KR102043893B1

KR102043893B1 - 알파-휴물렌(alpha-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102043893B1
Application number: KR1020180001577A
Authority: KR
Inventors: 이효종; 황수정; 여다희
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2019-11-12
Also published as: WO2019135569A1; KR20190083760A

Abstract

본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 뮤신의 분비를 증가시키는 시약 조성물 및 방법에 관한 것으로, 상기 α-휴물렌은 항히스타민 활성, 항산화 활성, 항염증 활성, 뮤신의 분비를 향상시키는 활성을 나타내어, 우수한 소화기계 점막을 보호하는 효과를 나타낼 수 있는 바, 상기 α-휴물렌을 유효성분으로 포함하는 조성물은 소화기계 점막 관련 질환을 보다 효과적으로 예방, 개선 내지 치료하는 데에 활용될 수 있다.

Description

알파-휴물렌(alpha-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition Comprising alpha-Humulene for Preventing or Treating Diseases Associated with Mucous Membrane of Digestive System}

본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방, 개선, 치료용 조성물, 뮤신의 양을 증가시키는 시약 조성물 및 뮤신 분비를 향상시키는 방법에 관한 것이다.

에탄올의 독성에 대해서는 이미 널리 알려져 있음에도 불구하고 현대생활에 있어서 음주의 불가피한 역할은 부인할 수 없다. 일찍이 19세기 초에 뷰몽(Beaumont)이 에탄올이 인체의 위 점막에 발적을 동반한 병리학적 변화를 일으킨다고 보고한 이래 이에 대하여 많은 연구가 이루어져 왔다. 과도한 음주는 인체의 여러 장기에 손상을 초래할 수 있으나 위, 간 및 췌장 등의 소화기관에 손상을 주는 경우가 많고 특히 위 점막 손상에 의한 증상을 호소하는 경우를 임상적으로 가장 흔히 경험할 수 있다.

일반적으로 인체에서는 35% 이상의 에탄올 농도에서 현저한 점막 및 점막 하 출혈, 괴사, 부종 등이 유발되는 것으로 알려져 있다. 에탄올에 의한 위 점막손상 기전은 아직 확실하지 않으나 수소이온에 대한 위 점막 방어기전의 손상, 염증, 가스트린 분비의 촉진, 위 점막 혈류 장애, 모세혈관의 투과성 변화, 세포보호 기전의 필수적인 요인인 산소유리기 제거 기전의 저해 등 다양한 병인들이 제시되고 있으며, 특히 최근에는 산소유리기 제거 기전에 많은 관심이 기울여지고 있다.

그러나 이와 같이 알코올이 위 점막 손상 작용 및 더 나아가서는 위출혈을 야기하는 작용이 있는 것으로 알려져 있음에도 불구하고, 지금까지 알려진 대부분의 약제들은 단순한 소화제이거나 알코올을 분해시켜 제거함으로써 알코올의 혈중 농도를 저하시키는 약제, 비타민제, 또는 알코올취를 제거하는 약제 등이 대부분이고, 아직까지 급성적인 위 점막 손상을 억제하는 효과적인 약제는 개발되지 않았다.

더욱이, 위의 점막을 보호하는 주요한 요소는 뮤신(MUC5AC, MUC6)과 트레포일 인자 패밀리(trefoil factor family; TFF1, TFF2) 펩타이드이다. 위는 2중층의 점막층과 단일층의 상피층으로 구성되어 있는데, 분비성의 겔-형성 뮤신인 MUC5A는 점막의 표면과 피트 세포(pit cell)에서 분비될 뿐만 아니라 내부 점액 장벽 주위를 만들기도 한다. 분비성의 겔-형성 뮤신의 다른 종류인 MUC6은 위샘과 피트 세포에서 분비되며, 흥미롭게도, TFF2는 MUC6과 함께 분비된다. 이들은 모두 알코올과 헬리코박터 파일로리(H. pylori)와 같은 외부 공격 요소들에서 위를 방어하는 중요한 요소들이다.

한편, α-카리오필렌(caryophyllene)으로도 알려진 α-휴물렌은 생물 기원의 휘발성 유기 화합물로, 많은 방향성 식물에서 아이소머 형태인 β-카리오필렌과 함께 종종 발견된다. β-카리오필렌은 항암 활성과 항염증 활성을 가진다고 알려져 있다. 또한 지난 연구에 따르면 α-카리오필렌(caryophyllene)을 포함하는 정유 성분이 TNF-α의 양을 감소시킴으로써 마우스의 카라기난-유도 앞다리-부종에 항-알러지 활성을 나타내었음이 보고되었다. 그러나 아직까지 α-휴물렌의 소화기계 점막 보호 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.

한국등록특허 제10-1782848호(2017.09.22 등록).

본 발명의 목적은 보다 우수한 소화기계 점막 보호 효과를 나타냄으로써 소화기계 점막 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 보다 우수한 소화기계 점막 보호 효과를 나타냄으로써 소화기계 점막 관련 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적으로 뮤신의 양을 증가시킬 수 있는 시약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적으로 뮤신 분비를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 뮤신의 양을 증가시키는 시약 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람을 제외한 동물에 α-휴물렌(α-Humulene)을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뮤신 분비를 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 α-휴물렌을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 뮤신의 양을 증가시키는 시약 조성물 및 뮤신 분비를 향상시키는 방법에 관한 것으로, 상기 α-휴물렌이 알코올성 점막 손상을 유도한 랫트에서 항히스타민, 항산화, 항염증 활성 및 점막 보호 효과를 나타낸 바, 소화기계 점막과 관련된 질환들을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 랫트에서 α-휴물렌의 에탄올-유도 위 점막 손상에 대한 효과를 확인한 결과이다(A: 위 내부의 위 점막 손상, B: H&E 염색을 통한 조직학적 관찰, C: 도 1A의 결과를 기반으로 한 출혈성 스케일의 그래프. *P<0.05, 0.01<**P<0.05, ***P<0.01(HCl/EtOH 처리군과 비교 시)).
도 2는 α-휴물렌의 산-중화 활성을 확인한 결과이다(*P<0.05, **P<0.01(대조군과 비교 시).
도 3은 화합물 48/80으로 자극된 HMC-1 세포에서 α-휴물렌의 히스타민 분비에 대한 효과를 확인한 결과이다(A: MTS 어세이를 통한 α-휴물렌의 세포 생존율 확인 결과, B: α-휴물렌의 항-히스타민 효과, **P<0.01(대조군과 비교 시), +P<0.05 및 ++P<0.01(화합물 48/80 처리군을 대조군과 비교 시)).
도 4는 HMC-1 세포에서 α-휴물렌의 세포내 칼슘 유입에 미치는 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 α-휴물렌의 효소 활성을 확인한 결과이다(A: ROS에 대한 α-휴물렌의 효과로, CellROX(초록색)의 강도가 ROS 양을 나타내고, 대조군과 비교함, B: α-휴물렌이 경구 투여된 조직에서 PGE2 레벨의 회복, 오차값은 각 그룹 별(n=3) 평균±표준편차임. **P<0.01(대조군과 비교 시), ++P<0.01 (HCl/EtOH 처리군과 비교 시), C: α-휴물렌이 경구 투여된 위에서 MDA 레벨의 감소, 오차값은 각 그룹 별(n=3) 평균±표준편차에서 얻음, **P<0.01 (정상 조직과 비교 시), +P<0.05 및 ++P<0.01(HCl/EtOH 처리 조직과 비교 시). D: α-휴물렌 경구 투여 시 SOD 활성 퍼센테이지, 오차값은 각 그룹의 위 조직 별(n=3) 평균±표준편차임, **P<0.01(대조군과 비교 시), ++P<0.01(HCl/EtOH-유도 위 점막 손상군과 비교 시).
도 6은 HMC-1 세포에서 α-휴물렌의 항-염증 활성을 나타낸 것이다(A: IL-6, IL-1β, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인과 관련된 RNA 발현 레벨, B: NF-κB 리포터 활성의 레벨 확인 결과, 모든 오차값은 각 독립 실험건에 대함 평균±표준편차임. *P<0.05(대조군과 비교 시), ++P<0.01(PMA 처리군과 비교 시)).
도 7은 에탄올-유도 위 점막 손상 모델에서 α-휴물렌의 점액 상향 조절 효과를 확인한 결과이다(A: 랫트 위 점막 손상 모델에서 위 구획에서의 점액에 알시안 블루 염색약이 결합된 결과, 도면의 윗줄은 5X 배율, 아랫줄은 10X 배율로 확대한 것으로, 점액은 밝은 파란색으로 염색됨. B: 조직에 결합된 알시안 블루의 분리량을 확인한 결과, 모든 값은 각 그룹별(n=3) 평균±표준편차로 나타낸 것임, P<0.01(HCl/EtOH-유도군과 비교 시).
도 8은 에탄올-유도 위 조직 파쇄액에서 α-휴물렌의 점막 보호 효과를 확인한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 α-휴물렌이 알코올로 유도한 위 점막 손상동물 모델에서 뮤신과 같은 점막 보호 인자의 발현량을 증가시켜 위 점막 보호 효과를 나타내었다.

즉, 상기 α-휴물렌은 보다 효과적으로 소화기계 점막을 보호할 수 있으므로, 상기 α-휴물렌을 포함하는 약학 조성물은 소화기계 점막 관련 질환을 효과적으로 예방 내지 치료할 수 있다.

상기 α-휴물렌은 항히스타민 활성을 나타냄으로써 소화기계 점막을 보호할 수 있고, 또는, 항산화 활성을 나타냄으로써 소화기계 점막을 보호할 수 있으며, 또는, 항염증 활성을 나타냄으로써 소화기계 점막을 보호할 수 있고, 또는, 뮤신의 분비를 향상시킴으로써 소화기계 점막을 보호할 수 있다.

이때, 상기 α-휴물렌은 MUC5AC, MUC6, TFF1, TFF2 및 pIgR로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증가시킴으로써 뮤신의 분비를 향상시킬 수 있다.

상기 소화기계 점막 관련 질환은 급성 점막 손상, 속 쓰림, 알코올성 또는 비알코올성 위염, 위용종, 위궤양, 위출혈, 점막염, 십이지장염, 염증성 장질환, 과민성 장 증후군일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

한편, 상기 α-휴물렌은 전체 약학 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 포함될 수 있는 바, 이러한 수치 범위 내에서 α-휴물렌의 소화기계 점막 보호 효과가 가장 효과적으로 발현되므로 바람직하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 α-휴물렌 외에 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 점안제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제, 액제 및 주사제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

더불어, 본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는 소화기계 점막 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 α-휴물렌이 알코올로 유도한 위 점막 손상동물 모델에서 뮤신과 같은 점막 보호 인자의 발현량을 증가시켜 위 점막 보호 효과를 나타낸 바, 즉, 상기 α-휴물렌은 보다 효과적으로 소화기계 점막을 보호할 수 있다.

상기 소화기계 점막 관련 질환은 급성 점막 손상, 속쓰림, 알코올성 또는 비알코올성 위염, 위용종, 위궤양, 위 출혈, 점막염, 십이지장염, 염증성 장질환, 과민성 장 증후군일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 α-휴물렌은 건강기능식품 조성물의 100 중량부에 대하여 0.1 내지 90 중량부로 포함될 수 있는 바, 이와 같은 수치 범위에서 α-휴물렌의 소화기계 점막 보호 효과가 가장 우수하게 나타날 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

더불어, 본 발명은 α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 뮤신의 양을 증가시키는 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 사람을 제외한 동물에 α-휴물렌(α-Humulene)을 처리하는 단계를 포함하는, 뮤신 분비를 향상시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<준비예 1> 실험 재료

1. 시약 및 세포 배양

인간 비만 세포주(Human leukemic mast cell)인 HMC-1은 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank; KCLB)에서 얻었고, 10% 소 태아 혈청(FBS: Gibco BRL), 페니실린(100 U/ml)/스트렙토마이신(100 μg/ml)을 포함하는 IMDM(Iscoves Modified Dulbeccos Medium; Gibco BRL)배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 실험에 사용될 PMA, 히스타민, 화합물 48/80 및 o-프탈알데하이드(OPA)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

2. 동물실험

6주령의 SPF 수컷 Sprague-Dawley 랫트는 효창 과학(Hyochang-Science; Daegu, Korea)에서 얻었고, 적어도 1주 간 표준 실험실 조건(온도: 25℃, 습도 범위: 40-70%, 빛: 7:00 내지 18:00)에 적응시켰다. 그리고 모든 랫트들은 규칙적인 펠렛과 UV-살균 수돗물을 임의로 제공받았다. 적응 기간 1주 후, 200-250 g의 체중을 갖는 7주령 랫트를 실험에 사용하였다.

<실시예 1> α-휴물렌의 알코올로 유도된 점막 손상으로부터의 보호 효과 및 그 기작의 확인

1. 실험 방법

1) 알코올-유도 위 점막 손상 평가

α-휴물렌의 점막 보호 효과는 150 nM HCl/60% EtOH 유도 위 점막 손상 모델에서 확인되었다. 먼저, 랫트들은 무작위로 6개의 그룹으로 나뉘었고, 실험에 앞서 24시간 동안 고정되었다. 다만 실험 전 4시간까지는 물을 마시는 것은 허용하였다. 각 그룹별로, 대조군에는 비이클(1.5 ml/200 g 체중)을, 양성 대조군에는 라니티딘(10 mg/kg)을, 실험군에는 α-휴물렌(20, 50, 100 mg/kg, i.p.)을 처리하였다. 30분 후에, 위 점막의 손상을 일으키기 위해 모든 군에 1.5 ml의 150 nM ECl/EtOH 용액을 경구 투여하였다.

경구 투여 1시간 후, 동물들을 희생시키고 그들의 위를 잘라내어 10% 포르말린으로 고정시켰다. 이후 이것들을 긴 면(great curvature)을 따라 오픈하고 세척하였다. 위의 안쪽을 대상으로 병변의 존재를 분석하였고 병변의 스케일을 측정하였다. 위를 따라 발생한 손상의 부가적인 측정은 ImageJ를 사용하여 병변의 인덱스로서 관찰되었다(mm).

2) 위의 조직학적 평가

HCl/EtOH-유도 위 점막 손상 모델에서 α-휴물렌에 의해 야기된 병리학적 조직 병변을 확인하기 위해, 위를 10% 포르말린 용액으로 고정하고 관찰하였다. 시각화 테스트 이후, 일반적인 실험 방법을 통해 조직학적 측정을 수행하였는데, 이때, 각 위의 몸체 부분을 5 mm 넓이로 자르고 OCT 블록으로 제조하였다. 이 샘플들을 4 μm 두께로 섹션화한 뒤, H&E 염색을 수행하였다.

3) 위 벽 점액의 확인

점액량(mucus contents)을 측정하기 위해서, 위 조직에 붙어 있는 알시안 블루(Alcian blue)의 양을 측정하였다. 간단하게, 고정된 조직을 칭량하고 10분 간 3% 아세트산에서 인큐베이션시켰다. 이후, 이 조직들을 10분 동안 1%의 알시안 블루 8GX(pH 2.5, Santa Cruz Biotechnology)로 염색시키고, 흐르는 수돗물에서 15분 간 씻어냈다. 조직을 10분 간 초음파 처리하는 동안, 염색 시료를 디메틸 설폭시드(DMSO, Sigma-Aldrich)로 희석하였고, 각 상층액의 50 μl를 96-웰 플레이트에 넣고 605 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4) α-휴물렌의 항-중화 활성의 확인

1 mg의 라니티딘과 α-휴물렌을 인공 위산으로 간주될 수 있는 0.1 N HCl 100 ml에 넣고 37℃에서 1시간 동안 흔들어주며 인큐베이션하였다. 산-중화 활성을 확인하기 위하여, 샘플들을 인공 위액에 넣고 pH 지시약으로서 페놀을 포함하는 0.1 N NaOH를 사용하여 적정하였다. 위 제산제의 구성성분으로 주로 사용되는 칼슘 카보네이트가 양성 대조군으로 사용되었다.

5) MTS 어세이

HMC-1 세포들을 다양한 농도의 α-휴물렌(62.5 ~ 1000 μM)과 함께 E-튜브에 넣어 현탁시킨 후 이 세포들을 96 웰 플레이트에 분주하였고, 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 20 μl의 MTS 시약(Promega, Madison, WI, USA)를 각 웰에 처리하고, 490 nm에서의 흡광도가 관찰될 때까지 4시간 동안 37℃에서 배양하였다.

6) 히스타민 어세이

HMC-1의 탈과립 상에서 α-휴물렌의 항-히스타민 효과를 확인하기 위하여, 각 세포들의 상층액 내의 히스타민 레벨을 측정하였다. 즉, 500 μl의 PBS 내 HMC-1 현탁액을 양성 대조군으로서 커큐민(50μl/ml) 또는 α-휴물렌(250, 500, 1000 μM)과 함께 1시간 동안 전-인큐베이션시켰다. 이후, 10분 간 1200 rpm에서의 원심분리를 수행하기에 앞서, 모든 군들을 화합물 48/80(200 μg)과 함께 3시간 동안 배양하였다. 표준 곡선을 그리기 위한 0.1 N HCl에 녹은 히스타민 스톡 용액 100 μg/ml을 준비하고, 워킹 용액(working solution) 8 μg/ml 내지 0.06258 μg/ml를 곧바로 희석하였다. 120 μl의 상층액과 각 농도별 표준 곡선을 검은색의 96 웰 마이크로플레이트에 분주하였다. 24 μl의 1N NaOH와 6 μl의 o-프탈알데하이드(OPA, Sigma)를 각 웰에 넣은 후, 플레이트를 4분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 3N HCl 12 μl를 4분 후 첨가하여 반응을 멈추고, 형광 강도를 360 nm 야기 필터 및 460 nm 방출 필터를 이용하여 측정하였다.

7) 세포 내 칼슘 농도 측정

HMC-1 세포 내의 세포 내 칼슘 농도를 α-휴물렌의 히스타민 방출 억제의 분자적 기작을 확인하기 위하여 측정하였다. 먼저, 세포 내 칼슘 농도를 측정하기 위하여, Fura-2am을 HMC-1 세포에 1시간 동안 로딩시켰고, 이후 남아 있는 염료를 제거하기 위해 버퍼로 표면을 두 번 세척하였다. 약물-처리 시간 의존적인 조건에서 칼슘 변화량을 멀티-모드 마이크로프레이트 리더기(FLUOstar Omega)를 이용하여 확인하였다.

8) 세포 내 ROS 측정

6-웰 플레이트에 분주된 HMC-1 세포에 α-휴물렌(1000 μM)를 1시간 동안 전처리하였고, PMA(20 ng/ml)와 함께 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포들은 PBS로 두 번 세척하였고, CellROX(5μM)로 37℃에서 30분동안 염색하였다. 이어서 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 세포를 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시켰다. 이후 핵을 식별하기 위하여 세포들을 Hoechst(Life technologies)과 함께 15분간 인큐베이팅하였다. 세포의 이미지는 Axiovert M200 현미경(Zeiss)을 사용하여 얻었다.

9) α-휴물렌의 항산화 활성

9.1) 프로스타글란딘 E ₂ (PGE ₂ )의 측정

PGE₂의 레벨을 측정하기 위해, 위 조직을 칭량한 후, 균질화 버퍼(homogenization buffer; 0.1 M 포스페이트(pH 7.4) 및 1 mM EDTA 함유)를 이용하여 균질화하였고, 4℃, 13,000 rpm에서 10분 간 원심분리한 뒤, 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담았다. 샘플들은 적어도 두 번 희석시켰고 PGE₂의 양을 PGE₂ELISA 키트(cayman, USA)를 이용하여 측정하였다.

9.2) 말론디알데하이드(MDA)의 측정

말론디알데하이드(MDA)를 결정하기 위하여 HCl/EtOH-처리군의 위 조직의 지질 과산화율을 티오바비투르산 반응 물질(Thiobarbituric acid reactive substances; TBARs) 테스트를 이용하여 측정하였다. 정리하면, 조직들을 프로테아제 저해제 칵테일 2 μl/ml가 첨가된 RIPA 버퍼로 균질화하였고, 얻어진 균질액을 4℃, 3,500 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 10% 트리클로로아세트산(TCA) 500 μl를 상층액 500 μl에 넣고 잘 혼합하였다. 이후, 상온, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 뒤, 500 μl의 상층액을 500 μl의 0.67% 티오바비투르산 반응 물질과 혼합하였고, 100℃에서 15분동안 인큐베이션시켰다. 샘플들이 식은 다음, 상층액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였다.

9.3) 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(Superoxide Dismutase; SOD) 활성 측정

SDO 활성을 측정하기 위하여, SOD 어세이 키트-WST((Dojindo, Japan)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 실험을 수행하였다. 즉, 위 조직을 수크로오즈 버퍼(0.25 M 수크로오즈, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 7.4)로 균질화하고 균질액을 4℃, 12,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하였다. 효소 활성 어세이 실험을 할 때까지 용해액을 -70℃에서 보관하였다. 이후 실험에서 샘플은 SOD 활성을 측정하게 전에 희석 버퍼로 희석시켰고, 20 μl의 희석된 버퍼 및 표준액을 96 웰 플레이트에 각 웰 별로 분주하였다. 200 μl의 WST 워킹 용액과 20 μl의 효소 워킹 용액을 각각의 샘플에 추가하고 완전히 섞어주었다. 플레이트를 20분간 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

10) 역전사-폴리머라아제 체인 반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)

HMC-1 세포를 α-휴물렌(250, 500, 1000 μM)으로 1시간 동안 전처리 하고, 6-웰 플레이트에서 4시간 동안 각 샘플 단독으로 또는 PMA(20 ng/ml)와 함께 배양하였다. in vivo 샘플로서는 칭량된 위 조직을 사용하였다. 제조자의 매뉴얼에 따라 총 세포 RNA를 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 분리하였고, M-MLV 역전사효소(Promega)의 존재하에서, 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 이때 사용된 PCR 프라이머는 Bioneer에서 구입하였으며, 하기 <표 1>에 나타난 바와 같았다.

유전자 이름	종류	서열
Human IL-1β	정방향	5’-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3’
Human IL-1β	역방향	5’-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3’
Human IL-6	정방향	5’-ATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3’
Human IL-6	역방향	5’-GTTTTCTGCCAGTGCCTCTTTG-3’
Human TNF-α	정방향	5’-GGCAGTCAGATCATCTTCTCGAAc-3’
Human TNF-α	역방향	5’-GAAGGCCTAAGGTCCACTTGTGT-3’
Rat MUC5AC	정방향	5’-GGCCAATGCGGCACTTGTACCAAT-3’
Rat MUC5AC	역방향	5’-GTCATCTGGACAGAAGCAGCCCTC-3’
Rat MUC6	정방향	5’-TCCTACTTGCCAGGTCTTCCAAC-3’
Rat MUC6	역방향	5’-TTGTGGGTGTTGACTTCGGTATAG-3’
Rat TFF1	정방향	5’-CCATGGAGCACAAGGTGACCTGTG-3’
Rat TFF1	역방향	5’-GGGAAGCCACAATTTATTCTCTCC-3’
Rat TFF2	정방향	5’-CCCACTTCCAAACCAAGCGTCG-3’
Rat TFF2	역방향	5’-CAGCAGTGCCCTTCAGTAGTGA-3'
Rat TFF3	정방향	5’-TGCCATGGAGACCAGAGCCTTCTG-3’
Rat TFF3	역방향	5’-TAGAACAGCCTTGTGCTGACTGTA-3’
Rat pIgR	정방향	5’-AAGAGACACCACCTCGTCCCAGAT-3’
Rat pIgR	역방향	5’-TGGTGCCCTTATGGCTTGGGTATG-3’
GAPDH	정방향	5’-GAGCTGAACGGGAAGCTCACTGG-3’
GAPDH	역방향	5’-CCACCTTCTTGATGTCATCAT-3’

PCR 생성물은 1.7% 아가로오스 겔에서 분석되었으며, UV-조사를 이용한 RedSafe 핵산 염색(Intron, Korea)을 통해 시각화하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다.

11) 루시퍼라아제 어세이

α-휴물렌의 NF-κB에 대한 효과를 확인하기 위해, HMC-1 세포를 10 ng의 NF-κB을 증진시키는 루시퍼라아제 리포터 유전자 플라스미드 pNF-κB-Luc(Promega, Madison, WI, USA)가 있거나 없는 조건에서 FuGENE 6 트랜스펙션 시약(Roche, Indianapolis, IN, USA)을 사용하여 4 ng의 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 pRL-TK(stratagene, La Jolla, CA, USA)로 트랜스펙션시켜 내재적 기준으로 나타내었다. 24시간 동안 트랜스펙션 시킨 후 세포들은 α-휴물렌이 있거나 없는 조건에서 4시간 동안 전처리되었고, PMA(20 ng/ml)로 1시간 동안 인큐베이션되었다. 시간 포인트는 세포 용해물에서 듀얼-루시퍼라아제 리포터 어세이 키트(Promega)를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 결정하기 위해 선택되었다. 레닐라 루시퍼라아제 발현 벡터는 루시퍼라아제 활성 레벨과 비교되었고, 트랜스펙션 효율을 해석하였다.

12) 데이터 분석 및 통계

모든 값은 평균±표준편차 오류로 나타내었고 상대적인 퍼센테이지로 환산하였다. 서로 다른 실험군들의 통계적 비교는 스튜던트의 t-테스트를 이용해 평가하였고, P value < 0.05일 경우 통계학적으로 유의미하다고 판단하였다.

2. 실험결과

1) α-휴물렌 전처리 시 위 점막 손상 보호 효과

SD-랫트에 150 mM HCl/60% EtOH로 위 점막 손상을 유도하였고, 이때 위 손상을 유도하기 전 α-휴물렌(20, 50, 100 mg/kg) 및 양성 대조군인 라니티딘(10 mg/kg)을 투여하였다. 그 결과, 도 1A 및 도 1C에 나타난 바와 같이, 정상군에 비해 손톱으로 긁힌 것처럼 보이는 위 점막 손상 병변이 HCl/EtOH 투여군에서 관찰되었다. 라니티딘 처리 군에 HCl/EtOH를 처리하는 동안에는 위 출혈성 병변이 감소하였고, 다양한 용량의 α-휴물렌을 처리한 군에서의 부상은 용량 의존적 조건으로 감소되었다. 특별히, 100 mg/kg의 α-휴물렌이 처리된 군에서는 라니티딘만큼의 위 점막 손상 보호 효과가 나타났다. 이러한 결과들은 도 1B에 나타난 바와 같이, H&E 염색 시에도 동일한 경향을 나타내었다.

2) α-휴물렌의 산-중화 활성

외부 자극 인자로 유도된 산의 불균형적인 분비는 위의 손상에 영향을 미친다. 제산제는 산에 대한 중화 효과를 가지고 있고 위염 및 위궤양의 치료에서 통증을 완화하는 데에 효과적이다. 이에, α-휴물렌이 0.1 N HCl을 사용하여 생성된 인공 위산에서 중화 활성을 가지는지 여부를 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 인공 위액에서 산을 제거하기 위하여 첨가된 0.1 N NaOH는 50.67±0.94 μl였고, 양성 대조군인 CaCO₃는 14.33±2.62 μl로, CaCO₃의 중화 활성을 71%라고 측정하였다. 라니티딘의 경우, 60.00±1.63 μl의 0.1 N NaOH가 소모되었다. 반면에, α-휴물렌은 45.00 ± 0.82 μl 만큼 사용되었고 11%의 활성을 나타내었지만, CaCO₃의 활성보다 낮은 활성을 보였다. 그러므로 α-휴물렌의 위 점막 손상 보호 효과는 산-중화 활성 때문이 아닌 것을 확인할 수 있었다.

3) 화합물 47/80으로 자극된 HMC-1 세포에서 α-휴물렌의 세포 독성 없는 히스타민 활성 억제 효과

위 점막으로의 히스타민 분비량 증가는 위의 히스타민 수용체의 과잉 자극과 위산의 과잉 분비를 야기한다. 세포 실험에 앞서, MTS 어세이를 통해 HMC-1 세포에 대한 α-휴물렌의 세포 독성을 평가하였고, 그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, HMC-1 세포에 대해 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 이후, 히스타민 어세이를 수행한 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, HMC-1 세포가 화합물 48/80으로 자극받았을 때, HMC-1는 히스타민을 방출하는데 이 방출된 히스타민을 형광 ELISA로 측정하였다. 정상 대조군과 비교했을 때, 화합물 48/80 처리는 히스타민 농도를 증가시켰다. 반면에, 양성 대조군으로 사용된 커큐민 처리 군에서는 히스타민의 농도가 감소하였다. 게다가, α-휴물렌의 용량에 의존적인 조건으로 히스타민의 농도가 감소하였다. 그러므로, α-휴물렌의 위 점막 보호 메커니즘은 히스타민 분비를 억제하는 것임을 알 수 있었다.

4) 화합물 48/80으로 자극된 HMC-1 세포에서 α-휴물렌의 세포내 칼슘 농도 감소 효과

HMC-1 세포에서 화합물 48/80과 같은 자극원에 의해 탈과립이 유도될 때, 세포내 칼슘의 농도에 중요한 영향을 미친다. Fura-2am이 로딩된 세포를 사용하여 칼슘 농도를 측정하였다. 이때, α-휴물렌을 10분간 전 처리 하고 화합물 48/80을 첨가한 직후부터 시간에 따른 형광량을 측정하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 비이클 대조군에서는 형광 강도가 큰 변화 없이 매우 낮게 유지되었지만, 반면에, 화합물 48/80 처리군의 경우 10초부터 형광 강도가 급격하게 증가하였다. 양성 대조군인 커큐민 처리 군에서의 형광강도 및 α-휴물렌 처리군에서의 형광강도는 화합물 48/80 처리군에서보다 낮았다. 이러한 결과를 토대로 보면, α-휴물렌의 항-히스타민 활성은 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 분자적 기작에 의해 영향을 받음을 알 수 있다.

5) α-휴물렌의 항산화 활성

자유 라디칼은 위 점막층을 손상시키는 전형적인 공격 인자이다. 이에, α-휴물렌의, 산화적 스트레스로 만들어지는 자유 라디칼 포착(scavenging) 활성 및 지질 과산화 저하 활성을 확인한 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, PMC로 활성화된 HMC-1 세포에서 정상 대조군에 비해 ROS가 증가하였다. 반면에, α-휴물렌을 처리한 군에서는 ROS에서의 레벨이 감소하였다.

또한, HCl/EtOH를 SD-랫트에 처리한 뒤 위 조직을 효소 실험에 사용한 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, PGE₂의 레벨이 정상 대조군에 비해 HCl/EtOH를 처리한 군에서 더 낮게 나타났고, 반면에 라니티딘은 양성 대조군에 비해서 증가하였으며 정상대조군에 비해서는 낮게 나타났다. 한편, α-휴물렌 처리군에서 α-휴물렌의 용량 의존적으로 PGE₂의 레벨이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

MDA는 지질 과산화의 결과로서 생성되며, 살아있는 세포의 산화적 손상을 측정하는 지표로 나타나기도 한다. 도 5C에 따르면, 정상군에서의 NDA 농도는 약 6 nM였고, HCl/EtOH 처리군에서의 MDA 농도는 급격히 증가하였다. 양성 대조군 그룹인 라니티딘 처리군에서는 HCl/EtOH를 투여한 그룹과 비슷한 수준을 나타내었는데, 이는 라니티딘이 지질 과산화에 영향을 미치지 못한다는 것을 나타낸다. 반면에, α-휴물렌은 용량 의존적 조건에 따라 MDA 레벨의 유의한 감소를 보였다.

SOD는 강한 활성 산소인 슈퍼옥사이드 라디컬을 하이드로겐 퍼록사이드로 대체시키는 효소이다. 도 5D에 따르면, SOD의 활성은 정상 대조군에 비해 ECl/EtOH 처리군에서 감소하였다. 라니티딘 처리군의 경우 감소된 SOD 활성이 회복되었고, α-휴물렌은 용량 의존적인 조건으로 SOD의 활성을 현저히 향상시켰다. 이를 함께 고려하면, α-휴물렌은 항산화 활성을 통해 위 점막 손상으로부터 보호함을 알 수 있다.

6) PMA로 자극된 HMC-1 세포에서 α-휴물렌의 염증-관련 인자 억제 효과

α-휴물렌이 항염증 활성을 나타내는지를 확인하기 위해, IL-6, IL-1β, TNF-α 등을 포함하는 염증-관련 사이토카인에 대한 PCR을 수행한 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, IL-1β 및 TNF-α가 α-휴물렌의 농도에 따라 현저히 감소한 반면, IL-6의 경우 약간 감소하였다.

또한, 염증 반응에서 중요한 전사인자인 NK-κB의 레벨을 확인하기 위한 루시퍼라아제 어세이를 수행한 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, PNA 처리 군에서 형광 강도는 대조군에 비해 급격히 증가하였다. 반면에, α-휴물렌 처리 군에서는 용량에 비례하여 형광강도가 현저히 감소하였다. 따라서, α-휴물렌은 IL-6, IL-1β, TNF-α를 조절함으로써, 또한 NF-κB를 조절함으로써 항염증 활성을 나타낼 수 있다.

7) 에탄올-유도 위 점막 손상 시 α-휴물렌의 점액 상향 조절 효과

뮤신은 위 점막 보호 인자의 한 구성요소로, 위 점막층을 형성할 뿐 아니라 위 점막을 뮤신을 분비함으로써 보호한다. α-휴물렌에 의한 뮤신의 형태학적 변화를 확인하기 위해, 뮤신에 특이적으로 결합하는 알시안 블루를 사용하여 염색을 수행한 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, HCl/EtOH를 처리한 군에서, 비이클을 처리한 대조군에 비해 뮤신이 감소하였고, 반면에 라니티딘 처리 군에서는 감소된 뮤신의 양이 회복되었다. 또한, α-휴물렌도 감소된 뮤신의 양을 회복시켰다. 도 7B에 나타난 바에 따르면, 도 7A의 결과와 같이, 각 처리군 별 조직으로부터 녹아 분리된 알시안 블루는 HCl/EtOH 처리군에서 감소하고, α-휴물렌의 적용 시 녹아 분리된 염료의 레벨이 증가하는 경향과 동일한 결과를 보여준다. 따라서 α-휴물렌은 HCl/EtOH-유도 위 점막 손상의 억제 시에 뮤신의 양을 증가시킨다.

8) 에탄올-처리 위 조직에서 α-휴물렌의 점막 보호 인자 상향 조절 효과

점막을 보호하는 분비성 뮤신(MUC5AC, MUC6), 분비성 펩타이드(TFF1, TFF2, TFF3) 및 폴리 면역글로블린 수용체(pIgR)과 같은 유전자들에 대한 α-휴물렌의 효과를 확인하기 위해, PCR을 수행한 결과, 도 8A 및 8B에 나타난 바와 같이, HCl/Et OH 처리에 의해 감소된 MUC5AC, MUC6, TFF1, TFF2의 발현이 α-휴물렌의 처리 시 농도 의존적으로 증가하였다. pIgR 또한 약간 증가하였다. 반면에, TFF3은 위보다는 소장에 위치해있기 때문에, 현저한 변화는 나타나지 않았다. 각 군 별로 개체 사이에 약간의 차이는 있었지만 경향은 일반적으로 비슷했다. 그러므로, α-휴물렌은 점막-관련 요소인 MUC5AC, MUC6, TFF1, TFF2, pIgR의 발현을 알코올-유도 위 점막 손상에 대한 방어 기작으로서 증가시킨다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

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α-휴물렌(α-Humulene)을 유효성분으로 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서 뮤신의 양을 증가시키는 시약 조성물.
사람을 제외한 동물에 α-휴물렌(α-Humulene)을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뮤신 분비를 향상시키는 방법.