MX2007002116A - Uso de cariofilinas en la fabricacion de medicamentos y tratamiento de condiciones corporales de inflamacion y dolor inflamatorio. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con el uso de cariofilinas relacionado con medicamentos y con el tratamiento de condiciones corporales de inflamacion y dolor inflamatorio.

Description

USO DE CARIOFILINAS EN LA FABRICACIÓN DE MEDICAMENTOS, Y TRATAMIENTO DE CONDICIONES CORPORALES DE INFLAMACIÓN Y DOLOR INFLAMATORIO La presente invención se relaciona con el uso de cariofilinas relacionado con medicamentos y con el tratamiento de condiciones corporales de inflamación y dolor inflamatorio. Se relaciona particularmente con el uso de cariofilinas en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de condiciones inflamatorias del cuerpo animal, incluyendo el cuerpo humano. La invención también se relaciona con el uso de cariofilinas para el tratamiento de condiciones inflamatorias del cuerpo, incluyendo dolor inflamatorio. Las cariofilinas son compuestos químicos conocidos, útiles en diversas aplicaciones. Por ejemplo el documento de patente US 3,987,008 revela derivados sesquiterpénicos como agentes modificadores de olor y sabor; In J. Nat. Prod. 1992 Jul; 55 (7) : 999-1003, beta-cariofilina y alfa-humulina se citan como agentes anticarcinógenos potenciales; en la solicitud de patente WO 9218001 alfa y beta-humulina y (-) -beta-cariofilina se citan en el control de especie mosca blanca; en la patente US5,314,693 se cita alfa-humulina como un repelente para nemátodos de madera de pino; en la solicitud de patente WO 02078719 alfa y beta-cariofilina están comprendidas en composiciones contra tumor. La presente invención se relaciona, en un aspecto particular, con un uso nuevo y útil para cariofilinas, más particularmente alfa-humulina o beta-cariofilina, como anti-inflamatorio y como analgésico, en un sentido amplio. En un sentido más específico, se encontró que los compuestos son inhibidores útiles de entidades que se sabe que están involucradas en el proceso inflamatorio: citocinas pro-inflamatorias IL-1? (interleucina Iß) y TNFa (factor de necrosis de tumor a) ; PGE2 (prostaglandina-E2) , Expresión de enzimas de COX-2 (cicloxigenasa-2) e iNOS (sintasa de óxido nítrico inducible) Un ejemplo particular de cariofilina de la invención es alfa-humulina, un sesquiterpeno identificado con el CAS (Chemical Abstracts Service) número de registro 6753-98-6, conocido también como alfa-cariofilina, representado por la siguiente estructura: Otro ejemplo particular de cariofilina de la invención es la trans-cariofilina (o beta-cariofilina), también un sesquiterpeno, identificado con el número de registro CAS (Chemical Abstracts Service) 87-44-5, representado por las siguientes estructuras A y B alternativas: Tnuis-cariofilina Trans-cariofilina Estructura A Estructura B De conformidad con el significado empleado en la presente, la mención a las cariofilinas, objeto de la invención, incluye las moléculas como tales, sus sales, isómeros, metabolitos, pro-drogas, solvatos (incluyendo hidratos) y aductos. Los terpenos, incluyendo sesquiterpenos, frecuentemente se mencionan como componentes de mezclas complejas extraídas de plantas, en donde - como es sabido por las personas expertas en el ramo, es indeterminado qué compuesto o compuestos son efectivos, cuan efectivos son, y si son activos por sí mismos, por vía del vehículo/solvente que contiene la composición (agua, alcohol, otros solventes, mezclas de esos, etc.), por vía de su interacción con otros componentes dentro de las mezclas. Los terpenos individuales en sí, de origen natural o productos de síntesis (por ejemplo J. Am. Chem. Soc., 99, 3864 (1977)), se mencionan raramente como agentes farmacéuticos efectivos. La alfa-humulina se ha mencionado que es virtualmente inactiva con respecto a efectos anti-inflamatorios o quimioterapéuticos (referencia: Carcinogenesis (2002), 23(5), 795-802). El solicitante ha encontrado ahora que las cariofilinas, particularmente alfa-humulina y trans-cariofilina, tienen marcados efectos anti-inflamatorios, incluyendo dolor inflamatorio, comprendido en el mismo el efecto inhibitorio sobre la producción de citocinas pro-inflamatorias TL-lß y TNFa, protaglandina PGE2, o la expresión de enzimas COX-2 e iNOS. El solicitante también encontró que las cariofilinas, particularmente alfa-humulina y trans-cariofilina, tienen efectos anti-alérgicos, particularmente anti-histamínicos . Las cariofilinas de la invención son parte de la búsqueda activa de drogas con actividad inflamatoria directa o indirecta, que inhiben los procesos de fisiopatología involucrados en la inflamación. Se usan en el control de enfermedades crónicas-degenerativas como artritis reumatoide, osteoartritis, eritematosus de lupus sistémico, colitis ulcerante, psoriasis, eczema atópica, arterioesclerosis, y otras enfermedades no degenerativas como depresión, y celulitis, y alergias. Por lo tanto, uno de los objetos de la presente invención es el uso de cariofilinas, particularmente alfa-humulina y/o trans-cariofilina, o composiciones que comprenden cariofilinas, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de condiciones inflamatorias del cuerpo animal, particularmente el cuerpo humano. Otro objeto de la presente invención es el uso de cariofilinas, particularmente alfa-humulina y trans-cariofilina, o composiciones que contienen cariofilinas, en el tratamiento de condiciones inflamatorias en el cuerpo animal, particularmente el cuerpo humano. Otro objeto de la presente invención es un método de tratamiento de una condición inflamatoria del cuerpo animal, particularmente el cuerpo humano, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de cariofilinas, particularmente alfa-humulina o trans-cariofilina, a un paciente. Otro objeto de la presente invención es el uso de cariofilinas, particularmente alfa-humulina y trans-cariofilina, o composiciones que contienen cariofilinas, para la inhibición de la producción corporal de una o más de citocina IL-1?, citocina TNFa, prostaglandina PGE2, expresión de enzimas COX-2 e iNOS. La cariofilina de la invención, así como composiciones que comprenden la cariofilina de conformidad con la invención, se pueden administrar al sujeto en necesidad de tratamiento en cualquier forma adecuada, enteral o parenteral, incluyendo oral, tópica, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal intravenosa, por infiltración, por inhalación, transdérmica, transmucosal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocular y sublingual. Las formas de administración particularmente adecuadas son sistémicamente (infiltración, oral, inhalación por rociadura, trandérmica) y tópicamente. La cariofilina de la invención puede estar comprendida en una composición de liberación lenta o controlada. Adyuvantes y excipientes conocidos se pueden utilizar en las composiciones. Una referencia para formas de dosificación farmacéutica útiles para las composiciones relacionadas con las invenciones se puede encontrar en la publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing. Las composiciones que comprenden cariofilina se pueden administrar a los pacientes como sólidos, líquidos o semilíquidos, tabletas, cápsulas, pildoras, polvo, granulos, suspensiones, emulsiones, dispersiones y cualquier otra forma conocida útil. Las composiciones pueden contener agentes activos adicionales, por ejemplo antibióticos, dependiendo del efecto deseado. Para administración oral como tabletas o cápsulas (ambas cápsulas suaves y duras), la cariofilina se puede combinar con vehículos inertes farmacéuticamente aceptables, tales como lactosa, almidón, sucrosa, glucosa, celulosa de metilo, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio, fosfato de calcio, manitol, sorbitol, y similares; para administración oral en la forma líquida, las cariofilinas se pueden combinar con etanol, glicerol, agua, y similares. Cuando se desee o sea necesario, agentes de aglomeración, agentes lubricantes, agentes desintegrantes, color y fragancia se pueden añadir a la mezcla. Los agentes de aglomeración comunes son glucosa, beta-lactosa y edulcorantes de maíz, gomas naturales o sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto o algitnato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, cera y similares. Los lubricantes incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio. Los desintegrantes incluyen almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano, y similares. Las composiciones relacionadas en la invención también se pueden administrar como liposomas o acoplarse con polímeros solubles como vehículos. Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden comprender colorantes y edulcorantes para aumentar la aceptación por pacientes. Los vehículos aceptables para formas de dosificación de agua son agua, un aceite apropiado, una solución salina, dextrosa acuosa, otras soluciones de azúcar y glicoles como propilenglicol o polietilenglicoles, tampón de fosfato. Las composiciones relacionadas con la presente invención típicamente comprenden alrededor de 1 mg a alrededor de 1000 mg de una o más cariofilinas, particularmente alrededor de 10 a 200 mg y más particularmente alrededor de 30 a 100 mg. En dichas composiciones la cariofilina representa alrededor de 0.1 a 99% en peso, particularmente alrededor de 1 a 70% y más particularmente alrededor de 10 a 40%, opcionalmente comprendiendo cuando menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos Los ejemplos que siguen representan modalidades particulares de la invención, y no imponen ninguna limitación a su extensión, que está limitada solamente por las reivindicaciones anexas a la presente. EJEMPLO 1 NOCICEPCIÓN INFLAMATORIA INDUCIDA POR CARREGENINA La metodología de evaluación usada en estas pruebas se describe por Vaz y col., en J. Pharmacol. Exp. Ther. 278:304-312, 1996. Ratones machos (25-35 g) se trataron sistémicamente (oralmente) con alfa-humulina, 50 mg/kg, administrada 1 hora antes del experimento. Los animales se trataron con solución salina al 0.9% (0.1 ml/10 g) se usaron como el control. Otro grupo de animales se trató con paracetamol (600 mg/kg, administrado oralmente 1 hora antes del tratamiento) , que se usó como control positivo. Para la inducción de dolor inflamatorio, los animales recibieron una inyección intraplantar de 0.05 ml de carragenina (300 ug por pata) en la superficie de planta de la pata trasera derecha. Esta dosificación ocasiona edema, nocicepción e hinchamiento substancial de la pata inyectada. La nocicepción se evaluó con un filamento Von Frey (0.4 g) después de 3, 4 y 6 horas. Para obtener una respuesta basal, los animales se probaron previamente el día anterior con el filamento Von Frey 0.4 g. Solamente los animales con una respuesta de alrededor de 20% de seleccionaron. El filamento se aplicó a la pata trasera derecha, cumpliendo con el criterio de (1) la aplicación fue perpendicular a la superficie de planta, con suficiente presión para ocasionar que el filamento de doble, obteniendo de esta manera presión total; (2) los animales se evaluaron cuando las cuatro patas estaban tocando la pantalla; (3) la respuesta de retiro de pata se consideró cuando el animal separó la pata completamente de la pantalla de soporte; (4) cada animal se estimuló 10 veces consecutivas, cada estímulo durando 1 segundo; (5) cada evento de retiro de pata se consideró como 10% de la respuesta, con 10 eventos de retiro correspondiendo a respuesta de 100%. La Gráfica 1 abajo compara la inhibición de dolor obtenida por alfa-humulina con la administración de paracetamol Cada punto representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio.

Gráfica 1 ® carragenina — Ú— alfa-humulina La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, una cariofilina como alfa-humulina redujo la nocicepción inflamatoria, como un resultado de reducción de inflamación, tanto como un analgésico conocido, paracetamol . EJEMPLO 2 EWDEMA DE CARRAGENINA EN PATA DE RATÓN La prueba usada abajo se describe por Cunha y col., en la publicación Life Sci. 70:; 159-169, 2001. Ratones macho de 25 g- 35 g se sedaron ligeramente con éter y se inyectaron con 50 ul de salina conteniendo carragenina (300 ul/pata) en la pata derecha. La pata izquierda recibió el mismo volumen de salida y se tomó como un control negativo. El hinchado se midió con un pletismómetro (fabricante: Ugo Basile, Italia) a lo largo de varios intervalos de tiempo después de la inyección del agente flogístico. La diferencia entre los volúmenes de la pata derecha y la izquierda se cuantificaron (en ml) y se tomaron como un índice de edema. Una hora antes de la prueba los animales de trataron sistémicamente (oralmente) con 50 mg/kg de alfa-humulina o trans-cariofilina. La Gráfica 2 abajo compara la inhibición del volumen del edema mediante administración de ya sea alfa-humulina o trans-cariofilina con inhibición obtenida con la administración de dexametasona (05. Mg/kg, inyectada subcutáneamente 4 horas antes de la prueba) y se usó como control positivo. Los intervalos de punto de tiempo de medición de volumen de edema fueron 30, 60, 120 y 240 min. 24 h y 48 h. Cada punto representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio.

Gráfica 2 tiempo después de inyección La gráfica muestra claramente que de conformidad con la invención, una cariofilina como alfa-humulina redujo el volumen inflamatorio, así como la dexametasona. EJEMPLO 3 EDEMA DE BRADIQUININA EN PATA DE RATÓN La prueba usada abajo se describe por Cunha y col., en la publicación Life Sci. 70:159-169, 2001. Ratones macho de 25 g - 35 g se sedaron ligeramente con éter y se inyectaron con 50 ul de salina que contiene bradiquinina (BK, 3 nmol/pata) , intraplantar. en la pata derecha. La pata izquierda recibió el mismo volumen de salina y se tomó como control negativo. El hinchado se midió con un pletismómetro (fabricante: Ugo Basile, Italia) a lo largo de intervalos de puntos de tiempo después de la inyección del agente flogístico. La diferencia entre los volúmenes de la pata derecha y la izquierda se cuantificaron (en ml) y se tomaron como un índice de edema. Una hora antes de la prueba los animales de trataron sistémicamente (oralmente) con 50 mg/kg de alfa-humulina o con trans-cariofilina. Los animales se trataron previamente con 5 mg/kg de captopril, inyectado subcutáneamente, 1 hora antes de la prueba, a fin de evitar degradación de quininas. Las Gráficas 3A y 3B abajo comparan la inhibición del volumen del edema mediante administración de alfa-humulina (3A) o trans-cariofilina (3B) . Los intervalos de tiempo de medición de volumen de edema fueron 10, 20, 30, 60 y 120 min, 24 h y 48 h. Cada punto representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio.

Gráfica 3 O 102030 SO 120 O 102030 60 120 tiempo después de inyección (min) La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, una cariofilina como alfa-humulina o trans-cariofilina redujo marcadamente el edema de pata inducido por bradiquinina. EJEMPLO 4 EDEMA DE HISTAMINA EN PATA DE RATÓN La prueba usada abajo se describe por Cunha y col., en la publicación Life Sci. 70:159-169, 2001. Ratones macho de 25 g - 35 g se sedaron ligeramente con éter y se inyectaron con 50 ul de salida que contiene histamina (100 nmol/pata), intraplantar, en la pata derecha. La pata izquierda recibió el mismo volumen de salina y se tomó como control negativo. El hinchado se midió con un pletismómetro (fabricante: Ugo Basile, Italia) a lo largo de varios intervalos de tiempo después de la inyección del agente flogístico. La diferencia entre los volúmenes de la pata derecha y la izquierda se cuantificaron en (ml) y se tomaron como un índice de edema. Una hora antes de la prueba los animales de trataron sistémicamente (oralmente) con 50 mg/kg de alfa-humulina. La Gráfica 4 abajo compara la inhibición del volumen de la edema mediante administración de alfa-humulina. Los intervalos de tiempo de medición de volumen de edema fueron 10, 20, 30, 60 y 120 min. 24 h y 48 h. Cada punto representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación convencional promedio. 20 Gráfica 4 Tiempo después e Inyección (mío) La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, una cariofilina como alfa-humulina redujo significativamente la formación de edema inducida por histamina. También muestra indirectamente el efecto contra alergia.

EJEMPLO 5 EDEMA DE FACTOR DE AGREGACIÓN DE PLAQUETA (PAF) EN PATA DE RATÓN La prueba usada abajo se describe en Cunha y col., en la publicación Life Sci. 70:159-169, 2001. Ratones macho de 25 g - 35 g se sedaron ligeramente con éter y se inyectaron con 50 ul de salina que contiene factor de agregación de plaqueta (PAF, 2 nmol/pata), intraplantar, en la pata derecha. La pata izquierda recibió el mismo volumen de salina y se tomó como control. El hinchado se midió con un pletsimómetro (fabricante: Ugo Basile, Italia) a lo largo de varios intervalos de tiempo después de la inyección del agente flogístico. La diferencia entre los volúmenes de la pata derecha y la izquierda se cuantificaron (en ml) y se tomaron como un índice de edema. Una hora antes de la prueba, los animales se trataron sistémicamente (oralmente) con 50 mg/kg de alfa-humulina o trans-cariofilina. La Gráfica 5 abajo compara la inhibición del volumen del edema mediante administración de alfa-humulina (5A) y trans-cariofilina (5B) . Los intervalos de tiempo de medición de volumen de edema fueron 30, 45, 60 y 120 min.

Cada punto representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación convencional promedio Gráfica 5 Tiempo después de inyección (uiin) La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, una cariofilina como alfa-humulina o trans-cariofilina redujo marcadamente la formación de edema inducida por PAF. Como también se sabe que PAF está involucrado en procesos alérgicos, este dato refuerza adicionalmente el uso de cariofilinas en el manejo de estados alérgicos. EJEMPLO 6 EDEMA DE ÁCIDO ARAQUIDÓNICO EN OREJA DE RATÓN El edema de oreja en la prueba abajo se midió de conformidad con Calixto y col., en la publicación Prostaglandins, 5: 515 - 526, 1991, con modificaciones menores. Ratones macho de 25 g - 35 g, en un primer grupo, se aplicaron tópicamente, en la superficie interna de las orejas, un ungüento que comprende una escala de 0.025 a 0.2% de alfa-humulina o trans-cariofilina. En el grupo de control positivo, los animales se aplicaron tópicamente 0.05 mg de fenidona por oreja. Después de 60 minutos, los animales recibieron 20 ul de ácido araquidónico (2 mg/oreja) , disuelto en acetona, en la superficie interna de la oreja derecha. El edema se midió usando un micrómetro digital, y las respuestas se expresaron como um, la diferencia entre el espesor de oreja antes y después de la aplicación de ácido araquidónico. Las respuestas de los animales tratados con cariofilinas se compararon con aquellas observadas en los animales de grupo de control, tratados con ungüento de base. Las Gráficas 6A y 6B abajo comparan la inhibición del volumen del edema mediante administración tópica de alfa-humulina (6A) y trans-cariofilina (6B). La medición de volumen de edema se realizó después de aplicación de 0.025%, 0.05%, 0.1 y 0.2% de ungüento de contenido de cariofilina, comparada con el volumen de edema ocasionado por la aplicación de fenidona y ácido araquidónico (C) . Cada punto representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio .

Gráfica 6 ungüento de alfa-huniulipa (%) ungüento de trans-carrofllliKi (%) La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, la aplicación tópica de una cariofilina como alfa-humulina o trans-cariofilina redujo marcadamente la formación de edema, en una manera dependiente de dosis. EJEMPLO 7 NIVELES DE CITOCINA PRO-INFLAMATORIA IL-1B La prueba usada abajo se describe por Campos y col., en la publicación Br. J. Pharmacol. 135: 1107-1114, 2002, con modificaciones menores. Ratones macho de 160-180 g recibieron oralmente 50 mg/kg de alfa-humulina. Los animales tratados con 0.9% (0.1 ml/10 g) de salina se usaron como control. Otro grupo de animales se trató con 0.5 mg/kg de dexametasona, subcutáneamente, 4 horas antes de la prueba y se usó como control positivo. Después de 60 minutos, los animales recibieron inyecciones intraplantares de 100 ul de carragenina (300 ug/pata) y se sacrificaron después de 180 minutos. Los animales de control recibieron salina. El tejido subcutáneo de las patas inyectadas se removió y puso en un tampón de fosfato que contiene 0.5% de tween 20, 0.1 mM de cloruro de benzametonio, 10 M de EDTA, 2 ug/m de aprotinina, 0.1 mM de PMSF (fluoruro de fenilo metilo sulfonilo) y 0.5% de BSA (albúmina de suero bovino). Los tejidos se homogeneizaron y sometieron a centrifugación a 3000 g, durante 10 min, a -4°C. El sobrenadante se usó en la prueba. Los niveles de IL-lß se midieron con un equipo Elisa, de conformidad con las instrucciones del fabricante (R & D Systems(R' , EUA). Las pruebas se realizaron en duplicado, y se repitieron tres veces. Las contestaciones se expresan en pg/mg de tejido. La Gráfica 7 abajo (cada resultado representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio) compara la inhibición de producción de cítocina IL-1? inflamatoria inducida por carragenina en las patas de ratas.

Gráfica 7 hii iillita La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, la administración de una cariofilina, tal como alfa-humulina, inhibió marcadamente la producción de citocina pro-inflamatoria IL-1? inducida por carragenina en las patas de ratas. EJEMPLO 8 NIVELES DE CITOCINA PRO-INFLAMATORIA TNFa La prueba usada abajo se describe por Campos y col., en la publicación Br. J. Pharmacol. 135: 1107-1114, 2002, con modificaciones menores. Ratones macho 160-180 g recibieron oralmente 50 mg/kg de trans-cariofilina. Los animales tratados con 0.9% (0.1 ml/10 g) de salina se usaron como control.. Otro grupo de animales se trató con 0.5 mg/kg de dexametasona, subcutáneamente, 4 horas antes de la prueba y se usaron como control positivo. Después de 60 minutos, los animales recibieron inyecciones intraplantares de 100 ul de carragenina (300 ug/pata) y se sacrificaron después de 180 minutos. Los animales de control recibieron salina. El tejido subcutáneo de las patas inyectadas se removió y se puso en un tampón de fosfato que contiene 0.5% de tween 20, 0.1 mM de cloruro de benzametonio, 10 mM de EDTA, 2 ug/m de aprotinina, 0.1 mM de PMSF (fluoruro de fenilo metilo sulfonilo) y 0.5% de BSA (albúmina de suero bovino). Los tejidos se homogeneizaron y sometieron a centrifugación a 3000 g durante 10 min, a -41C. El sobrenadante se usó en la prueba. Los niveles de TNFa fueron medidos con un equipo Elisa, de conformidad con las instrucciones del fabricante (R & D Systems!R) EUA) . Las pruebas se realizaron en duplicado, y se repitieron tres veces. Las contestaciones se expresan en pg/mg de tejido. La Gráfica 8 abajo (cada resultado representa el promedio de 5 animales y, las barras verticales la desviación de error convencional promedio) compara la inhibición de producción de citocina TNFa inflamatoria inducida por carragenina en las patas de las ratas.

La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, la administración de una cariofilina, tal como trans-cariofilina, inhibió marcadamente la producción de citocina TNFa pro-inflamatoria inducida por carragenina en las patas de ratas. EJEMPLO 9 NIVELES DE PGE2 La prueba usada abajo se describe por Pinheiro y col., en la publicación Inflamm. Res. 51: 603-610, 2002, con modificaciones menores. Ratas macho de 160-180 g recibieron oralmente 50 mg/kg de trans-cariofilina. Los animales tratados con 0.9% (0.1 ml/10 g) de salida se usaron como control. Otro grupo de animales se trató con 0.5 mg/kg de dexametasona, subcutáneamente, 4 horas antes de la prueba y se usaron como control positivo. Después de 60 minutos, los animales recibieron inyecciones intraplantares de 100 ul de carragenina (300 ug/pata) y se sacrificaron después de 180 minutos. El exudado de las patas se recogió mediante diálisis con ayuda de dos cánulas de polietileno, y se utilizó para la cuantificación de PGE2, con un equipo Elisa, de conformidad con las instrucciones del fabricante (R & D Systems!R), EUA). Las pruebas se realizaron en duplicado, y se repitieron tres veces. Las contestaciones se expresan en pg/mg de tejido. La Gráfica 9 abajo (cada resultado representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio) compara la inhibición del crecimiento de nivel de PGE2 inducido por carragenina en las patas de las ratas, mediante administración de alfa-humulina y trans-cariofilina, comparada con el efecto obtenido por el tratamiento con dexametasona.

La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, la administración de una cariofilina, tal como alfa-humulina o trans-cariofilina, inhibió marcadamente el crecimiento de niveles de PGE2 inducidos por carragenina en las patas de ratas. EJEMPLO 10 INHIBICIÓN DE EXPRESIÓN DE ENZIMAS COX-2 E iNOS La expresión de enzimas COX-2 e iNOS se determinaron mediante mancha Western de conformidad con la metodología descrita por Medeiros y col., en la publicación Circ Res. 28: 1375-1382, 2004. Ratas macho de 160-180 g recibieron oralmente 50 mg/kg de trans-cariofilina. Los animales tratados con 0.9% (0.1 ml/10 g) de salina se usaron como control. Otro grupo de animales se trató con 0.5 mg/kg de dexametasona, subcutáneamente, 4 horas antes de la prueba, y se usó como control positivo. Después de 60 minutos, los animales recibieron inyecciones intraplantares de 100 ul de carragenina (300 ug/pata) y se sacrificaron después de 180 minutos, y el tejido de pata subcutáneo se removió 240 minutos después de la inyección de carragenina. El tejido recogido se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se re-suspendió en un tampón de lisis hipotónica (10 mM HEPES ácido N-2-hidroxietilpi?erazin-N'-2-etansulfónico, 1.5 M de MgC12, 10 mM de KCl, 0.5 mM de PMSF, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1.5 ug/ml de inhibidor de tripsina, 7 ug/ml de pepstatina A, 5 ug/ml de luepeptina, 0.1 mM de benzamidina, 0.1 mM y 0.5 mM de ditiotreitol) y se homogeneizó. Le homogenado se dividió en tres alícuotas de 2 ml, se enfrió en hielo durante 15 minutos, se agito vigorosamente y nuevamente se enfrió en hielo, en presencia de 20 ul de 10% de detergente no iónico Nonidet P-40 (Roche Diagnostics, EUA) . La fracción nuclear se precipitó mediante centrifugación (1,500 g, 5 minutos) y el sobrenadante que contiene el extracto citosólico se almacenó a -70°C para las pruebas de mancha Western. La concentración de proteína se determinó mediante el método Bradford (BioRad Laboratories Inc. Equipo, Milán, Italia) .

Los extractos se pusieron en ebullición con cantidades equivalentes en v/v de tampón Laemmly (125 mM de Tris-HCl, 2 mM de EDTA, 4% de sulfato de dodecilsodio, 20% de glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol y 0.1% de azul brillante Comassie, pH 6.8). Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (100 ug/pozo) y se separaron mediante electroforesis. Las membranas posteriormente se bloquearon mediante incubación durante la noche (4°C) con leche en polvo descremada (10% de PBS), y luego se incubaron con los anticuerpos anti-iNOS o anti-COX-2 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces con 10% de Triton-X en PBS y la peroxidasa de anticuerpo conjugada (contra-conejo) . Las bandas obtenidas de esta manera se cuantificaron usando un equipo de quimioluminiscencia y análisis de densitometría (unidades relativas) en películas radiográficas. La Gráfica 10 abajo (cada resultado representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio) compara la inhibición de expresión de las enzimas COX2, obtenidos por la administración de alfa-humulina y trans-cariofilina, cuando se evaluaron en el tejido subcutánea o la pata inyectada con carragenina, comparada con la expresión de COX2 inducida por carragenina obtenida mediante tratamiento con dexometasona.

Gráfica 10 La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, la administración de una cariofilina, tal como alfa-humulina o trans-cariofilina, inhibió marcadamente la expresión de enzimas COX2 inducida por carragenina en las patas de ratas. La Gráfica 11 abajo (cada resultado representa el promedio de 5 animales, y las barras verticales la desviación de error convencional promedio) compara la inhibición de expresión de las enzimas iNOS, obtenida por la administración de alfa-humulina, cuando se evalúa en el tejido subcutáneo o la pata inyectada con carragenina, comparada con la expresión de iNOS inducida por carragenina obtenida mediante el tratamiento con dexometasona.

Gráfica 11 La gráfica muestra claramente que, de conformidad con la invención, la administración de una cariofilina, tal como alfa-humulina, inhibió marcadamente la expresión de enzimas iNOS inducida por carragenina en las patas de ratas. Los ejemplos y la información proporcionada en la presente se relacionan con modalidades particulares de la presente invención, que está solamente limitada por la anchura de las reivindicaciones anexas a la presente.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1.- El uso de cariofilinas o de composiciones que comprenden cariofilinas en la fabricación de un medicamento para la profilaxis y tratamiento de condiciones inflamatorias del cuerpo animal, particularmente el cuerpo humano. 2.- El uso de cariofilinas, o de composiciones que comprenden cariofilinas, en la fabricación de un medicamento para la disminución en la producción corporal de citocina IL-l?, citocina TNFa, prostaglandina PGE2, y en la expresión de enzimas COX-2 e iNOS asociados con la profilaxis y tratamiento de condiciones inflamatorias. 3.- El uso de cariofilinas de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 2, en la fabricación de un medicamento para la profilaxis y tratamiento de cuando menos una enfermedad crónica-degenerativa comprometida en el grupo de artritis reumatoide, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico, colitis ulcerante, psoriasis, eczema atópica, arterioesclerosis, o en el tratamiento de cuando menos una enfermedad no degenerativa comprendida en el grupo de depresión, y celulitis, o alergias. 4.- El uso de cariofilinas, o composiciones que comprenden cariofilinas, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, administrados vía enteral o parenteral, incluyendo oral, tópica, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, mediante infiltración, mediante inhalación, transdérmica, transmucosal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocular y sublingual. 5.- El uso de conformidad con la reivindicación 4, la administración siendo tópica o sistémica, particularmente seleccionada entre infiltración, oral, inhalación o transdérmica. 6.- El uso de cariofilinas, o composiciones que comprenden cariofilinas, de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, las cariofilinas siendo una o más de alfa-humulina y trans-cariofilina. 1 . - Un método de tratamiento de condiciones inflamatorias y dolor inflamatorio del cuerpo animal, particularmente el cuerpo humano, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de cariofilinas, a un paciente. 8. - Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que las condiciones inflamatorias y dolor inflamatorio están presentes en cuando menos una de enfermedades crónicas-degenerativas comprendidas en el grupo de artritis reumatoide, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico, colitis ulcerante, psoriasis, eczema atópica, arterioesclerosis, o en cuando menos una de enfermedades no degenerativas comprendidas en el grupo de depresión y celulitis, o en alergias. 9.- Un método para disminuir la producción corporal de citocina IL-l/?, citocina TNFa, prostaglandina PGE2, y la expresión de enzimas COX-2 e iNOS asociados con condiciones inflamatorios y dolor inflamatorio que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más cariofilinas, a un paciente. 10.- Un método de conformidad con una de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la cariofilina es una o más de alfa-humulina y trans-cariofilina. 11.- Una composición antiinflamatoria que comprende una o más cariofilinas, la cantidad de las cuales siendo de 1 a 1000 mg por unidad de forma de dosificación. 12.- Una composición antiinflamatoria de conformidad con la reivindicación 11, la cantidad de cariofilina siendo de 10 a 200 g por unidad de forma de dosificación. 13.- Una composición antiinflamatoria de conformidad con la reivindicación 11, la cantidad de cariofilinas siendo de 30 a 100 mg por unidad de forma de dosificación. 14.- Una composición antiinflamatoria de conformidad con la reivindicación 11, la cariofilina comprendiendo de 0.1 a 99% en peso de la composición. 15.- Una composición antiinflamatoria de conformidad con la reivindicación 11, la cariofilina comprendiendo de 1 a 70% en peso de la composición. 16.- Una composición antiinflamatoria de conformidad con la reivindicación 11, la cariofilina comprendiendo de 10 a 40% en peso de la composición. 17.- Una composición antiinflamatoria de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 16, la cariofilina siendo una o más de alfa-humulina y trans-cariofilina.