JP2009210265A

JP2009210265A - ダイヤモンドライクカーボン薄膜を形成した光学検出場

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Abstract

【課題】安定した物質吸着制御作用を発揮し、光学検出感度を向上させることができる光学検出場の提供。
【解決手段】物質の存在領域１１,１３,１５に臨む面にフッ素を含有するＤＣＬ薄膜１７を形成した光学検出場を提供する。ＤＣＬ薄膜１７は、原子比（F／F＋C＋H）が０〜４０％でフッ素を含有する。本発明に係る光学検出場１１は、特にリアルタイムＰＣＲ又はＤＮＡチップにおける蛍光性物質の検出に好適に採用されるものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、物質を光学的に検出するための光学検出場に関する。より詳しくは、物質の存在領域に臨む面にフッ素を含有するダイヤモンドライクカーボン薄膜を形成したことを特徴とする光学検出場に関する。

現在、分子生物学分野において、核酸やタンパク質などの物質を、蛍光標識試薬を用いて検出することが広く行われている。

遺伝子発現量の測定を行うリアルタイムPCRでは、例えば、PCR反応によって増幅されるDNAに蛍光標識試薬を取り込ませ、この蛍光標識試薬を取り込んだ増幅DNAを蛍光検出することにより、リアルタイムにDNAの増幅をモニターしている。

また、網羅的な遺伝子発現解析に用いられるDNAチップでは、細胞や組織のmRNAから合成したcDNAを蛍光試薬で標識し、基板上に固相化したプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、標識試薬を蛍光検出することによってcDNAとプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイズを検出している。

従来、リアルタイムPCRは、ポリプロピレン製やポリカーボネート製のチューブやマルチプレートを用いて行なわれている。しかし、これらのプラスチック製の容器は表面の物質吸着性が高いため、核酸や酵素が容器表面へ吸着され、解析精度が低下してしまうという問題があった。これを防止するため、反応溶液にウシ血清アルブミン(BSA)などを0.1％程度添加して、BSAの容器表面への競争吸着を利用して、核酸や酵素の吸着を抑制することが行なわれている。この競争吸着による核酸や酵素の吸着抑制は、一般に「ブロッキング」と呼ばれている。

また、DNAチップにおいても、蛍光標識された核酸が基板ガラス表面へ非特異的に吸着すると、シグナル−ノイズ比（S／N）が低下して、解析結果の信頼性に問題が生じることとなる。

このため、リアルタイムPCRやDNAチップといった光学検出系において、チューブやマルチプレート等の容器表面や、スライドガラス等の基板表面への物質の吸着を効果的に制御するための技術が求められていた。

そこで、出願人は、特許文献１に、検出表面への物質の非特異的吸着を有効に防止することができるバイオアッセイ用基板を開示している。このバイオアッセイ用基板は、基板に積層された炭素化合物層を、陰電荷を帯びるカルボキシル基などの官能基で修飾しておくことによって、反応領域内に存在する陰電荷を帯びる物質が反応領域内表面へ非特異的に吸着するのを、電気的反発により有効に防止できるものである。

特許文献１には、上記炭素化合物層は、ダイヤモンド又はダイヤモンドライクカーボンから形成されており、蛍光強度測定のため光透過性を備えるものであることが記載されている。

ここで、本発明に関連する技術として、ダイヤモンドライクカーボン薄膜（以下、「DLC薄膜」という）について説明する。

DLC薄膜は、熱CVD法などの化学蒸着やイオンプレーティング法などの物理蒸着を用いて形成できる。DLC薄膜は、緻密なアモルファス（非晶質）構造を有するため、表面平滑性が高く、優れたトラボロジー（摩擦磨耗）を発揮する。また、高熱伝導率、高絶縁耐性、耐熱性、耐腐食性、放射線耐性、Ｘ線吸収特性、化学物質に対する不活性、負の電子親和力などの特性を備えている。

DLC薄膜は、これらの特性を活用して、これまで切削工具や磨耗部品などに主に採用されてきた。現在では、半導体、平面パネルディスプレイ、放射線やＸ線などのモニター装置、歪み・圧力・温度・磁場などを検出するセンサ装置、電極材料などに利用されている。さらに、近年では、分子生物学分野への応用も進められてきており、上記特許文献１に開示される技術もその１つとなっている。

特開２００５−３４５１８１号公報

特許文献１に開示されるバイオアッセイ用基板では、炭素化合物層へ修飾付加したカルボキシル基の陰電荷と、陰電荷を帯びる物質との電気的反発により、物質の反応領域表面への非特異的吸着を防止するものである。このため、反応溶液のpHによっては、カルボキシル基の反応性に起因して、電気的反発が弱められる可能性があった。

そこで、本発明は、安定した物質吸着制御作用を発揮し、光学検出感度を向上させることができる光学検出場を提供することを主な目的とする。

上記課題解決のため、本発明は、物質の存在領域に臨む面にフッ素を含有するDLC薄膜を形成した光学検出場を提供する。
フッ素は、DLCの骨格である炭素原子よりも電気陰性度が高いため、フッ素を含有するDLC薄膜は負に帯電する。また、フッ素は反応性の官能基や解離基に比べて溶液中でも安定であるため、このDLC薄膜の負電位は極めて安定したものとなる。さらに、フッ素基を含有するDLC薄膜は、C-F結合の外界誘起分極率の低さ（動的分極率の低さ）に基づき、高い疎水性を発揮する。
従って、上記の光学検出場においては、DLC薄膜の安定した負電位に基づいて、陰電荷を帯びる物質の吸着を効果的に抑制することができる。また、DLC薄膜の高疎水性に基づく疎水相互作用によって、疎水性物質の吸着を促進することができる。
この光学検出場において、DLC薄膜は、原子比（F／F＋C＋H）で０〜４０％でフッ素を含有することが好適となる。
また、光学検出場に、物質を導入又は排出するための流路を連通させる場合には、流路の物質の存在領域に臨む面にもDLC薄膜を形成することができる。
この光学検出場は、特に、リアルタイムPCR又はDNAチップにおける蛍光性物質の検出に特に好適に用いることができるものである。

本発明により、安定した物質吸着制御作用を発揮し、光学検出感度を向上させることができる光学検出場が提供される。

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

図1は、本発明に係る光学検出場を配設したリアルタイムPCR用基板を示す図である。図１（A）は上面斜視図、（B）はA−A断面図を表す。この基板は、複数の遺伝子や複数の検体について網羅的な発現解析を行う際に好適に用いられるものである。

図1中、符号1で示される基板には、上面中央部に合計８箇所の反応領域11が設けられている。反応領域11は、PCR反応の場であって、測定対象とする標的DNAやプライマー、ヌクレオチド（dNTPs）、酵素（Polymerase）、蛍光標識試薬等の「物質の存在領域」であり、蛍光標識試薬の「光学（蛍光）検出場」ともなる。各反応領域11の物質の表面には、DLC薄膜17が形成されている（図1（B）参照）。

基板1の材質は、特に限定されないが、一般には、ポリプロピレン又はポリカーボネートが使用されている。他に、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリ乳酸、ポリメタクル酸樹脂、ピークなどの各種プラスチックやガラス、金属などを採用してもよい。基板1を閉蓋する蓋16は、蛍光標識試薬の光学検出のため、光透過性を備える透明な材質で形成されることが望ましい。なお、図1（A）では、蓋16を省略して示している（図1（B）参照）。

基板1の一端には、溶液注入部12が設けられており、溶液注入部12には反応溶液の導入流路13が連通されている。導入流路13の溶液注入部12の反対側は、分岐されて各反応領域11に連通されている。また、基板1の他端には、溶液抽出部14が設けられており、溶液抽出部14には反応溶液の排出流路15が連通されている。排出流路15の溶液抽出部14の反対側は、分岐されて各反応領域11に連通されている。

導入流路13及び排出流路15は反応溶液が流れる場であって、反応溶液中の標的DNAやプライマー、dNTPs、Polymerase、蛍光標識試薬等の「物質の存在領域」であり、当該領域の表面にはDLC薄膜17が形成されている。

なお、基板1では反応領域11を合計８箇所に設けているが、反応領域11の数は特に限定されない。また、導入流路13及び排出流路15の構成も図に示す態様に限定されない。

続いて、この基板1を利用したリアルタイムPCRについて簡単に説明する。ここでは、蛍光標識試薬として、核酸の二本鎖間に挿入結合され、この挿入結合された状態で励起されることで蛍光を発する「インターカレーター」を用いる場合を説明する。インターカレーターは、SYBER Green（登録商標）やTOTO-1、POPO-1等の通常用いられるものであってよい。

まず、予め発現量の測定を行う遺伝子に特異的なプライマーセットを設計し、各プライマーセットを反応領域11内に保持させる。プライマーは、溶液として調製したものを反応領域11内に分注する。若しくは、より好適には、分注後プライマー溶液を一旦乾燥させ反応領域11内に固着させる。

次に、標的DNA、ヌクレオチド（dNTPs）、酵素（Polymerase）、インターカレーター、塩を含む反応溶液を溶液注入部12から注入する。注入された反応溶液は導入流路13を流れ、各反応領域11内へ導入される。反応領域11内へ導入された反応溶液は、予め反応領域11内に保持されたプライマーを溶解する。

反応領域11内に過剰に導入された反応溶液は、排出流路15を流れて、溶液抽出部14から基板1外へ排出される。このとき、過剰な反応溶液とともに溶解されたプライマーが流出するのを防ぐため、各反応領域11内には適量の反応溶液が導入されるようにすることが望ましい。

反応溶液の導入後、反応領域11に対してサーマルサイクリングを行なうことにより、PCR反応を進行させる。サーマルサイクリングは通常のPCRと同様の条件で行うことができる。

このPCR反応において、標的DNAから増幅されるDNA中に挿入結合されたインターカレーターをリアルタイムに検出することにより、標的DNA量を測定する。インターカレーターの検出は、通常のリアルタイムPCR装置（以下、単に「装置」という）と同様の光学（蛍光）検出手段により行なうことができる。光学検出手段については、図2でその好適な構成について説明する。

次に、基板1に形成されたDLC薄膜17について説明する。図1中、符号17で示されるDLC薄膜は、反応領域11の表面、導入流路13及び排出流路15（以下、両者を合わせて単に「流路」とも称する）の表面に形成されている。

DLC薄膜17はフッ素を含有しているため、フッ素の高い電気陰性度に基づく負電位と、高疎水性を具備している。このため、DLC薄膜17を形成した反応領域11表面及び流路（導入流路13及び排出流路15）表面は、電気的反発により陰電荷を帯びる物質の吸着を阻害する作用を発揮する。また、疎水相互作用により疎水性物質の吸着を促進する作用を発揮する。

このDLC薄膜17の陰電荷を帯びる物質の吸着阻害作用によって、基板1では、陰電荷を帯びる核酸（この場合、標的DNA）の反応領域11表面及び流路表面への吸着を効果的に抑制することができる。

また、一般にタンパク質は、疎水性領域と親水性領域を有するので、その疎水性領域とDLC薄膜17との疎水相互作用を利用して、BSA等のタンパク質を反応領域11表面及び流路表面へ効率良く吸着させることができる。これにより、高いブロッキング効果が得られるため、より効果的に標的DNAの吸着を抑制し、プライマーやdNTPs、Polymerase、インターカレーターの吸着も抑制することができる。

ブロッキングは、反応溶液に先立って、BSA等のタンパク質溶液を溶液注入部12から注入することにより行なうことができる。ブロッキング後、タンパク質溶液は溶液抽出部14から基板1外へ排出する。また、ブロッキングは、タンパク質溶液を反応領域11内に分注した後、一旦乾燥させることにより、予め行なっておいてもよい。

従来のリアルタイムPCR用基板では、反応領域や流路の表面に標的DNAが吸着してしまうことで、標的DNAの量を正確に測定することができなかったり、反応領域や流路の表面に吸着した蛍光標識試薬からの蛍光がノイズとして検出されることにより、解析精度の低下が生じていた。

これに対して、上述の通り、本発明に係る光学検出場を配設したリアルタイムPCR用基板1では、反応領域11表面、導入流路13及び排出流路15の表面への標的DNAやインターカレーター等の吸着を効果的に抑制することができるため、従来生じていた上記の問題を解決し、高い解析精度を得ることができる。

このようなDLC薄膜の物質吸着制御作用は、DLC薄膜の水に対する濡れ性を調整することにより制御が可能である。

DLC薄膜の濡れ性は、DLC薄膜のフッ素含有率によって制御することが可能であり、本発明ではフッ素含有率を原子比（F／F＋C＋H）で0〜40％とすることで、DLC薄膜の純水に対する接触角は80度以上とし、好適な濡れ性を実現した。

本発明において、DLC薄膜は、膜厚が1nm-1000nm、可視光（波長300-600nm）の透過率が10％以下となるように構成することができる。

DLCは、SP³結合（ダイヤモンド結合）とSP²結合（グラファイト結合）とからなっており、ダイヤモンド結合を多く含むと透明性が高く、逆にグラファイト結合を多く含むと黒色となって透明性が低下する。このため、DLC薄膜のSP²結合とSP³結合の混成比（SP²／SP³）を調整することにより、DLC薄膜の光透過性を制御することが可能である。また、DLC薄膜の光透過性は、膜厚の調整によっても制御が可能である。

本発明では、SP²／SP³を0.5〜1.1とし、膜厚を1nm-1000nmとすることで、DLC薄膜の可視光の透過率を10％以下に制御した。

これにより、図1に示した本発明に係る光学検出場を配設したリアルタイムPCR用基板1では、反応領域11や導入流路13及び排出流路15からの蛍光の漏れを抑制して、蛍光検出感度を向上させることが可能となっている。

以下、図2に基づいて、このDLC薄膜による蛍光検出感度の向上効果についてより具体的に説明する。

図2は、リアルタイムPCRにおける蛍光検出を示す図である。（A）は本発明に係る光学検出場を配設した基板1を、（B）は従来の基板を用いた蛍光検出を表している。図中、符号3は励起光源、符号4は蛍光検出器である。図では、各反応領域（光学検出場）に対して励起光源3及び蛍光検出器4を独立に設けた装置により蛍光検出を行う場合を示した。このような装置は、反応領域を多数集積した基板における蛍光検出に好適に用いられるものである。なお、図中、符号5は後述する温度制御手段である。

まず、図2（B）に基づいて、従来の基板において蛍光検出感度の低下をもたらしていた要因を説明する。

図2（B）中、符号2で示される従来の基板では、反応領域の表面や排出流路（又は導入流路）の表面に吸着した蛍光標識試薬からの蛍光がノイズとして検出されることにより、解析精度の低下が生じていたことは上述の通りである。これは、特に基板2の材質としてポリプロピレンなどのプラスチックを用いた場合に顕著であった。加えて、プラスチックは光透過性を有するため、一の反応領域の蛍光が、隣接する他の反応領域に漏れ出すことがあった。

具体的に説明すると、一の反応領域21（符号211で示す）において、励起光源3からの励起光によってインターカレーターから発せられる蛍光（図2（B）矢印F₁参照）は、対応する蛍光検出器4によって検出される。この際、隣接する他の反応領域21（符号212で示す）から、蛍光の漏れ（矢印F₂参照）が生じると、蛍光検出器4においてこの漏出蛍光F₂を検出してしまうことがあった。

このような漏出蛍光の検出（以下、「クロストーク」という）は、反応領域211と連通する排出流路25（又は導入流路23）の表面にインターカレーターの吸着が生じている場合には、反応領域211と排出流路25との間でも生じえる（図中、矢印F₃参照）。

反応領域21間、又は反応領域21と排出流路25（又は導入流路23）間でのクロストークは、蛍光検出器4においてノイズとして検出されるため、蛍光検出感度の低下を引き起こす要因となっていた。さらに、基板2では、反応領域21を形成する基材の自家蛍光によるノイズも蛍光検出感度の低下を引き起こす要因となっていた。

これに対して、図2（A）に示す本発明に係る光学検出場を配設した基板1では、DLC薄膜17の光透過性を制御することで、反応領域11間、又は反応領域11と排出流路15（又は導入流路13）間でのクロストークを効果的に抑止することが可能である。

すなわち、基板1では、光透過性10％以下としたDLC薄膜17を、反応領域11表面、排出流路15（及び導入流路13）表面に形成したことにより漏出蛍光が遮断され、クロストークが発生しない。また、自家蛍光性の低いDLC薄膜17によって、基材からの自家蛍光の発生も抑止できる。従って、基板1では、クロストークや基材の自家蛍光によるノイズを低減し、高い蛍光検出感度を得ることが可能である。

次に、温度制御手段5とDLC薄膜17が有する高熱伝導性による効果について説明する。

温度制御手段5は、PCR反応の温度制御のために装置に設けられるものである。図2に示すように反応領域11ごとに個別の温度制御手段5を設ける場合には、ペルチェ素子等を好適に採用することができる。また、個別に温度制御手段5を設けない場合には、通常使用されるヒートブッロクを使用してもよい。

ここで、一般に、プラスチックの熱伝導度は、金属やガラス、シリコン、セラミックスに比べ、二桁程度低い。このため、従来のプラスチック製の基板では、温度制御手段5による加熱（又は冷却）温が反応領域内の反応溶液に伝わりにくいという問題があった。

このため、反応溶液が熱平衡状態に至るまでに時間がかかり、この間にプライマーのミスアニーリングによる非特異的な遺伝子増幅が生じることがあった。このような非特異的遺伝子増幅は、蛍光標識試薬としてインターカレーターを用いる場合には、標的DNAの増幅と区別されず検出されることとなるため、ノイズとして測定精度を低下させる要因となっていた。

これに対して、本発明に係る光学検出場を配設した基板1（図2（A）参照）では、温度制御手段5によって基板1に加えられた加熱（又は冷却）温は、優れた熱伝導性を備えるDLC薄膜17内を速やかに伝達され、反応領域11内の反応溶液を底面及び側面から加熱（又は冷却）する。

これにより、反応溶液が熱平衡状態に至るまでの時間を短縮することができ、プライマーのミスアニーリングに起因したノイズを低減して、測定精度を向上させることが可能となる。また、PCRの反応速度を高速化して、解析のハイスループット化を行なうことも可能となる。

以上、リアルタイムPCR用基板を例として、本発明に係る光学検出場について説明した。ここで、本発明に係る光学検出場は、リアルタイムPCRに限られず、物質の光学検出のために広く採用可能なものである。

好適な具体例として、DNAチップが挙げられる。DNAチップでは、遺伝子発現を調べたい細胞や組織のmRNAから合成したcDNAを、基板上の反応領域（物資の存在領域）に固相化したプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、cDNAにラベルした蛍光標識試薬やハイブリダイズ二本鎖に挿入結合する蛍光標識試薬（インターカレーター）の蛍光検出を行なう。

この際、基板上の反応領域として本発明に係る光学検出場を用いることで、DLC薄膜の吸着阻害作用によって、cDNAの反応領域及び流路表面への吸着を効果的に抑制することができる。また、DLC薄膜の疎水相互作用を利用してブロッキングを行なうことにより、cDNAやインターカレーター等の非特異的吸着を抑制することができる。

さらに、DLC薄膜との電気的反発によって、反応領域表面に固相化されたプローブオリゴヌクレオチドを、反応領域表面に対して垂直に保持することができるため、プローブオリゴヌクレオチドとcDNAとのハイブリダイズ効率を高め、解析精度を向上させることが可能となる。

従って、リアルタイムPCRの例で説明したように、本発明に係る光学検出場を配設したDNAチップにおいては、クロストークや基材の自家蛍光によるノイズを低減し、高い蛍光検出感度を得ることが可能である。

本発明におけるDLC薄膜は、熱CVD法などの化学蒸着やイオンプレーティング法などの物理蒸着などの公知の薄膜形成方法によって形成することができるが、複雑形状に均一に被覆できることや、フッ素の部分添加が容易であるという観点から、イオン注入法とプラズマCVD法とを融合させたプラズマイオン注入・製膜（Plasma-based ion implantation and deposition: PBIID）法が好ましい。

PBIID法では、まず、チャンバー内にメタン、エタン、プロパン、ベンゼン、トルエン、ベンジルアルコールなどの原料ガスを導入して、高周波やマイクロ波、直流放電などによってプラズマを発生させる。ここで、原料ガスとして、例えば、C₆F₆やC₆F_XH_6-X（X=1〜6）等のフッ素含有ガスを単独で、又は併用して用いることにより、フッ素を含有するDLC薄膜が得られる。DLC薄膜のフッ素含有率は、導入するフッ素含有ガスの種類や分圧調整によって制御することができる。PBIID法は、サンプルステージが高周波アンテナであるという特徴を有している。

続いて、プラズマ中に載置した基材にマイナスの高電圧パルスを印加して、連続的にイオン加速し、基材表面に堆積・製膜させる。加速電圧はパルス的に印加されるため、プラズマ発生と加速電圧とのデューティー比を制御することにより、基材の温度上昇を抑制して、常温で製膜することが可能となる。また、この際、加速電圧を調整することによって、SP²結合とSP³結合の混成比（SP²／SP³）を制御することが可能である。なお、SP²／SP³は、電子線エネルギー損失分光法（EELS）やラマン分光法により測定することができる。

＜実施例１＞
１．DLC薄膜の製膜試験
本実施例では、PBIID法を用いて、反応ウェルを形成した試験用基板表面にDLC薄膜を形成した。

試験用基板には、縦15 mm×横25 mm×厚さ0.6 mmのポリカーボネート板の表面に、縦0.5 mm×横0.5 mm×深さ0.2 mmの直方体のウェルを縦7列×横7列（ウェル間隔2mm）で形成したものを用いた。

製膜は、PBIID装置（栗田製作所）を用いて行なった。原料ガスはC₇H₈を気化させ、流量20CCMで真空チェンバに導入した。成膜中の真空度は1.3Paに保った。プラズマ発生のため、13.56MHz、500WのR.F.をパルス幅30μsecに設定し、加速電圧を2.5kV、パルス幅を5μsec、遅延時間を55μsecに設定して、2 kHzで15分繰り返した。

製膜試験の結果を、図3に示す。（A）は製膜前の試験用基板、（B）は製膜後の試験用基板である。

製膜を行なったDLC被覆基板（図3（B）参照）では、基板表面全体に均一にDLC薄膜が形成されている。また、深さ0.2mmのウェル底面にもDLC薄膜を形成可能であることが確認された。

＜実施例２＞
２．DLC薄膜の組成解析
本実施例では、実施例1で製膜したDLC薄膜に加え、フッ素含有DLC薄膜の製膜を行い、これらの組成をフーリエ変換赤外分光光度計を用いて分析した。フッ素含有DLC薄膜の製膜は、実施例1記載の製膜条件において、原料ガスにC₆F₆を用いた。

フーリエ変換赤外分光（Fourier Transform InfraRed spectrometer:FT-IR）の測定は、Thermo社製のNICOLET 8700を用いて、全反射吸収（Attenuated Total Reflection:ATR）法により行なった。

組成解析の結果を、図4に示す。図中、「DLC:F」はフッ素含有DLC薄膜のATR-FT-IRスペクトルを示している。「DLC:H」はフッ素を含有しないDLC薄膜のATR-FT-IRスペクトルを示している。また、「Polycarbonate」は対照として製膜前の試験用基板について測定を行ったものである。

フッ素含有DLC薄膜（以下、「DLC:F」という）のATR-FT-IRスペクトルでは、符号（A）で示す波数領域で、炭素原子とハロゲン原子との結合（Alkyl-Hal）に特徴的な吸収ピークが出現している。また、符号（B）で示す波数領域では、炭素原子間の二重結合（>C=C<）に特徴的な吸収ピークが出現している。

符号（C）で示す吸収ピークは、炭素原子と酸素原子の二重結合(C=O)の振動モードに基づくスペクトルであり、測定を行った全てのATR-FT-IRスペクトルで認められている。これは、ポリカーボネート板としてポリ炭酸エステル（下記、「化１」参照）板を用いたため、ポリ炭酸エステル内のC=O結合が検出されたためである。

DLC:FのATR-FT-IRスペクトルでは、Alkyl-Hal結合及び>C=C<結合の吸収ピークが存在するため、これらの吸収ピークに対して、C=O結合の吸収ピークが相対的に小さく検出されている。

一方、フッ素を含有しないDLC薄膜（以下、「DLC:H」という）のATR-FT-IRスペクトルは、若干の吸収率の低下は認められるが、ポリカーボネート基板のスペクトルと同等である。これは、DLC薄膜は赤外領域に対しては透明であるので、下地のポリカーボネート基板の吸収が測定されていることを示している。つまり、図３(B)に示す茶色に呈色した薄膜がDLCであることを示している。DLCは赤外分光法に対しては不活性だが、後述のラマン分光法で同定することが可能である。

以上の結果から、DLC:FとDLC:Hのそれぞれにおいて、所望の組成を有する薄膜が形成できていることが確認された。

＜実施例３＞
３．接触角の測定
本実施例では、実施例1及び実施例2で製膜したDLC:H及びDLC:Fについて、疎水性の評価を行なった。評価は、接触角測定装置（協和界面科学株式会社製：dropmaster DM300）を用いて、純水に対する接触角（Contact angle）を測定することにより行なった。

接触角の測定結果を、図5に示す。

製膜前の試験用基板（図中、「Polycarbonate」）の接触角は90度であり、DLC:H被覆基板の接触角は68度であった。

これに対して、DLC:F被覆基板では接触角は98度となり、DLC:H被覆基板及び製膜前の試験用基板に比べて接触角が増加した。

以上の結果から、DLC薄膜にフッ素を含有させることによって、水に対する濡れ性を制御でき、高い疎水性が得られることが確認された。

＜実施例４＞
４．光透過性の検討
本実施例では、実施例1で製膜したDLC:H被覆基板について、光透過性（着色程度）の評価を行なった。

図6は、実施例1記載の製膜条件において、製膜時間を変化させて製膜を行なったDLC:H被覆基板を示している。（A）は実施例1（製膜時間15min）で作製したDLC:H被覆基板、（B）及び（C）は製膜時間をそれぞれ5min及び1minに短縮して製膜を行なったDLC:H被覆基板を示している。

製膜時間を変化させてDLC:Hの膜厚を制御することにより、DLC薄膜被覆基板の光透過性（着色程度）を制御できることが分かる。

＜実施例５＞
５．SP²／SP³の測定
DLCは、SP³結合（ダイヤモンド結合）とSP²結合（グラファイト結合）とからなり、SP²結合とSP³結合の混成比（SP²／SP³）を調整することによって、DLC薄膜の光透過性を制御することが可能である。本実施例では、製膜条件を変化させることにより、SP²／SP³の調整を試みた。

実施例1記載の製膜条件において、加速電圧を変化させて製膜を行ない、得られたDLC:Hについて、ラマン分光法によってSP²／SP³を測定した。ラマンスペクトルの測定は、ジョバン・イボン社製の顕微レーザラマン分光装置Lab RAMを用いて行った。

SP²／SP³の測定結果を、図7に示す。図中、符号Gで示す波数1560cm^-1のラマンピーク（G-peak）はSP²結合に起因するピークであり、符号Dで示す波数1360 cm^-1のラマンピーク（Ｄ-peak）はSP³結合に起因するピークである。

図（A）に示すように、DLC:Hのラマンピークでは、G-peak とＤ-peakのピーク比がほぼ同程度となっている。これに対して、DLC:FのラマンピークではG-peakが高く（SP²／SP³は高く）なっている。このことから、成膜により得られた膜が炭素骨格を有することが分かる。

図（B）には、加速電圧を2.5kV及び10kVに変化させて成膜したDLC:Hのラマンスペクトルを示す。加速電圧を変えることにより、SP²／SP³比を変えられることが分かる。

＜実施例６＞
６．光透過率の測定
本実施例では、実施例1で作製したDLC:H被覆基板の光透過率の測定を行った。

大塚電子社製の分光器MCPD-7000を用いて得た透過スペクトルを、図8に示す。図中、横軸は照射光の波長、縦軸は光透過率を示す。

図に示すように、DLC:H被覆基板の光透過度は、400〜600nmの可視光領域で10％以下と顕著に抑制された。

＜実施例７＞
７．自家蛍光強度及びS／Nの測定
本実施例では、実施例1で作製したDLC:H被覆基板における自家蛍光の抑制効果及びS／N向上効果について検討した。

日立社製の蛍光分光光度計(FL-4500)を用いて測定した自家蛍光の強度を、図9に示す。図（A）は、DLC:H被覆基板に一定波長（473nm）の励起光を照射し、基板からの蛍光強度を測定した結果を示す。図（B）は、励起波長を520-700nmまで変化させ、一定波長（520nm）の蛍光強度を測定した結果を示す。

図中、符合1は、強い自家蛍光性を有するポリプロピレンにより形成した試験用基板（製膜なし）の自家蛍光である。このポリプロピレン基板にDLC:Hを被覆した基板（符号2参照）では、検出波長周辺の蛍光強度が低下し、基板の自家蛍光が抑制されていることが分かる。DLC:Hを被覆することにより、ポリプロピレン基板の自家蛍光強度を、自家蛍光性の低いポリカーボネート基板の自家蛍光強度（符号3参照）と同程度まで減少させることができた。

次に、DLC:H被覆基板のウェルに、PCR反応後のリアルタイム用PCR試薬（SYBER Green Master Mix：Applied Biosystems）を含む応溶液を50nL分注し、蛍光顕微鏡によるインターカレーターの蛍光を観察した。冷却CCDカメラで蛍光画像を取得し、画像処理によって蛍光強度を数値化した。

蛍光顕微鏡による観察像を、図10に示す。図（A）は製膜前の基板のウェルの蛍光像、図（B）はDLC:H被覆基板のウェルの蛍光像である。図中、中央部の正方形がウェルであり、ウェルは内部のインターカレーターの蛍光によって白色に輝いて観察されている。

図（A）に示す製膜前の基板では、ウェル外の基板領域も、基板の自家蛍光性により白色に輝いて観察されている。このため、 S／N（ウェルの蛍光強度／ウェル外の蛍光強度）は1.5と低かった。これに対して、図（B）に示す DLC:H被覆基板では、ウェル外の基板領域の輝度が抑制されており、ウェル内のインターカレーターに起因する蛍光のみが観察されていることが分かる。これにより、S／Nは2.3にまで向上した。

以上より、DLC:Hの被覆により、検出感度を５０％程度向上させることができることが確認された。

＜実施例８＞
８．核酸吸着阻害試験
本実施例では、実施例1及び実施例2で作製したDLC:H被覆基板及びDLC:F被覆基板について、その表面への核酸吸着量の評価を行った。

DLC:F被覆基板は、原料ガスC6F6、加速電圧2.5kV、RF power 500Wの条件で製膜した。また、DLC:H被覆基板は、原料ガストルエン、加速電圧2.5kV、 RF power 500Wの条件で製膜した。対照には、製膜前のポリカーボネート基板を用いた。各基板表面に、Cy3標識DNA（20mer, 10μM）を20μL液盛し、90分間室温で静置した。次にHEPES Buffer中に基板を浸漬しシェーカー（150rpm）で5分間洗浄した後、MilliQ水でリンスし、蛍光顕微鏡で吸着したDNA-Cy3の蛍光画像を取得し、画像処理により蛍光強度を数値化した。

蛍光強度の測定結果を、図11に示す。製膜前の基板では、Cy3標識DNAが吸着することにより蛍光強度が２倍程度まで増加した。これに対してDLC:H被覆基板及びDLC:F被覆基板では、蛍光強度の増加が抑えられ、基板表面への核酸の吸着が顕著に抑制されていることが分かる。

本発明に係る光学検出場は、種々の物質の光学検出のために用いることが可能であり、例えば、リアルタイムPCR用基板やDNAチップ等に好適に採用される。

本発明に係る光学検出場を配設したリアルタイムPCR用基板を示す図である。（A）は上面斜視図、（B）はA−A断面図である。リアルタイムPCRにおける蛍光検出を示す図である。（A）は本発明に係る光学検出場を配設した基板、（B）は従来の基板における蛍光検出を表す。製膜前の試験用基板（A）と、製膜後の試験用基板（B）を示す図である（実施例1）。フーリエ変換赤外分光スペクトルの測定結果（実施例2）を示す図である。純水に対する接触角の測定結果（実施例3）を示す図である。製膜時間を変化させて製膜を行なったDLC薄膜被覆基板の光透過性を示す図である（実施例4）。 SP²／SP³の測定結果（実施例5）を示す図である。光透過率の測定結果（実施例6）を示す図である。自家蛍光強度の測定結果（実施例７）を示す図である。 S／Nの測定結果（実施例7）を示す図である。核酸吸着試験の結果（実施例8）を示す図である。

符号の説明

1 基板
2 従来基板
11, 111, 211, 212 反応領域
12 溶液注入部
13 導入流路
14, 24溶液抽出部
15, 25排出流路
16, 26蓋
17 DLC薄膜
3 励起光源
4 蛍光検出器
5 温度制御手段
F₁, F₂, F₃ 蛍光

Claims

物質の存在領域に臨む面にフッ素を含有するダイヤモンドライクカーボン薄膜を形成した光学検出場。
前記ダイヤモンドライクカーボン薄膜は、原子比（F／F＋C＋H）が０〜４０％でフッ素を含有することを特徴とする請求項１記載の光学検出場。
物質を導入又は排出するための流路が連通されており、
該流路の物質の存在領域に臨む面にも前記ダイヤモンドライクカーボン薄膜が形成されていることを特徴とする請求項２記載の光学検出場。
リアルタイムPCR又はDNAチップにおいて蛍光性物質の検出に用いられることを特徴とする請求項３記載の光学検出場。