JP2002350440A - Dnaチップの製造方法およびこの方法により得られたdnaチップ - Google Patents
Dnaチップの製造方法およびこの方法により得られたdnaチップInfo
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Abstract
工程等においてプロ−ブDNA、サンプルDNAの損失
が少なく、DNAサンプルを有効に活用できるDNAチ
ップの製造方法、およびこの方法により製造されたDN
Aチップを提供する。 【解決手段】 真空槽内を所定の真空度とした後、ダイ
アモンドライク膜の原料ガスを供給し、さらに、窒素源
となる原料ガスを導入し、CVD法により基板上にDN
A結合基を有するダイアモンドライク膜を形成してDN
A結合層とする構成のDNAチップの製造方法とした。
Description
伝子の変異、遺伝子の多型等の解析に特に有用なDNA
チップに関する。
解析は、これまで種々の細胞や組織からRNAを調製
し、そのRNAをメンブレン上に固定し、解析対象の遺
伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーション
を行うノーザンブロット(もしくは、ドットブロット)
法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用いたR
T−PCR法などによって行われてきた。
要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプ
ロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴
って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まって
いる。
アレイ法もしくはDNAチップ法が開発されつつある。
これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異
なる数千種類のDNA断片を固定し(DNAチップまた
はバイオチップという。)、この固定DNA断片と極少
量の標識されたターゲットDNA断片とのハイブリダイ
ゼーションを行い、高感度でターゲットDNA断片を検
出することである。
のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を
数枚のDNAチップ等を用いて解析することができ、標
識RNAによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行
うこともできる。また、ゲノムDNAを標識することに
よって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
チップ」法(基板表面上に固定するDNA断片を、直
接、基板表面上で合成する方法)によらない場合には、
DNA断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、
次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表
面に固定する。
図である。図2(a)に示すように、複数種類のプロー
ブDNA21が入っているマイクロプレート22を用意
する。一方、図2(b)に示すよう、プレート23とし
てガラス板を用意しておき、図2(c)で示すように、
プレート23の表面にpoly-l-Lysine等のDNAとガラ
スの結合剤24をコーティングする。この後、マイクロ
プレート22に入っているプローブDNA21をピンに
付着させ、表面にDNAとガラスの結合剤(poly-l-Lys
ine)24がコーテイングしてあるガラスプレート23
の上に、ピンに付着させたプローブDNA1を接触させ
てスポットする。マイクロプレート22に入っている全
てのプローブDNAをスポットし終わるまでこの作業を
繰り返し、図2(d)に示すDNAチップを製造してい
た。このように、従来はプレートに予めDNAとガラス
の結合剤を全面コーティングし、その上にDNAをプロ
ットしてDNAチップを製造していた。
程は、プローブDNAが結合剤でガラスのプレートにス
ポットされているDNAチップと、蛍光物質で標識した
サンプルDNAを、ともにハイブリダイゼーション溶液
に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーショ
ン溶液は、ホルムアルデヒド、SSC(NaCl, trisodiu
mcitrate)、SDS(sodium dodecyl sulfate)、ED
TA(ethylenediamidetetraacetic acid)、蒸留水な
どからなる混合液であり、混合比率は使用するDNAの
性質により異なる。
上のプローブDNAが相補鎖DNAであれば、両者は二
重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でな
ければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプ
ルDNAは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残
留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーテ
ィングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残
る場合もある。
物質で標識したサンプルDNAを水槽等の中に入れて洗
い流すと、プローブDNAと結合していないサンプルD
NAは排出される。その後、プローブDNAと結合して
いるサンプルDNAに標識している蛍光物質を、所定の
光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起し
て発光する光をCCDなどの光センサーで検出すること
でハイブリダイゼーションの検出を行う。
スの結合剤は、DNAに対する結合力が十分でないた
め、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブ
リダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があっ
た。このような、不十分な結合に由来するプローブDN
AおよびサンプルDNAの損失は、多いときには70%
以上にも達し、高価なプローブDNAや、貴重なサンプ
ルDNAを徒に浪費しているのが現状であった。
て種々の材料が検討されている。例えばDLC(ダイア
モンドライクカーボン)膜は耐熱性、耐久性等を有し、
将来的に有望な材料の一つであるが、DLC成膜後に表
面の塩素化処理を行い、さらにアンモニアガスによる塩
素置換でアミノ化を行っている。
品の収率が悪くなると共に、コスト低減を図る上で大き
な障害となっていた。特に、近年、DNAチップの臨床
現場での応用に対する要望が高まるなか、広く一般大衆
に利用可能な価格で提供することは、国民の健康と医療
技術の向上を図る上でも極めて重要である。
な工程で安価に製造でき、しかも水洗い工程等において
プロ−ブDNA、サンプルDNAの損失が少なく、DN
Aサンプルを有効に活用できるDNAチップの製造方
法、およびこの方法により製造されたDNAチップを提
供することである。
下の本発明の構成により達成される。 (1) 真空槽内を所定の真空度とした後、ダイアモン
ドライク膜の原料ガスを供給し、さらに、窒素源となる
原料ガスを導入し、CVD法により基板上にDNA結合
基を有するダイアモンドライク膜を形成してDNA結合
層とするDNAチップの製造方法。 (2) 前記ダイアモンドライク膜は、少なくとも炭
素、ケイ素、酸素、水素を含有するダイアモンドライク
ナノコンポジット(DLN)膜である上記(1)のDN
Aチップの製造方法。 (3) 前記ダイアモンドライク膜は、少なくとも炭
素、水素を含有するダイアモンドライクカーボン(DL
C)膜である上記(1)のDNAチップの製造方法。 (4) 前記ダイアモンドライク膜の原料ガスは、シリ
コーンオイルを加熱して得る上記(1)または(2)の
DNAチップの製造方法。 (5) 前記窒素源はシリコーンオイル中に含有されて
いる上記(4)のDNAチップの製造方法。 (6) 請求項1〜5の方法により得られ、DNA結合
基を含有するDNA結合層を有するDNAチップ。
は、基板上にアミノ基修飾ダイアモンドライク膜を同時
形成してDNA結合基含有層とするものである。
後、ダイアモンドライク膜の原料ガスを供給し、さら
に、窒素源となる原料ガスを導入し、CVD法により基
板上にDNA結合基を有するダイアモンドライク膜を形
成してDNA結合層とするものである。また、このとき
窒素源をダイアモンドライク膜の原料ガスに含ませてい
てもよい。
アモンドナノコンポジット(DLN)またはダイアモン
ドライクカーボン(DLC)により形成された膜をい
う。
化水素を励起し、分解して得た高硬度炭素膜であり、ダ
イヤモンド様炭素、i−カーボン膜等と称されることも
ある。DLC膜については、例えば、特開昭62−14
5646号、同62−145647号、New Diamond Fo
rum 、第4巻第4号(昭和63年10月25日発行)等
に記載されている。
記載されているように、ラマン分光分析において、15
50cm-1にブロードな(1520〜1560cm-1)ラマ
ン吸収のピークを有し、1333cm-1に鋭いピークを有
するダイヤモンドや、1581cm-1に鋭いピークを有す
るグラファイトとは、明らかに異なった構造を有する物
質である。
は、炭素とケイ素の独立したネットワーク構造が相互貫
入した2重構造を有するアモルファス硬質薄膜であり、 a(CHx)y ・a(SiOz)w と表すことができる。また、これに第3成分として金属
元素を含有していてもよい。DLNについては、例えば
V.F.Dorfman and B.N.Pypkin,Surface and Coating Tec
hnology,48,193(1991)、米国特許第5352492号等
に記載されている。DLNの構造は、STM,AFM、
X線解析、電子線回折、TEMなどにより確認すること
ができる。例えば、FTIRスペクトルにおいて、10
10cm-1と、800cm-1 とにSi−O結合の存在を示
すピークが認められる。
る場合、CVD法などによりDLC、DLN膜を成膜し
た後、これを洗浄し、UV照射により表面炭素原子を塩
素置換する。次に、アンモニアガスの存在下でUV照射
を行い、塩素置換して、表面炭素原子に対する共有結合
可能なアミノ化を行う。そして、DLC,DLN表面の
アミノ基と、DNA断片とをアミド結合させる。
されたDNAチップは、上記のように製造効率が悪く、
収率が悪く、原料を浪費してしまう。これに対し、本発
明の方法により製造されたDNAチップは、薄く、均一
な結合剤含有層を形成し、ピンホールの発生もないた
め、DNA断片を良好な状態で結合、坦持することがで
きる。また、DLC、DLN成膜時に、アミド結合に必
要なアミノ基も同時に導入されるため、製造工程も簡略
化できる。
性が良好で、高い安定性を有し、耐熱性、耐光性、機械
的強度に優れている。従って、繰り返しの使用にも十分
に耐え、DNAチップを有効に効率よく利用することが
できる。
を製造するのであれば、炭素源、水素源となる原料ガス
を供給する。また、DLN膜を製造する場合には、炭素
源、ケイ素源、酸素源、水素源となる原料ガスを供給す
る。
C2H5 等が、ケイ素源としては、シラン、メチルシラ
ン等が、酸素源としてはO2 等が、水素源としてはH2
等が挙げられ、これらの材料を混合して用いてもよい
し、1種で複数の材料源とすることもできる。
る膜の種類に応じて適宜必要とされる量を供給すればよ
い。
シリコーンオイルを用いるとよい。原料として用いるシ
リコーンオイルは、オルガノシロキサンであって、DL
Nのケイ素源、炭素源、酸素源、水素源となり、一つの
材料で容易にDLNの構成元素をバランスよく供給する
ことができる。シリコーンオイルは加熱することにより
気化し、原料ガスとなる。
キルポリシロキサン、ジアルコキシポリシロキサン、フ
ェニルポリシロキサン、フルオロアルキルポリシロキサ
ン、アミノ変性シリコーンオイル等を用いることがで
き、特にジメチルシリコーンが好ましい。シリコーンオ
イルは、例えば信越化学社製KF96、KF69等とし
て市販され、入手することができる。
器に入れられ真空槽内に配置される。シリコーンオイル
の容器としては、シリコーンオイルとの反応性が低く、
所定の加熱温度に耐えうる材料であれば特に限定される
ものではない。具体的には、通常、真空蒸着の蒸発源と
して用いられているような材料(白金、PBN等)、容
器(蒸着ボート、るつぼ等)を用いることができる。
しては、真空槽内で気化可能な温度であればよく、具体
的には200〜600℃、好ましくは300〜400℃
程度である。
0-3 Torr以下、特に10-4 Torr以下が好ましい。
の原料ガスとしては、N2 、NH3等を挙げることがで
きる。これらの原料ガスの流量としては、1〜100SC
CM、特に1〜50SCCM程度である。さらにこの原料ガス
に加えてH2 、CH4 等のガスを導入してもよい。
ルを用いる場合には、上記原料ガスは供給しなくてもよ
い。このような窒素源を含有するシリコーンオイルとし
ては、アミノ変性シリコーンオイル等を挙げることがで
きる。
DLC,DLN膜を成膜する。CVD法としては、自己
バイアスを含むバイアス印加プラズマCVD法が好まし
い。CVD法では高周波電源を用いることが好ましく、
高周波電力としては50w〜2kw程度である。また、通
常、バイアス電圧は−50V〜−5kV、全圧は0.02
〜0.2Torr、反応時間は10〜120分、電極間距離
は例えば4cm程度、全ガス流量は0.2〜100SCCMで
あり、基板温度は10〜300℃である。
膜を形成するためのガラス基板が配置され、この基板上
に所定の距離を離間させて対極が配置される。
NA結合剤含有層)は、蒸留水等により洗浄して用いる
とよい。
するDNAチップは、プローブDNAとの結合が良好で
あり、水洗い工程等においてもDNAが剥がれ落ちるこ
ともなく、原料を有効に活用することができる。また、
耐熱性、耐候性、機械強度に優れるため、繰り返し使用
することも可能である。
たはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビ
スフェノールA等のポリカーボネート、ポリスチレン、
ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好
ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが
特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャ
ニング装置による解析の容易さによるものである。シリ
カ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚
さとしては、100〜2000μmの範囲にあることが
好ましい。
て二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べる
ためには、cDNA、cDNAの一部、EST等のポリ
ヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリ
ヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一
般的にはデータベースに登録された配列を基にしてcD
NAのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全
ゲノムをテンプレートとしてPCR法によって増幅して
調製する(以下「PCR産物」という。)。あるいは、
PCR法によって増幅しないものも使用することができ
る。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準とな
る既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々
のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが
好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、4n(n
は、塩基の長さ)種のオリゴヌクレオチドを合成すし、
これを使用することが好ましい。DNA断片の塩基配列
は、既知であることが好ましい。
体に溶解あるいは分散した水性液を、96穴もしくは3
84穴プラスチックプレートに分注し、分注された水性
液をスポッター装置を用いて基板上に滴下して行うこと
が好ましい。
て、102 〜105 種類/cm2 の範囲にあることが好
ましい。DNA断片の量は、1〜10-15 モルの範囲に
あり、重量としては数ng以下であることが好ましい。
点着によって、DNA断片の水性液は、基板表面にドッ
トの形状で固定されるが、そのドット間の距離は、0〜
1.5mmの範囲にあることが好ましく、特に100〜
300μmの範囲にあることが好ましい。1つのドット
の大きさは、直径が50〜300μmの範囲にあること
が好ましい。点着する量は、100pL〜1μLの範囲
にあることが好ましく、特に1〜100nLの範囲にあ
ることが好ましい。
ンを行うことが好ましい。インキュベート後、点着され
なかったDNA断片を洗浄して除去することが好まし
い。
ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子
発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要で
ある。
の寿命は、cDNAが固定されたcDNAチップで数週
間、オリゴDNAが固定されたオリゴDNAチップでは
さらに長期間である。これらのDNAチップは、遺伝子
発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型
解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸と
のハイブリダーゼーションである。
列や機能が未知であるDNA断片試料あるいはRNA断
片試料を用いることが好ましい。
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組
織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く
任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等
であることが好ましい。標的がmRNAならば、mRN
Aが発現される組織サンプルから抽出することが好まし
い。mRNAは、逆転写反応により標識dNTP(「d
NTP」は、塩基がアデニン(A)、シトシン(C)、
グアニン(G)もしくはチミン(T)であるデオキシリ
ボヌクレオチドを意味する。)を取り込ませて標識cD
NAとすることが好ましい。dNTPとしては、化学的
な安定性のため、dCTPを用いることが好ましい。1
回のハイブリダイゼーションに必要なmRNA量は、液
量や標識方法によって異なるが、数μg以下であること
が好ましい。尚、DNAチップ上のDNA断片がオリゴ
DNAである場合には、標的核酸は低分子化しておくこ
とが望ましい。原核生物の細胞では、mRNAの選択的
な抽出が困難なため、全RNAを標識することが好まし
い。
目的では、標識プライマーもしくは標識dNTPを含む
反応系で標的領域のPCRを行って得ることが好まし
い。
あるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法と
しては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が
挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍
光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであ
れば何れも用いることができるが、シアニン色素(例え
ば、Cy DyeTMシリーズのCy3、Cy5等)、ロ
ーダミン6G試薬、N−アセトキシ−N2 −アセチルア
ミノフルオレン(AAF)、AAIF(AAFのヨウ素
誘導体)などを使用することが好ましい。
は384穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した標的核酸が溶解あるいは分散してなる水性液を、
上記で作製したDNAチップ上に点着することによって
実施することが好ましい。点着の量は、1〜100nL
の範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーション
は、室温〜70℃の温度範囲で、そして6〜20時間の
範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーショ
ン終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗
浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好まし
い。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエ
ン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝
液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸
緩衝液を用いることが好ましい。
ョンの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないこ
とである。そのため、基板に固定するDNA断片の鎖長
や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーシ
ョンの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解
析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低
い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うこと
が好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時
間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。ま
た、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を
二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーション
に用いることにより、同一のDNAチップ上で発現量の
比較や定量ができる特徴もある。
真空槽31内の基板33上に、ガラス基板34を配置
し、基板33上に配置されたガラス基板34上にアミノ
修飾DLN膜を膜厚:0.3μm に成膜した。このと
き、所定の真空度を維持するように排気しつつ、原料ガ
スを導入し、交流電源35から基板33、対電極32間
にセルフバイアスにてRF電力を印加し、プラズマ36
を形成した。このときの条件としては、 シリコーンオイル:ジメチルシリコーンオイル、信越化
学社製、商品名KF96SS 加熱温度:350℃ 槽内真空度:10-4 Torr 原料ガス:N2 原料ガス流量:5SCCM 印加電力:RF500Wであった。
マイクロプレート22に入っているプローブDNA21
をピンに付着させ、前記高分子膜が形成されたガラスプ
レート23の上に、ピンに付着させたプローブDNAを
接触させてスポットした。マイクロプレート22に入っ
ている全てのプローブDNAをスポットし終わるまでこ
の作業を繰り返し、図2(d)に示すようなDNAチッ
プを製造した。
程は、プローブDNAが結合でガラスのプレートにスポ
ットされているDNAチップと、蛍光物質で標識したサ
ンプルDNAを、ともにハイブリダイゼーション溶液に
入れてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション
溶液は、ホルムアルデヒド、SSC(NaCl, trisodiumc
itrate)、SDS(sodium dodecyl sulfate)、EDT
A(ethylenediamidetetraacetic acid)、蒸留水など
からなる混合液であり、混合比率は使用するDNAの性
質により異なる。
物質で標識したサンプルDNAを水槽等の中に入れて洗
い流し、プローブDNAと結合していないサンプルDN
Aを排出した。
DNAはほとんど剥がれ落ちることなく残留し、水洗工
程でDNAが剥がれ落ちないことが確認できた。
ンプルDNAに標識している蛍光物質を、所定の光源か
らの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光
する光をCCDなどの光センサーで検出することでハイ
ブリダイゼーションの検出を行った。
ョンが的確に行われることが確認できた。また、基板上
に結合しているプローブDNAはほとんど剥がれ落ちる
ことなく残留し、水洗工程でDNAが剥がれ落ちないこ
とが確認できた。
飾工程が不要となり、少なくとも工程数が2つ減り、製
造コストの削減に極めて有効であることがわかった。
ンオイルとしてアミノ変性シリコーンオイルを用い、原
料ガスを導入しない以外は実施例1と同様にしてアミノ
変性DLN膜を形成し、DNAチップとして評価した。
その結果、実施例1とほぼ同様の結果が得られることが
確認できた。
を成膜する代わりにDLC膜を成膜した。このときの条
件としては、 原料ガス:エチレン 流量:1〜4SCCM 原料ガス:N2 流量:5SCCM 槽内真空度:10-4 Torr 印加電力:RF500Wであった。
ップを得、評価した。その結果、原料ガスの調整が必要
なものの、実施例1とほぼ同様の効果が得られることが
わかった。
程で安価に製造でき、しかも水洗い工程等においてプロ
−ブDNA、サンプルDNAの損失が少なく、DNAサ
ンプルを有効に活用できるDNAチップの製造方法、お
よびこの方法により製造されたDNAチップを提供する
ことである。
である。
る。
Claims (6)
- 【請求項1】 真空槽内を所定の真空度とした後、 ダイアモンドライク膜の原料ガスを供給し、 さらに、窒素源となる原料ガスを導入し、 CVD法により基板上にDNA結合基を有するダイアモ
ンドライク膜を形成してDNA結合層とするDNAチッ
プの製造方法。 - 【請求項2】 前記ダイアモンドライク膜は、少なくと
も炭素、ケイ素、酸素、水素を含有するダイアモンドラ
イクナノコンポジット(DLN)膜である請求項1のD
NAチップの製造方法。 - 【請求項3】 前記ダイアモンドライク膜は、少なくと
も炭素、水素を含有するダイアモンドライクカーボン
(DLC)膜である請求項1のDNAチップの製造方
法。 - 【請求項4】 前記ダイアモンドライク膜の原料ガス
は、シリコーンオイルを加熱して得る請求項1または2
のDNAチップの製造方法。 - 【請求項5】 前記窒素源はシリコーンオイル中に含有
されている請求項4のDNAチップの製造方法。 - 【請求項6】 請求項1〜5の方法により得られ、DN
A結合基を含有するDNA結合層を有するDNAチッ
プ。
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---|---|---|---|
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---|---|---|---|
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