JPWO2017115863A1 - マイクロ流体デバイスおよび観察方法 - Google Patents

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Abstract

マイクロ流体デバイスであって、電磁波透過性を有する基板と、前記基板と離間し、前記基板に対向して配置された蓋部材と、前記基板と前記蓋部材との間に設けられ、所定の波長の電磁波を吸収する光吸収層が配置される流路と、前記流路に向けて開口しかつ解析対象が導入される複数のマイクロウェルを有し、前記基板上に形成されたマイクロウェルアレイと、を備える。

Description

本発明は、マイクロ流体デバイスおよび観察方法にかかり、特に、生体分子解析キットに用いられる際に好適な技術に関する。
本願は、２０１５年１２月２８日に日本に出願された特願２０１５−２５７２６４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年研究や診断を目的とし、生体物質や細胞に対する蛍光物質を用いた測定が行われている。たとえばイン サイチュー ハイブリダイゼーション法（FISH法）は、蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブと、目的の遺伝子とをハイブリダイゼーションさせた後、蛍光顕微鏡で検出することでがんの診断を行う手法である。
例えば、特許文献１では、デジタルイライザ法は１分子のタンパク質を微小なウェルへ入れた後、蛍光顕微鏡観察によりタンパク質分子が入ったウェルをカウントする手法であり、１ピコリットル（ｐｌ）以下の容積を有する微小空間内で酵素反応を行うことでタンパク質検査が可能であることが示されている。また、特許文献２では微小空間内でインベーダー反応を行うことで遺伝子の１塩基の違いを検出する方法が示されている。
日本国特開２００４−３０９４０５号公報 国際公開第２０１５／１１５６３５号パンフレット
しかしながら、蛍光顕微鏡で試料の蛍光を観察する際に、観察領域となるウェルの外に蛍光を発する物質が存在すると観察の際にノイズ発生の原因となる。そのため、目的の蛍光を鮮明に観察することができない。特に、ウェル封止用のオイル内に蛍光物質が残留する場合や、観察面と逆側に位置する基板が自家蛍光を有する場合などに、ノイズの発生の問題が著しかった。
また、蛍光顕微鏡で試料の蛍光を観察する際には、蛍光顕微鏡のピントをウェル位置に合わせる必要があるが、蛍光顕微鏡のピント合わせは、明視野でおこなわれる。ところが、ウェルの状態によっては、ピントが合わせづらい場合があり、観察精度が低下するという問題があった。
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたもので、蛍光ノイズ発生の少ない生体分子解析キット及び精度の高い蛍光観察方法となるマイクロ流体デバイスおよび観察方法を提供するという目的を達成しようとするものである。
本発明の第一態様に係るマイクロ流体デバイスは、電磁波透過性を有する基板と、前記基板と離間し、前記基板に対向して配置された蓋部材と、前記基板と前記蓋部材との間に設けられ、所定の波長の電磁波を吸収する光吸収層が配置される流路と、前記流路に向けて開口しかつ解析対象が導入される 複数のマイクロウェルを有し、前記基板上に形成されたマイクロウェルアレイと、を備える。
前記光吸収層が、前記解析対象に応じた波長の光を吸収する光吸収材を含んでいてもよい。
前記光吸収層が、液体であってもよい。
前記光吸収層としての前記液体が、前記マイクロウェルに導入される水性液体と混和しにくい液体であってもよい。
前記光吸収層が着色成分を含んでいてもよい。
本発明の第二態様に係る蛍光観察キットは、上記態様に係るマイクロ流体デバイスを備える。
本発明の第三態様に係る観察方法は、上記態様に係るマイクロ流体デバイスを準備し、前記流路に前記解析対象を含む水性液体を送液し、前記マイクロウェルに前記水性液体を導入し、前記流路に封止液として前記光吸収層を送液し、前記マイクロウェルに導入された前記水性液体の上に封止層として前記光吸収層を形成し、前記水性液体を前記マイクロウェル内に封入し、前記マイクロウェルに第１の電磁波を照射し、前記マイクロウェルから放出される第２の電磁波を検出する。
前記マイクロウェルに対して前記電磁波を照射した後に、前記基板の外面から前記マイクロウェルを観察してもよい。
前記マイクロウェルの内部に位置する観察面と前記光吸収層とが接しており、前記観察面で前記解析対象を検出してもよい。
前記マイクロウェルの内部に位置する観察面よりも前記光吸収層が観察方向遠方に位置し、前記観察面で前記解析対象を検出してもよい。
前記マイクロウェルの前記内部に導入される前記解析対象を含む物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および細胞のうちいずれか１つを含み、前記解析対象がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質のうちいずれか１つであってもよい。
前記マイクロウェルの前記内部に位置する前記観察面上に配置された前記水性液体において酵素反応が行われたときに、前記酵素反応によるシグナルを検出してもよい。
前記解析対象が核酸であり、前記酵素反応がインベーダー反応であってもよい。
本発明の第四態様に係る光吸収層用光吸収剤は、所定の波長の電磁波を吸収する材料を含有し、前記材料は、電磁波透過性を有する基板と、前記基板と離間し、前記基板に対向して配置された蓋部材と、前記基板と前記蓋部材との間に設けられ、前記材料が配置される流路と、前記流路に向けて開口しかつ解析対象を含む水性液体が導入される複数のマイクロウェルを有し、前記基板上に形成されたマイクロウェルアレイとを備えるマイクロ流体デバイスに用いられ、前記水性液体上に配置され、前記電磁波を吸収するように構成されている。
本発明の第五態様に係るノイズ軽減方法は、上記態様に係る光吸収剤を用いて、前記マイクロ流体デバイスから発せられる測定対象電磁波におけるノイズの発生を軽減する。
本発明の第六態様に係るノイズ軽減方法は、上記態様に係る光吸収剤に加え、前記マイクロウェルの壁部を着色し、前記マイクロ流体デバイスから発せられる測定対象電磁波におけるノイズの発生を軽減する。
本発明の上記態様に係るマイクロ流体デバイスは、電磁波透過性を有する基板と、前記基板と離間し、前記基板に対向して配置された蓋部材と、前記基板と前記蓋部材との間に設けられ、所定の波長の電磁波を吸収する光吸収層が配置される流路と、前記流路に向けて開口しかつ解析対象が導入される複数のマイクロウェルを有し、前記基板上に形成されたマイクロウェルアレイと、を備える。
そのため、前記マイクロウェル内部となる観察面に対して前記基板の外面（前記基板側）となる観察方向より遠方となる流路内に光吸収層が設けられている。
そのため、流路内に蛍光物質が残留する場合や、蓋部材が自家蛍光を有する場合などであっても、観察領域となるウェルの外から発生する蛍光を光吸収層によって遮断し、観察の際にノイズの発生の原因となる蛍光を低減することができる。これにより、Ｓ／Ｎ比を向上して、目的の蛍光を鮮明に観察することが可能となる。上記態様に係るマイクロ流体デバイスによれば、光吸収層として着色した封止液を適用することにより、非観察領域に存在する蛍光を発する物質からマイクロウェルへ照射する蛍光を減少させ、測定時のノイズ発生を低減することを可能とし、精度の高い測定を実現して、観察精度を向上したマイクロ流体デバイスを提供することが可能となる。
本発明の上記態様に係るマイクロ流体デバイスは、前記光吸収層が、前記解析対象に応じた波長の光（観察光）を吸収する光吸収材を含有することにより、流路内に蛍光物質が残留する場合や、蓋部材が自家蛍光を有する場合などであっても、観察領域となるウェルの外（観察領域外）から発生する蛍光を光吸収層によって吸収し、観察の際にノイズ発生の原因となる蛍光を低減することができる。
ここで、前記観察光の波長が、蛍光波長または励起波長、あるいは、蛍光波長と励起波長との両方とされることが可能である。すなわち、前記光吸収層が、観察する蛍光波長を有する光または励起波長を有する光、または、蛍光波長を有する光と励起波長を有する光との両方を吸収する物質を含むことが可能である。
本発明の上記態様に係るマイクロ流体デバイスは、前記光吸収層が、液体であることにより、マイクロウェルに導入された解析対象物質（解析対象）を含む水性液体の上側（上部）に封止層としての前記光吸収層を形成させて、封止層に蛍光物質が残留する場合や、蓋部材が自家蛍光を有する場合などであっても、観察領域となるウェルの外から発生する蛍光を光吸収層によって吸収し、観察の際にノイズ発生の原因となる蛍光を低減することができる。しかも、流路に封止層としての液体を充填するだけで光吸収層を形成することが可能となるため、作業工程の増加を必要とせず、構成部品の増加もない状態で、ノイズ発生を低減してＳ／Ｎ比を向上し、観察精度を向上することが可能となる。
本発明の上記態様に係るマイクロ流体デバイスは、前記光吸収層としての前記液体が、前記マイクロウェルに導入される水性液体と混和しにくい液体であることにより、マイクロウェルの開口付近に位置する光吸収層となる液体が、マイクロウェルに導入される水性液体と混和しにくい状態を維持して、光吸収層となる液体によって、マイクロウェル内の液体を封止する。さらに、観察領域となるウェルの外（観察領域外）から発生する蛍光を光吸収層によって吸収し、観察の際にノイズ発生の原因となる蛍光を低減することができる。
ここで、光吸収層を構成する液体が水と混和しにくい液体、例えば親油性を有する液体で構成することができる。
本発明の上記態様に係るマイクロ流体デバイスは、前記光吸収層が着色成分を含むことにより、着色成分によって観察領域となるウェルの外（観察領域外）から発生する蛍光を光吸収層によって吸収し、観察の際にノイズ発生の原因となる蛍光を低減することができる。さらに、光吸収層における着色成分以外の液体によってマイクロウェル内の液体を効果的に封止することができる。
本発明の上記態様に係る蛍光観察キットは、上記態様に係るマイクロ流体デバイスを有することで、作業工程を増加させず、構成部品の増加もない状態で、製造コストを増加させず、ノイズの発生を低減してＳ／Ｎ比を向上し、観察精度を向上することが可能な蛍光観察キットを提供することができる。
本発明の上記態様に係る観察方法は、上記態様に係るマイクロ流体デバイスを準備し、前記流路に前記解析対象を含む水性液体を送液し、前記マイクロウェルに前記水性液体を導入し、前記流路に封止液として前記光吸収層を送液し、前記マイクロウェルに導入された前記水性液体の上に封止層として前記光吸収層を形成し、前記水性液体を前記マイクロウェル内に封入し、前記マイクロウェルに第１の電磁波を照射し、前記マイクロウェルから放出される第２の電磁波（例えば、蛍光又は燐光）を検出する。
上記態様に係る観察方法によれば、前記マイクロウェル内部となる観察面に対して前記基板の外面（基板側）となる観察方向より遠方となる流路内に光吸収層を設けて、マイクロウェルに導入された解析対象物質（解析対象）を含む水性液体の上に封止層としての前記光吸収層を形成してマイクロウェルを封止する。また、封止層に蛍光物質が残留する場合や、蓋部材が自家蛍光を有する場合などであっても、観察領域となるウェルの外（観察領域外）から発生する蛍光を光吸収層によって遮断又は吸収することができる。しかも、流路に封止層としての液体を充填するだけで光吸収層を形成することが可能となるため、作業工程の増加を必要とせず、構成部品の増加もない状態で、ノイズの発生を低減してＳ／Ｎ比を向上し、観察精度を向上することが可能となる。
本発明の上記態様に係る観察方法は、前記マイクロウェルに対して前記電磁波を照射した後に、前記基板の外面（基板側）から前記マイクロウェルを観察することにより、観察の際にノイズ発生の原因となる蛍光を低減することができる。
本発明の上記態様に係る観察方法は、前記マイクロウェル内部に位置する観察面と前記光吸収層とが接しており、前記観察面で前記解析対象を検出するか、または、前記観察面よりも前記光吸収層が観察方向遠方に位置し、前記観察面で前記解析対象を検出することにより、蛍光視野において、マイクロウェルを観察する際のノイズの発生を低減可能とできる。さらに、明視野においてマイクロウェル内部に位置する観察面にピントをあわせる際に、ピント合わせを正確にかつ迅速におこなって、観察の正確性と作業時間の短縮とを実現するとともに、鮮明な蛍光観察を可能にすることが可能となる。
本発明の上記態様に係る観察方法は、前記マイクロウェル内部に導入される解析対象を含む物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および細胞のうちいずれか１つを含み、前記解析対象がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質のうちいずれか１つであってもよい。
本発明の上記態様に係る観察方法は、前記マイクロウェルの前記内部に位置する前記観察面上に配置された前記水性液体（微小液滴）において酵素反応が行われたときに、前記酵素反応によるシグナルを検出することができる。
本発明の上記態様に係る観察方法は、前記解析対象が核酸であり、前記酵素反応がインベーダー反応であってもよい。
本発明の上記態様に係る光吸収層用光吸収剤は、所定の波長の電磁波を吸収する材料を含有し、前記材料は、電磁波透過性を有する基板と、前記基板と離間し、前記基板に対向して配置された蓋部材と、前記基板と前記蓋部材との間に設けられ、前記材料が配置される流路と、前記流路に向けて開口しかつ解析対象を含む水性液体が導入される複数のマイクロウェルを有し、前記基板上に形成されたマイクロウェルアレイとを備えるマイクロ流体デバイスに用いられ、前記水性液体上に配置され、前記電磁波を吸収するように構成されている。
本発明の上記態様に係るノイズ軽減方法は、上記態様に係る光吸収剤を用いて、前記マイクロ流体デバイスから発せられる測定対象電磁波におけるノイズの発生を軽減する。
本発明の上記態様に係るノイズ軽減方法は、上記態様に係る光吸収剤に加え、前記マイクロウェルの壁部を着色し、前記マイクロ流体デバイスから発せられる測定対象電磁波におけるノイズの発生を軽減する。
上記態様によれば、１ナノリットル（ｎｌ）以下の容積を有する微小空間（マイクロウェル）内で酵素反応を行い、蛍光顕微鏡で蛍光を観察する際に、観察領域外（非観察領域）に蛍光を発する物質が存在すると観察の際にノイズ発生の原因となり、目的の蛍光を鮮明に観察することができないという問題を解決することができる。また、上記態様によれば、非観察対象からの蛍光ノイズの削減をすることができ、鮮明な蛍光観察を可能にするマイクロ流体デバイスおよび観察方法を提供することができるという効果を奏する。
本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す断面図である。 本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび観察方法を示す拡大断面図である。 本発明の第２実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 本発明の第２実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す断面図である。 本発明の第２実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび観察方法を示す拡大断面図である。 本発明の実施例に係るマイクロ流体デバイスおよび観察方法における光吸収層を設けた蛍光画像を示す図である。 本発明の実施例に係るマイクロ流体デバイスおよび観察方法における光吸収層を設けない蛍光画像を示す図である。 本発明の実施例に係るマイクロ流体デバイスおよび観察方法における光吸収層を設けた蛍光画像を示す図である。 図９におけるラインスキャンの距離と蛍光強度との関係を示す図である。 本発明の実施例に係るマイクロ流体デバイスおよび観察方法における光吸収層を設けない蛍光画像を示す図である。 図１１におけるラインスキャンの距離と蛍光強度との関係を示す図である。 本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。
以下、本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび観察方法を、図面に基づいて説明する。本明細書において、各図面における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
図１は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図であり、図２は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す断面図（図１のｂ−ｂ線矢視断面図）であり、図１および図２において、符号１は、マイクロ流体デバイスである。
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１は、生体分子解析方法を適用可能な生体分子解析キットである。本実施形態に係る生体分子解析キットでは、解析する生体分子として、細胞、エクソソーム、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ（以下、ＲＮＡ類と言うことがある。）、タンパク質のうちいずれか１つが選ばれる。本実施形態に係る生体分子解析キットは、例えば、核酸定量用アレイデバイスとされている。
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１は、図１，図２に示すように、基板１０と、基板１０と対向配置された蓋部材２０と、基板１０と蓋部材（カバー部）２０との間に設けられたマイクロウェルアレイ（微小孔アレイ層）３０と、光吸収層４０（光吸収層４０が配置される流路）とを備えている。
換言すれば、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１は、第一面と第一面の反対に設けられた第二面とを有する基板１０と、基板１０の第一面と対向配置された蓋部材２０と、基板１０の第一面と蓋部材２０との間であって、基板１０の第一面上に設けられたマイクロウェルアレイ３０と、光吸収層４０（光吸収層４０が配置される流路）とを備えている。
基板１０とマイクロウェルアレイ３０とは反応容器を形成している。
なお、複数のマイクロウェル３３が設けられた領域をマイクロウェルアレイ領域ｍと示している。
基板１０は、実質的に透明な材料から形成される板状部材であり、電磁波透過性を有する。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。基板１０が電磁波透過性を有することにより、マイクロ流体デバイス１に封入した試料に生じる蛍光、燐光等を基板１０側（基板１０の外面、基板１０の第二面）から観察することができる。
基板１０の電磁波透過性は、所定の波長範囲に限られてもよい。例えば、マイクロウェル内の試料について、可視光領域である３５０〜７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合には、少なくとも上記波長範囲（３５０〜７００ｎｍ）の可視光に対して透過性を有する基板を用いればよい。
基板１０を形成する材料としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂基板としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合・積層されていてもよい。
基板１０の厚みは、適宜決定することが出来るが、例えば５ミリメートル（ｍｍ）以下が好ましく、２ｍｍ以下がより好ましく、１．６ｍｍ以下がさらに好ましい。
基板１０は、核酸定量用アレイデバイスを搬送する装置や作業者の手作業による取扱い時に破損しない程度の剛性を持ったものであればよい。
基板１０は、後述する試料分析方法では蛍光や燐光を利用するため、観察結果の検出に使用する波長において、自家蛍光を有しないか、自家蛍光を有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることが好ましい。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光であれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
蓋部材２０は、板状またはシート状、フィルム状に形成された部材であり、蓋部材２０の厚さ方向に貫通する第一孔（注入孔）２１および第二孔２２を有する。第一孔２１および第二孔２２は、完成したマイクロ流体デバイス１において、マイクロウェルアレイ３０を含む内部空間（流路）Ｓと連通しており、それぞれ内部空間に流体を供給する入口および流体が排出される出口として機能する。
蓋部材２０を形成する材料や蓋部材２０の厚みについては、基板１０と同様とすることができる。
蓋部材２０は、蓋部材２０と基板１０との間に隙間を有して複数の反応容器の開口部分（開口部）を覆うように基板１０に重ねられている。基板１０と蓋部材２０との間に設けられた空間は、各種の液体が流れる流路となる。本実施形態では、基板１０と蓋部材２０との間に設けられた空間において、注入口部である第一孔２１から排出口部である第二孔２２へ向かって各種の液体が流れる。
蓋部材２０の電磁波透過性については適宜設定できる。すなわち、後述する電磁波照射工程を蓋部材２０側（蓋部材２０の外面）から行わない場合は、蓋部材２０は電磁波透過性を有さなくてもよい。
マイクロウェルアレイ３０は、基板１０上に設けられた底部層３１と、底部層３１上に形成された壁部層３２とを備えており、アレイ状に形成された複数のマイクロウェル３３を有する。基板１０と蓋部材２０との間の内部空間Ｓにおいて、マイクロウェルアレイ３０と蓋部材２０との間には隙間が存在する。この隙間は、複数のマイクロウェル３３、並びに第一孔２１および第二孔２２と連通する流路として機能する。本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１において、底部層３１は設けないように構成することもできる。
マイクロウェルアレイ３０は、複数の貫通孔が並べて形成された層である。本実施形態に係るマイクロウェルアレイ３０においては、例えば、マイクロウェルアレイ３０の層厚は３μｍで、底部層３１と蓋部材２０との間には１００μｍの間隔が流路として空けられている。マイクロウェルアレイ３０と基板１０とで形成される反応容器としてのマイクロウェル３３は、一端に開口部を有する有底円柱形状の空間である。
本実施形態に係るマイクロウェル３３は、例えば、直径が５μｍ、中心線方向の高さが３μｍの円柱形状である（微小空間の容積は約６０フェムトリットル（ｆｌ））。
反応容器としてのマイクロウェル３３の容積は適宜設定されてよいが、マイクロウェル３３の容積が小さい方がシグナル検出可能となるまでの反応時間を短縮可能である。
一例としては、各マイクロウェル３３の容積は、１００ピコリットルまたは１００ピコリットル以下である。
なお、本実施形態において、タンパク質を解析するために本実施形態の構成を適用することも可能である。
各反応容器としてのマイクロウェル３３同士の中心線間の距離（ピッチ）は、各マイクロウェル３３の直径よりも大きければよい。
各マイクロウェル３３の間隔（隙間）の大きさは、各マイクロウェル３３において独立してシグナル検出ができる分解能に応じて設定される。
各マイクロウェル３３は、平面視した（鉛直方向から観察した際に）マイクロウェルアレイ３０の主面に対して三角格子状を形成して配列されている。なお、各マイクロウェル３３の配列のされ方は特に限定されない。
底部層３１を設けない場合には、マイクロウェルアレイ３０に形成されたマイクロウェル３３と、基板１０の表面とによって、基板１０を底面部とする有底筒状の微小なマイクロウェル３３が形成されている。
底部層３１を設ける場合には、マイクロウェルアレイ３０に形成されたマイクロウェル３３と、底部層３１の表面とによって、底部層３１を底面部とする有底筒状の微小なマイクロウェル３３が形成されている。
具体的には、シグナルを飽和させて十分なシグナルを発生させるのにかかる時間を短縮する目的がある場合には、解析対象の分子が１ウェルに１つ以下となる液量に基づいて、反応容器となるマイクロウェル３３の容積が設定される。
マイクロウェルアレイ３０の材質は、樹脂やガラス等であってよい。マイクロウェルアレイ３０の材質は、基板１０の材質と同じでもよいし、基板１０の材質と異なっていてもよい。また、マイクロウェルアレイ３０は基板１０と同じ材料で、マイクロウェルアレイ３０と基板１０とが一体化されていてもよい。
また、マイクロウェルアレイ３０は基板１０と同じ材料でマイクロウェルアレイ３０と基板１０とが一体成型されていてもよい。樹脂から形成されたマイクロウェルアレイ３０の材質の例としては、シクロオレフィンポリマーや、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂などが挙げられる。なお、マイクロウェルアレイ３０の例として示されたこれらの材質はあくまでも例であり、マイクロウェルアレイ３０の材質はこれらには限られない。
また、マイクロウェルアレイ３０は着色されていてもよい。マイクロウェルアレイ３０が着色されていると、マイクロウェル３３内で蛍光、発光、吸光度等の光の測定をする場合に、測定対象となるマイクロウェル３３に近接する他のマイクロウェル３３からの光の影響が軽減される。
マイクロウェルアレイ３０は、基板１０に積層された疎水性膜のベタパターン（基板１０の全面に疎水性膜が形成されている状態）に対してエッチング，エンボス形成，あるいは切削等の加工が施されることによって反応容器としてのマイクロウェル３３が形成される。また、マイクロウェルアレイ３０が基板１０と一体成型される場合は、基板１０にエッチング，エンボス形成、あるいは切削等の加工が施されることによって、マイクロウェルアレイ３０のマイクロウェル３３に相当する部分が形成される。これによって、疎水部及び親水部を有するパターンを基板に形成することができる。
マイクロウェルアレイ３０として底部層３１を設ける場合には、底部層３１がマイクロウェル３３の底面を構成する。マイクロウェル３３の底面に親水性を付与したい場合は親水性材料で底部層３１を形成し、マイクロウェル３３の底面に疎水性を付与したい場合は疎水性材料で底部層３１を形成することができる。底面の特性が基板１０の特性で問題ない場合は、底部層３１を設けずに、基板１０上に直接壁部層３２が形成されてもよい。底部層３１を設ける場合は、電磁波透過性を有するように形成して、基板１０側（基板１０の外面、基板１０の第二面）からのマイクロウェル３３内の試料観察の妨げにならないようにする。
この場合、壁部層３２を、有色の材料で形成することができるが、壁部層３２は基板１０と同様の電磁波透過性を有することもできる。壁部層３２は、厚さ方向に見た状態においてアレイ状に設けられた複数の貫通孔３２ａを有する。各貫通孔３２ａの内面は、各マイクロウェル３３の内壁面を構成する。
壁部層３２を形成する材料としては、樹脂に所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を混合した材料を用いることができる。樹脂材料としては、マイクロウェル３３に求める特性等を考慮して、底部層３１と同様に、樹脂の構成成分の分子が親水性基を有する親水性樹脂と、樹脂の構成成分の分子が疎水性基を有する疎水性樹脂と、のいずれも用いることができる。
親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、エステル基等が挙げられる。親水性樹脂の例としては、例えば、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン−酢酸ビニル共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。
疎水性樹脂の例としては、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。
親水性樹脂および疎水性樹脂のいずれも、熱可塑性樹脂であっても熱硬化性樹脂であってもよい。さらに、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。樹脂材料としてフォトレジストを用いると、フォトリソグラフィにより壁部層３２に多数の微細な貫通孔を精度良く形成することができる。
レジストを用いない場合は、例えば射出成型等により壁部層３２を形成することができる。
有色成分としては、有機質又は無機質の顔料が例示できる。具体的には、黒色顔料としては、カーボンブラック、アセチレンブラック、鉄黒、黄色顔料としては、クロム黄、亜鉛黄、黄土、ハンザイエロー、パーマネントイエロー、ベンジンイエロー、橙色顔料としては、オレンジレーキ、モリブデンオレンジ、ベンジンオレンジ、赤色顔料としては、べんがら、カドミウムレッド、アンチモン朱、パーマネントレッド、リソールレッド、レーキレッド、ブリリアントスカーレット、チオインジゴレッド、青色顔料としては、群生、コバルトブルー、フタロシアニンブルー、フェロシアンブルー、インジゴ、緑色顔料としては、クロムグリーン、ビリジアンナフトールグリーン、フタロシアニングリーン等があげられる。
マイクロウェルアレイ３０の周囲には、平面視において（鉛直方向から見て）枠状の周縁部材３４が配置されている。マイクロ流体デバイス１の厚さ方向における周縁部材３４の寸法は、壁部層３２よりも大きい。周縁部材３４は、蓋部材２０を支持することにより蓋部材２０とマイクロウェルアレイ３０との間に隙間を確保し、流路を維持している。
周縁部材３４の材質等に特に制限はないが、例えばシリコーンゴムや、アクリル発泡体から形成された芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープ等が挙げられる。
次に、図３を用いて本実施形態に係る生体分子解析キットとしてのマイクロ流体デバイス１に好適に適用可能な試薬の組成について説明する。
検出反応試薬（液体）１６ａは、基板１０とカバー部２０との間に注入孔２１から送液可能な試薬の水溶液である。検出反応試薬１６ａは、解析対象物質に関連する鋳型核酸に対する酵素反応などの生化学的反応を行うための試薬である。
鋳型核酸に対する生化学的反応は、たとえば、鋳型核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。検出反応試薬１６ａは、たとえば核酸を検出可能な方法に応じて選択される。たとえば、インベーダー（登録商標）法や、ＬＡＭＰ法（商標登録）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法または、蛍光プローブ法やその他の方法に使用される試薬が本実施形態の検出反応試薬１６ａに含まれる。
次に、本実施形態に係る生体分子解析キットとしてのマイクロ流体デバイス１に好適に適用可能な光吸収層４０について説明する。
本実施形態に係る光吸収層４０は、マイクロウェル３３の開口側に位置して、マイクロウェル３３における蛍光観察に対する攪乱要因となる蓋部材２０側（蓋部材２０の外面）からの観測光に対応する光を遮断・吸収する層である。光吸収層４０としては、マイクロウェル３３の開口側に位置して遮光が可能であれば固体や、粉体、流体、液体でもよく、流路Ｓ内に配置された構成であってもよい。
光吸収層４０は、マイクロウェル３３の開口付近において、マイクロウェルアレイ３０に接触していることができ、好ましくは、光吸収層４０がマイクロウェル３３の開口の全周に接触した状態であるように設けることができる。換言すれば、光吸収層４０は、マイクロウェル３３の開口（開口部）を覆うように配置することができる。
なお、流路Ｓ内において、蓋部材２０に接触するまで光吸収層４０が充填されていることが好ましいが、流路Ｓ内の蓋部材２０全面に光吸収層４０が接していない状態であってもよい。
なお、光吸収層４０の厚さは、流路Ｓの高さ寸法によって規定されるが、後述するように光吸収層４０の特性としての吸光度の値によって、必要な光の遮断・吸収能を設定することができる。
本実施形態では、特に、生体分子解析キットとしてのマイクロ流体デバイス１における光吸収層４０として、光吸収性の物質（光吸収材）を含む液体とすることができる。これによりマイクロウェル３３となる観察面以外に存在する検出反応試薬１６ｂからの光を観察せずに、観察面からの蛍光のみを観察することができる。
同時に、光吸収層４０は、基板１０とカバー部２０との間に注入孔２１から送液可能な溶液のうち、解析対象物質を含む試料と混合しない油性封止液のような液体が選択されている。光吸収層４０としての油性封止液により、検出反応試薬（水性溶液）１６ａが導入されたマイクロウェル３３を封止することができる。
光吸収層４０としての油性封止液は、解析対象物質を含む試料と混合しない材料から選ぶことができる。油性封止液としてはミネラルオイルやクロロホルム、スクアレン、ヘキサデカン、フッ素系液体のＦＣ４０等を用いることができる。
光吸収層４０に含有される光吸収性の物質は、励起光または観察する波長を吸収する物質であり、かつ、油性封止液に溶解する材料から選ぶことができる。光吸収性の物質としては、顔料、染料、クエンチャー（励起エネルギー吸収剤）などから選ぶことができる。
光吸収層４０に含有される光吸収性の物質は、光吸収性から黒色を有する物質が望ましいが、吸収する光（電磁波）によって青色、赤色、黄色、紫色、緑色、それらの混合色など任意の物質を選択することもできる。
光吸収層４０において、光吸収層４０の吸光度は、観察の阻害となる自家蛍光の強さや励起光の強さによって選ぶことができるが、０．０５以上、より好ましくは、０．１以上の範囲を有することができる。
ここで、吸光度の測定法としては、分光光度計を使った測定法とすることができる。
光吸収層４０において、光吸収層４０の濁度は、観察の阻害となる自家蛍光の強さや励起光の強さによって選ぶことができるが５０〜５０００の範囲、より好ましくは、２００〜２０００程度の範囲を有することができる。
ここで、濁度の測定法としては、透視比濁法、透過光測定法、散乱(反射)光測定法を用いることができる。
光吸収層４０を用いることにより、マイクロ流体デバイス１において、蛍光観察した際のＳ／Ｎ比を１．５〜２０００の範囲、より好ましくは、２〜５００程度の範囲とすることができる。
光吸収層４０において上記の吸光度を実現するために、含有される光吸収性の物質として粒子性の物質を選択した場合には、マイクロウェル３３における蛍光観察を阻害しないように、５μｍ以下の粒径範囲、より好ましくは、０．０１μｍ以下程度の粒径を有する物質とすることができる。
光吸収層４０に含有される光吸収性の物質としては、粒子性の物質を選択した場合には、油性封止液（封止液）に対する粒子性の物質の濃度を、０．０１〜３０容量％の範囲、より好ましくは０．０１〜１０容量％程度の濃度範囲を有するように構成することができる。この濃度は、粒子性物質の重量／油性封止液の体積（容積）の百分率である。
なお、光吸収層４０に含有される光吸収性の物質として、粒子性の物質を選択した場合において、油性封止液（封止液）に対する粒子性の物質の濃度を、重量％（ｗｔ％）濃度で算出してもよく、０．００１〜５０ｗｔ％の範囲、より好ましくは０．０１〜１５ｗｔ％程度の濃度範囲を有するように構成してもよい。この濃度は、粒子性物質の重量／油性封止液の重量の百分率である。
光吸収層４０に含有される有色成分として顔料を用いる場合、濃度を上記の範囲（０．００１〜５０ｗｔ％）に設定した場合、顔料の粒子径は、マイクロウェル３３の大きさに応じて所定の範囲に設定されてよい。例えば、マイクロウェル３３の開口の径方向寸法（径方向の長さ）に対して、粒子径を５分の１以下とすればマイクロウェル３３での観察精度に影響を及ぼさないために好適である。マイクロウェル３３の開口の径方向寸法（径方向の長さ）に対して、粒子径を１０分の１以下に設定するとさらに好ましい。例えば、マイクロウェル３３での径寸法が０．１μｍ〜１０μｍ程度であった場合、顔料の粒子径はメーカーカタログ値等において１ｎｍ〜１μｍ程度が好ましい、マイクロウェル３３での径寸法が１００ｎｍ〜１０μｍであった場合、顔料の粒子径は、メーカーカタログ値等において１０ｎｍ〜０．１μｍ程度が好ましい。
顔料の粒子径を上述の範囲（マイクロウェル３３の開口の径方向寸法（径方向の長さ）の５分の１以下）に設定することで、顔料がマイクロウェル３３に対して十分小さくなる。その結果、マイクロウェル３３を観察する際においても、顔料の粒子が妨げにならず、精度良く観察することができる。また、顔料の粒子間に配置される着色されない油性封止液領域をマイクロウェル３３に対して十分小さくすることにより、不必要な蛍光に対する抑制効果を好適に発揮させることができる。
以下、本実施形態における観察方法について図面に基づいて説明する。
図３は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１による観察方法を示す拡大断面図である。
本実施形態における観察方法は、マイクロ流体デバイス１の流路に水性液体を送液し、マイクロウェルアレイ３０のマイクロウェル３３に水性液体を導入する工程と、流路に封止液としての光吸収層４０を形成させ、マイクロウェル３３に導入された水性液体の上側に光吸収層４０となる封止液の層を形成させ、水性液体をマイクロウェル３３内に封入する工程と、マイクロウェル３３に電磁波（第１の電磁波）を照射する工程と、マイクロウェル３３から放出される第２の電磁波（例えば、蛍光又は燐光）を基板１０側から観察して検出する工程と、を備える。
換言すれば、本実施形態における観察方法によれば、マイクロ流体デバイス１を準備し、マイクロ流体デバイス１の流路に水性液体を送液し、マイクロウェル３３に水性液体を導入し、流路に封止液として光吸収層４０を送液し、マイクロウェル３３に導入された水性液体の上に封止層として光吸収層４０を形成し、水性液体をマイクロウェル３３内に封入し、マイクロウェル３３に電磁波（第１の電磁波）を照射し、マイクロウェル３３から放出される第２の電磁波（例えば、蛍光又は燐光）を検出する。
ここで、水性液体とは、水、検出対象である生体分子を含有する緩衝液等の生体試料、酵素反応液、上述した検出反応試薬１６ａ等を含むことができる。さらに、水性液体中には、界面活性剤等の添加物を含有させてもよい。
また、封止液とは、マイクロウェルアレイの各ウェルに導入された液体同士が互いに混合されない状態にして、マイクロウェルアレイの各ウェルに導入された液体を隔離するために用いる液体を意味し、例えば、オイル類を用いることができる。
封止液は、壁部層３２の材質に対する接触角が５〜８０度であることが好ましい。封止液の接触角がこの範囲(５〜８０度)であると、各マイクロウェル３３に好適に試料を封入することができる。封止液の接触角は、例えば、ＪＩＳ Ｒ３２５７−１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液を用いて測定すればよい。
封止液として用いるオイルとしては、例えばシグマ社製の商品名「ＦＣ４０」や、３Ｍ社製の商品名「ＨＦＥ−７５００」、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等を用いることができる。従来のマイクロウェルアレイでは、ミネラルオイルを封止液に利用することは困難な場合があるが、上述したマイクロウェルアレイであれば、ミネラルオイルを封止液に利用しても、ウェルに水性液体を封入することができる。
上述したように、本実施形態では、光吸収層４０として、このような油性封止液に顔料等の着色成分を含有した溶液を適用することができる。
まず、シリンジ等を用いて、マイクロ流体デバイス１の注入孔２１から水性液体を送液する。その結果、流路の内部に配置されたマイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３内に水性液体１６が導入される。
次に、シリンジ等を用いて、注入孔２１から光吸収層４０となる有色成分を含有した封止液を流路（内部空間Ｓ）に送液する。供給された封止液４０は流路内を流れ、図１３に示すように、流路内（内部空間Ｓ内）に存在するマイクロウェル３３外の水性液体１６と置換される。その結果、流路の内部に配置されたマイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３の開口近傍に封止液としての光吸収層４０が形成され、マイクロウェル３３内に水性液体１６ａが封入される。これにより、マイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３に水性液体１６を容易に封入することができる。
次いで、マイクロウェル３３に電磁波（第１の電磁波）を照射し、マイクロウェル３３内部の成分から放出される第２の電磁波（例えば、蛍光又は燐光）を検出する。マイクロウェルアレイ３０を構成するマイクロウェル３３のうち、何個のマイクロウェル３３が蛍光又は燐光を発しているかを計測することができる。
このとき、光吸収層４０がマイクロウェル３３を封止するようにマイクロウェル３３の開口付近に位置しているため、マイクロウェルアレイ３０よりも蓋部材２０側からの光を観測することがない。
特に、図３に示すように、流路内で、蓋部材２０側に蛍光試薬１６ｂが残留していた場合であっても、蓋部材２０側に残留した蛍光試薬１６ｂからの蛍光がマイクロウェル３３に入射することを防止でき、観察に必要なマイクロウェル３３からの蛍光を邪魔することがない。また、基板１０が自家蛍光を有する場合でも、基板１０の自家蛍光がマイクロウェル３３に入射することを防止できる。これにより、マイクロウェル３３からの蛍光シグナルに対するＳ／Ｎ比が低下してしまうことを防止して、正確な観測を行うことが可能となる。
本実施形態の観察方法は、例えば、蛍光顕微鏡を用いて行ってもよい。また、電磁波の照射は、マイクロウェルアレイの基板側から行ってもよく、ウェル側から行ってもよく、その他の任意の方向から行ってもよい。また、電磁波の照射の結果発生する蛍光又は燐光の検出は、マイクロウェルアレイの基板側から行ってもよく、ウェル側（流路側）から行ってもよく、その他の任意の方向から行ってもよいが、例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光又は燐光を検出する場合には、マイクロウェルアレイ３０の基板１０側（基板１０の外面、基板１０の第二面）から行うことが簡便である。
本実施形態において、蛍光顕微鏡を用いる場合に、顕微鏡のピントを明視野においてマイクロウェル３３に対応するマイクロウェルアレイ３０となる観察面にあわせる場合に、光吸収層４０が着色成分を含有することで、マイクロウェル３３を精度よく観察でき、容易にピントをあわせることができる。これにより、蛍光視野における検出を精度よく行うことが可能となる。
本実施形態におけるマイクロ流体デバイス１によれば、光吸収層４０によって、蛍光観察の精度を向上するとともに、観察にかかる作業時間の短縮を実現することが可能となる。
以下、本発明の第２実施形態に係るマイクロ流体デバイスを、図面に基づいて説明する。
図４は、本実施形態におけるマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。
図５は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す断面図（図４のｂ−ｂ線矢視断面図）である。
本実施形態において上述した第１実施形態と異なるのはマイクロウェルアレイ領域ｍに関する点であり、マイクロウェルアレイ領域ｍ以外の対応する構成要素に関しては、同一の符号を付してその説明を省略する。
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス２は、上述した第１実施形態に係るマイクロ流体デバイス１の平面視において（マイクロ流体デバイス１を鉛直方向から観察した際において）、流路の一部を拡大したものである。また、マイクロ流体デバイス２におけるマイクロウェルアレイ領域ｍは、マイクロ流体デバイス１におけるマイクロウェルアレイ領域ｍと比較して、平面視における（鉛直方向から観察した際における）面積が大きくなっている。マイクロ流体デバイス２におけるマイクロウェルアレイ領域ｍは、注入口部である第一孔２１から流路Ｓが枝分かれして多数のマイクロウェル３３に連通するとともに、流路Ｓが排出口部である第二孔２２に向けて合流するように構成されているため、図４に示すように平面視矩形ではなくて、菱形などの形状とされることもできる。また、マイクロ流体デバイス２では流路を設けなくても、測定・観察等の操作を実施可能である。
なお、本明細書において平面視とは、マイクロ流体デバイスの底部部材又はマイクロウェルアレイの基板に対して垂直な方向からマイクロ流体デバイス又はマイクロウェルアレイを見た状態をいう。
本実施形態において、蓋部材２０が自家蛍光層であってもよい。この場合でも、光吸収層４０によって、自家蛍光層からの自家蛍光が観察の邪魔になることを防止することができる。
さらに、本実施形態において、マイクロウェル３３内の蛍光ビーズ１６ｃを観察する場合、自家蛍光層となる蓋部材２０からの蛍光を観察しないようにすることができる。なお、光吸収層４０は固体でも液体でもよいが、流路Ｓに送液することで設ける場合には液体が選択される。
ここで、対象分子を特異的に認識する蛍光ビーズ１６ｃを用いて、対象分子を補足した後に、蛍光ビーズ１６ｃをマイクロウェル３３に収容し、対象分子を特異的に標識し得る蛍光標識と接触させて、目的分子をマイクロウェル３３内で蛍光標識してもよい。
本実施形態においても、平面視して拡大されたマイクロウェルアレイ３０において上記の実施例と同様の効果を奏することができる。
さらに、本発明の第３実施形態に係るマイクロ流体デバイスを、図面に基づいて説明する。
本発明の第３実施形態に係るマイクロ流体デバイスは、図２に示した本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体デバイス１におけるマイクロウェルアレイ３０の壁面を構成する壁部層３２が有色成分を含有する材料で形成されている点において、本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体デバイスと異なる。
そのため、本実施形態においては、図２を用いて説明するとともに、マイクロウェルアレイ３０の壁面を構成する壁部層３２が有色成分を含有する材料で形成されている点以外の対応する構成要素に関しては、同一の符号を付してその説明を省略する。
本実施形態においては、マイクロ流体デバイス１におけるマイクロウェルアレイ３０の壁面を構成する壁部層３２が有色成分を含有する材料で形成されているため、壁部層３２の樹脂材料が励起光に対して自家蛍光を有していても、有色成分により自家蛍光が低減される。その結果、マイクロウェル３３の周囲における自家蛍光が好適に低減され、マイクロウェル３３の観察に妨げになることが好適に防止される。
本実施形態では着色した封止液（オイル）と壁部層３２が有色成分を含む部材とを利用している。
また、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスによれば、壁部層３２に含まれる有色成分の粒子径がマイクロウェル３３の最小寸法（最小径）に対して所定の範囲とされているため、マイクロウェル３３の形成精度に影響を与えることを抑えつつ、試料分析における自家蛍光の影響を低減することができる。
さらに、有色成分の粒子がマイクロウェル３３の内壁面を適度に粗面化する。その結果、試料とマイクロウェル３３との接触面積が増加し、マイクロウェル３３への試料の封入効率を向上させることができる。
さらに、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスによれば、壁部層３２の形成材料の中に、樹脂以外の自家蛍光を有する物質（例えば埃等）が入っていた場合でも、物質の周囲に有色成分が存在するため、励起光が物質まで到達しにくい。仮に励起光が物質まで少量到達した場合でも、発生した自家蛍光は有色成分により吸収されて打ち消され、試料分析に影響を与えにくい。
加えて、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスによれば、基板１０と壁部層３２との境界の位置を認識しやすいため、試料観察工程において、マイクロウェル３３の底面付近に顕微鏡のピントを合わせやすい。したがって、試料観察を簡便かつ好適に行うことができる。
さらに、壁部層３２が有色に形成されるため、壁部層３２の視認性が向上し、壁部層３２等のマイクロ流体デバイスの内部部材の形成状況等を好適に確認することができる。したがって、マイクロ流体デバイス１の製造における品質管理や工程管理等の品質チェックが容易となる。
さらに、壁部層３２の色彩特性を利用した偽造防止も可能である。壁部層３２が透明である場合、外観だけでは所定の樹脂で作製されているか否かを判別することが出来ない。
本実施形態のように、フェロシアンブルー等の有色成分を含有した材料で壁部層３２を作製した場合、一見して同様の色彩であっても、分光光度計により測定した吸収スペクトルにより、正当な製造者が製造した物と第三者による偽造品とを容易に判別することができる。
本実施形態において、使用する蛍光波長は、任意の波長で選択することが出来る。例えば可視光領域である３５０〜７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合、発生する蛍光の色として青、緑、黄、赤色などを選択し、検出したい生体分子ごとに結合する蛍光分子の色を異ならせておくことで、一度の検出で複数種の生体分子を検出することが可能となる。
ここで、有色成分として、黒色または青色のものを用いると、広い波長範囲の電磁波を吸収できるため、汎用性が高く、好ましい。
また、有色成分の電磁波吸収特性は、使用する蛍光波長や、使用する励起光の波長、また、落下の可能性がある埃等の自家蛍光波長等に応じて適宜変更されてよい。また、壁部層は、所定の波長の電磁波を完全に吸収する必要は必ずしもなく、上述した自家蛍光の影響を試料分析に支障のない程度まで低減できればよい。「試料分析に支障のない程度」とは、少なくとも検出対象の蛍光強度の１／２以下であり、１／５以下であるとさらに好ましい。
以下、本発明にかかる実施例を説明する。
＜実施例１＞
本発明に係る蛍光ノイズの少ない生体分子解析キットとしてのマイクロ流体デバイスおよび観察方法の作用効果を確認するために行った実施例１について説明する。
ここでは、実施例１として、測定波長または蛍光波長を吸収する光吸収層を設けることで、ノイズ発生の原因となる蛍光を減らすことが可能であることを確認するために実験を行った。
＜アレイデバイスの作製＞
０．５ｍｍ厚のガラス製の基板にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子製）をスピンコートした後、１８０℃で１時間ベークした。形成されたＣＹＴＯＰの厚みは３μｍだった。ＣＹＴＯＰを基板にスピンコートによってコートした後、ポジティブフォトレジストをコートし、フォトマスクを用いてパターンを形成した。その後、Ｏ２プラズマによってＣＹＴＯＰをドライエッチングした。表面に残ったフォトレジストを除去するためにアセトンとエタノールにより表面を洗浄、リンスした。
ＣＹＴＯＰによって形成されたウェル（微小空間）の直径は５μｍであり、インベーダー反応によるシグナル検出が数分で可能な体積を有する。マイクロウェルアレイ領域ｍには１００ブロックのウェルアレイ５０が設けられた。また、各々のブロックは１０，０００個のウェルを有していた。そのため、基板（積層基板）に合計１００万個のウェルが形成された。図４，図５に示すように、送液ポート（注入口部：不図示）を有するガラス製の板と基板（積層基板、基体部）とを、５０μｍの厚みを有する両面テープを用いて接着した。
＜試料と検出反応試薬との混合液の送液＞
遺伝子検出手法であるインベーダー反応を使い、光吸収層を設けることで蛍光ノイズの発生が減らせるかを確認した。
まず、インベーダー反応試薬（１μＭ アレルプローブ、１μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース、Ｔｗｅｅｎ ２０）２２μl及び検出対象のＤＮＡ（検出反応試薬）を、送液ポートを通じてアレイデバイスに送液した。
その後、検出反応試薬と混ざり合わない脂質であるスクアレンに黒色のオイルパステルを溶解させた溶液を光吸収層用溶液として準備し、光吸収層用溶液を流路に送液ポートを通じて８０μl送液することで各ウェル内に試薬を分割して封入し、併せて光吸収層を形成した。なお、光吸収層用溶液としてのスクアレンに黒色のオイルパステルを溶解させた溶液は、０．１ｇのオイルパステルを、１ｍＬ＝約０．８６ｇのスクアレン（スクアレンの比重：０．８５８）で溶かして得られた溶液であり、光吸収層用溶液におけるオイルパステル／スクアレンの濃度が１１ｗｔ％程度となるように調製した溶液を用いた。
また、比較例１として黒色のパステルを溶解しないスクアレンを送液したサンプルを用意した。
これら実施例１の試料と比較例１の試料とを６３℃のホットプレート上で１５分間加熱し、インベーダー反応を実施した。
次に、蛍光顕微鏡（オリンパス製）を使用し、ＮＩＢＡの蛍光フィルタを用いて各ウェルの蛍光を検出した。露光時間は、１０００ｍｓｅｃとした。
実施例１に係るスクアレンに黒色のパステルを溶解し光吸収層を設けたとき蛍光画像を図７に示す。また、比較例１に係るスクアレンに黒色のパステルを溶解せず光吸収層を設けないときの蛍光画像を図８に示す。写真の倍率はそれぞれ１０倍（×１０）である。
これらの結果から、実施例１のように光吸収層を設けたときには、インベーダー反応による微小液滴からの蛍光のみが鮮明に観察されたことがわかる。一方、比較例１のように光吸収層を設けていないときには、スクアレン中に浮遊している反応液溜り（図３の残留蛍光試薬１６ｂ）からの蛍光がノイズ発生の原因となり、鮮明な画像が得られなかったことがわかる。
＜実施例２＞
本発明に係る蛍光ノイズ発生の少ない生体分子解析キットとしてのマイクロ流体デバイスおよび蛍光観察方法の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
本実施例としては、図６に矢印で示す観察方向（図６におけるマイクロ流体デバイスの下面、基板１０の外面、基板１０の第二面）から見て、観察面となる（観察面を構成する）マイクロウェル３３より遠方に、観察面の観察波長と同じ波長を発する層（自家蛍光層）として蓋部材２０があるとき、または、鏡面の層（反射層）があるときに、観察面と自家蛍光層との間、または、観察面と反射層との間に光吸収層を設けることで蛍光ノイズの発生が減らせるかを蛍光ビーズ１６ｃをマイクロウェル３３に封入して確認した。
実施例２におけるアレイデバイスは実施例１と同様のアレイデバイスを使用し、蓋部材２０として、ガラス製の板の代わりに自家蛍光を持つＰＥＴ樹脂の板を用いた。３マイクロメートルの蛍光ビーズ１６ｃを送液ポートを通じてアレイデバイスに送液した。
その後、検出反応試薬と混ざり合わない脂質であるスクアレンに黒色のパステルを溶解させた溶液（実施例１と同様のオイルパステル／スクアレン溶液）を流路に送液ポートを通じて８０μl送液することで各ウェル内に試薬を分割して封入し、併せて光吸収層４０を形成した。
また、比較例２として黒色のパステルを溶解しないスクアレンを送液したサンプルを用意した。
次に、蛍光顕微鏡（オリンパス製）を使用し、ＮＩＢＡの蛍光フィルタを用いて各ウェルの蛍光を検出した。露光時間は、５０ｍｓｅｃとした。
スクアレンに黒色のパステルを溶解し光吸収層を設けたときの蛍光画像を図９に示す。また、図９に対応してラインスキャンを使い横軸を距離、縦軸を蛍光強度で表した図を図１０に示す。また、スクアレンに黒色のパステルを溶解せず光吸収層を設けないときの蛍光画像を図１１に示す。さらに、図１１に対応してラインスキャンを使い横軸を距離、縦軸を蛍光強度で表した図を図１２に示す。また、各蛍光強度を比較し、シグナルノイズレシオ（Ｓ／Ｎ比）を算出した表を表１に示す。写真の倍率はそれぞれ１０倍（×１０）である。
ここで、シグナル（Ｓ）とは、観察対象（ウェル領域）から発せられた蛍光であり、ノイズ（Ｎ）とは観察対象領域外で観察された蛍光である。また、センサー自身が持っているノイズは露光時間などの撮影条件によって発生するため、サンプルをステージに置かない状態で撮影したときのシグナルを、サンプルを撮影したときのシグナル（ＳおよびＮ）の蛍光強度から差し引いた。また、Ｓ／Ｎ比は、図１０，図１２における波で示されるウェル領域から発せられた蛍光強度の値を平均して算出している。
これらの結果から、光吸収層を設けたときには、Ｓ／Ｎ比が１２４で、設けないときには１２となり、光吸収層を設けたときには明らかにノイズの発生が減っていることが確認された。本実施例において、ノイズの発生はＰＥＴ樹脂の板から発せられている自家蛍光と考えられる。よって、光吸収層を設けることで、観察面以外で発せられる蛍光ノイズ発生の影響を受けにくい状態にて、目的とする試料の観察が可能となることがわかる。この効果は、ＰＥＴ樹脂などの自家蛍光を持つ板の他、励起光を反射する金属板をカバー部として用いる場合や、蛍光を発生する液層が存在する場合にも有効である。
さらに、上述の本発明の第３実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび試料分析方法について、効果を確認するための実施例および比較例を用いて説明する。
＜実施例３＞
自家蛍光を有さない基板１０として、厚さ７５０μｍのガラス基板を準備した。
壁部層３２の形成材料として、感光により硬化するネガ型のフォトレジストにカーボンブラックを３０ｗｔ％添加したものを用いた。壁部層３２用の形成材料を底部層３１上にスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、プリベークを行った後、感光させて壁部層３２を形成した。
プリベークの条件および露光条件等は使用したフォトレジストに基づき適宜設定した。
以上により上記本発明の第３実施形態のマイクロ流体デバイスに対応する層構造を有する実施例３の積層体を得た。
カーボンブラック含有壁部層によって形成されたウェル（微小空間）の直径は５μｍであり、インベーダー反応によるシグナル検出が数分で可能な体積を有する。マイクロウェルアレイ領域ｍには１００ブロックのウェルアレイ５０が設けられた。また、各々のブロックは１０，０００個のウェルを有した。そのため、実施例３に係る積層体には合計１００万個のウェルが形成された。図４，図５に示すように、送液ポート（注入口部：不図示）を有するガラス製の板と積層体（基体部）とを、５０μｍの厚みを有する両面テープを用いて接着した。
＜試料と検出反応試薬との混合液の送液＞
蛍光物質であるフルオロセインを含む蛍光試薬溶液を使い、光吸収壁部層と光吸収層を設けることで蛍光ノイズがさらに減らせるかを確認した。
まず、蛍光試薬溶液（１μＭフルオロセイン、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース、Ｔｗｅｅｎ ２０）２２μlを送液ポートを通じてアレイデバイスに送液した。
バックグラウンドの蛍光強度取得のため蛍光物質を含まない試薬溶液を使い、光吸収壁部層と光吸収層を設けた際の蛍光を発しないウェルの蛍光値を確認した。
試薬溶液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース、Ｔｗｅｅｎ ２０）２２μlを送液ポートを通じてアレイデバイスに送液した。
その後、検出反応試薬と混ざり合わない脂質であるスクアレンに黒色のオイルパステルを溶解させたもの（実施例１と同様のオイルパステル／スクアレン溶液）を光吸収層として、光吸収層を送液ポートを通じて８０μl送液することで各ウェル内に試薬を分割して封入し、併せて光吸収層を形成した。また、比較例３として黒色のパステルを溶解しないスクアレンを送液したサンプルを用意した。
次に、蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ製）を使用し、ＧＦＰの蛍光フィルタを用いて各ウェルの蛍光を検出した。露光時間は、１．２ｓｅｃとした。
スクアレンに黒色のパステルを溶解し光吸収層を設けたときにおける蛍光溶液の蛍光強度（表２における光吸収層あり、フルオロセインあり、シグナルに示した数値）と蛍光を含まない溶液の蛍光強度（表２における光吸収層あり、フルオロセインなし、バックグラウンドに示した数値）、および、スクアレンに黒色のパステルを溶解せず光吸収層を設けないときにおける蛍光溶液の蛍光強度（表２における光吸収層なし、フルオロセインあり、シグナルに示した数値）と蛍光を含まない溶液の蛍光強度（表２における光吸収層なし、フルオロセインなし、バックグラウンドに示した数値）を表２にそれぞれ示す。また、各蛍光強度を比較し、シグナルノイズレシオ（Ｓ／Ｎ比）を算出した。ここで、シグナル（Ｓ）とは、観察対象（ウエル領域）から発せられた蛍光であり、ノイズ（Ｎ）とは観察対象領域外で観察された蛍光である。ここで、シグナル（Ｓ）、ノイズ（Ｎ）Ｓ／Ｎ比蛍光強度の値を平均して算出した。なお、蛍光強度の測定方法およびＳ／Ｎ比の算出方法は実施例２と同様の方法を用いた。
これらの結果から、光吸収層を設けたときには、Ｓ／Ｎ比が１．７８で、設けないときには１．０９となり、光吸収壁部層かつ光吸収層を設けたときには明らかにノイズの発生が減っていることが確認された。
本実施例において、ノイズの発生はＰＥＴ樹脂の板から発せられている自家蛍光と考えられる。
よって、光吸収壁部層と光吸収層を同時に設けることで、観察面以外で発せられる蛍光ノイズ発生の影響をより低減した観察が可能となることがわかる。この効果は、ＰＥＴ樹脂などの自家蛍光を持つ板の他、励起光を反射する金属板をカバー部として用いる場合や、蛍光を発生する液層が存在する場合にも有効である。
本発明の活用例として、本願のような基材を介しての測光を行う容器、測光時のノイズ成分を遮蔽する用途に利用可能である。
１、２…マイクロ流体デバイス
１０…基板
２０…蓋部材（カバー部）
３０…マイクロウェルアレイ（微小孔アレイ層）
３３…マイクロウェル（微小孔）
４０…光吸収層
５０…ウェルアレイ
１６…液体、水性溶液、水性液体
１６ａ…検出反応試薬（液体、水性溶液、ウェル内の水性液体）
１６ｂ…検出反応試薬（ウェル外、ウェル外の水性液体）
１６ｃ…蛍光ビーズ
Ａ１…蛍光強度（シグナル）
Ａ２…蛍光強度（バックグラウンド）
Ｂ１…蛍光強度（シグナル）
Ｂ２…蛍光強度（バックグラウンド）
Ｓ…流路（内部空間）
ｍ…マイクロウェルアレイ領域

Claims (16)

  1. マイクロ流体デバイスであって、
    電磁波透過性を有する基板と、
    前記基板と離間し、前記基板に対向して配置された蓋部材と、
    前記基板と前記蓋部材との間に設けられ、所定の波長の電磁波を吸収する光吸収層が配置される流路と、
    前記流路に向けて開口しかつ解析対象が導入される複数のマイクロウェルを有し、前記基板上に形成されたマイクロウェルアレイと、
    を備える、
    マイクロ流体デバイス。
  2. 前記光吸収層が、前記解析対象に応じた波長の光を吸収する光吸収材を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  3. 前記光吸収層は、液体である、請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイス。
  4. 前記光吸収層としての前記液体が、前記マイクロウェルに導入される水性液体と混和しにくい液体である、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
  5. 前記光吸収層が着色成分を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  6. 蛍光観察キットであって、
    請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを備える、蛍光観察キット。
  7. 観察方法であって、
    請求項１から５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを準備し、
    前記流路に前記解析対象を含む水性液体を送液し、前記マイクロウェルに前記水性液体を導入し、
    前記流路に封止液として前記光吸収層を送液し、前記マイクロウェルに導入された前記水性液体の上に封止層として前記光吸収層を形成し、前記水性液体を前記マイクロウェル内に封入し、
    前記マイクロウェルに第１の電磁波を照射し、
    前記マイクロウェルから放出される第２の電磁波を検出する、
    観察方法。
  8. 前記マイクロウェルに対して前記電磁波を照射した後に、前記基板の外面から前記マイクロウェルを観察する、請求項７に記載の観察方法。
  9. 前記マイクロウェルの内部に位置する観察面と前記光吸収層とが接しており、前記観察面で前記解析対象を検出する、請求項８に記載の観察方法。
  10. 前記マイクロウェルの内部に位置する観察面よりも前記光吸収層が観察方向遠方に位置し、前記観察面で前記解析対象を検出する、請求項８に記載の観察方法。
  11. 前記マイクロウェルの前記内部に導入される前記解析対象を含む物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および細胞のうちいずれか１つを含み、前記解析対象がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質のいずれか１つである、請求項９または１０に記載の観察方法。
  12. 前記マイクロウェルの前記内部に位置する前記観察面上に配置された前記水性液体において酵素反応が行われたときに、前記酵素反応によるシグナルを検出する、請求項９から１１のいずれか一項に記載の観察方法。
  13. 前記解析対象が核酸であり、前記酵素反応がインベーダー反応である、請求項１２に記載の観察方法。
  14. 光吸収層用光吸収剤であって、
    所定の波長の電磁波を吸収する材料を含有し、
    前記材料は、電磁波透過性を有する基板と、前記基板と離間し、前記基板に対向して配置された蓋部材と、前記基板と前記蓋部材との間に設けられ、前記材料が配置される流路と、前記流路に向けて開口しかつ解析対象を含む水性液体が導入される複数のマイクロウェルを有し、前記基板上に形成されたマイクロウェルアレイとを備えるマイクロ流体デバイスに用いられ、前記水性液体上に配置され、前記電磁波を吸収するように構成された、
    光吸収層用光吸収剤。
  15. ノイズ軽減方法であって、
    請求項１４に記載の光吸収剤を用いて、前記マイクロ流体デバイスから発せられる測定対象電磁波におけるノイズの発生を軽減する、
    ノイズ軽減方法。
  16. ノイズ軽減方法であって、
    請求項１４に記載の光吸収剤に加え、前記マイクロウェルの壁部を着色し、前記マイクロ流体デバイスから発せられる測定対象電磁波におけるノイズの発生を軽減する、
    ノイズ軽減方法。
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