活性化する。これにより、顕著な殺ウイルス性および殺菌性の作用を有する一重項酸素が生じる。

理想的には使用される光増感剤は、ウイルスおよび他の病原体の本質的な成分に対して、例えば、その核酸に対して高い親和性を有し、除染の行なわれる製剤の成分に対しては親和性が低いか、または、親和性が全く無いことが理想的である。その場合、光力学的な処理によって病原体は不活化されるが、製品の作用は維持されたままである。プラズマの処理に適した光増感剤として、例えば、フェノチアジン染料であるメチレンブルーが挙げられる。血小板濃縮物の除染には、リボフラビン（ビタミンＢ２）が使用され、ＥＣの除染には、フタロシアニンが実証された。しかしながら、ＥＣ中の光力学的な病原体不活化のための方法は、これまでのところ、実験室規模を超えていない。

血液自体にはこのことがよりいっそう当てはまる。その主な理由は、使用される光増感剤を活性化できるように入射光が特定の輝度を有している必要があり、血液およびＥＣがどのような波長の光に対しても非常に低い透過性しか有していない、ということにあるであろう。同じ程度でなくとも、この問題はプラズマにおいても当然生じる。

短波長の、すなわち、約２００から３２０ｎｍの範囲内の、特に２００から３００ｎｍ未満の波長域の紫外（ＵＶ）光（ＵＶＢおよびＵＶＣ）を照射するだけで、病原体を同様に不活化することができる、ということも知られている。３２０ｎｍ以上では、放射のエネルギーが小さ過ぎて微生物およびウイルスを不活化することができない。病原体不活化のための化学的方法、光化学的方法、および、光力学的方法に対して、ＵＶ光による単なる照射は、基本的に、それ自体で効果的であり、反応性化学薬品または光活性物質の添加物を必要としない、という利点を有している。

直接的な病原体不活化に最も効果的なのはＵＶＣである。しかしながら、ＵＶＣは、プラズマなどの蛋白質含有溶液または混濁浮遊液（例えば、血液およびＥＣ）には非常に浅い浸透深さまでしか浸透しないという欠点を有している。ＵＶＣは、第二次世界大戦中およびその直後に、プラズマおよびアルブミン溶液を殺菌するため、とりわけ肝炎ウイルスを不活化するために使用されていた。当時は、溶液を、ＵＶＣ光源を通過するように通過装置に薄膜として導入していた。この方法は、不確実だと証明され、中止された（非特許文献１)。

現在は、同じ原則に基づいて行なわれるさらに開発された方法が、治療上のプラズマ蛋白質製剤を殺菌するために使用されている。全ての場合において、比較的大きな体積、つまり、数百リットルまで、および、それ以上ものプラズマプールすなわち蛋白質溶液を処理することが考慮されていた、または、考慮されている（非特許文献２および非特許文献３）。
Kallenbach NR, Cornelius PA, Negus D他著「Inactivation of viruses by ultraviolet light」 Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus.、１９８９年、第５６頁、第７０頁から第８２頁 Hart H, Reid K, Hart W.著「Inactivation of viruses during ultraviolet light treatment of human intravenous immu noglobulin and albumin.」 Vox Sang、１９９３年；６４（２）：第８２頁から第８８頁 Chin S, Williams B, Gottlieb P他著「Virucidal short wavelength ultraviolet light treatment of plasma and factor VIII concentrate: protection of proteins by antioxidants」Blood、１９９５年；８６（１１）：第４３３１頁から第４３３６頁

多くとも数百ｍｌまでの体積の給血、プラズマ、またはＥＣの多数の個々のユニットを殺菌するためには、上記通過装置は適していない。しかしながら、まさしくこれが、血液バンクの日々の業務に必要なのである。

ＵＶＢは、ＵＶＣと同じ程度ではないとしても、微生物致死性および殺ウイルス作用が同様にある。ＵＶＢは、蛋白質含有溶液および混濁浮遊液に、ＵＶＣよりもややよく浸透するが、例えばプラズマへのその浸透深さは、ほんの数ミリメートルの範囲において測定される。

プラズマおよびＥＣは、普通は個々の給血から分離されるか、または、個々の給血者から機械によるアフェレーシスによって得られる。製剤の体積は、一般的に、約２００から３５０ｍｌの範囲内である。給血の体積は、普通は４５０から５００ｍｌの範囲内である。製剤を、平坦なプラスチック袋に、一般的には、冷凍して（プラズマ）、または、約４°Ｃで（給血、ＥＣ）貯蔵する。

上記製剤は、このような袋中で殺菌されることが望ましい。しかしながら、この場合は、製剤はＵＶ光をほとんど透過させず、特に血液およびＥＣは可視光をほとんど透過させないという既述の問題が生じる。

驚くべきことに、上記問題は、請求項１に記載の方法によって解決されるということが分かった。好ましい形態は、従属請求項の対象であるか、または、以下で説明されている。

本発明によれば、製剤、すなわち給血者の血（血液）、血漿（プラズマ）および／または赤血球濃縮物（ＥＣ）を、その感光袋中で適切な方法で動かす。その結果、容器中でサンプルが連続的に循環する。

この動作は、入射光を透過させることができるように非常に薄い層が液体および／または浮遊液内に部分的に形成される程度の強さで行なわれる。

同時に、この動作によって、液体体および／または浮遊液が袋中で効率的に混合される必要がある。以下の条件であればこれら双方が実現される。

１．感光袋は非常に柔軟で、感光中は固定されず、例えば、ガラスまたは水晶の板の間に挟み込まれない。したがって、感光袋は、袋が動かされるときに生じるプラズマおよび／または浮遊液（血液、ＥＣ）の形状変化に適合する。

２．感光袋は、最大の充填体積の多くても３０％まで、特に、多くても１５％まで充填されている。

３．袋は、例えば水平に（直線的に前後方向に、もしくは、円または楕円の形に）、または、垂直に（上下に）強く動かされる。

この場合、強い動作とは、以下（のそれぞれ、または、組合せ）のことと解釈する。

１．強い動作は、液体および／または浮遊液をただ混合する動作以上のことを意味する。

２．強く動かされる液体および／または浮遊液内において、ＵＶ光および／または可視光（後者は混濁および／または着色された液体および／または浮遊液、例えばＥＣに当てはまる）を透過させることができるような非常に薄い領域が、少なくとも一時的に異なる場所に形成される。

３．強い動作では動作方向の転換が非常に突然なので、感光袋中にある製剤の大部分は、その慣性によって元の方向へさらに動き、それにより、置き去りにされた残留部分が入射光を透過させることのできる薄い層を形成し得る。

同時に混合が連続的に行なわれ、最終的には、製剤（および、それに含まれる病原体）全体が感光され、それによって、製剤は殺菌される。

感光袋は、横になっている充填された状態でほんの数ｍｍの厚み、例えば１０ｍｍ未満、好ましくは５ｍｍ未満であり、例えば２００ｍｌから５００ｍｌまでのサンプル体積を受け入れるように定められている。しかしながら、感光袋の最大容量（体積）は、実際に感光袋に含まれる被処理サンプル体積よりも、少なくとも因数３だけ、普通は少なくとも６．６６倍、好ましくは少なくとも１０倍、または、少なくとも２０倍も大きい。

−実験的研究−
記載の実験は、方法の有効性を説明するものであり、上記ウイルスの不活化に制限されない。記載の実験において使用される、給血から派生したプラズマおよび／またはＥＣに限らず、本発明に係る方法は、他の方法で製造された製剤にも使用可能である。全ての記載の実験を、３〜６回実施した。表示された結果は、それぞれ、これらの実験の平均値を示す。

−プラズマユニットおよび赤血球濃縮物−
使用したプラズマユニットおよびＥＣは、個々の給血から通常の方法によって製造したものである。プラズマユニットおよびＥＣは、約２５０ｍｌから３００ｍｌまで、または、多くとも３５０ｍｌの体積を有していた。また、プラズマユニットおよびＥＣを、血液製剤のための通常のプラスチック袋に貯蔵した。残留の白血球および／または血小板を濾過によって除去した。ＥＣは、安定剤ＳＡＧ−Ｍ中で懸濁されていた。プラズマを、−３０℃未満の温度で貯蔵し、実験のために水槽に溶かした。ＥＣを、４〜８℃で冷蔵室に貯蔵した。

−ウイルスの研究−
プラズマおよび／またはＥＣの標本に、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、インディアナ株、ＡＴＣＣ ＶＲ−１５８）またはシンドビスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６８）またはブタヘルペスウイルス（ＳＨＶ−１、仮性狂犬病ウイルス、オーエスキー株、ＡＴＣＣ ＶＲ−１３５）を加えた。ウイルス力価を、ＣＰＥ検定（ＣＰＥ＝細胞変性効果（cytopathic effect））によって測定した。ウイルス力価を、ＴＣＩＤ５０（ＴＣＩＤ＝組織培養感染量（tissue culture infective dose））として表す。指標細胞として、ベロ細胞が機能した。実施した実験の当初のウイルス濃度は、約１０５〜１０７ＴＣＩＤ５０であった。

−感光装置、感光袋−
使用された感光装置の１つには、ＵＶＣ光（波長：２５４ｎｍ）を放つ管が備えられている。置かれた感光袋の両側から、すなわち、上下から照射を行なった。第２の感光装置には、ＵＶＢ光（２８０〜３２０ｎｍ）を放つ管が備えられている。同じく、両側から照射を行なった。第３の感光装置には、６３５ｎｍ前後の波長域の高輝度の赤色の光を放つＬＥＤ（発光ダイオード）が備えられている。３つの全ての装置を、運転中は１分あたり最大１００回転するオービタル振盪器（製造者：Ｂuｈｌｅｒ社、テュービンゲン、タイプＳＭ２５）上に置いた。使用された感光袋は、ＵＶ透過性のある薄く非常に柔軟なプラスチックシートでできている。

＜実験例１＞
−ＵＶＣによるプラズマ中のＶＳＶの不活化：照射中のプラズマの振盪速度および自由な動作可能性の影響−
感光袋のプラズマユニットにＶＳＶを加え、ＵＶＣを２分間照射した。一方のサンプルを１００ｒｐｍで振盪させた。この一方のサンプルは、照射の間は２つの水晶板の間にしっかりと装着されていた。他方のサンプルは水晶板の間にただ単に置いた。その結果、この他方のサンプルは、振盪中は袋の中で動くことができた。振盪器の回転数を３０から１００ｒｐｍの範囲内で変化させた。結果は［表１］にまとめられている。しっかりと装着されていたサンプルでは、ウイルス力価が、因数約０．３ｌｏｇ_１０しか低減されなかった。

緩めて置いたサンプルでは、回転数がウイルス不活化の程度に直接的な影響を有していた。未処理の対照標準サンプルに比べて、不活化因数は、３０ｒｐｍではたった約１．１ｌｏｇ_１０であり、５０ｒｐｍではたった約２．４ｌｏｇ_１０であったが、７５ｒｐｍでは約５．１ｌｏｇ_１０に上昇し、１００ｒｐｍでは約６．６ｌｏｇ_１０に上昇した。この実験の結果は、ＵＶ光の照射が有効になるようにプラズマを処理中に強く振盪させる必要がある、ということを証明している。しかしながら、振盪効果も現れるようにするため、光を通すことのできる薄い層が振盪中に形成されるようにサンプルも緩めて置かれている必要がある。

＜実験例２＞
−ＵＶＣの照射によるプラズマ中のＶＳＶ、シンドビスウイルス、および、ＳＨＶ−１の不活化：不活化動力学−
プラズマユニットに、ＶＳＶ、シンドビスウイルス、または、ＳＨＶ−１を加え、１〜５分間照射した。オービタル振盪器上に緩めて置いたサンプルを、１００ｒｐｍで動かした。対照標準サンプルに５分間照射したが、振盪はさせなかった。実験の結果は［表２］にまとめられている。振盪させたサンプルでは、ＶＳＶの力価が３分以内に因数６．５ｌｏｇ_１０よりも多く低減された。その一方で、振盪させなかった対照標準サンプルの不活化因数は、１．５ｌｏｇ_１０を上回らなかった。シンドビスウイルスは、ＶＳＶよりも安定性があると証明された。しかしながら、振盪させたサンプルと振盪させないサンプルとの大きな違いがここでも示された。５分間の照射時間の後、振盪させたサンプルのウイルス力価は、約５．１ｌｏｇ_１０低減されたのに対して、振盪させないサンプルのウイルス力価は、０．３０ｌｏｇ_１０しか低減されなかった。ＳＨＶ−１を使用した場合も同様の結果となった。振盪させたサンプルでは、ウイルス力価は４〜５分以内に因数４．３〜４．５ｌｏｇ_１０低減されたが、振盪させないサンプルでは、５分の照射の後に０．３ｌｏｇ_１０しか低減されなかった。

＜実験例３＞
−ＵＶＢの照射によるプラズマ中のＶＳＶの不活化：不活化動力学−
プラズマユニットにＶＳＶを加え、１〜５分間照射した。オービタル振盪器上に緩めて置いたサンプルを１００ｒｐｍで動かした。対照標準サンプルに５分間照射したが振盪はさせなかった。［表３］から分かるように、振盪させたサンプルではウイルス力価は５分以内に因数６．３６ｌｏｇ_１０低減されたが、振盪させなかった対照標準サンプルでは、約１．５ｌｏｇ_１０しか低減されなかった。この結果は、見い出された現象、すなわち強く振盪させることで緩めて置いたサンプル中の病原体不活化が向上する、ということは、ＵＶＣに限定されていないことを示す。

＜実験例４＞
−メチレンブルーおよび光を用いた光力学的な処理によるプラズマ中のＶＳＶの不活化−
プラズマユニットにＶＳＶを加え、０．２５μＭ／Ｌの光増感剤であるメチレンブルー（ＭＢ）を混合し、オービタル振盪器上で１００ｒｐｍの回転数で最長３０分間赤色ＬＥＤ光を照射した。対照標準サンプルに同じ濃度のＭＢを混合して２０分間感光させたが、その間は動かさなかった。［表４］に示すように、振盪させたサンプルのウイルス不活化の程度は、振動させないサンプルよりも非常に大きかった。振盪させたサンプルでは、ウイルス力価は、２０分後に因数約４．４ｌｏｇ_１０低減され、３０分後では約５．８ｌｏｇ_１０低減された。これに対して、動かさなかったサンプルでは、減衰因子は、２０分後に約２．７ｌｏｇ_１０を上回らなかった。

＜実験例５＞
−メチレンブルーおよび光を用いた光力学的な処理によるＥＣ中のＶＳＶの不活化−
ＥＣ標本にＶＳＶを加え、５μＭ／Ｌの光増感剤であるメチレンブルー（ＭＢ）を混合し、オービタル振盪器上で１００ｒｐｍの回転数で最大３０分間赤色ＬＥＤ光を照射した。これに対し、対照標準サンプルは、感光中は動かさなかった。実験のはっきりとした結果を［表５］に示す。振盪させたサンプルのウイルス不活化は、振盪させないＥＣサンプルよりも著しく速く行なわれるということは明らかである。処理中に動かしたサンプルでは、ウイルスは、３０分後にほぼ完全に不活化された（不活化因数６．７ｌｏｇ_１０）。これに対し、動かさないサンプルの減衰因子は３０分後、たった約２．７ｌｏｇ_１０であった。

実験例４および５の結果は、サンプルを感光中に強く振盪させる場合はプラズマまたは赤血球濃縮物の光力学的な処理の有効性も大幅に向上される、ということを証明している。

Claims (25)

1. 給血者の血、血漿、および、赤血球濃縮物のうちの少なくとも１つの中の病原体を不活化するための方法であり、
   給血、すなわち、給血者の血および機械によるアフェレーシスうちの少なくとも１つから得られる製剤を用意し、
   （ａ）適切な光活動性の物質の追加すると共に、前記光活動性の物質の吸収領域内の波長を含む、または、前記光活動性の物質の吸収領域内の波長のみからなる光を照射することにより光力学的に処理するステップ、または、
   （ｂ）前記製剤に２００から３２０ｎｍまでの波長の紫外（ＵＶ）光を照射するステップを含み、
   前記製剤は、個々に処理可能な分離して貯蔵される多数のユニットからなり、
   前記製剤が、それぞれ、光透過性（上記（ａ）の場合）、または、ＵＶ透過性（上記（ｂ）の場合）の柔軟で平坦な感光袋中にある、方法であって、
   前記感光袋は、前記感光袋の最大の充填体積の３０容量％未満に充填され、
   前記光力学的な処理およびＵＶ光の照射のうちの少なくとも１つの間に、前記感光袋の内容物が循環するように前記感光袋を動かし、前記動作によって、層厚の変化するゾーンを形成することを特徴とする方法。
2. 前記請求項１に記載の方法において、
   前記病原体は、ウイルス、および、バクテリアのうちの少なくとも一方であることを特徴とする方法。
3. 前記請求項１〜２のうちのいずれか１項に記載の方法において、
   前記動作によって、前記ゾーンは、規則的且つ一時的に１ｍｍ未満、好ましくは０．０５ｍｍ未満の層厚となる領域を有することを特徴とする方法。
4. 前記請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法において、
   前記動作、特に前記動作の振幅を、前記製剤内において規則的且つ一時的に０．０５ｍｍ未満の層厚の領域が生じるように行なうことを特徴とする方法。
5. 前記請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法において、
   内容物に接触しているまたは接触可能な前記感光袋の下面と上面との面積の合計は、前記内容物の内側全表面の面積の９０パーセントを上回り、好ましくは９９パーセントを上回っていることを特徴とする方法。
6. 前記請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法において、
   前記（ｂ）の場合、前記照射は、
   ３２０ｎｍ未満２８０ｎｍまでのＵＶＢ、および、２８０ｎｍ未満２００ｎｍまでのＵＶＣ、特には２６０ｎｍ未満２２０ｎｍまでのＵＶＣのうちの少なくとも一方であるか、または、
   ３２０ｎｍ未満２８０ｎｍまでのＵＶＢ、および、２８０ｎｍ未満２００ｎｍまでのＵＶＣ、特には２６０ｎｍ未満２２０ｎｍまでのＵＶＣのうちの少なくとも一方を含み、
   好ましくは前記のいずれかの範囲の波長の照射のみからなること特徴とする方法。
7. 前記請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法において、
   前記ユニットの各々は、１から６人の給血者、好ましくは１人の給血者のものであることを特徴とする方法。
8. 前記請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法において、
   ＵＶＢによる前記照射を、０．３〜１０Ｊ／ｃｍ^２、好ましくは０．５〜５Ｊ／ｃｍ^２の光エネルギーによって行なうことを特徴とする方法。
9. 前記請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法において、
   ＵＶＣによる前記照射を、０．０１〜５Ｊ／ｃｍ^２、特に０．１〜２Ｊ／ｃｍ^２の光エネルギーによって行なうことを特徴とする方法。
10. 前記請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記感光袋は、５０００ｍｌ以下の体積を有していることを特徴とする方法。
11. 前記請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記感光袋を、前記感光袋が動かされ照射される装置内に動作可能に保持し、特に、２つの面の間に装着しないことを特徴とする方法。
12. 前記請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    全感光期間の少なくとも４分の３、特に少なくとも６分の５は前記感光袋を動かすことを特徴とする方法。
13. 前記請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記感光袋を振盪、上下動作、および、回転のうちの少なくとも一方によって動かすことを特徴とする方法。
14. 前記請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記製剤は、プラズマであって、８０重量％を上回る血漿を含んでいることを特徴とする方法。
15. 前記請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記製剤は、ＥＣ製剤であって、１０から７５重量％の範囲内、好ましくは２０から６０重量％の範囲内のヘマトクリットを有していることを特徴とする方法。
16. 前記請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記光活動性の物質は、１つまたは複数のフェノチアジン染料、特にはチオニン、メチレンブルー、トルイジンブルー並びにアズール染料Ａ、ＢおよびＣのうちのいずれかであることを特徴とする方法。
17. 前記請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記光活動性の物質は、１つまたは複数のフタロシアニン化合物であることを特徴とする方法。
18. 前記請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記光活動性の物質は、１つまたは複数のポルフィリン化合物であることを特徴とする方法。
19. 前記請求項１６〜１８のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記光力学的な処理を、使用される１つまたは複数の光増感剤の吸収範囲（±２０ｎｍ）における波長のみによって行なうことを特徴とする方法。
20. 前記請求項１〜１９のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記感光袋は、最大の充填体積の多くとも１５％に充填されていることを特徴とする方法。
21. 前記請求項１〜２０のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    血漿を、ステップ（ａ）に基づき光増感剤を用いずに処理することを特徴とする方法。
22. 前記請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記振盪を、オービタル振盪器、プラットフォーム振盪器、シーソー式振盪器、または、タンブラー振盪器によって行なうことを特徴とする方法。
23. 前記請求項１〜２２のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記感光袋を片面で置くことで、動作または振盪の間に、および、動作または振盪によって、前記感光袋の高さを、前記感光袋が置かれた面と、前記感光袋の上面に対する交差点との間の距離（表面法線）に関して、前記感光袋の全上面に亘って連続的に変化させることを特徴とする方法。
24. 前記請求項１〜２３のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記感光袋は、５ｍｍ未満の平均的な充填レベルを有し、
    前記動作によって、前記平均的な充填レベルの半分未満の層厚、好ましくは１ｍｍ未満、または、０．０５ｍｍさえ下回る層厚の波の谷が連続的に生成されることを特徴とする方法。
25. 前記請求項１〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法において、
    前記感光袋を、前記感光中は０．２ｍｍを上回る、好ましくは１ｃｍを上回る、特に１〜１５ｃｍまたは２〜８ｃｍの振幅で少なくともｘ方向、および、必要に応じてｙ方向（ｙ方向は、ｘ方向に対して直角）へ連続的に動かし、
    これとは無関係に、動作の方向転換の振動数は、０．５Ｈｚを上回り、好ましくは１〜１０Ｈｚであることを特徴とする方法。