KR101189938B1 - 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물은 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인함으로써 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 치료 및 예방에 유용한 조성물을 제공할 수 있다.

Description

복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물 {Topical Pharmaceutical Composition and cosmetic composition comprising the extract of complex herb an active ingredient for preventing and alleviating allergic or non-allergic skin disease}

본 발명은 부평초, 사상자 및 백부근의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 예방 및 개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Incorvaria C et al., Allergy and the skin Clin Exp Immunol 153 suppl 1:27-29 (2008)

[문헌 2] Anna Paula Galli Snchez, Immunopathogenesis of psoriasis An Bras Dermatol 85(5):747-9 (2009)

[문헌 3] Werfel T, Wittmann M., T cell regulation in allergy, asthma and atopic skin disease Chem Immunol Allergy 94:101-11 (2008)

[문헌 4] Asnis L.A et al., Cutaneous reaction to recombinant cytokine therapy J Am Acad Dermatol 24, 915-926, 1995

[문헌 5] 정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.277~278, 1998

[문헌 6] 정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.416~418, 1998

[문헌 7] 정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.152~154, 1998

외부로부터의 자극과 항원에 대항하기 위하여 피부에는 다양한 면역세포가 존재하며 서로간의 복잡한 네트워크를 형성하며 항상성을 유지한다 (1). 상피조직은 주로 케라티노사이트로 구성되어있고 랑거한스 세포, T 세포와 대식 세포가 존재한다 (2). 대부분의 피부질환은 면역 세포에 의한 염증 반응을 특징으로 하며, 가려움, 부종, 홍반, 습진, 비늘화와 같은 임상 증상을 동반한다. 항원제시세포가 외부로부터 침입한 항원을 인지하면 화학유주인자가 분비되고 호산구와 비만세포가 유입되며, T 세포가 활성화되어 손상 조직으로 모여든다. 활성화된 T 세포로부터 분비되는 특정 사이토카인들이 과 발현되는 것은 피부염의 병리인자로서 작용한다는 것이 알려져 있다 (3). 이들은 가려움을 유발하고 염증세포의 유입을 증가시켜 아토피성 피부염, 접촉성 피부염뿐 만 아니라 건선과 같은 알러지성 혹은 비알러지성 피부 질환을 일으킨다(Incorvaria C et al., Allergy and the skin Clin Exp Immunol 153 suppl 1:27-29 (2008); Anna Paula Galli Snchez, Immunopathogenesis of psoriasis An Bras Dermatol 85(5):747-9 (2009); Werfel T, Wittmann M., T cell regulation in allergy, asthma and atopic skin disease Chem Immunol Allergy 94:101-11 (2008)).

IL-31은 활성화된 T 세포 (Th2 세포에서 더 많이 발현됨)에서 생산되는데 IL-6 사이토카인 가족 (family)에 속한다. IL-31수용체는 gp-130수용체 (GPL, or IL-31RA) 와 oncostatin M receptor (OSMR)로 구성되며, 상피세포와 케라티노사이트에 상시 존재한다. 아토피 피부염 환자의 피부조직에서는 IL-31의 발현이 현저히 증가되어 있으며 IL-4 와 IL-13 같은 Th2 사이토카인 증가를 유도한다고 여겨진다. 이들 Th2 사이토카인은 B 세포에 작용하여 IgE의 생산을 증가 시킬 수 있으며, IgE는 비만세포에 존재하는 수용체에 결합하여 히스타민등의 유리를 매개 함으로서 염증 반응과 가려움증을 일으킨다. 더불어 아토피 피부염 환자의 상피와 케라티노사이트, 환자에서 분리된 대식세포에서 IL-31수용체의 발현이 증가한다고 알려졌다. 또한 IL-31을 생쥐의 피부에 주입하거나 IL-31을 계속 발현하는 transgenic 생쥐는 심한 가려움증을 나타내며 호산구, 비만 세포의 피부 조직으로의 현저한 유입이 관찰되는 바, 피부염을 심화시키는 주요 병리 인자임을 알 수 있다. 한편 T 세포로부터 분비되는 IL-2은 T 세포의 증식을 자극하고 활성화시킨다. IL-2로 치료 받는 암환자의 경우 심한 피부 소양증을 나타내며, 피부 조직의 부종, 홍반, 괴사, 두드러기, 수포등을 형성한다는 것이 알려져 있다 (Asnis L.A et al., Cutaneous reaction to recombinant cytokine therapy J Am Acad Dermatol 24, 915-926, 1995).

부평초(Spirodela polyrrhiza)는 천남성과의 다년생 초본으로서 수면에 뜨는 작은 풀로서 개구리밥에 전초를 부평초라고도 지칭하며, 산화칼륨 및 염화칼륨, 불소 등의 성분이 알려져있고 강심작용, 해혈작용 등에 효과가 있는 것으로 알려진바 있다 (정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.277~278, 1998년).

사상자(Torilis japonica DC)는 대한민국 중북부에 분포하는 미나리과의 일년생 초본인 벌사상자 및 동속 근연식물의 과실을 지칭하며, 피넨(l-pinene), 캄펜(l-camphene), 보르네올(borneol), 이소발레릭 에스테르(isovaleric ester)등 의 성분이 알려져 있으며 항트리코모나스 작용, 성호르몬과 같은 유사작용등의 약효가 알려진 바 있다 (정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.416~418, 1998년).

백부근(Stemona japonica MIQ)은 다년생 초본으로서 중국 원산지이며 백부 및 동속 근연식물의 괴근을 지칭하며 스테모닌(stemonine), 스테모니딘(stemonidine), 이소스테모닌(isostemonine)등의 성분으로 알려져 있으며 향균 작용, 살충작용등의 효능을 가진 것으로 알려진 바 있다 (정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.152~154, 1998년).

본 연구자는 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물 (MJ201)을 NC/Nga 아토피 피부염 생쥐에 경구 투여 하였을 때 가려움증이 현저히 감소하고 피부 조직의 홍반과 부종이 억제 된 것을 확인하였고 epidermis와 dermis의 두께가 증가하는 것을 억제하며 호산구와 비만세포의 유입이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 접촉성 피부염을 유도하며 MJ201을 생쥐에 경구 투여한 결과 IgE 생산이 유의적으로 감소하였으며, 분리된 CD4+ T 세포 로부터 IL-31의 발현과 IL-2의 생산이 감소 하는 것을 확인하였다. 또한 PMA와 ionomycin에 의해 활성화된 EL-4 T 세포의 IL-31발현과 IL-2의 생성이 유의적으로 감소하는 것을 확인 한 바, MJ201은 다양한 피부 질환의 가려움증을 감소시키고 피부염증, 홍반, 부종, 두께 증가와 같은 병리적 손상이 발생하는 것을 억제함으로써 다양한 피부 질환 치료제로 응용할 수 있다.

이에 본 발명자는 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물을 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 부평초, 사상자 및 백부근으로 조성된 생약 추출물(MJ201)의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 부평초, 사상자 및 백부근으로 조성된 생약 추출물(MJ201)의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 복합생약 추출물은 부평초, 사상자 및 백부근의 건조중량비(w/w)가 1~10:1~10:1, 바람직하게는 1~5:1~5:1, 더 바람직하게는 1~3:1~3:1을 포함함을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는“추출물”은 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올, 가장 바람직하게는 60% 내지 90% 에탄올 가용 추출물을 포함한다.

상기 복합생약 추출물은 피부외용 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

본원에서 정의되는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예로는 알러지성 피부질환으로는 과민증, 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품알러지 또는 약품 알러지, 바람직하게는 알러지성 비염, 천식, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 두드러기, 식품 알러지 또는 약품 알러지, 보다 바람직하게는 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염을 들 수 있으며; 비알러지성 피부질환으로는 비알러지성 습진 (자극성 피부염, 지루성 피부염, 화폐성 습진, 울체성 피부염, 만성 단순성 태선, 한포진, 노인성 습진), 원발성 단순 접촉성 피부염, 완선, 건선 등, 바람직하게는 자극성 피부염 또는 지루성 피부염을 포함한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

예를 들어, 건조상태의 부평초, 사상자 및 백부근 약제를 건조중량비(W/W)가 1~10:1~10:1~10, 바람직하게는 1~5:1~5:1~5, 더 바람직하게는 1~3:1~3:1~3 비율로 혼합하는 제 1단계; 상기 혼합물 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 1 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올, 보다 바람직하게는 60-90% 에탄올 혼합용매로, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 60℃ 온도에서 약 1 내지 48시간, 바람직하게는 12시간 내지 36시간 동안 추출하는 제 2단계; 제 2단계를 약 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복하는 제 3단계; 이를 여과농축 및 동결 건조시키는 제 4단계를 포함하는 제조방법을 통해 본 발명의 복합 생약 추출물을 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 복합생약들은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 복합생약 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 첩포 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 복합생약 추출물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 복합생약 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 복합생약 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물은 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인하여 알러지 질환의 치료 및 예방에 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 복합생약 추출물은 미백 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5% 중량, 보다 바람직하게는 0.01 - 3% 중량로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 복합생약 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물은 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인함으로써 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 치료 및 예방에 유용한 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 NC/Nga 마우스에서 귀피부의 조직학적 검사결과이며, 동물에게는 식염수(Naive) 또는 MJ201(250mg/kg/day)을 6주간 투여하고. 귀 생검을 염증성 세포 및 비만세포를 검사하기 위하여 염색법(hematoxylin and eosin (H&E) (left panel) 및 toluidine blue (right panel))을 수행하고 염색된 조직을 밝은 현미경(Nikon,Japan,orignalmagnification,x200)으로 관찰한 것이며(a; Naive, b; Control, c; CsA, d; MJ201);
도 2는 NC/Nga 마우스에서 등피부의 조직학적 검사결과이며, 동물에게는 식염수(Naive) 또는 MJ201(250 mg/kg/day)을 6주간 투여하고. 등 피부 생검을 염증성 세포 및 비만세포를 검사하기 위하여 염색법(hematoxylin and eosin (H&E) (left panel) 및 toluidine blue (right panel))을 수행하고 염색된 조직을 밝은 현미경(Nikon,Japan,orignalmagnification,x200)으로 관찰한 것이며(a; Naive, b; Control, c; CsA, d; MJ201);
도 3은 NC/Nga 마우스에서의 긁는 행동에 대한 MJ201의 효과를 나타낸 결과이며, 긁은 행동을 20분간 긁는 행위 발생수를 판독한 것이며(* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001);
도 4는 NC / Nga 마우스 피부에서의 IL -31에 대한 추출물의 효과를 나타낸 도이며, IL-31 및 β-actin mRNA 의 발현 수준을 RT-PCR으로 측정한 도이며;
도 5는 CD4 + T 세포에서의 IL -31 mRNA 발현에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, 동물들은 접촉성 피부염을 유발시키기 위하여 DNCB 로 처치하고 연속 4일간 식염수 (Naive) 또는 MJ201 (250mg/kg/day) 을 투여하고, CD4+ T 세포들 비장으로부터 분리하고 6시간동안 항(anti)-CD3 및 항(anti)-CD28 항체로 자극하고 IL-31 mRNA 수준을 정량적 실시간 (real-time) PCR으로 특정한 것이며;
도 6는 CD4 + T 세포에서의 IL -2 생산에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, MJ201 (250㎎/㎏/day)을 4일간 BALB/c 마우스에 경구투여하고, 동물들을 익일에 희생시키고 CD4+ T 세포를 분리하고 6시간 동안 항(anti)-CD3 및 항(anti)-CD28 항체로 자극하고 배양 상등액에서의 IL-2 수준을 ELISA로 측정하였으며;
도 7는 IgE 생성에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, IgE 의 혈청 수준을 ELISA로 측정하였으며, 개개 막대(bar)는 IgE 수준의 혈중 평균(mean S.E.M.)을 표시한 것이며(* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001);
도 8는 활성화된 EL -4 T 세포에서 IL -31 mRNA 발현에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, EL-4 T 세포는 60 ㎍/㎖의 MJ201으로 1시간 동안 전처리하고, 6시간 동안 PMA (50ng/㎖) 및 이노마이신(Ionomycin; 0.25μM)으로 자극시키고, IL-31 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR으로 측정하고;

도 9는 활성화된 EL -4 T 세포에서 IL -2 생산에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, EL-4 T 세포는 60㎍/㎖의 MJ201으로 1시간 동안 전처리하고, 6시간 동안 PMA (50ng/㎖) 및 이노마이신(Ionomycin; 0.25μM)으로 자극시키고, IL-2 생산 수준을 정량적 실시간 PCR으로 측정한 것이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 식물추출물 MJ201의 제조

삼각 플라스크에 허브포유사(http://www.herbforyou.net, Daejeon, Korea)에서 구입한 건조상태의 3가지 약제를 동등한 비율로 혼합하였다. 이 약제혼합물 300 g에 95% 에탄올과 증류수를 80 : 20으로 혼합한 80% 에탄올로 실온에서 1일간 방치하여 추출하였다. 이 같은 방법으로 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 여과한 후 회전식감압농축기 (Rotary evaporator)를 이용하여 감압농축 시킨 후 냉동 건조한 후 생약의 에탄올 추출물 70g을 얻고 MJ201이라 명명하였다. MJ201은 파우더 형태로 -20℃에 보관하였다.

참고예 1. 재료 및 방법

1. 재료

(1) 동물 및 세포주

NC/Nga 생쥐 (Male, 6주령), BALB/c 생쥐 (Female, 4주령)는 대한바이오링크(Korea)에서 구입하였으며, 고형사료 (삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 실온 22 ± 2℃, 습도 50~70%, 조명시간 12시간 (08:00～20:00), 조도 150～300Lux로 설정하여 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. EL-4 T lymphoma 세포는 한국세포주은행 (Seuol, Korea)에서 구매하였으며 RPMI 1640에 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin 100U/㎖, streptomycin 100㎍/㎖를 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

(2) 시약 및 기기

1) 시약

본 실험에 사용된 시약으로 MJ201(허브포유), anti-CD3/anti-CD28 (BDbiosciences Co., Korea), Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), Ionomycin, 이소프로판올, 클로로포름(Sigma Co., U.S.A), Trizol, DEPC water (Invitrogen Co., U.S.A), VarioMACS(Miltenyi Biotec Co., Germany), SYBRPCR Master Mix, TaqManExpression Master Mix(Applied Biosystems Co., U.S.A), Prime Script™RT reagent kit (TAKARA Co., JAPAN), Maxime PCR PreMix Kit(iNtRON Biotechnology Co., Korea), IgE ELISA kit for mouse (SAIBAYAGI Co., Itd. JAPAN), RPMI-1640, dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), fetal bovine serum (FBS), penicillin and streptomycin은 Gibco사 제품을 사용하였다.

2) 기기

본 실험에 사용된 기기는 Microplate spectrophotometer (Molecular Devices,U.S.A), CO₂ 배양기(incubator; FormascientificCo.,U.S.A), cleanbench(VisionscientificCo.,Korea), autoclave(Sanyo,Japan), micro-pipet(Gilson,France), waterbath(VisionscientificCo.,Korea), vortexmixer(VisionscientificCo.,Korea), real-time PCR (Applied Biosystems Co., U.S.A), centrifuge (Sigma Co., U.S.A), Microscopy (Nikon, JAPAN) 등을 사용하였다.

실험예 1. NC/Nga 아토피 피부염에 미치는 효과실험

상기 실시예에서 수득한 시료의 경구 투여가 NC/Nga 아토피 피부염에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.(Matsuda, H et al., Development of atopic dermatitis like skin lesions with IgE hyperproduction in NC/Nga mice. Int Immunol. 9, 461-466, 1997)

(1) 아토피 피부염 모델 (NC/Nga 생쥐)

1) Nc/Nga 생쥐에서 피부염 유도 및 시료처리

6주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단 부까지 전체를 제모 한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치 하였다. 1% TNCB 용액 (아세톤 : 올리브오일 = 3 : 1 ) 100㎕를 제모 한 부위에 도포하고, 1주 후 0.2% DNCB 용액을 3주 동안 100 ㎕ 처리하였다. 실험은 4개의 그룹으로 나누고, 정상군, 대조군에는 생리식염수를, 양성대조군인 CsA 투여군은 격일로 12.5㎎/㎏의 용량으로 복강 주사하였으며, 실험군에는 MJ201을 250㎎/㎏의 용량으로 매일 5주간 경구 투여하였다.

2) 조직 검사

실험 종료 후에 귀 끝부분, 등 피부를 떼어내어 10% paraformaldehyde에서 24시간동안 고정하였다. 그 조직을 파라핀으로 포맷하였고, 5㎛ 두께로 block을 만들었다. Hematoxyline and Eosin(H&E)염색법을 이용하여 epidermis, dermis, keratinocytes, neutrophils/eosinophil을 염색하였으며, 톨루이딘 블루(toluidine blue)염색법을 이용하여 비만세포의 침윤을 관찰 하였다.

3) 피부 조직에 미치는 효과

MJ201이 아토피 피부염에 미치는 효과를 조사하기 위하여 NC/Nga 생쥐의 등에 TNCB를 처리하여 피부염을 유발하면서 6주간 매일 250mg/kg의 용량으로 경구 투여하였다. 실험 종료 후 귀의 일부와 등 피부를 절단 한 후 H&E 염색과 toluidine 염색을 실시하였다. H&E 염색에서 대조군의 epidermis와 dermis는 부종으로 현저하게 확장되었고, 백혈구 침윤도 관찰 되었다 (Fig. 1. b and Fig. 2. b). 이에 비해 MJ201 투여군은 대조군에 비하여 epidermis와 dermis의 두께가 감소되고 백혈구의 침윤도 억제되었다 (도 1. d 및 도 2. d). Toluidine 염색법에 의하여 비만세포를 염색하였을 때, 대조군에서는 dermis 주변에 비만세포가 현저히 침윤한 것을 관찰 할 수 있었다 (도 1. f 및 도 2. f). 반면에 MJ201 투여군에서는 그림에서 나타난 바와 같이 비만 세포를 거의 관찰 할 수 없었다 (도 1. h 및 도 2. h).

실험예 2. 소양증에 미치는 효과실험

상기 실시예에서 수득한 시료의 경구 투여가 소양증에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 긁는 행위(Scratching behavior) 평가 실험을 실시하였다 (Oku H, Ishiguro, K Antipururitic and antidermatitic effects of extract and compounds of Impatients bal Samin L in atopic dermatitis model NC mice Phytother Res 15, 506-510, 2001; Grimstad O et al., Anti-interleukin 31-antibodies ameliorate scratching behavior in NC/Ngamice; a model of atopic dermatitis Exp Dermatol 18(1), 35-43, 2009).

소양증에 미치는 효과를 측정하기 위하여 MJ201를 투여 후 20분 동안 몸을 긁는 회수를 세어서 scratching behavior로 나타내었으며 일주일에 1번씩 5주 동안 관찰하였다 (단, 핥는 행위는 제외).

가려움증에 미치는 효과

소양증에 미치는 효과를 조사하기 위하여 MJ201 투여 후 20분간 긁는 횟수를 측정하였다. 실험 기간이 경과함에 따라 정상군, 대조군, 양성 대조군, 생약, 모든 군에서 긁는 횟수가 증가하는 것을 관찰 할 수 있었으며 4주차에 그 수치가 최고치에 이르렀다. 정상군은 20분당 약 20번이 관찰 되었고, 대조군에서는 약 40번으로 그 수치가 현저히 증가되었으며, 양성대조군인 CsA(CyclosporinA) (Calbiochem, La Jolla, CA. USA) 투여군에서는 약 30번, MJ201 투여군에서도 30번으로 양성 대조군과 비슷한 수준으로 가려움증이 감소한 다는 것을 확인하였다.

실험예 3. NC / Nga 생쥐의 피부 조직에서 IL -31 mRNA 발현에 미치는 효과실험

상기 실시예에서 수득한 시료의 NC/Nga 생쥐의 피부 조직에서 IL-31 mRNA 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 RT-PCR 실험을 실시하였다 ( Takaoka A, Arai I et al., Expression of IL-31 gene transcripts in NC/Nga mice with atopic dermatitis Eur J Pharmacol 516(2), 180-181 2005).

NC/Nga 생쥐의 귀 피부 조직을 떼어내어 Trizol 시약을 500㎕을 넣고 튜브에 넣은 후 클로로포름을 100㎕ 넣은 후 잘 섞었다. 원심분리하여 층이 분리되면 aqueous phase 용액을 200㎕ 취해서 튜브에 옮긴 후, 동량의 이소프로판올을 넣어 상온에서 10분간 방치한 후 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 75% 에탄올을 1㎖ 넣어 잘 섞어준 후 원심분리하여 생등액을 완전히 제거하고 투명해질 때까지 말린 후 DEPC water로 RNA의 양에 따라 20~50 ㎕ 넣어 녹였다. RNA를 정량 하여 200ng/㎕로 맞춘 후 Prime Script™RT reagent kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다. cDNA를 만든 후 Maxime PCR PreMix Kit에 cDNA를 넣은 후 94℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초로 25~30회 RT-PCR을 하였다 (표 1 참조).

Mouse IL-31 primer sets
forward;	5’- TCGGTCAT AT GC CA CTGGAG -3’
reverse;	5’- GCACAGTC CTTTGGAGTTAAGTC -3’
Mouse β-actin primer sets
forward;	5’- CGGGGACCTGACTGACTACC -3’
reverse;	5’- AGGAAGGCTGGAAGAGTGC -3’

NC / Nga 생쥐의 피부 조직에서 IL -31 mRNA 발현에 미치는 효과

피부 조직으로부터 mRNA를 분리하여 IL-31의 발현 정도를 비교 한 결과, 대조군에서는 정상군에 비하여 그 발현 양이 현저히 증가하였고, 양성 대조군인 CsA 투여군은 IL-31 mRNA 발현이 현저히 억제되었으며, MJ201 투여군에서도 IL-31 mRNA 발현이 억제되었다.

실험예 4. 접촉성 피부염 모델 실험

상기 실시예에서 수득한 MJ201 추출물의 경구 투여가 접촉성 피부염 생쥐의 면역계에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 접촉성 피부염 모델 실험을 실시하였다 (손미예, 남상해, 두충 추출물이 DNCB로 유발된 알레르기성 접촉피부염과 산화적 손상에 미치는 영향. 한국식품영양과학회지 36(12), 1517-1522, 2007; 임금선등 BALB/c 및 Nc/Nga 마우스의 아토피성 피부 질환 모델에서 생약조성물 SPZZC의 치료 효능. 약학회지 52(3), 232-239, 2008).

4-1. BALB /c 생쥐의 피부염 유도 및 시료처리

4주령이 된 BALB/c 생쥐의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치 하였다. 0.5%의 DNCB용액 (아세톤 : 올리브오일 = 4 : 1) 200㎕를 제모한 부위에 도포하고, 5일 후 1%의 DNCB용액 100㎕를 귀에 도포하여 피부염을 야기하였다. 실험은 5 마리씩 3개의 그룹으로 나누고, 정상군, 대조군에는 생리식염수를, 실험군으로 MJ201 (250㎎/㎏/day)을 1일 1회씩 4일 동안 각각 경구 투여하였다.

4-2. 혈청 내 IgE 생산량 측정

투여 처치 종료 후 ether로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 다음 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 내 IgE 생성량 측정은 ELISA kit를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 항체가 coating되어 있는 microwell을 3회 washing 완충 용액으로 세척한 후 혈청 (10배 희석) 50㎕씩 분주하였다. 이를 2시간 동안 실온에서 반응 시키고 washing 완충 용액으로 3회 세척한 다음 biotin-conjugated antibody 50㎕로 실온에서 2시간 처리하고 HRP-avidin용액 50㎕로 다시 1시간 반응 시킨 후 세척하였다. 여기에 TMB기질 (chromogenic substrate)을 50㎕씩 분주하고 암소에서 20분간 방치한 다음 50㎕의 stop 용액을 처리하였다. 반응 용액은 ELISA reader 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

4-3. Splenocyte CD4 + T cell 분리

MJ201을 4일 동안 투여한 후 이틀 후에 BALB/c 마우스를 경추 탈구하여 치사시킨 후, 비장을 무균적으로 적출하여 빙냉의 RPMI 배지에 나일론 체 (70uM) 위에서 비장 조직을 갈아서 면역세포를 방출시켰다. 세포 현탁액을 원심분리한 후 세포침전물에 RBC lysis buffer를 가하여 적혈구를 용혈 시킨 후, PBS로 2회 세척하고 RPMI 1640-FBS (10% FBS 함유된 RPMI-1640) 배지를 이용하여 세포 농도를 1×10⁷cells/㎖ 조정하여 세포용액을 조제하였다.

이 세포액에 MACS CD4+T cell kit지시에 따라 biotin-antibody cocktail과 anti-biotin microBeads, MACS buffer를 넣고 반응 시킨 후 MACS Column에 세포를 로딩하여 CD4+ T cell을 얻었다. 이를 2×10⁶cells/㎖로 조정하여 6well에 2 ㎖씩 분주한 후 anti-CD3/anti-CD28과 함께 37℃, 5% CO₂배양기에서 6시간 배양하였다.

4-4. Real - time PCR

Splenocyte CD4+ T cell를 6 well에 2×10⁶cells/㎖로 분주한 후 anti-CD3/anti-CD28으로 6시간 동안 자극한 뒤 세포를 얻었다. EL-4 T cell 1×10⁶cells/㎖로 60mm 플레이트에 4 ㎖씩 분주한 후 MJ201을 60㎍/㎖로 처리하고 1시간 후에 PMA(50ng/㎖)와 ionomycin(0.25μM)으로 자극한 뒤 6시간 후에 세포를 얻었다. RT-PCR과 동일한 방법으로 cDNA를 만든 후 IL-31, GAPDH primer를 적정농도로 각각 희석하여 넣고, Power SYBR Green PCR Master Mix, TaqManExpression Master Mix와 cDNA를 넣은 후 real-time PCR을 95℃ 10분 실행 후 95℃ 15초, 60℃ 1 분으로 40회 실행시켰다 (표 2 참조).

Mouse IL-31 primer sets
forward;	5’- ATACAGCTGCCGTGTTTCAG -3’
reverse;	5’- AGCCATCTTATCACCCAAGAA -3
Mouse GAPDH Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (Applied Biosystems Co., U.S.A, Cat. No. 435239E)

4-5. 통계 처리

각 실험군 결과 값은 통계프로그램(unpaired student's T-test)을 사용하여 통계 처리하였으며, P<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다 (* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001).

상기한 바와 같은 실험 결과,

4-6. CD4 + T cell 에서 IL -31 mRNA 및 IL -2 생산에 미치는 효과,

DNCB를 피부에 도포하여 접촉성 피부염을 유발한 생쥐의 비장으로부터 CD4+ T 세포를 분리하고 mRNA를 얻은 후, IL-31의 발현 정도를 비교 한 결과, 대조군 에서는 정상군에 비하여 그 발현 양이 현저히 증가하였고, MJ201을 투여한 군에서는 IL-31 mRNA 발현이 억제되었다 (도 5). DNCB를 피부에 도포하여 접촉성 피부염을 유발한 생쥐의 비장으로부터 CD4+ T 세포를 분리하고 anti-CD3 와 anti-CD28로 활성화된 CD4+ T 세포의 상층액을 얻은 후, IL-2의 생성 정도를 비교 한 결과, 대조군은 정상군에 비해 IL-2의 생산이 2배 정도 증가 하였고, MJ201 투여군에서는 IL-2 생산이 감소하여 정상군과 비슷한 정도로 나타났다 (도 6 참조).

4-7. IgE 생산량에 미치는 효과

대조군의 혈청 중 IgE의 농도는 651.79 ± 46.68ng/㎖으로 정상군(319.47 ± 58.44ng/㎖) 보다 유의적으로 증가하였고, MJ201 투여군은 362.76 ± 62.56ng/㎖으로 유의적으로 감소하였다.

4-8. MJ201의 T 세포 활성 억제 작용

(1) EL-4 T cell에서 및 IL-2의 생성에 미치는 효과

PMA와 Ionomycin으로 활성화된 EL-4 T 세포에 MJ201(60㎍/㎖) 을 처리하여 mRNA를 얻은 후, IL-31의 발현 정도를 비교 한 결과, PBS만을 처리한 정상 세포에 비하여 PI를 처리한 대조군에서는 IL-31의 발현 양이 현저히 증가하였고, MJ201을 처리한 세포에서는 IL-31 mRNA 발현이 억제 되었다 (도 8). PMA와 Ionomycin으로 활성화된 EL-4 T 세포에 MJ201을 처리하여 상층액을 얻은 후, IL-2의 발현 정도를 비교 한 결과, 대조군은 정상군에 비해 IL-2의 발현이 증가 하였고, MJ201 투여군은 대조군보다 유의적으로 감소하였다 (도 9).

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 부평초, 사상자 및 백부근으로 조성된 생약 추출물 (MJ201)의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
7. 제 6항에 있어서
   상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 또는 팩의 제형인 조성물.
   
   
   
   
   

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