JP2009203244A - シクロオキシゲナーゼ２の選択的阻害を示す複雑な混合物 - Google Patents

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Abstract

【課題】誘導性シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の選択的阻害を示す活性成分の複雑な混合物を含む組成物およびＣＯＸ−２媒介性のプロスタグランジン合成の選択的阻害のための方法を提供すること。
【解決手段】本質的に、α酸およびβ酸から構成される組成物であって、該α酸およびβ酸が、投与された場合、ＣＯＸ−１活性に対する最小の効果を有しつつ、誘導性ＣＯＸ−２活性を阻害し得る比で存在する、組成物。栄養補助食品を補充するための方法であって、該方法は、炎症の症状に罹患している動物に、上記組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／体重／日のα酸、０．０１〜１００ｍｇ／体重／日のβ酸を提供する用に処方される、方法。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に誘導性シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の選択的阻害を示す活性成分の複雑な混合物を含む組成物およびＣＯＸ−２媒介性のプロスタグランジン合成の選択的阻害のための方法に関する。より詳しくは、この組成物は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）の抽出物から単離される活性成分の混合物を含有する。この組成物は、構成的なシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１）に有意な影響がほとんどないかまたは全くなしで、誘導性シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の誘導性および／または活性を阻害するように機能する。
（発明の背景）
炎症性疾患は、５千万より多いアメリカ人が罹患する。この１０〜１５年にわたる分子免疫学および細胞免疫学における基礎研究の結果として、これらの免疫学的に基づく疾患を診断し、処置し、そして予防するアプローチは、劇的に変化した。この１例は、シクロオキシゲナーゼ酵素の誘導型の発見である。構成的シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）（最初に１９７６年に精製され、１９８８年にクローニングされた）は、アラキドン酸（ＡＡ）からのプロスタグランジン（ＰＧ）の合成において機能する。その精製の３年後、ＣＯＸ活性を有する誘導性酵素が同定され、名称ＣＯＸ−２を与えられ、一方、構成的ＣＯＸは、ＣＯＸ−１と称された。
ＣＯＸ−２遺伝子発現は、炎症誘発性のサイトカインおよび増殖因子の制御下にある。故に、推論として、ＣＯＸ−２は、炎症および細胞増殖の制御の両方において機能する。ＣＯＸ−２は、多くの組織で誘導性であるが、脳および脊髄（ここでＣＯＸ−２は、疼痛および発熱に関する神経伝達において機能し得る）では構成的に存在する。ＣＯＸの２つのアイソフォームは、構造においてほとんど同一であるが、基質およびインヒビター選択性ならびに細胞内局在において重要な違いを有する。保護的ＰＧ（これは、胃の内面の完全性を保ち、易感染性の腎臓において正常な腎臓機能を維持する）は、ＣＯＸ−１によって合成される。一方、免疫細胞においてＣＯＸ−２によって合成されるＰＧは、炎症プロセスの中心に位置する。
ＣＯＸ−２の発見は、ＣＯＸ−１によって産生される胃および腎臓中の保護的ＰＧを除去することなく、炎症を低減する薬物の設計を可能にした。本発明の組合せは、被験体における炎症の処置、および炎症関連傷害の処置（例えば、疼痛および頭痛の処置における鎮痛剤として、または発熱の処置のための解熱剤として）に有用であるが、これらに限定されない。例えば、本発明の組合せは、関節炎（関節リウマチ、脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｔｈｏｐａｔｈｉｅｓ）、痛風性関節炎、変形性関節症、全身性エリテマトーデスおよび若年性関節炎を含むがこれらに限定されない）の処置に有用である。本発明のこのような組合せは、喘息、気管支炎、月経痙攣、腱炎、滑液包炎ならびに乾癬、湿疹、火傷および皮膚炎のような皮膚に関連した状態の処置において有用である。本発明の組合せはまた、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群および潰瘍性結腸炎のような胃腸の状態を処置するために、ならびに結腸直腸癌のような癌の予防または処置のために有用である。本発明の組成物は、以下のような疾患における炎症の処置のために有用である：血管の疾患、偏頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｍａ）、リウマチ熱、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス（ｓａｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群（Ｂｅｈｃｈｅｔ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、外傷後におこる腫脹、心筋虚血など。
本発明の組成物はまた、網膜症、結膜炎、ブドウ膜炎、目の光恐怖症、目の組織への急性損傷のような眼の疾患の処置において有用である。この組成物はまた、ウイルス感染および嚢胞性線維症に関連するような肺の炎症の処置において有用である。この化合物はまた、皮質痴呆（アルツハイマー病を含む）のような特定の神経系障害の処置のために有用である。本発明の組合せは、有意に少ない有害な副作用を有するさらなる利点を備える（関節炎の処置のためのような）抗炎症剤として有用である。ＰＧＥ２のＣＯＸ−２媒介性生合成のインヒビターとして、これらの組成物はまた、アレルギー性鼻炎、呼吸窮迫症候群、内毒素ショック症候群、アテローム性動脈硬化症、ならびに発作、虚血および外傷に起因する中枢神経系の損傷の処置において有用である。
ヒトの処置に有用であること以外に、これらの化合物はまた、他の動物（ウマ、イヌ、ネコ、トリ、ヒツジ、ブタなどを含む）の処置のために有用である。炎症の処置のための理想的な処方物は、ＣＯＸ−１の活性に影響することなく、ＣＯＸ−２の誘導および活性を阻害する。歴史的には、炎症の処置のために使用される非ステロイド性およびステロイド性の抗炎症剤は、ＣＯＸ−１に影響することなくＣＯＸ−２を阻害する特異性を欠く。従って、ほとんどの抗炎症剤が長期の期間使用された場合、胃腸系を損傷する。故に、炎症および炎症に基づく疾患に対する新たなＣＯＸ−２特異的処置が緊急に必要とされる。
一つの形態または別の形態中のホップ抽出は、水およびアルコール中の抽出が最初に試みられた、１９世紀初頭まで１５０年以上遡る。今日でさえ、エタノール抽出は、ヨーロッパで利用可能であるが、圧倒的に優勢な抽出は、有機溶媒抽出物（ヘキサン）およびＣＯ２抽出（超臨界および液体）である。ＣＯ２（代表的には６０バール圧および５〜１０℃）は、液体状態であり、そしてホップのやわらかい樹脂および油に対して非常に特異的な、比較的穏やかな、非極性の溶媒である。臨界点を超えると、代表的には、３００バール圧および６０℃において、ＣＯ２は、気体および液体の両方の特性を有し、かなりより強い溶媒である。種々の抽出物の組成が、表１において比較される。
Figure 2009203244
最も簡潔には、ホップ抽出は、製粉（ｍｉｌｌｉｎｇ）する工程、ペレット化する工程、およびリュープリンを広げるためのホップを再製粉する工程、樹脂成分を回収するために溶媒を充填カラムに通過させ、そして最後に全樹脂抽出物または「純粋な」樹脂抽出物を得るために溶媒を除去する工程を含む。
主要な有機抽出溶媒は、強い溶媒であり、実質的に全てのリュ−プリン成分に加えて、植物色素、クチクラ蝋、水および水溶性物質を抽出する。
超臨界ＣＯ２は、有機溶媒より選択的であり、より少ないタンニンおよび蝋ならびにより少ない水およびそれ故より少ない水溶性成分を抽出する。超臨界ＣＯ２は、クロロフィルのようないくつかの植物色素を抽出するが、有機溶媒が抽出するよりもかなり少ない。液体ＣＯ２は、ホップについて商業的に使用される最も選択的な溶媒であり、従って最も純粋な全樹脂および油抽出物を産生する。液体ＣＯ２は、硬い樹脂またはタンニンを全く抽出せず、植物蝋を非常に少量抽出し、植物色素を抽出せず、そしてより少ない水および水溶性成分しか抽出しない。
この選択性および穏やかな溶媒の特性の結果として、ホップの単位重量あたりの液体ＣＯ２抽出物の絶対的な収量は、他に言及された溶媒を使用する場合よりも少ない。さらに、液体ＣＯ２でのα酸の収量（８９〜９３％）は、超臨界ＣＯ２の収量（９１〜９４％）または有機溶媒の収量（９３〜９６％）よりも低い。抽出後、溶媒の除去の過程があり、これは有機溶媒については、揮発を起こすための加熱を含む。それにもかかわらず、微量の溶媒が、抽出物中に残る。しかしながら、ＣＯ２の除去は、ＣＯ２を揮発させるための圧力の解放を単に必要とする。
ホップ抽出物由来のフムロンの骨吸収のインヒビターとしての同定は、非特許文献１に報告される。同じグループによる後の研究は、フムロンの作用のメカニズムをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＴＮＦα刺激後のＣＯＸ−２遺伝子転写の阻害として特徴づけている［非特許文献２]。
従って、ＣＯＸ−１にほとんど影響がないかまたは全く影響なく、ＣＯＸ−２によるプロスタグランジンの合成を特異的に阻害または防止する化合物の天然処方物を同定することが有用である。関節組織の健康を維持し、関節炎または他の炎症性状態を処置するために有用である、このような処方物は、未だに発見されていない。用語「特異的または選択的なＣＯＸ−２インヒビター」は、ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物または化合物の混合物を包含する。好ましくは、この化合物は、ＣＯＸ−１の阻害についての中央有効濃度より最小でも５倍高いＣＯＸ−２阻害についての中央有効濃度を有する。例えば、試験処方物のＣＯＸ−２についての中央阻害濃度が０．２μｇ／ｍＬである場合、ＣＯＸ−１についての中央阻害濃度が１μｇ／ｍＬ以上でなければ、この処方物は、ＣＯＸ−２特異的とみなされない。
グルコサミンは、変形性関節症の治療に効果的で安全であるとして一般的に認められているが、変性関節疾患の処置への医療的介入は、一般的に急性症状の軽減に制限される。医師は、一般的に、変形性関節症の処置に非ステロイド性およびステロイド性の抗炎症薬を利用する。しかし、これらの薬物は、長期の治療に十分適していない。なぜなら、これらの薬剤は、軟骨を増強および保護する能力を欠くだけでなく；軟骨の変性または軟骨の合成の低下を実際に導き得るからである。さらに、ほとんどの非ステロイド性の抗炎症薬は、長期間使用された場合、胃腸系を損傷する。従って、関節炎のための新たな処置が緊急に必要とされる。
グルコサミンの関節保護特性は、以下の２つの欠点を除いて、グルコサミンを変形性関節症のための魅力的な治療薬にする：（１）グルコサミン処置に対する応答の速度は、抗炎症薬での処置よりも遅く、そして（２）グルコサミンは、変性の回復の予測を実行し損ない得る。グルコサミンを非ステロイド性抗炎症薬と比較する研究において、例えば、１日あたり１５００ｍｇ硫酸グルコサミンを１２００ｍｇのイブプロフェンと比較する二重盲検は、最初の２週間の間に、イブプロフェン患者においてグルコサミン処置患者より早く、疼痛スコア（ｐａｉｎ ｓｃｏｒｅ）が減少したことを示した。しかし、疼痛スコアにおける減少は、グルコサミンを受けた患者において試験期間中続き、２群の間の差は、８週までにグルコサミンに有利に有意に変わった。非特許文献３。従って、グルコサミンは、利用可能な抗炎症薬より遅い速度で関節炎の疼痛および炎症を軽減し得る。
軟骨の代謝の正常化または変形性関節症の処置のための理想的な処方物は、強力な抗炎症活性を有する適切な軟骨保護（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を提供する。変形性関節症のための最適な栄養補助食品は、グルコサミンによって提供される一般的な関節再構築特性を増強し、そして任意の有害な副作用を導入することなく炎症応答を弱めるべきである。これは、安価に製造されるべきであり、全ての政府の規制に従うべきである。
しかし、現在利用可能なグルコサミン処方物は、変形性関節症および関節リウマチの根底の問題を最適に攻撃し、そして軽減するように処方されていない。さらに、多くの市販のハーブの補助食品および栄養補助食品のように、利用可能な処方物は、その安全性および有効性を確証し得る利用の歴史も制御された臨床試験も有さない。
従って、ＣＯＸ−２酵素活性の発現を特異的に阻害するかまたは抑制するが、ＣＯＸ−１代謝にほとんどまたは全く影響を有ない組成物の同定が有用であり、その結果、これらは、有害な副作用がない十分に低い用量または現在の臨床用量で使用され得る。
Ｔｏｂｅ，Ｈら、「Ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｏｐ ｅｘｔｒａｃｔ」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９７，６１（１）１５８〜１５９ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｉｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍｕｌｏｎ ｏｆ ｂｅｅ ｈｏｐ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４６５：１０３〜１０６ Ｌｏｐｅｓ Ｖａｚ，Ａ．，「Ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｎｅｅ ｉｎ ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｏｐｉｎ．（１９８２）８，１４５〜１４９
（本発明の要旨）
本発明は、成分ＩおよびＩＩは同じではないという条件で、α酸およびβ酸からなる群から選択される、有効量の成分Ｉ、ならびに、α酸、β酸、精油、脂肪およびワックスからなる群から選択される、少なくとも１つの有効量の成分ＩＩを含む組成物提供する。好ましくは、この組成物は、α酸、β酸および精油からなる群から選択される、２つ以上の活性成分を含む。この本発明の活性成分は、好ましくは、ホップ抽出物から作られる。組成物は、ＣＯＸ−１に対して殆ど影響しないか、または全く影響しないで誘導性ＣＯＸ−２の活性を阻害するように、相乗的に機能する。
本発明はさらに、結合運動を正常化するようグルコサミンまたはコンドロイチン硫酸の機能を増強するか、または変形性関節症の症状を軽減させる組成物を提供する。
本発明の１つの特定の実施形態は、３０重量％〜６０重量％のα酸、１５重量％〜４５重量％のβ酸および３重量％〜６重量％の精油を含む組成物である。この組成物は、必要に応じて２重量％〜８重量％の脂肪およびワックスを含む。好ましくは、α酸、β酸、精油、脂肪およびワックスは、好ましくはＣＯ２抽出により調製された、ホップ抽出物由来である。
本発明はさらに、食餌補助の方法、および動物における炎症または炎症に基く疾患の処置の方法を提供し、この方法は、炎症の徴候を有する患者にα酸、β酸および精油からなる群から選択される２つ以上の活性成分を含む本発明の組成物を投与する工程、および症状が消失するかまたは軽減するまで、この組成物のこのような食餌補助を継続する工程を包含する。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
α酸およびβ酸から本質的になる組成物であって、
該α酸およびβ酸は、投与された場合、ＣＯＸ−１活性に対する最小の効果を有しつつ誘導性ＣＯＸ−２活性を阻害し得る比で存在する、
組成物。
・（項目２）
３０〜６０％のα酸、１５〜４５％のβ酸から本質的になる組成物であって、
該組成物は、投与された場合、ＣＯＸ−１活性に対する最小の効果を有しつつ誘導性ＣＯＸ−２活性を阻害し得る、
組成物。
・（項目３）
項目１または２に記載の組成物であって、前記α酸およびβ酸が、ＣＯ２抽出により調製されたホップ抽出物から作製された、組成物。
・（項目４）
ＣＯ２抽出によって調製されたホップ抽出物から作製された精油をさらに含む、項目３に記載の組成物。
・（項目５）
項目１または２に記載の組成物であって、前記α酸が、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、ヒュールポン（ｈｕｌｕｐｏｎｅ、アドフムロン、キサントヒュモール（ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ）Ａおよびキサントヒュモール（ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ）Ｂからなる群より選択される、組成物。
・（項目６）
項目１または２に記載の組成物であって、前記β酸が、リュープロン、コリュープロン、アドリュープロン、テトラヒドロイソフムロンおよびヘキサヒドロコリュープロンからなる群より選択される、組成物。
・（項目７）
項目１または２に記載の組成物であって、抗酸化剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、炭水化物、グルコサミン、コンドロイチン硫酸およびアミノ糖からなる群より選択される１つ以上のメンバーをさらに含む、組成物。
・（項目８）
食餌補助の方法であって、該方法は、
炎症の症状に罹患している動物に、項目１または２に記載の組成物を投与する工程
を包含し、
該組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／体重／日のα酸、０．０１〜１００ｍｇ／体重／日のβ酸を提供するように処方された、
方法。
・（項目９）
項目８に記載の方法であって、前記組成物が、α酸またはβ酸の活性成分の０．００１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの血清濃度または標的組織濃度を維持するのに十分な量で投与される、方法。
（本発明の詳細な説明）
本発明の組成物、ならびにその作成および使用の方法を開示および、記載する前に、本発明は、プロセス工程のような特定の構成に限定されず、物質は他のものに変えられ得ることが理解される。本発明の範囲は、添付の請求項およびその等価物によってのみ制限されるので、本明細書内で使われる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのために使用され、制限することを意図しないことがまた、理解されることを意図している。
本発明明細書および添付の請求項で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈中で明らかに別の意味を示していない限りは、複数の対象を含むことに注意されたい。
本発明は、ＣＯＸ−２の活性に対して選択的な阻害作用を有する組成物を提供し、この組成物は、成分Ｉと成分ＩＩが同じ化合物ではないという条件付で、α酸およびβ酸からなる群から選択される有効量の成分Ｉ、およびα酸、β酸、精油、脂肪およびワックスからなる群から選択される、少なくとも１つの有効量の成分ＩＩを含む。さらに特に、この組成物は、α酸、β酸および精油からなる群から選択される２つ以上の活性成分を含む。好ましくは、この本発明の活性成分はホップ抽出物から作られる。好ましくは、組成物は、３０重量％〜６０重量％のα酸、１５重量％〜４５重量％のβ酸および３重量％〜６重量％の精油を含む。この組成物は、必要に応じて２重量％〜８重量％の脂肪およびワックスを含む。好ましくは、α酸、β酸、精油、脂肪またはワックスはＣＯ２抽出により調製された、ホップ抽出物由来である。本発明により提供される組成物は、食餌補助食品または治療的成分として処方され得る。この成分は、ＣＯＸ−１にほとんど影響しないかまたは全く影響しないで、ＣＯＸ−２の誘導および／もしくは活性を阻害するように機能する。
本明細書中で使用する場合、用語「食餌補助食品」は、消費されて、生理現象において構造的変化または機能的変化に影響する化合物をいう。用語「治療的成分」は、投与されて、疾患を処置するまたは疾患を予防する任意の化合物をいう。
本明細書で使用する場合、用語「ＣＯＸインヒビター」は、ＣＯＸ−２酵素の活性または発現を阻害し得る、または、痛みや腫脹を含む、深刻な炎症応答を阻害し得るかまたはその重症度を軽減し得る、天然化合物の組成物をいう。
本明細書で使用する場合、用語「ホップ抽出物」は、（１）ホップ植物産物を溶媒にさらし、（２）ホップの植物体産物から溶媒を分離し、（３）溶媒を除去することで得られる固形の物質をいう。
本明細書で使用する場合、用語「溶媒」は、ホップ植物産物から固体の物質を抽出するのに必要な性質を有する水溶性の液体または有機的性質をいう。溶媒の例としては、水、蒸気、加熱水、メタノール、エタノール、ヘキサン、クロロホルム、液体ＣＯ２、液体窒素またはそれらの物質の組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「ＣＯ２抽出物」は、ホップ植物産物を液体または臨界超過のＣＯ２調製物にさらした後、ＣＯ２を除去して得られる固体の物質をいう。
本明細書で使用する場合、用語「α酸分画」は、ホップ植物産物から単離された化合物（中でも、フムロン、コフムロン、イソフムロン、イソプレフムロン、フルポン（ｈｕｌｕｐｏｎｅ）、アドフムロン（ａｄｈｕｍｕｌｏｎｅ）、キサントフモールＡおよびキサントフモールＢを含む）をいう。
本明細書で使用する場合、用語「β酸分画」は、一まとまりでルプロンとして公知の化合物（なかでも、ルプロン、コルプロン、アドルプロン、テトラヒドロイソフムロンおよびヘキサヒドロコルプロンを包含する）をいう。
本明細書で使用する場合、用語「精油分画」は、主にミルセン、フムレン、β−カリオフィレン（ｂｅｔａ−ｃａｒｙｏｐｈｙｌｅｅｎ）、ウンデカン−２−オンおよび２−メチル−ブト−３−エン−オールからなる構成成分の複合混合物をいう。
本明細書で使用する場合、用語「脂肪」は、脂肪酸のトリアシルグリセロールエステルをいう。
本明細書で使用する場合、用語「ワックス」は、非常に長い鎖（＞２５ 炭素）の脂肪アルコール鎖または脂肪酸鎖のトリアシルグリセロールエーテルまたはトリアシルグリセロールエステルをいう。
従って、本発明のひとつの好ましい実施形態は、α酸、β酸および精油からなる群から選択される、２つ以上の有効量の活性成分の組合せを含む組成物である。本発明の組成物は、特に、ＣＯＸ−１に対してほとんど、または全く影響を示さないで、ＣＯＸ−２の誘導能の阻害または活性を阻害するよう機能する。従って、本発明の組成物は、本質的に、素早く、一切の有害な副作用を誘導することなく、痛みや腫脹を含む炎症応答を取り除く。
薬学的等級の抽出物は、幅広い安全性および有効性の手続に合格しなければならない。薬学的等級のＣＯ２ホップ抽出物は、本発明の実施において用いる場合、ホップ抽出物の濃度が、約１０重量％〜９５重量％のα酸含有量である調製をいう。好ましくは、α酸含有量は、４５重量％より高い。薬学的等級のホップ抽出物における、β酸含有量の範囲は、約１０重量％〜９５重量％である。好ましくは、β酸含有量は４５重量％より高い。薬学的等級の抽出物が、特に好ましい。本発明の食餌補助食品の１日当りの投与量（ｍｇ／ｋｇ−日）を、動物の体重の１ｋｇ当り、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇのホップ抽出物のＣＯ２抽出物を送達するよう処方する。
局所的適用のための、本発明の組成物は、約０．００１ｗｔ％〜１０ｗｔ％の薬学的等級のＣＯ２ホップ抽出物、好ましくは０．０１ｗｔ％〜１ｗｔ％の薬学的等級のＣＯ２ホップ抽出物を含む。
本発明の好ましい組成物は、約０．００５ｎｇ／ｍＬ〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で、α酸成分またはβ酸成分のいずれかの血漿濃度または標的組織濃度を生じる。
成分Ｉと成分ＩＩが同じ化合物でないという条件での、α酸およびβ酸からなる群から選択される成分Ｉならびにα酸、β酸、精油、脂肪およびワックスからなる群から選択される成分ＩＩの組み合わせに加えて、食餌適用のためのこの組成物は、多様な添加剤（例えば、代謝中間生成物の他の天然の成分、ビタミンおよびミネラル）、ならびに不活性成
分（例えば、タブレットおよびカプセルの製造において、標準的な賦形剤であるタルクおよびマグネシウムステアレート）を含み得る。
本明細書中で使用する場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤、甘味料などを含む。これらの薬学的に受容可能なキャリアは、広い範囲の物質（希釈剤、結合剤、および接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、バルキング剤、香味料、甘味料、および多種の物質（例えば、特定の治療的成分を調製するために必要となり得る緩衝剤および吸収剤）が挙げられるが、これらに限定されない）から調製され得る。薬学的に活性な物質に対する、それらの媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の習慣的な媒体または薬剤が活性物質と両立しない場合を除いては、本組成物における使用が意図される。１つの実施形態において、タルクおよびマグネシウムステアレートは、本発明の処方物に含まれる。ダイエットバーもしくは機能食のような、この組成物の製造に影響することが既知である他の成分としては、香味料、糖、アミノ糖、タンパク質および／または改良スターチ、ならびに脂肪および油が挙げられ得る。
本発明の食餌補充食品、ローションまたは治療的成分は、当業者に公知の任意の方法で処方され得る。１つの実施形態において、この組成物は、当業者で利用で可能な技術を用いて、カプセルまたはタブレットの中に処方される。カプセル形態またはタブレット形態では、成人または動物に対する推奨の１日の用量は、好ましくは、１個〜６個のカプセルまたはタブレットに含まれ得る。しかし、本組成物はまた、他の便利な形態（例えば、注射溶液もしくは注射懸濁液、スプレー溶液もしくはスプレー懸濁液、ローション、ガム、トローチ剤、食物、または軽食の品目）で処方され得る。食品、軽食、ガムまたはトローチ剤の品目は、甘味料、香味料、油、スターチ、タンパク質、果物もしくは果物抽出物、野菜もしくは野菜抽出物、穀物、動物性脂肪または動物性タンパク質を含む、任意の摂取成分を含み得る。従って、本組成物は、シリアル、軽食品目（例えば、チップス、バー、噛むことのできるキャンディーまたはゆっくりと溶かすことのできるトローチ剤）の中に処方され得る。
本発明は、炎症に基く、急性および慢性の両方の、あらゆる形態の疾患の処置を意図する。本組成物は、炎症応答を軽減し、それにより影響を受ける組織の治癒を促進するか、またはさらなる損傷を防ぐ。薬学的に受容可能なキャリアはまた、本組成物および本処方物において使用され得る。
本発明に従って、動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、鳥類、ウマ、反芻動物またはその他の動物などからなる群から選択されるメンバーであり得る。本発明は、主にヒトの処置を示す。投与は、当業者に利用可能な任意の方法（例えば、経口経路、局所的経路、経皮性経路、経粘膜性経路、または非経口経路）であり得る。
以下の実施例は、例示目的であり、本発明についていかなる限定もなされない。
（実施例１）
（ホップのＣＯ２抽出物によるシクロオキシゲナーゼ−２媒介プロスタグランジンＥ２の選択的阻害）
この実施例は、先行技術で記載された精製化合物フムロンと比較して、本発明のＣＯ２ホップ抽出物の優れたＣＯＸ−２選択性を例証する。従って、本発明のＣＯ２ホップ抽出物の有効性は、先行技術で記載された精製化合物フムロンより優れていることが推論される。
（ホップのＣＯ２抽出物によるＰＥＧ２のＣＯＸ−２媒介生成の阻害）
装置 − 平衡器、分析用のＯｈａｕｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｏｈａｕｓ Ｍｏｄｅｌ ＃ＥＯ１１４０，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、生物学的に安全なキャビネット（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ１２１４，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、１００μＬ〜１０００μＬのピペッター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、セルハンドタリーカウンター（ｃｅｌｌ ｈａｎｄ ｔａｌｌｙ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃２３６０９−１０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３２１０，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、血球計算器（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＃１４９２，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｏｄｅｌ ＃ＤＭ ＩＬ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１２チャンネルの多重チャンネルピペッター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、Ｐｉｐｅｔ Ａｉｄ（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、０．５μＬ〜１０μＬのピペッター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１００μＬ〜１０００μＬのピペッター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、２μＬ〜２０μＬのピペッター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、２０μＬ〜２００μＬのピペッター（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＰＵＲＥＬＡＢ Ｐｌｕｓ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ． Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、４℃冷蔵庫（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、ボルテックスミキサー（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃３３９９４−３０６，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、水浴（Ｓｈｅｌ Ｌａｂ Ｍｏｄｅｌ，＃１２０３，Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，ＯＲ）。
細胞、化学物質、試薬および緩衝剤−細胞スクレーパー（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃３００８，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５５０７，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃１０−０１３−ＣＶ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ−ＨＩ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃３５−０１１−ＣＶ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、リボポリサッカライド（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｌ−２６５４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１．７ｍＬの微量遠心管（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ＃３０−００１−ＣＩ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、０．５μＬ〜１０μＬのピペッター用のピペッタ−チップ（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１００μＬ〜１０００μＬのピペッター用のピペッタ−チップ（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、２μＬ〜２０μＬおよび２０μＬ〜２００μＬのピペッター用のピペッタ−チップ（ＶＷＲ Ｃａｔａｌｏｇ ＃５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１０ｍＬのピペット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５５１，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、２ｍＬのピペット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５０７，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、５ｍＬのピペット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃７５４３，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、ＲＡＷ ２６４．７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃ＴＩＢ−７１，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ），試験化合物（Ｈｏｐｕｎｉｏｎ，Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ製の液体ＣＯ２ホップ抽出物）、９６ウェル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ＃３０７５，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｎｅｓ，ＮＪ）、超純水（抵抗＝１８メガΩ−ｃｍ 脱イオン水）。
一般手順−ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣから入手）を、ＤＭＥＭ培地中で増殖させ、そして対数期で維持した。このＤＭＥＭ増殖培地を、以下のように作製した：５０ｍＬの熱不働化ＦＭＳおよび５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを、ＤＭＥＭの５００ｍＬのビンに添加し、そして４℃で貯蔵した。良好な結果を得るために、この培地を、３ヶ月以内に使用し、使用前に、水浴中で３７℃まで加温するべきである。
実験の１日目の朝に、対数期の２６４．７細胞を、９６ウェル組織培養プレート中のウェル１つあたり０．２ｍＬの増殖培地中に、８×１０４細胞／ウェルでプレーティングした。１日目の終わり（プレーティング後６〜８時間）に、各ウェルから１００μＬの増殖培地を、取り出し、そして１００μＬの新鮮な培地と交換した。１．０ｍｇ／ｍＬのＬＰＳ溶液（これは、ＲＡＷ ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の発現を誘導するために使用される）を、１ｍＬのＤＭＳＯ中にＬＰＳ（１．０ｍｇ）を溶解することによって、調製した。これを、溶解するまで撹拌し、そして４℃で貯蔵した。使用前に、室温または３７℃の水浴中で融解した。６０日ごとに新しい溶液を作製する。
実験の２日目に、液体ＣＯ２ホップ抽出物を、ＤＭＳＯ中の１０００倍ストックとして調製した。例えば、試験物質の最終濃度が、１０μｇ／ｍＬである場合、１０ｍｇ／ｍＬのストックを、１０ｍｇの試験物質を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解することによって、調製するべきである。最良の結果を得るために、新鮮な液体ＣＯ２ホップ抽出物を、実験の日に調製するべきである。１．７ｍＬの微小遠心管中に、ＦＢＳを含まない１ｍＬのＤＭＥＭを、試験濃度０．０５、０．１０、０．５および１．０μｇ／ｍＬで添加する。試験物質の１０００×ＤＭＳＯストック２μＬを、ＦＢＳを含まない培地（１ｍＬ）に添加した。最終濃度の試験物質を含む管を、２倍に濃縮し、そしてこの管を、１０分間平衡状態になるまでインキュベータに置いた。
１００μｌの培地を、１日目に調製した細胞プレートの各ウェルから取り出した。１００μｌの平衡化した２×最終濃度の試験化合物を、細胞に添加し、９０分間インキュベートした。１ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯストック（４４μＬ）を１０ｍＬの培地に添加することによって、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中のＬＰＳを調製した。刺激される細胞の各ウェルごとに、２０μＬのＬＰＳ（ＬＰＳの最終濃度は、０．４μｇ／ｍＬ ＬＰＳである）を添加し、そして２４時間インキュベートした。
３日目に、この細胞の外観を観察した。培地中のＰＧＥ２の量を決定するために、各ウェルから１００μｌの上清培地を、清潔な微量遠心管に移した。
（ホップ抽出物によるＣＯＸ−１酵素阻害の決定）
試験物質がＰＧＥ２のＣＯＸ−１合成を阻害する能力を、本質的にＮｏｒｅｅｎ，Ｙ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６１，２−７，１９９８）により記載されるようにして、決定した。
装置−バランサー（２４００ｇ，Ａｃｃｕｌａｂ ＶＩ−２４００，ＶＷＲ カタログ番号１１２３７−３００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、バランサー、分析用、Ｏｈａｕｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｏｈａｕｓ Ｍｏｄｅｌ ＃ＥＯ１１４０，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、バイオセイフティーキャビネット（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ１２１４，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、冷凍庫（−３０℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７９７）、冷凍庫（−８０℃超低温）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ８５１６，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＨＯ）、加熱撹拌プレート（ＶＷＲ カタログ番号３３９１８−２６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、製氷器（Ｓｃｏｔｓｍａｎ Ｍｏｄｅｌ ＃ＡＦＥ４００Ａ−１Ａ，Ｆａｉｒｆａｘ，ＳＣ）、マルチチャネルピペッター、１２チャネル（ＶＷＲカタログ番号５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、マルチチャネルピペッター、８チャネル（ＶＷＲカタログ番号５３５０１−６６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、オービタルシェーカープラットホーム（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ ＃Ｆ３７０４１−００００，Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ）、ｐＨメーター（ＶＷＲカタログ番号３３２２１−０１０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペットエイド（ＶＷＲカタログ番号５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、０．５〜１０μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、１００〜１０００μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２〜２０μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２０〜２００μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＰＵＲＥＬＡＢ ＰＬＵＳ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷蔵庫（４℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）、真空チャンバ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｚ３５，４０７−４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ボルテックスミキサー（ＶＷＲカタログ番号３３９９４−３０６，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。
供給源および試薬−９６ウェル丸底プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ ＃２６７２４５，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。アラキドン酸（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−３９２５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、遠心分離管（１５ｍＬ、コニカル、滅菌）（ＶＷＲカタログ番号２０１７１−００８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＣＯＸ−１酵素（ヒツジ）４０，０００単位／ｍｇ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号６０１００，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＶＷＲカタログ番号５５０７，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、エタノール１００％（ＶＷＲカタログ番号ＭＫ７０１９０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、エピネフリン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ−４２５０，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、グルタチオン（還元型）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ−６５２９，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、メスシリンダー、１０００ｍＬ（ＶＷＲカタログ番号２４７１１−３６４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ヘマチン（ブタ）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ−３２８１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、塩酸（ＨＣｌ）（ＶＷＲカタログ番号ＶＷ３１１０−３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、キムワイプ（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｃｌａｒｋカタログ番号３４２５６，Ｒｏｓｗｅｌｌ，ＧＡ）、微量遠心管、１．７ｍＬ（ＶＷＲカタログ番号２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ−５８８１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．５〜１０μＬピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲカタログ番号５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１００〜１０００μＬピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲカタログ番号５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、２〜２０μＬピペッターおよび２０〜２００μＬピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲカタログ番号５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、プロスタグランジンＥ２（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−３６４０，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、プロスタグランジンＦ２α（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−０４２４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、スターラーバー（マグネティック）（ＶＷＲカタログ番号５８９４８−１９３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、貯蔵ビン、１０００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１３９５−１Ｌ，Ｃｏｒｎｉｎｇ．ＮＹ）、貯蔵ビン、１００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１３９５−１００，Ｃｏｒｎｉｎｇ．ＮＹ）、ホップのＣＯ２抽出物（Ｈｏｐｕｎｉｏｎ，Ｙａｋｉｍａ，ＷＡ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ−５９４１，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、超純水（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ＝１８メガΩ−ｃｍ脱イオン水）。
一般手順−酸素を含まない１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を、以下のようにして調製した：１０００ｍＬのビーカー中で、１２．１１ｇのＴｒｉｚｍａ ＨＣｌを９００ｍＬの超純水に溶解した。このビーカーにスターラーバーを入れて、撹拌プレート上に置いた。ｐＨが８．０に達するまで、ＮａＯＨを添加した。容量を、１０００ｍＬの最終容量に調整し、そして１０００ｍＬの貯蔵ビン中で貯蔵した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を、ゆるく蓋をして真空チャンバに入れ、この緩衝液の泡立ちが止まるまで、空気ポンプをオンにした。この真空チャンバをオフにし、そして貯蔵ビンを密閉した。この工程を、酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用する場合ごとに繰り返した。
１ｍＬの酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に、１．３ｍｇの（−）エピネフリン、０．３ｍｇの還元グルタチオンおよび１．３ｍｇのヘマチンを添加することによって、１ｍＬの補因子溶液を調製した。試験物質の溶液を、必要に応じて調製した。すなわち、１０ｍｇのアスピリンを計量し、そして１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。
酵素を、以下のように、酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解した。すなわち、氷上で、６．５μＬの酵素を、４０，０００単位／ｍＬで採取し、そして６４３．５μＬの酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加した。この酵素溶液は、６０回の反応に十分である。ＣＯＸ−１酵素溶液を、以下のように調製した。１５ｍＬの微量遠心管中で、１０μＬのＣＯＸ−１酵素（４０，０００単位／ｍＬ）を、酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌに、１つの反応あたり５０μＬの補因子溶液と共に添加した。この混合物を、氷上で５分間インキュベートした（すなわち、６０回の反応は、６５０μｌの酵素を、酸素を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に、３．２５ｍＬの補因子溶液と共に添加する）。
６０μｌの酵素溶液を、９６ウェルプレートの各ウェル中で、２０μｌの試験溶液と合わせた。試験溶液の最終濃度は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２μｇ／ｍＬであった。これらのプレートを、氷上で１０分間プレインキュベートした。２０μＬのアラキドン酸（３０μＭ）を添加し、そして３７℃で１５分間インキュベートした。
２ＭのＨＣｌを、１２．１ＮのＨＣｌを希釈することによって調製した。１００ｍＬの貯蔵ビン中に、８３．５ｍＬの超純水を添加し、次いで、１２．１Ｎ ＨＣｌ（１６．５ｍＬ）を添加した。これを、１００ｍＬの貯蔵ビン中で貯蔵し、そしてバイオセイフティーキャビネット中に置いた（常に最後に酸を加える）。この反応を、２Ｍ ＨＣｌ（１０μＬ）を添加することにより終結させた。この最終溶液を、ＰＧＥ２アッセイのための上清として使用した。
（培地中のＰＧＥ２濃度の決定）
以下の手順は、本質的に、Ｈａｍｂｅｒｇ，Ｍ．およびＳａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｂ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７１．２４６，６７１３−６７２１）により記載される手順である；しかし、市販の非放射性手順を使用した。
装置−冷凍庫（−３０℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｆ３７９７）、加熱撹拌プレート（ＶＷＲ カタログ番号３３９１８−２６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、マルチチャネルピペッター、１２チャネル（ＶＷＲカタログ番号５３５０１−６６２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、オービタルシェーカープラットホーム（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ ＃Ｆ３７０４１−００００，Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ，ＮＪ）、ピペットエイド（ＶＷＲカタログ番号５３４９８−１０３，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、０．５〜１０μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２００，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、１００〜１０００μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２０８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２〜２０μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２０２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペッター、２０〜２００μＬ（ＶＷＲカタログ番号４０００−２０４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、プレートリーダー（Ｂｉｏ−ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ ＃Ｅｌｘ８００，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）、ＰＵＲＥＬＡＢ
ＰＬＵＳ Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕ．Ｓ．Ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）、冷蔵庫（４℃）（Ｆｏｒｍａ Ｍｏｄｅｌ ＃ｆ３７７５，Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｏｈｉｏ）。
化学物質、試薬および緩衝液−プロスタグランジンＥ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ４８０−ウェル（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号５１４０１０，Ａｎｍ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、遠心分離管（５０ｍＬ、コニカル、滅菌）（ＶＷＲカタログ番号２０１７１−１７８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈカタログ番号１０−０１３−ＣＶ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、メスシリンダー、１００ｍＬ（ＶＷＲカタログ番号２４７１１−３１０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、キムワイプ（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｃｌａｒｋカタログ番号３４２５６，Ｒｏｓｗｅｌｌ，ＧＡ）、微量遠心管、１．７ｍＬ（ＶＷＲカタログ番号２０１７２−６９８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈカタログ番号３０−００１−ＣＩ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、０．５〜１０μＬピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲカタログ番号５３５０９−１３８，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１００〜１０００μＬピペッター用のピペットチップ（ＶＷＲカタログ番号５３５１２−２９４，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、２〜２０μＬピペッターおよび２０〜２００μＬピッペター用のピペットチップ（ＶＷＲカタログ番号５３５１２−２６０，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ピペット、２５ｍＬ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号７５５１，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）、貯蔵ビン、１００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１３９５−１００，Ｃｏｒｎｉｎｇ．ＮＹ）、貯蔵ビン、１０００ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１３９５−１Ｌ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、超純水（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ＝１８メガΩ−ｃｍ脱イオン水）。
一般手順−ＥＩＡ緩衝液濃縮物（バイアル＃４）の内容物を、９０ｍｌの超純水で希釈することにより、ＥＩＡ緩衝液を調製した。このバイアル＃４を、数回リンスし、全ての結晶が除去されたことを保証し、そして１００ｍＬの貯蔵ビンに入れ、そして４℃で貯蔵した。
洗浄緩衝液濃縮物（バイアル＃５）を、超純水で１：４００で希釈することによって、洗浄緩衝液を調製した。次いで、０．５ｍｌ／ｌのＴｗｅｅｎ ２０（バイアル＃５ａ）を添加した（正確な測定のためのシリンジを使用して）。すなわち、１ｌの洗浄緩衝液に対して、２．５ｍｌの洗浄緩衝液濃縮物、０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０および９９７ｍｌの超純水を添加する。この溶液を、１ｌの貯蔵ビン中、４℃で貯蔵した。
プロスタグランジンＥ２標準を、以下のように再構築した。２００μＬのピペットチップを、繰返しこのチップにエタノールを満たしそしてそのエタノールを排出することによって、平衡化した。このチップを使用して、１００μＬのＰＧＥ２標準（バイアル＃３）を１．７ｍＬの微量遠心管に移した。９００μｌの超純水を、この管に添加し、そして４℃で貯蔵した。これは、約６週間安定であった。
プロスタグランジンＥ２アセチルコリンステラーゼトレーサーを、以下のように再構築した。１００μＬのＰＧＥ２トレーサー（バイアル＃２）を取り、そして５０ｍＬの遠心分離管中で、３０ｍＬのＥＩＡ緩衝液と混合し、そして４℃で貯蔵した。この溶液は、５週間以内に使用されるべきである。
プロスタグランジンＥ２モノクローナル抗体を、以下のように再構築した。１００μＬのＰＧＥ２抗体（バイアル＃１）をとり、そして５０ｍＬの遠心管中で、３０ｍＬのＥＩＡと混合し、そして４℃で貯蔵した。この溶液は、５週間以内に使用されるべきである。
５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを５００ｍＬのＤＭＥＭに添加することにより、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭを調製し、そして４℃で貯蔵した。
プレートを以下のように調製した。各プレートは、最低２つのブランク（Ｂ）、２つの非特異的結合ウェル（ＮＳＢ）、２つの最大結合ウェル（Ｂ０）および二重に走る８点の標準曲線（Ｓ１−Ｓ８）を含んだ。各サンプルを、最低２つの希釈でアッセイし、そして各希釈は、二重に行った。
標準物を以下のように調製した：８個の１．７ｍＬ微量遠心管に、管１〜８とラベルを付けた。９００μＬのＤＭＥＭを、管１に入れ、そして５００μＬのＤＭＥＭを管２〜８に入れた。１００μＬのＰＧＥ２標準を、管１に入れ、そして混合した。５００μｌの溶液を、管１から取り、そして管２に入れ、そしてこのプロセスを、管８まで繰り返した。
５０μｌのＥＩＡ緩衝液および５０μｌのＤＭＥＭを、ＮＳＢウェルに添加した。５０μｌのＤＭＥＭを、Ｂ０ウェルに添加した。５０μｌの溶液を、管＃８から取り、そして最も低い標準ウェル（Ｓ８）の両方に添加した。５０μｌを、管＃７から取り、そして次の２つのウェルの各々に添加した。これを、管＃１まで続けた。（８個の標準全てに同じピペットチップを使用する。この標準中にピペットを上げ下げすることにより、必ず各新しい標準中でこのチップを平衡化すること。Ｐ２００を使用して、各希釈で５０μｌの各サンプルを、サンプルウェルに添加する）。
１２チャネルピペッターを使用して、５０μｌのプロスタグランジンＥ２アセチルコリンステラーゼトレーサーを、全活性（ＴＡ）ウェルおよびブランク（Ｂ）ウェル以外の各ウェルに添加した。１２チャネルピペッターを使用して、５０μｌのプロスタグランジンＥ２モノクローナル抗体を、全活性（ＴＡ）ウェル、（ＮＳＢ）ウェルおよびブランク（Ｂ）ウェル以外の各ウェルに添加した。このプレートを、プラスチックフィルム（品目＃７）で覆い、そして４℃で１８時間インキュベートした。
このプレートを、以下のように現像した：１００μＬバイアルのＥｌｌｍａｎ試薬（バイアル＃８）を、５０ｍＬの遠心管中で、５０ｍｌの超純水を用いて再構築した。これを、光から保護し、そして同じ日に使用した。これらのウェルを、１２チャネルピペッターを使用して、洗浄乾燥液で５回リンスした。２００μｌのＥｌｌｍａｎ試薬を、１２チャネルピペッターを使用して、各ウェルに添加し、そして（ＴＡ）ウェルに対する５μｌのトレーサーを、Ｐ１０を使用して、各ウェルに添加した。このプレートを、プラスチックフィルムで覆い、そして６０〜９０分間、暗室中で、オービタルシェーカーに入れた。
このプレートを、４０５ｎｍと４２０ｎｍとの間の単一の波長で、Ｂｉｏ−ｔｅｋプレートリーダーを用いて読み取った。各プレートを読みとる前に、底部を、キムワイプで拭った。このプレートは、ウェルの吸光度が、０．３〜０．８Ａ．Ｕ．の範囲にある場合に、読みとるべきである。このウェルの吸光度が、１．５を越える場合、洗浄し、新たなＥｌｌｍａｎ試薬を添加し、そして再現像する。
ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１の両方についてのＣＯ２ホップ抽出物の培地阻害濃度を、ＣａｌｃｕＳｙｎ（ＢＩＯＳＯＦＴ，ｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ）を使用して、評価した。この統計的パッケージは、Ｔ−Ｃ ＣｈｏｕおよびＰ．Ｔａｌａｌｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．４：４５０−４５４）に記載される５０パーセント有効法（Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、複数の薬物効果計算を実施する。簡単には、これは、「用量」および「効果」を最も単純な可能な形態：ｆａ／ｆｕ＝（Ｃ／Ｃｍ）ｍで相関付け、ここで、Ｃは、化合物の濃度または化合物の用量であり、Ｃｍは、５０パーセント有効用量であり、これは抗力を表す。Ｃｍは、５０パーセント有効
プロットのｘ切片から決定される。試験物質の濃度により影響を受ける関数は、ｆａであり、濃度に影響されない関数は、ｆｕである（ｆｕ＝１−ｆａ）。指数ｍは、薬物有効曲線のＳ字曲線（ｓｉｇｍｏｉｄｉｃｉｔｙ）または形状を表すパラメーターである。これは、５０パーセント有効プロットの傾きにより見積もられる。
５０パーセント有効プロットは、ｘ＝ｌｏｇ（Ｃ）対ｙ＝ｌｏｇ（ｆａ／ｆｕ）のプロットであり、そしてＣｈｏｕの５０パーセント有効式の対数形態に基づく。５０パーセント有効式に対するデータの適合の良さは、この５０パーセント有効プロットの一次相関係数ｒによって表される。通常、酵素またはレセプター系からの実験データは、組織培養実験または酵素実験によると、ｒ＞０．９６を有する。
ＲＡＷ ２６４．７細胞モデルにおけるホップのＣＯ２抽出物によるＣＯＸ−２阻害の５０パーセント阻害濃度は、０．０２４μｇ／ｍＬ（９５％ ＣＩ＝０．１６−０．３６）であった。同じホップのＣＯ２抽出物は、２５．５μｇ／ｍＬのＰＧＥ２のＣＯＸ−１産生の５０パーセント阻害濃度を示した。従って、１０６のＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２特異性が、観察される。このＣＯＸ−２特異性は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＴＮＦα刺激における純水なフムロンについて示されるＣＯＸ−２特異性より２．７倍大きい［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．２０００．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍｕｌｏｎ ｏｆ ｂｅｅ ｈｏｐ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６５：１０３−１０６］。純水な化合物と複雑な混合物との間のＣＯＸ−２特異性のこのような大きな差異は、予想外であり、新規な知見をなす。複雑な混合物が、ほとんどの活性な分子よりもより特異的な生物学的活性を含むことが、通常である。推論は、生体活性分子（フムロンを含む）間の根底にある相乗作用が、このような効果の原因であるということである。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載されるような発明。
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