KR101477552B1

KR101477552B1 - 유제놀 유도체를 함유하는 아토피성 피부염의 치료용 약제학적 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101477552B1
Application number: KR1020120141863A
Authority: KR
Inventors: 김이화; 김용민; 박종필; 손정현
Original assignee: 세명대학교 산학협력단
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2014-12-30
Also published as: KR20140073873A

Abstract

본 발명은 유제놀(eugenol)을 함유하는 아토피 질환 치료제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 정향(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry 및 Eugenia caryophyllata thunb.)의 꽃봉오리 추출물로부터 분리되어 정유성분인 유제놀(Eugenol), 유제놀아세테이트(Eugenol acetate), 캐리요필렌(Caryophyllene)을 포함하는 분획물인 것이 특징이고, 이러한 분획물은 비만세포를 포함하는 과립구에서 탈과립화 및 히스타민 방출을 억제하고, DNCB (2,4-Dinitrochlorobenzene)에 의하여 유발된 아토피성 피부염 질환동물 모델에서 피부염 및 부종 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 혈액에서 아토피성 피부염의 주된 항체인 IgE의 생성 억제효과를 가지는바, 아토피성 피부염 치료 또는 예방에 유용한 효과를 가진다.

Description

유제놀 유도체를 함유하는 아토피성 피부염의 치료용 약제학적 조성물 및 그 제조방법{A pharmaceutical composition for the treatment of atopic dermatitis and method of production thereof}

본 발명은 정향으로부터 얻은 유제놀 및/또는 그것의 유도체를 포함하는 것으로, 특히 아토피성 피부염의 치료 또는 예방에 유용한 효과를 가지는 조성물에 대한 것이다.

아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 흔한 피부질환으로 주로 유아기와 소아기에 높은 발생빈도를 보인다. 아토피 피부염의 유병율은 3%에서 15%정도 보고되고 있으며, 2차 세계대전이래 계속 증가추세로 광범위한 역학조사가 실시되었으며, 국내에서도 많은 연구가 진행되었다(참조: Hanifin JM. 등, Ciagnostic features of atopic dermatitis, Acta Derm Venereol, 1980, Suppl 92, 44~47; Diepgen TL 등, Recent epidemiological and genetic studies in atopic dermatitis, Acta Derm Venereol, 1992, Suppl 176, 13~18; Diepgen TL. 등, Evaluation and relevance of atopic base and minor features in patients with atopic dermatitis and in the general population, Acta Derm Venereol, 1989, Suppl 144, 50-54).

아토피 피부염은 만성 재발성 피부염으로서 심한 소양증, 피부 병변의 특징적인 모양 및 분포, 및 개인적 또는 가족적인 아토피 병력을 갖는 유전적 소인으로 보인다. 최근에는 아토피 피부염이 음식 첨가제나 환경오염의 영향 등으로 증가하는 추세이며, 정확한 병인은 알려져 있지 않지만 유전적, 환경적 및 면역학적 요인이 복잡하게 연관되어 발병하는 것으로 추측되고 있다(참조: Leung DYM 등, In: Fitzpatrick TB, 등 eds, Dermatology in general medicine, 4th ed, New York: McGraw-Hill, 1993, 1543~1564; Morren MA 등, Atopic dermtitis: triggering factors, J Am Acad Dermatol, 1994, 31, 467~473).

아토피 피부염에서는 말초혈액의 CD8+ T 임파구의 감소가 관찰되고 결과적으로 CD4:CD8 비율이 증가하게 된다. 이런 현상이 전신적인 세포매개 면역의 감소를 유도하지는 않지만 피부 면역의 저하를 초래하여 아토피 피부염 환자에게서 바이러스나 세균감염이 빈발하게 되고, 접촉 알레르겐(allergen)에 대한 반응이 저하되는 현상이 발생한다. 또한, CD4+ T 임파구 중에서 INF-γ 와 TNF-β를 분비하여 정상적인 세포매개 면역에 관여하는 Th1의 수는 감소하게 되고 IL-4를 분비하여 알러지 반응을 유발하는 IgE의 생산을 증가시키고 알러지 반응에 직접 관여하는 Th2의 수는 증가하게 된다(참조: Bos JD 등, Immune dysregulation in atopic eczema, Arch Dermatol, 1992, 128, 1509; Del Prete G 등, Biology of disease, Human Th1 and Th2 cells: Functional properties, mechanisms of regulation, and role in disease, Lab Invest 1994, 70, 299).

한편, 아토피 피부염 환자의 80%는 혈청 IgE가 정상인에 비해 높으며, 증상이 심할수록 그 수치가 높은 경향이 있어 증가된 IgE 자체가 피부 병변에 직접 관여하는지 억제 T세포의 결함이 IgE 항체의 증가를 초래하는지는 아직 불분명하다(참조: Jones HE 등, Atopic disease and serum immunoglobulin-E, Br J Dermatol, 1975, 92, 17~25).

또한, 아토피 환자에게서 표피 장벽의 손상이 관찰된다. 이는 표피 각질층에서 각질 세포사이의 지질 성분인 세라마이드 (ceramide)의 부족이 아토피 피부염에서 경피 수분손실을 증가시켜 건조함을 유발하는 것으로 추정하고 있다.

현재, 아토피를 예방 및/또는 치료하는 것을 목적으로 시판되고 있는 아토피 관련제품으로는 스테로이드계 또는 식물추출물을 소재로 하고 있다. 그러나, 상기 스테로이드계는 부작용과 내성으로 소비자들이 기피하고 있는 실정이고, 대부분의 아토피관련 제품은 식물추출물을 원료로 사용하고 있으나 그 약효는 아토피 환자들을 만족시키지는 못하고 있다. 따라서 아토피 피부염의 예방, 개선, 치료에 관한 공지문헌 및 시제품이 많이 있음에도 불구하고, 여전히 아토피 피부염에 대해 효과가 높고 독성이 없는 새로운 물질 및 제제의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 종래 알려진 아토피성 피부염 질환 치료제들 보다 항 아토피성 피부염의 효과가 우수하면서 부작용이 거의 없는 생약 성분을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 정향(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry)을 에탄올로 추출한 핵산 분획물과, 이로부터 분리한 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)이 세포 및 동물 실험에서 아토피성 피부염 질환 치료효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 핵산 분획물, 및/또는 이로부터 분리된 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)들을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 정향으로부터 아토피성 피부염을 치료 할 수 있는 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 분리하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한, 본 발명은 정향(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry 및 Eugenia caryophyllata thunb.) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물이다.

여기서, 상기 정향은 정향의 꽃봉오리인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 정향 추출물은 정향 꽃봉오리의 알콜 추출물인 것이 가능하다.

또한, 상기 정향 추출물의 분획물은 정향 추출물의 오일성분을 노르말 헥산으로 분획한 노르말 헥산 분획물인 것이 바람직하다.

또한, 상기 분획물은 유제놀(Eugenol), 유제놀아세테이트(Eugenol acetate) 및 캐리요필렌(Caryophyllene)을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 예는, 유제놀(Eugenol), 유제놀아세테이트(Eugenol acetate) 및 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물이다.

여기서, 상기 유제놀은 하기 화학식 1로 표시되고, 상기 유제놀아세테이트는 하기 화학식 2로 표시되며, 상기 캐리요필렌은 하기 화학식 3으로 표시되는 것이 바람직하다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명의 다른 실시형태는, 정향의 꽃봉오리를 세절하고 탄소수 1 ~ 4의 저급 알콜로 추출하여 여과한 여액을 감압 농축해서 정향 추출물을 얻는 단계; 상기 얻은 정향 추출물을 농축하고 1~10 ℃에서 5 ~ 7일간 정치하여 상층액과 하층액으로 분리해서, 상기 분리한 상층액을 오일성분으로 얻는 단계; 및 상기 얻은 오일성분을 물에 현탁하고 노르말 헥산으로 분획하여 노르말 헥산 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법이다.

그리고, 상기 얻은 노르말 헥산 분획물을 감압 농축하여 유제놀, 유제놀아세테이트 및 캐리요필렌을 포함하는 정향유를 분리하는 단계;를 더 포함하는 것이 가능하다.

본 발명의 다른 예는, 상기한 제조방법에 의해 제조되어, 유제놀, 유제놀아세테이트 및 캐리요필렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명은 정향(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry 및 Eugenia caryophyllata thunb.)의 꽃봉오리 및 이로부터 분리된 정유성분인 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)이 비만세포를 포함하는 과립구에서 탈과립화 및 히스타민 방출을 억제하고 DNCB (2,4-Dinitrochlorobenzene)에 의하여 유발된 아토피성 피부염 질환동물 모델에서 피부염 및 부종 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라 혈액에서 아토피성 피부염의 주된 항체인 IgE의 생성을 억제하는 새로운 용도를 제공함으로써 지금까지 그 치료에 있어서 어려움이 있던 아토피피부염 치료용 약제학적 조성물로 널리 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 나타내는 것으로, 특히 정향의 에탄올 추출물에서 유제놀(Eugenol), 유제놀아세테이트(Eugenol acetate), 캐리요필렌(Caryophyllene)을 포함하는 정향유를 얻는 과정의 일례를 나타내는 흐름도이고,
도 2는 본 발명에 따른 정향유에서 유제놀, 유제놀아세테이트 및 캐리요필렌을 확인한 GC-MASS 분석 결과이고,
도 3은 본 발명에 따른 정향유를 RBL-2H3 세포에 처리하여, 비만세포의 탈과립화 억제 효과를 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 4는 본 발명에 따른 정향유를 RBL-2H3 세포에 처리하여, 비만세포의 히스타민 방출 억제 효과를 측정를 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 5는 본 발명에 따른 정향유를 RBL-2H3 세포에 처리하여, MAPK의 인산화 억제 효과를 측정한 결과의 일례를 나타내는 사진이고,
도 6은 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염 질환모델 마우스인 NC/Nga에 처리하는 과정의 일례를 나타내는 개념도이고,
도 7은 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염이 유발된 동물에 처리하여 질환 치료 효과를 측정한 결과의 일례를 나타내는 사진이고,
도 8은 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염이 유발된 동물에 농도별로 처리하여 매주 마우스의 피부손상정도(clinical score)를 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 9는 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염이 유발된 동물에 농도별로 처리하고, 피부조직을 H&E 염색하여 조직내 면역세포의 침윤 정도를 측정한 결과의 일례를 나타내는 사진이고,
도 10은 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염이 유발된 동물에 농도별로 처리하여 혈액내 IgE 농도를 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 11은 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염이 유발된 동물에 농도별로 처리하여 혈액내 히스타민 농도를 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 12는 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염이 유발된 동물에 농도별로 처리하여 혈액내 염증 인자의 농도를 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래프이고,
도 13은 본 발명에 따른 정향유를 아토피성 피부염이 유발된 동물에 농도별로 처리하여 혈액내 T 림프구 분화 (Th1/Th2)에 필요한 인자의 농도를 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[용어의 정의]

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 발명에 사용된 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 피부 상태에 적용하여 예방 또는 치료 효과를 제공하는 약제학적 조성물의 양을 의미한다.

본 발명에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적으로 유효한 양의 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 유효성분으로 함유하여 아토피 피부염에 의해 유발된 피부 상태를 예방 또는 치료하는 약제(pharmaceutical preparations), 세정제(detergents) 및 화장제(cosmetics) 모두를 포함한다.

본 발명에 사용된 용어 "피부 상태"는 아토피 피부염에 의해 피부의 감염 부위가 변화된 상태를 의미하며, 이러한 상태는 피부 질환으로 간주되는 상태와 피부질환으로 간주되지 않은 상태 모두를 포함한다.

본 발명에 사용된 용어 "치료"는 본 발명의 약제학적 조성물을 아토피 피부염 부위에 적용한 결과로서 아토피 피부염 증세의 완치는 물론 아토피 피부염 증세의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.

본 발명에 사용된 용어 "예방"은 본 발명의 약제학적 조성물을 피부, 특히 아토피 피부염에 적용하여 피부에의 아토피 피부염 증세를 억제 또는 차단함으로써, 아토피 피부염 증세가 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.

[ 정향 추출물을 포함하는 조성물]

정향 나무(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry 및 Eugenia caryophyllata thunb.)는 쌍떡잎식물 도금양목 도금양과의 상록 소교목으로써, 꽃이 피기 전의 꽃봉오리를 수집하여 말린 것을 정향 또는 정자(丁字)라고 한다. 꽃봉오리의 형태가 못처럼 생기고 향기가 있으므로 정향이라고 하며 영어의 클로브(clove)도 프랑스어의 클루(clou:못)에서 유래한다. 매우 향기로우므로 그대로 또는 분말로 사용하고, 물이나 증기로 빼낸 정향유를 활용한다. 식품·약품·방부제 등에 쓰거나, 발작증을 비롯하여 치과에서 진통제 등으로 쓴다. 정향은 그 산출량이 적기 때문에 꽃봉오리뿐만 아니라 꽃대와 열매까지도 모두 이용하고 있다.

그란, 정향 나무, 정향, 정향유의 유효 성분이 아토피 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물로 사용될 수 있다고 알려진 바는 없었다.

이에 본 발명자들은 다양한 산림자원을 이용한 기능성 제품을 연구하던 중, 정향의 용매 추출물을 분획한 분획물을 함유하는 조성물이 아토피 질환의 예방과 치료에 효과적이라는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에 따라, 본 발명은 정향(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry 및 Eugenia caryophyllata thunb.) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물이다.

이러한 본 발명에 따른 조성물은 정향 또는 그것의 분말을 물이나 증류수 또는 저급 알콜로 추출하여 얻어진 추출물로부터 고체상과 액상을 분리한 후, 상기 액상을 분획해서 얻은 것을 포함하거나 이것을 분말화한 것을 포함하는 것이 특징입니다.

본 발명에 따른 유성물은 유효성분으로써 상기 정향 추출물의 분획물을 전체 조성물의 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1.00 내지 30 중량%로 포함되는 것이다. 상기 함량이 0.001 중량% 미만일 경우에는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 50 중량%를 초과할 경우 조성물의 물성을 저하시킬 우려가 있다.

상기 정향 추출물은 정향의 꽃봉오리, 꽃대 및 열매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추출한 것일 수 있고, 그 중에서도 정향의 꽃봉오리를 이용하는 것이 바람직하다. 그리고, 상기 정향 추출물을 얻는 방법은 초음파 추출법, 여과법, 열수추출법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 그래서, 상기 정향 추출물은 정향 꽃봉오리의 알콜 추출물인 것이 바람직하고, 특별히 저급 알콜 추출물인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 정향 추출물의 분획물은 정향 추출물로부터 오일성분만을 더욱 효과적으로 분획하기 위하여, 상기 정향 추출물을 정치 보관해서 상층액과 하층액으로 분리한 뒤, 상기 분리한 상층액만을 분획시키는 것이 바람직하다.

이어서, 상기 분획시킨 상층액을 저극성 용매 내지 고극성 용매로 분획하는데, 특별히 노르말 헥산으로 분획한 노르말 헥산 분획물에 유제놀(Eugenol), 유제놀아세테이트(Eugenol acetate) 및 캐리요필렌(Caryophyllene)이 포함된 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 다른 예는, 유제놀(Eugenol), 유제놀아세테이트(Eugenol acetate) 및 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[ 정향 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법]

구체적으로, 본 발명은 1) 건조된 정향의 꽃봉오리를 세절하고 탄소수 1 ~ 4의 저급 알콜로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압 농축하여 그 추출물을 얻는 단계; 2) 상기 알콜 추출물을 4 ℃ 저온에 7일간 정치 보관하면, 상층과 하층으로 나뉘게 되고 이때 상층의 황갈색 오일 성분만 획득하는 단계; 3) 상기 오일 성분을 물에 현탁하고, 저극성에서 고극성 용매로의 순서로, 예를 들어 노르말 헥산, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및, 노르말 부탄올의 차례로 분획한 분획물을 얻는 단계; 4) 상기 노르말 헥산 분획물을 감 압농축하여 정향 오일을 얻는 단계;를 포함하여 이루어진 정향의 꽃봉오리로부터 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 분리하는 방법일 수 있다.

이를 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 정향의 꽃봉오리를 건조시키고, 이를 세절한 다음 정향의 중량(kg)의 1 ~ 100배 량(L) 바람직하게는 5 ~ 15배량의 탄소수 1 ~ 4의 저급 알콜로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압 농축하여 정향의 추출물을 얻는다. 이때, 저급 알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 노르말 부탄올 등이 바람직하다.

상기 추출물을 농축하여 엑기스 150 ~ 300 g을 얻고 이를 저온 냉장고 4 ℃에 7일간 정치하면 상층의 오일성분과 하층의 엑기스가 분리된다. 이를 분획 깔대기를 이용하여 상층의 적갈색의 오일층만 취하여 증류수 0.5 ~ 3L 에 현탁한 후, 0.3 ~ 3배량, 바람직하게는 현탁액과 각각 동일 량의 노르말 헥산, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트와 노르말 부탄올로 차례로 분획한 다음 감압 농축하여 노르말 헥산 분획물 즉 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 주성분으로한 오일을 10 ~ 30 ml을 얻는다.

이렇게 얻어진 정향 알콜 추출물, 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 주성분으로한 오일은 RBL-2H3(흰쥐 호염구 세포주)를 항원과 항체를 이용하여 탈과립화를 유도 하였을 때 탈과립화를 억제하고 DNCB로 아토피성 피부염이 유도된 NC/Nga 마우스를 이용한 동물실험에서 피부병변 완화 효과와 혈액내의 히스타민 방출을 억제하는 효능을 확인하였으며, 비장의 T 임파구 (Th1/Th2)의 비율이 정상적으로 회복하였다. 이것으로 인하여 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 주성분으로한 오일 혼합물 역시 탈과립화를 억제하고 DNCB로 아토피성 피부염이 유도된 NC/Nga 마우스를 이용한 동물실험에서 피부병변 완화하는 효능, 즉 항 아토피성 피부염 활성을 가짐을 용이하게 예측할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 정향 추출물 및/또는 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)은 아토피성 피부염 치료에 효과적으로 적용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 다른 예는, 상기한 제조방법에 의해 제조되어, 유제놀, 유제놀아세테이트 및 캐리요필렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다.

[약제 제형]

본 발명의 한 양태는 유효성분으로서 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 함유하여 아토피 피부염으로 유발된 피부 상태를 예방 또는 치료하는 약제를 제공한다. 본 발명의 약제는 특별히 한정되지 않지만 경피투여형 또는 경구형 제형일 수 있으며, 구체적인 예로는 연고, 크림, 파스타제(pastes), 로션, 찰제(liniments), 외용 액제, 틴크제, 글리세로젤라틴(glycerogelatins), 외용산제, 에어로졸, 경고제(plasters), 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태로 제형될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour]에 기술되어 있다.

상기 약제의 제형 중 바람직한 양태의 한 제형은 연고이다. 본 발명의 연고는 페트롤라툼(patrolatum), 화이트 페트롤라 툼, 옐로우 연고, 미네랄 오일과 같은 탄화 수소 기제, 친수성 페트롤라툼, 무수 라놀린, 라놀린, 콜드 크림과 같은 흡수 기제, 친수성 연고와 같은 수세가 가능한 기제, 폴리에틸렌 글리콜 연고와 같은 수용성 기제 어느 것으로도 제조 가능하다.

이들의 선택 및 제조는 약물의 기제로부터의 방출속도, 기제에 의한 경피흡수의 증가기대, 기제에 의한 피부 수분 밀봉 여부, 약물의 기제내에서의 안정성, 기제에 대한 약물의 영향과 같은 요인을 고려하여 이루어지지만, 약제 제형 분야의 숙련가에게는 통상적인 기술에 속한다.

또한, 상기 약제의 제형 중 바람직한 양태의 다른 제형은 크림이다. 본 발명의 크림은 콜드 크림, 에몰리엔트 크림(emollient cream)과 같은 쉐이빙 크림, 바니싱 크림, 핸드 크림, 린싱 크림(rleansing cream)을 포함한다. 더욱 바람직하게는 전형적으로 물과 스테아린산을 함유하는 바니싱 크림이다. 일반적으로 환자나 의사는 크림이 연고보다 씻어내기 쉽기 때문에 연고제보다 크림을 선호하는데, 이러한 관점에서 본 발명의 약제 제형에서 가장 바람직한 양태는 크림이다.

또한, 상기 약제의 제형 중 바람직한 양태의 또 다른 제형은 로션이다. 본 발명의 로션은 현탁재, 유제, 액제 등과 같은 방법으로 조제되며 이들 또한 약제 제형 분야의 숙련가에게는 통상적인 기술에 속한다. 본 발명에 있어서 더욱 바람직한 것은 화이트 로션(white lotion)이며, 이 제제는 황산아연(sulfated potash)을 4%씩 정제수에 별도로 녹여 여과하여 일정 속도로 서서히 교반하면서 황산아연용액에 가해 조제한다.

또한, 상기 약제의 제형 중 바람직한 양태의 또 다른 제형은 찰제이다. 본 발명의 찰제는 유성 찰제 및 에탄올성 찰제 어느 것으로 제조 가능하며, 바람직한 것은 피부에 자극이 적은 유성 찰제이다. 유성 찰제의 경우 알몬드 오일, 낙화생유, 면실유 등의 불휘발성유, 윈터그린(wintergreen), 투르펜틴(turpentine) 같은 휘발성유 또는 불휘발성유의 배합 등이 있다.

[세정 및 화장제 제형]

본 발명의 또 다른 양태는 유효성분으로서 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 함유하여 아토피 피부염으로 유발된 피부 상태를 예방 또는 치료하는 세정 및 화장제를 제공한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 다양한 세정 및 화장제로 제형될 수 있다. 대표적인 세정 및 화장제로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 헤어 토이레트리(hair toiletry), 헤어드레싱(hairdressing) 및 스킨 토이레트리를 포함한다.

이들 제제의 구체적인 예로는 헤어 비누, 헤어 크림, 수성 및 수성-알코올성 헤어 로션, 웨이브-세팅 로션(헤어 고정제), 헤어드레싱 크림 및 겔, 헤어 스프레이, 헤어 토닌, 헤어 오일, 헤어 포마드, 헤어 브릴리언틴, 특히 헤어 린스 및 샴푸를 들 수 있다. 또한, 스킨 토이레트리의 예로는 고형, 액상 또는 파우더의 비누 및 세정제 조성물, 액체 크림 및 스킨 젤, 스킨 오일, 바디로션, 훼이스 로션(face lotion), 수렴수(astringent), 에센스 및 디오더런트(deodorant)를 들 수 있다. 또한, 바람직한 양태로서 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 활성 성분으로 함유하는 상기 세정 및 화장제 제형은 계면활성제, 안정화제, 보존제, 습윤화제, 항염증제, 항산화제, 착색제, 물 및 이들의 혼합물 중 적어도 하나의 보조제를 포함할 수 있다. 상기 보조제는 조성물 총 중량에 대하여 90.0 내지 99.999 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

상기 본 발명의 세정 및 화장제에 사용되는 계면활성제는 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 모두를 포함하며, 사용량은 전형적으로 30중량%이상, 바람직하게는 70중량% 이상이다. 계면활성제의 종류 및 사용량을 선택 결정하는 것은 본 분야의 숙련가에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 세정 및 화장제에 사용될 수 있는 바람직한 안정화제로는 이로서 한정되는 것은 아니지만, 글리콜 스테아레이트를 포함한다. 상기 안정화제는 일반적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량%로 사용된다.

또한, 본 발명의 세정 및 화장제에 사용될 수 있는 바람직한 보존제로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 테트라나트륨에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트라아자-1-아다만탄, 파라벤, 메틸파라벤, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온의 혼합물, 페녹시에탄올, 벤질알코올, 벤조페논-4, 메틸클로로이소티아졸리논, 메틸이소티아졸리논 및 이들의 혼합물을 포함한다. 상기 보존제는 일반적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 6 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 4 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2 중량%로 사용된다.

또한, 본 발명의 세정 및 화장제에 사용될 수 있는 바람직한 습윤화제로는 밀 단백질(예, 라우르디모늄 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질), 헤어 케라틴 아미노산, 나트륨 퍼옥실린카르볼산, 판테놀, 토코페롤(비타민 E), 디메티콘 등 및 이들의 혼합물이 포함된다. 상기 습윤화제는 일반적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%로 사용된다.

또한, 본 발명의 세정 및 화장제에 사용될 수 있는 착색제로는 FD&C 그린 3번, Ext. D&C 바이올렛 2번, FD&C 옐로우5번, FD&C 레드 40번 및 이들의 혼합물을 포함한다. 상기 착색제는 일반적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 0.1 중량%, 바람직하게는 0.005 내지 0.05 중량%로 사용된다.

또한, 본 발명의 세정 및 화장제에 사용될 수 있는 항염증제로는 국소적으로 투여하기에 적합하고 약제학적으로 허용되는 화합물이라면 그 어느 것도 포함할 수 있으며, 바람직하게는 알란토인이다. 상기 항염증제는 염증 억제 또는 경감시키기에 충분한 양으로 사용되고, 일반적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.3 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 1 중량%로 사용된다.

본 발명의 세정 및 화장제에 사용될 수 있는 항산화제는 천연효소형 항산화제와 비효소형 항산화제 모두 사용될 수 있다.

상기 천연 효소형 항산화제의 예로는 과산화물 디스뮤타제(SOD), 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제를 들 수 있다. 또한, 적합한 비효소형 항산화제로는 비타민 E(예, 토코페롤), 비타민 C(아스코브산), 카로테노이드, 에키나코시드(Echinacoside) 및 카페오일 유도체, 올리고머 프로안토시아니딘 또는 프로안타놀(예, 포도 종자 추출물), 실리마린(예, 밀크 엉겅퀴 추출물, 실리붐 마리아늄), 은행나무(Ginkgo biloba), 녹차 폴리페놀 및 이들의 혼합물이 포함된다. 상기 카로테노이드는 강력한 항산화제이고, 이의 구체적인 예로는 베타-카로틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, 라이코펜, 루테인, 크로세틴, 캡산틴 등을 포함한다.

상기 항산화제에서는 비타민 E, 비타민 C 또는 카로테노이드가 바람직하다. 또한, 항산화제는 두피에서 유리-라디칼의영향을 억제하거나 경감시키기에 충분한 양으로 사용되며, 일반적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량%로 사용된다.

한편, 본 발명에 의한 세정 및 화장제는 본 분야에서 통상적으로 사용되는 다른 보조제를 더 함유할 수 있다. 이러한 보조제의 예로는 향료, 염료(헤어를 동시에 염색하거나 색조를 부가하는 염료를 포함), 용매, 불투명화제 또는 펄제(pearlescent agent)(예, 지방산과 폴리올의 에스테르, 지방산의 마그네슘 염 및 아연 염), 공중합체계 분산액, 농후화제(예, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄 및 황산나트륨), 지방산 알킬올아미드, 셀룰로즈 유도체, 천연 검, 식물 추출물, 알부민 유도체(예, 젤라틴), 콜라겐 가수분해 생성물, 천연 또는 합성 폴리펩타이드, 난황, 렉시틴, 라놀린 및 라놀린 유도체, 지방, 오일, 지방 알코올, 실리콘, 디오더런트, 항균 물질, 항지루성 물질, 각질용해제(예, 황, 살리실산, 벤조일 퍼옥사이드, 셀레늄 설파이드, PG, FA, 효소) 및 각화제(예, 타르, 황, 살리실산, 셀레늄 설파이드, 항균제, 벤조일 퍼옥사이드, 클로르헥시딘, 요오드, 트리클로산, 항진균제, 효소)를 포함한다.

[약제학적으로 유효한 양]

본 발명에 의한 약제, 세정제 및 화장제의 아토피 피부염에 대한 예방 또는 치료 용량 범위는 중증도 및 제형에 따라 변할 수 있다. 또한, 적용 횟수도 환자의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 아토피피부염 치료용 약제학적 조성물에 유효성분으로 사용되는 4-유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene) 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.005 내지 2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%로 함유한다. 이러한 범위내에서 특정 제제의 농도는 이들을 사용하고자 하는 용도에 따라 결정되며, 사용하기 전에 희석해야 하는 농축 제제와 같은 특정 제제는 좀 더 높은 농도를 함유할 수 있다.

본 발명에 의한 상기 모든 제제는 본 분야에 통상적인 기술을 사용하여 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 포함한 각각의 성분을 혼합하고 혼합물을 적절히 원하는 형태로 제형한다. 본 발명에 의해 제조된 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 함유한 여러 제제는 통상적인 방식으로, 바람직하게는 아토피 피부염에 바르거나 마사지하여 사용할 수 있다.

[바람직한 양태]

본 발명에 의한 아토피피부염 치료용 약제학적 조성물은 유효성분으로서 유제놀 (Eugenol), 유제놀아세테이트 (Eugenol acetate), 캐리요필렌 (Caryophyllene)을 함유하고, 그 제형은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 연고, 크림, 파스타제(pastes), 로션, 찰제(liniments), 외용 액제, 틴크제, 글리세로젤라틴(glycerogelatins), 외용산제, 에어로졸, 경고제(plasters) 등의 약제; 헤어 비누, 헤어 린스, 바디클렌져 및 샴푸 등의 세정제; 및 크림, 에센스, 바디로션 등의 화장제;의 형태로 제형화 할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 정향 추출물의 제조

건조된 정향의 꽃봉오리를 약재상으로부터 구입하여 세절하고, 세절한 정향 1 kg을 에탄올 5 L로 실온에서 3 ~ 5회 반복 추출하여 그 추출물을 얻었다.

실시예 2: 유제놀 ( Eugenol ), 유제놀아세테이트 ( Eugenol acetate ), 캐리요필렌( Caryophyllene)을 함유하는 오일의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 추출물(에탄탄올 엑기스) 205 g을 4 ℃ 냉장고에서 7일간 정치 후 상층액(58 g)을 얻었다. 그리고, 상기 얻은 상층액을 증류수 0.5 L에 현탁한 후, 각각 동일 량의 노르말 헥산, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트와 노르말 부탄올로 차례로 분획한 다음 감압 농축하여 노르말 헥산 분획물 32 g을 얻었다.

상기 분획물을 GC mass 분석하여 구성물질을 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 유제놀(Eugenol), 유제놀아세테이트(Eugenol acetate), 캐리요필렌(Caryophyllene)이 함유되어 있었다.

실험예 1: 비만세포의 탈과립화 방지 효과

RBL-2H3 세포주를 15% 우태아혈청(Fetal bovine serum)과 L-글루타민(Glutamine)을 포함하는 이글염(Eagles salt)을 포함하는 최소 기본 배지(Minimum essential media, 이하 EMEM)를 이용하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하며, 고착성을 갖는 세포를 트립신(Trypsin)-EDTA 용액을 사용하여 부유시키며 이를 분리, 회수하여 실험에 이용하였다.

RBL-2H3 세포주를 활성인자(Dinitrophenol-conjugated human serum albumin, (DNP-HSA)-specific IgE)로 활성화시킨 후 활성화된 세포에 안티젠(DNP-HSA) 200 ng/mL을 처리하고, 상기 실시예 2의 노르말 헥산 분획물(유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물)을 0, 25, 50, 100 μg/ml을 각각 처리하여 30분 동안 배양하였다(도 3). 이후 흡광광도계(microplate spectrophotometer)를 이용하여 배지 내로 분비된 베타 헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 양을 측정하였다. 베타 헥소사미니다제 분비 양의 억제는 면역세포의 탈과립화를 방지함을 의미한다.

도 3은 본 발명의 정향으로 부터 분리한 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물을 RBL-2H3 세포주(Rat mast cell line)에 처리하여 안티젠에 의한 탈과립화를 억제하는 효과를 나타낸 것이다. 도 3에서 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 양이 증가함에 따라 베타 헥소사미니다제 분비양이 감소한 것을 확인할 수 있다.

실험예 2: 비만세포에서 히스타민 감소효과

RBL-2H3 세포주를 활성인자(Dinitrophenol-conjugated human serum albumin, (DNP-HSA)-specific IgE)로 활성화 시킨 후 활성화된 세포에 안티젠(DNP-HSA) 200 ng/mL을 처리하고, 상기 실시예 2의 노르말 헥산 분획물(유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물)을 0, 25, 50, 100 μg/ml을 각각 처리하여 16시간 동안 배양하였다(도 4). 이후 배양 상층액을 취하여 히스타민 면역 혈청분석 kit을 이용하여 배지 내로 분비된 히스타민 양을 측정하였다.

도 4는 본 발명의 정향으로 부터 분리한 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물을 RBL-2H3 세포주(Rat mast cell line)에 처리하여 안티젠에 의한 탈과립화를 억제하는 효과를 나타낸 것이다. 히스타민 분비 양의 억제는 면역세포의 탈과립화와 비만세포의 활성을 억제한다. 도 4에서 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 양이 증가함에 따라 히스타민 분비양이 감소한 것을 확인할 수 있다.

실험예 3 : 비만세포의 MAPK ( Mitogen Activated protein kinase ) 기전 활성화 억제 효과

RBL-2H3 세포주를 활성인자(Dinitrophenol-conjugated human serum albumin, (DNP-HSA)-specific IgE)로 활성화 시킨 후 활성화된 세포에 안티젠(DNP-HSA) 200 ng/mL을 처리하고, 상기 실시예 2의 노르말 헥산 분획물(유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물)을 0, 25, 50, 100 μg/ml을 각각 처리하여 16시간 동안 배양하였다(도 5). 이후 배지를 제거하고 Tris-Hcl base lysis buffer를 이용하여 세포를 파쇄한 후, 단백질을 추출하였다. 획득한 단백질을 SDS-PAGE 방법에 의하여 전기영동하여 단백질을 분자량 별로 분리하고 nitrocellulose membrane에 전사시켰다. nitrocellulose membrane에 전사시킨 단백질에 항 인산화 JNK 및 항 인산화 p38 그리고 항 인산화 p38 항체를 붙인 후 발색시켜 각 MAPK 단백질의 인산화 정도를 확인하였다. 각 well에 동일 양을 전사시킨 것을 확인하기 위하여 actin 항체를 사용하여 확인하였다(도 5).

도 5는 본 발명의 정향으로 부터 분리한 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물을 RBL-2H3 세포주(Rat mast cell line)에 처리하여 안티젠에 의한 MAPK 활성화 기전을 억제하는 효과를 나타낸 것이다. 도 5에서 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 양이 증가함에 따라 비만세포의 활성에 관여하는 MAPK인 p38 단백질의 인산화가 감소한 것을 확인할 수 있다.

실험예 4 : 실험동물 준비

5주령 된 NC/Nga 마우스를 중앙실험동물(주)에서 공급받아 약 1주간 실험실 순화과정을 거친 후 사용하였다. 마우스용 케이지(220 × 200 × 145 mm)에 5마리씩 수용하였다. 동물실험실의 환경은 온도 21~25℃, 상대습도 45~65%, 환기횟수 12 회/시간, 조명주기 12시간, 조도 150 - 300 lux로 조절되었다. 실험동물용 펠렛(pellet)형 고형사료인 Purina Rat Chow 를 Nestle Purina PetCare Korea Ltd. (Seoul, Korea)로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다.

실험예 5 : 아토피성 피부염의 유발시험 및 검체처리

상기 실험예 4의 Balb/c 마우스를 제모제(민감성피부용 veet)를 충분히 사용하여 등 부위를 넓게 제모하고, 마우스를 6군(A; 미유도군, B; DNCB 유도군, C; DNCB 유도 및 1% pimecrolimus 도포군, D; DNCB 유도 및 0.2% 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 도포군, E; DNCB 유도 및 1% 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 도포군, F; DNCB 유도 및 5% 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 도포군)으로 나누었다.

24시간 후 DNCB (2,4-dinitrofluorobenzene)을 0.15% 농도로 아세톤(aceton)에 희석한 후 마우스 등 귀부분에 200 ul를 취하여 도포하였고, 다시 4일 후 200 ul를 도포한 후, 이후 주 2회 도포를 반복하여 피부염을 유발하였다. 6주째 실험 24시간 전부터 절식시키고 가벼운 에테르 마취상태에서 복개 후 심장에서 혈액을 채취하여 원심분리(3,000g, 10분)하여 혈청을 얻었고, 실험이 진행되기 전까지 70℃에서 보관하였으며, 아토피성 피부염이 유발된 등 부위의 피부를 절개하여 포르말린 용액에 넣어 4℃에 보관하였다. 비장을 적출하여 비장 내 T 림프구를 분리하였다(도 6 참조).

실험예 6 : 유제놀 ( Eugenol ), 유제놀아세테이트 ( Eugenol acetate ), 캐리요필렌( Caryophyllene ) 혼합물의 아토피성 피부염의 억제 효과

상기 실험예 5에서 준비한 NC/Nga 마우스를 6주간 매주 마우스의 피부손상정도(clinical skin score)를 측정하였다. 피부손상정도는 홍반과 출혈(erythema and hemorrhage), 부종과 혈종(edema and excoriation), 진무름과 상처(erosion and scarring) 항목에 대하여 양호함(0), 약함(1), 심함(2), 아주 심함(3)으로 평가하였고, 각 실험군에 대하여 그 평가 점수를 합산하여 총점을 구하였으며, 육안평가는 실험에 관여하지 않은 일반관찰자에 의해 진행되었다.

실험결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 DNCB 처리군에서는 DNCB 도포 2주째부터 피부가 붉어지고 거칠어졌으며 심한 경우 출혈 등의 심한 피부염 증상을 보이기 시작했으며, DNCB 처리 부위가 그렇지 않은 피부에 비해 눈에 띄게 두꺼워졌음이 관찰된 반면, 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물을 투여한 실험군은 눈에 띄게 피부염 증상이 호전되는 것을 관찰할 수 있었다(도 7 참조).

상기의 실험결과를 토대로 각 마우스의 피부손상정도(clinical score)를 측정한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 피부손상 정도는 6주차 DNCB 처리군에서 13으로 나타난 반면, 양성대조군인 1% pimecrolimus 를 도포한 군에서는 4로 나타났다. 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물을 1%와 5% 도포한 군에서는 양성 대조군과 비슷한 수준으로 회복하였다. 하지만 0.2% 처리한 군에서는 10 정도의 수치를 보여 주나 통계적인 유의성은 관찰 할 수 없었다(도 8 참조).

실험예 7 : 아토피성 피부염 동물 모델에서 피부조직학적 관찰

상기 실험예 5에서 준비한 NC/Nga 마우스의 피부를 10% 포르말린에 고정하였다. 통상적인 방법으로 5㎛ 두께의 파라핀 절편을 제작한 후, Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색을 실시하여 염증부위내의 뭇핵형백혈구(polymorphic nuclear leukocytes, PMNL)의 침윤정도를 광학현미경을 이용하여 관찰하고 사진을 촬영하였다(도 9 참조).

A, 미유도군과 비교하여 B, DNCB 유도하여 아토피성 피부염을 유도한 피부에서 많은 뭇핵형백혈구의 침윤이 관찰 되지만, 양성대조군인 C, DNCB 유도 및 1% pimecrolimus 도포군과 D, DNCB 유도 및 0.2% 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 도포군 및 E, DNCB 유도 및 1% 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 도포군 그리고 F, DNCB 유도 및 5% 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 도포군에서 뭇핵형백혈구의 침윤을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다(도 9 참조).

실험예 8 : 아토피성 피부염 동물 혈청에서 Immunoglibulin E ( IgE ) 억제효과 측정

상기 실험예 5 방법으로 수득한 혈액으로부터 얻은 각각의 샘플을 면역효소분석법(Mouse IgE ELISA KIT, Pharmingen, USA)을 사용하여 측정하였다. 항-마우스 IgE 마이크로웰 스트립 플레이트에 샘플을 100ul 넣은 후, 1시간 동안 방치한 후 4회 세척하였다. 그리고 각각의 항-마우스 IgE-HRP conjugate를 100ul 씩 넣은 후, 30분 간 방치하고 5회 세척하였다. 100ul TMB 기질을 각각의 웰에 넣고 15분 동안 감광시킨 후, 100ul의 정지 용액을 넣고 흡광도(Microplate Reader, Molecular Devices, USA) 405nm로 측정하였다.

실험결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 DNCB 처리군은 미 처리군에 비하여 유의하게 IgE의 양이 증가한 반면, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌 혼합물 도포군 및 E, DNCB 유도 및 1% 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 도포군에서는 양성대조군과 거의 비슷하거나 보다 낮은 농도로 IgE가 측정었다 [도 10 참조].

실험예 9 : 아토피성 피부염 동물 혈청에서 히스타민 농도 감소 효과 측정

상기 실험예 5의 방법으로 수득한 혈액으로부터 얻은 각각의 샘플을 히스타민 효소면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 혈중 히스타민 농도를 측정하였다. 실험군은 군당 10 마리를 사용하였으며 양성대조군으로서 1% pimecrolimus를 사용하였다. 아토피성 피부염의 요인자로서 히스타민 농도의 증가로 확인되므로 혈액 내 히스타민 농도 감소는 아토피성 피부염의 감소로 의미 된다.

도 11에서 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 양 증가에 따라 혈중 히스타민 농도가 감소하였다(도 11 참조).

실험예 10 : 아토피성 피부염 동물 혈청에서 알러지 활성인자 ( pro -inflammatory cytokine ) 농도 감소 효과 측정

상기 실험예 5의 방법으로 수득한 혈액으로부터 얻은 각각의 샘플을 인터루킨 1베타 및 인터루킨 6 효소면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 혈중 인터루킨 1베타 및 인터루킨 6의 농도를 측정하였다. 실험군은 군당 10 마리를 사용하였으며 양성대조군으로서 1% pimecrolimus를 사용하였다. 아토피성 피부염이 발생하면 병변을 통하여 외부 감염이 일어남에 따라 알러지 활성인자 농도의 증가로 확인되므로 혈액 내 알러지 활성인자 감소는 아토피성 피부염에 의한 병변이 감소했다는 의미가 된다.

도 12에서 유제놀, 유제놀아세테이, 캐리요필렌의 혼합물 양 증가에 따라, 혈중 인터루킨 1베타와 인터루킨6의 농도가 감소하였다(도 12 참조).

실험예 11 : 아토피성 피부염 동물 혈청에서 T 림프구 활성인자 농도 조절효과 측정

상기 실험예 5의 방법으로 수득한 혈액으로부터 얻은 각각의 샘플을 Th1 림프구를 활성화 시키는 사이토카인인 인터페론 감마 및 인터루킨2와 Th2 임프구를 활성화 시키는 인터루킨 10 및 인터루킨 4 효소면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 혈중 Th1과 Th2의 활성화 인자의 농도를 측정하였다. 실험군은 군당 10 마리를 사용하였으며 양성대조군으로서 1% pimecrolimus를 사용하였다. 아토피성 피부염은 인반적으로 Th1 림프구의 양은 거의 변화가 없으나 Th2 림프구는 증가하게 되므로 혈액 내 Th2 활성인자 감소는 아토피성 피부염에 의한 Th1/Th2 림프구의 균형을 이루게 한다.

도 13에서 유제놀, 유제놀아세테이, 캐리요필렌의 혼합물 양 증가에 따라 혈중 Th2 활성인자의 농도가 감소하였다(도 13 참조).

실험예 12 : 아토피성 피부염 동물모델에서 Th1 / Th2 림프구의 조절효과 측정

상기 실험예 5의 방법으로 수득한 비장으로부터 얻은 각각의 T림프구를 FITC로 표지된 항 CD8과 PE로 표지된된 항 CD4 항체를 이용하여 항원 항체 반응을 시킨 후 유세포 분석기를 이용하여 Th1/Th2 림프구의 비율을 측정하였다. 실험군은 군당 10 마리를 사용하였으며 양성대조군으로서 1% pimecrolimus를 사용하였다. 아토피성 피부염은 인반적으로 Th1 림프구의 양은 거의 변화가 없으나 Th2 림프구는 증가하게 되므로 Th1/Th2 림프구의 비율이 무너지게 된다. 따라서 증가한 Th2 림프구의 감소는 아토피성 피부염에 의한 Th1/Th2 림프구의 불균형을 해소하게 된다.

하기 표 1은 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물이 비장의 T 림프구의 구성에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌의 혼합물 양 증가에 따라 Th2 림프구의 수가 감소하였다.

Group	CD4⁺, %	CD8⁺, %	CD4⁺/CD8⁺, %
Normal control	2.82 ± 0.523	1.72 ± 0.302	2.03 ± 0.362
DNCB	6.43 ± 0.702	2.52 ± 0.452	5.63 ± 0.623
DNCB+1% pimecrolimus	3.15 ± 0.356	1.82 ± 0.369	2.13 ± 0.369
DNCB+0.2% SAE	5.94 ± 0.564	2.41 ± 0.362	2.63 ± 0.412
DNCB+1% SAE	5.02 ± 0.632	2.32 ± 0.251	2.03 ± 0.213
DNCB+5% SAE	3.82 ± 0.236	2.08 ± 0.302	1.92 ± 0.152

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims

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정향의 꽃봉오리를 세절하고 탄소수 1 ~ 4의 저급 알콜로 추출하여 여과한 여액을 감압 농축해서 정향 추출물을 얻는 단계;
상기 얻은 정향 추출물을 농축하고 1~10 ℃에서 5 ~ 7일간 정치하여 상층액과 하층액으로 분리해서, 상기 분리한 상층액을 오일성분으로 얻는 단계;
상기 얻은 오일성분을 물에 현탁하고 노르말 헥산으로 분획하여 노르말 헥산 분획물을 얻는 단계; 및
상기 얻은 노르말 헥산 분획물을 감압 농축하여 유제놀, 유제놀아세테이트 및 캐리요필렌을 포함하는 정향유를 분리하는 단계;를 포함하는 정향의 꽃봉오리로부터 유제놀, 유제놀아세테이트, 캐리요필렌을 분리하는 방법.
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