BRPI0419105B1

BRPI0419105B1 - Uso de alfa-humuleno

Info

Publication number: BRPI0419105B1
Application number: BRPI0419105-6A
Authority: BR
Inventors: Luiz F. Pianowski; João B. Calixto; Dagoberto de C. Brandão
Original assignee: Aché Laboratórios Farmacêuticos S.A.
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2004-10-01
Publication date: 2006-04-13
Also published as: JP2008514649A; ATE518531T1; BRPI0419105B8; EP1809268B1; CA2577219A1; MX2007002116A; US20080280996A1; EP1809268A1; WO2006037194A1; BR122016029094B1; BRPI0419105A; AR048806A1

Abstract

usos de cariofilenos ou composições que compreendem cariofilenos, método de tratamento de condições inflamatórias e dores inflamatórias, método de inibição e composição que compreende cariofileno a presente invenção refere-se ao uso de cariofilenos relativos a medicamentos e ao tratamento de condições corpóreas de inflamações e dores inflamatórias.

Description

(54) Título: USO DE ALFA-HUMULENO (73) Titular: ACHÉ LABORATÓRIOS FARMACÊUTICOS S.A., Empresa Brasileira. Endereço: Rodovia Presidente Dutra Km 222,2, Guarulhos, SP, BRASIL(BR), 07034-904 (72) Inventor: LUIZ F. PIANOWSKI; JOÃO B. CALIXTO; DAGOBERTO DE C. BRANDÃO

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 02/10/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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USO DE ALFA-HUMULENO

CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção refere-se ao uso de cariofileno alfa-humuleno relacionado a medicamentos e ao tratamento de condições corpóreas de inflamações e dores inflamatórias. A presente invenção refere-se especificamente ao uso de cariofileno alfa-humuleno na fabricação de medicamentos para o tratamento de condições inflamatórias do corpo de animais, incluindo o corpo humano. A presente invenção também se refere ao uso de cariofileno alfa-humuleno para o tratamento de condições inflamatórias do corpo, incluindo dores inflamatórias e edema.

ANTECENDENTES DA INVENÇÃO [0002] Cariofilenos são compostos químicos conhecidos, úteis em várias aplicações. A patente US 3.987.008, por exemplo, revela derivados sesquiterpênicos como agentes modificadores de odor e sabor; em J. Nat. Prod. julho de 1992; 55 (7): 999-1003, beta-cariofileno e alfa-humuleno são mencionados como agentes anticarcinogênicos potenciais; no pedido de patente WO 92/18001, alfa- e beta- humuleno e (-)-beta-cariofileno são mencionados no controle de espécies de moscas brancas; na patente US 5.314.693, alfa-humuleno é mencionado como um repelente de nematóides dos pinheiros; no pedido de patente WO 02/078719, alfa- e beta-cariofilenos são compreendidos em composições antitumorais.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0003] A presente invenção refere-se, em um aspecto específico, ao uso novo e útil de cariofilenos,

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2/19 mais especificamente alfa-humuleno, como antiinflamatório e analgésico, em um sentido amplo. Em um sentido mais especifico, os compostos foram considerados inibidores úteis de entidades que conhecidamente estão envolvidas no processo inflamatórios:

citocinas pró-inflamatórias IL-Ιβ (interleucina 1β) e TNFoí (fator de necrose tumorosa a) ;

- PGE2 (prostaglandina E2); e expressão de enzimas COX-2 (cicloxigenase 2) e iNOS (sintase de óxido nítrico indutível).

[0004] Um exemplo específico de cariofileno de acordo com a presente invenção é alfa-humuleno, sesquiterpeno identificado com registro CAS (Serviço de Resumo Químicos) número 6753-98-6, também conhecido como alfa-cariofileno, representado pela estrutura a seguir:

[0005] Outro exemplo específico de cariofileno não de acordo com a presente invenção é o trans-cariofileno (ou beta-carifileno), outro sesquiterpeno, indentifiçado com registro CAS (Serviço de Resumos Químicos) n° 87-44-5, representado pelas estruturas alternativas A e B a seguir:

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Trans-cariofileno

Estrutura A

Trans-cariofileno

[0006] Segundo o significado empregado no presente, a menção aos cariofilenos, objetos da presente inclui as moléculas como tais, seus sais, metabólitos, pró-drogas, solvatos (incluindo invenção, isômeros, hidratos) adutos.

[0007]

Terpenos, incluindo sesquiterpenos, são frequentemente mencionados como componentes de misturas complexas extraídas de plantas, em que (conforme conhecido pelos técnicos no assunto) não se determina qual(is) composto(s) é(são) eficaz(es), qual a extensão da sua eficácia e se eles são ativos por si próprios, por meio de veículo/solvente que a composição contém (água, álcool, outros solventes, sias misturas etc.) ou por meio de sua interação com outros componentes nas misturas. Terpenos individuais intrinsecamente, de origem natural ou produtos de síntese ( tais como J.Am. Chem. Soc., 99, 3864 (1977)), são raramente mencionadas como agentes farmacêuticos eficazes. Alía-humuleno chegou mesmo a ser mencionado como como virtualmente inativo com relação aos efeitos antiinflamatórios ou quimioterapêuticos (referência: Carcinnogenesis (2002), 23 (5), 795,802).

[0008] O depositante descobriu agora que cariofilenos, particularmente alfa-humuleno, possuem

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4/19 notáveis efeitos antiinflamatórios, incluindo para dores inflamatórias, neles compreendidos o efeito inibidor sobre a podução de citocinas pró-inflamatórias IL-1 β e TNFa, prostaglandina PGE2 ou a expressão das enzimas COX-2 e iNOS.

[0009] O depositante também descobriu que cariofilenos, particularmente alfa -humuleno, possuem efeitos antialérgicos, particularmente anti-histamínicos.

[0010] Os cariofilenos de acordo com a presente invenção são parte da busca contínua de drogas com atividade inflamatória direta ou indireta, que inibem os processos fisiopatológicos envolvidos na inflamação. Eles são utilizados no controle de doenças crônicodegenerativas, tais como artrite reumatóide, osteoartrite, lupus eritematose sistêmico, colite ulcerativa, psoríases, eczema atópico, arteriosclerose e outras doenças não degenerativas, tais como depressão, celulite e alergias.

[0011] Um dos objetos da presente invenção é, portanto, o uso de cariofilenos, particularmente alfahumuleno, ou composições que compreendem cariofilenos, na fabricação de medicamento para o tratamento de condições inflamatórias do corpo dos animais, particularmente do corpo humano.

[0012]	Outro	objeto da presente	invenção	é o
uso de cariofilenos, particularmente alfa	-humuleno,	ou
composições que	contêm	cariofilenos, no	tratamento	de

condições inflamatórias do corpo dos animais, particularmente do corpo humano.

[0013] Outro objeto da presente invenção é método de tratamento de condições inflamatórias do corpo

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5/19 dos animais, particularmente do corpo humano, que compreende a administração de quantidade terapeuticamente eficaz de cariofilenos, particularmente alfa-humuleno, a um paciente.

[0014] Outro objeto da presente invenção é o uso de cariofilenos, particularmente alfa -humuleno, ou composições que contêm cariofilenos, para a inibição da produção corporal de um ou mais dentre citocina IL-1 β, citocina TNFoí, prostaqlandina PGE2 e expressão de enzimas COX-2 e iNOS.

[0015] O cariofileno de acordo com a presente invenção, bem como as composições que compreendem o cariofileno de acordo com a presente invenção, pode ser administrado ao paciente necessitado de tratamento de qualquer forma adequada, enteral ou parenteral, incluindo oral, tópica, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, por meio de infiltração, por inalação, transdérmica, transmucosa, intramuscular, intrapulmonar, vaqinal, retal, intraocular e sublinqual. Formas particularmente adequadas de administração de acordo com a presente invenção são sistêmicas (infiltração, oral, inalação por pulverização, transdérmica) e locais. O cariofileno de acordo com a presente invenção pode estar compreendido em composição de liberação lenta ou controlada. Adjuvantes e excipientes conhecidos podem ser utilizados nas composições. Referência para formas de dosaqem farmacêutica úteis para as composições relativas à presente invenção podem ser encontradas na publicação Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishinq.

[0016] As composições que compreendem

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6/19 cariofileno podem ser administradas a pacientes na forma de sólidos, líquidos ou semilíquidos, pastilhas, cápsulas, pílulas, pó, grânulos, suspensões, emulsões, dispersões e qualquer outra forma conhecida útil.

[0017] As composições poderão conter agentes ativos adicionais, tais como antibióticos, dependendo do efeito desejado.

[0018] Para administração oral na forma de pastilhas ou cápsulas (tanto cápsulas duras quanto moles), o cariofileno pode ser combinado com veículos inertes farmaceuticamente aceitáveis, tais como lactose, amido, sacarose, glicose, metil celulose, estearato de magnésio, fosfato dicálcico, fosfato de cálcio, manitol, sorbitol e similares; para administração oral na forma líquida, os cariofilenos podem ser combinados com etanol, glicerol, água e similares. Quando desejado ou necessário, agentes aglomerantes, agentes lubrificantes, agentes desintegrantes, cor e fragrância podem ser adicionados à mistura. Os agentes aglomerantes comuns são glicose, βlactose, adoçantes de milho, gomas naturais ou sintéticas tais como goma arábica, tragacanto ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietileno glicol, cera e similares. Os lubrificantes incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio e cloreto de sódio. Os desintegrantes incluem amido, metil celulose, agar, bentonita, goma xantana e similares.

[0019] As composições indicadas na presente invenção podem também ser administradas como lipossomos ou acopladas a polímeros solúveis na forma de veículos.

[0020] Formas de dosagem líquida para

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7/19 administração oral podem compreender corantes e edulcorantes para aumentar a aceitação pelos pacientes. Veículos aceitáveis para formas de dosagem aquosa são água, óleo apropriado, solução salina, dextrose aquosa, outras soluções de açúcar e glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicóis, tampão de fosfato.

[0021] As composições relativas à presente invenção compreendem tipicamente cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg de um ou mais cariofilenos, particularmente cerca de 10 a 200 mg e, mais especificamente, cerca de 30 a 100 mg. Nessas composições, o cariofileno representa cerca de 0,1 a 99% em peso, particularmente cerca de 1 a 70% e, mais especificamente, cerca de 10 a 40%, compreendendo opcionalmente pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0022] A Figura 1 se refere a um gráfico que compara a inibição da dor obtida por alfa-humuleno com a administração de paracetamol. Cada ponto representa a média de cinco animais e as barras verticais são os desvios padrões médios.

[0023] A Figura 2 se refere a um gráfico que compara a inibição do volume do edema por meio de administração de alfa-humuleno ou trans-cariofileno, com inibição obtida através da administração de dexametasona (0,5 mg/kg, injetada por via subcutânea quatro horas antes do teste) e utilizada como controle positivo. Os intervalos de momentos de medição do volume do edema foram de 30, 60, 120 e 240 minutos, 24 e 48 horas. Cada ponto representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o

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8/19 desvio padrão médio.

[0024] A Figura 3 se refere a gráficos (3A e 3B) que comparam a inibição do volume do edema por meio de administração de alfa-humuleno (3A) ou trans-cariofileno (3B). Os intervalos de tempo de medição do volume do edema foram de 10, 20, 30, 60 e 120 minutos, 24 e 48 horas. Cada ponto representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio padrão médio.

[0025] A Figura 4 compara a inibição do volume do edema por meio da administração de alfa-humuleno. Os intervalos de tempo de medição do volume do edema foram de 10, 20, 30, 60 e 120 minutos, 24 e 48 horas. Cada ponto representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio padrão.

[0026] A Figura 5 se refere a gráficos que comparam a inibição do volume do edema por meio da administração de alfa-humuleno (5A) e trans-cariofileno (5B) . Os intervalos de tempo de medição de edema foram de 30, 45, 60 e 120 minutos. Cada ponto representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio padrão.

administração tópica cariofileno (6B). A [0027] A Figura 6 se refere a gráficos que comparam a inibição do volume do edema por meio da de alfa-humuleno (6A) e transmedição do volume do edema foi realizada após a aplicação de ungüento com teor de 0,025%, 0,05%, 0,1% e 0,2% de cariofileno, em comparação com o volume de edema causado pela aplicação de fenidona e ácido araquidônico (C) . Cada ponto representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio

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9/19 padrão .

[0028] A Figura 7 se refere a um gráfico (em que cada resultado representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio padrão) que compara a inibição da produção de citocina inflamatória IL-Ιβ induzida por carragenina nas patas de ratos.

[0029] A Figura 8 se refere a um gráfico (em que cada resultado representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio padrão) que compara a inibição da produção de citocina inflamatória TNFa induzida por carragenina nas patas de ratos.

[0030] A Figura 9 se refere a um gráfico (em que cada resultado representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio padrão) que compara a inibição do crescimento do nível de PEG2 induzido por carragenina nas patas de ratos, por meio de administração de alfa-humuleno e trans-cariofileno, em comparação com o efeito obtido por meio do tratamento com dexometasona.

[0031] A Figura 10 se refere a um gráfico (em que cada resultado representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio padrão) que compara a inibição da expressão das enzimas COX2, obtida por meio da administração de alfa-humuleno e trans-cariofileno, quando avaliada no tecido subcutâneo ou na pata injetada com carragenina, em comparação com a expressão de COX2 induzida por carragenina obtida por meio de tratamento com dexometasona.

[0032] A Figura 11 se refere a um gráfico (em que cada resultado representa a média de cinco animais e as barras verticais indicam o desvio médio padrão) que compara

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10/19 a inibição da expressão das enzimas iNOS, obtida por meio da administração de alfa-humuleno, quando avaliada no tecido subcutâneo ou na pata injetada com carragenina, em comparação com a expressão de iNOS induzida por carragenina obtida por meio de tratamento com dexometasona.

EXEMPLOS [0033] Os exemplos que se seguem representam realizações particulares da presente invenção e não impõem nenhuma limitação à sua extensão, que é limitada apenas pelas reivindicações anexas ao presente.

EXEMPLO 1

Nocicepção Inflamatória Induzida por Carragenina [0034] A metodologia de avaliação utilizada nestes testes é descrita por Vaz et al. em J. Pharmacol. Exp. Ther. 278: 304-312, 1996.

[0035] Camundongos machos (25 a 35 g) foram tratados sistemicamente (oralmente) com alfa-humuleno, 50 mg/kg, administrados uma hora antes do experimento. Animais tratados com solução salina a 0,9% (0,1 ml/10 g) foram utilizados como controle. Outro grupo de animais foi tratado com paracetamol (600 mg/kg, por via oral, administrado uma hora antes do tratamento), que foi utilizado como controle positivo. Para a indução de dor inflamatória, os animais receberam injeção intraplantar de 0,05 ml de carragenina (300 J.tg por pata) na superfície da planta da almofada da pata direita. Esta dosagem causa edema, nocicepção e inchaço substancial da pata injetada.

[0036] A nocicepção foi avaliada com filamento Von Frey (0,4 g) após três, quatro e seis horas. Para obter reação básica, os animais foram testados previamente no dia

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11/19 anterior com o filamento von Frey de 0,4 g. Somente animais com reação de cerca de 20% foram selecionados. O filamento foi aplicado à almofada da pata direita, atendendo aos critérios de (1) a aplicação foi perpendicular à superfície da planta, com pressão suficiente para causar a dobra do filamento, de forma a obter pressão total; (2) os animais foram avaliados quando as quatro patas estavam tocando a tela; (3) a reação de retirada da pata foi considerada quando o animal removeu a pata completamente da tela de suporte; (4) cada animal foi estimulado por dez vezes consecutivas, em que cada estímulo durou um segundo; e (5) cada evento de retirada da pata foi considerado 10% da reação, com dez eventos de retirada correspondendo a 100% de reação.

[0037] A Figura 1 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, cariofileno como alfahumuleno reduziu a nocicepção inflamatória, como resultado da redução da inflamação, tanto quanto o analgésico conhecido, paracetamol.

EXEMPLO 2

Edema de Carragenina em Patas de Camundongos [0038] O teste utilizado abaixo é descrito por Cunha et ai na publicação Life Sei. 70: 159-169, 2001 .

[0039] Camundongos machos de 25 g a 35 g foram levemente sedados com éter e receberam injeção de 50 μΐ de solução salina contendo carragenina (300 μΙ/pata) na pata direita. A pata esquerda recebeu o mesmo volume de solução salina e foi tomada como controle negativo. O inchaço foi medido com pletismômetro (fabricante: Ugo Basile, Itália) ao longo de vários intervalos de tempo após a injeção do

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12/19 agente flogístico. A diferença entre os volumes da pata direita e da esquerda foi quantificada (em ml) e tomada como índice de edema. Uma hora antes do teste, os animais foram tratados sistemicamente (oralmente) com 50 mg/kg de alfa-humuleno ou trans-cariofileno.

[0040] Os animais foram previamente tratados com 5 mg/kg de captopril, injetado por via subcutânea, uma hora antes do teste, a fim de evitar a degradação de quininas.

[0041] A Figura 3 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, cariofileno como alfahumuleno ou trans-cariofioleno reduziu notadamente o edema das patas induzido por bradiquinina.

EXEMPLO 3

Edema de Histamina em Patas de Camundongos [0042] O teste utilizado abaixo é descrito por Cunha et ai na publicação Life Sei. 70: 159-169, 2001.

[0043] Camundongos machos de 25 g a 35 g foram levemente sedados com éter e receberam injeção de 50μ1 de solução salina contendo histamina (100 nmol/pata) , intraplantar, na pata direita. A pata esquerda recebeu o mesmo volume de solução salina e foi considerado controle negativo. O inchaço foi medido com pletismômetro (fabricante: Ugo Basile, Itália) ao longo de vários intervalos de tempo após a injeção do agente flogístico. A diferença entre os volumes da pata direita e da pata esquerda foi quantificada (em ml) e tomada como índice de edema. Uma hora antes do teste, os animais foram tratados sistemicamente (oralmente) com 50 mg/kg de alfa-humuleno.

[0044] A Figura 4 demonstra claramente que, de

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13/19 acordo com a presente invenção, cariofileno como alfahumuleno reduziu significativamente a formação de edema induzida por histamina. Também exibe indiretamente efeito contra alergia.

EXEMPLO 4

Edema por fator de agregação de plaquetas (PAF) em patas de camundongos [0045] O teste utilizado abaixo é descrito por Cunha et ai na publicação Life Sci. 70: 159-169,2001.

[0046] Camundongos machos de 25 g a 35 g foram levemente sedados com éter e receberam injeção de 50μ1 de solução salina contendo fator de agregação de plaquetas (PAF, 3 nmol/pata), intraplantar, na pata direita. A pata esquerda recebeu o mesmo volume de solução salina e foi tomada como controle negativo. O inchaço foi medido com pletismômetro (fabricante: Ugo Basile, Itália) ao longo de vários intervalos de tempo após a injeção do agente flogístico. A diferença entre os volumes da pata direita e da esquerda foi quantificada (em mililitros) e tomada como índice de edema. Uma hora antes do teste, os animais foram tratados sistemicamente (oralmente) com 50 mg/kg de alfahumuleno ou trans-cariofileno.

[0047] A Figura 5 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, cariofileno como alfahumuleno ou trans-cariofileno reduziu notadamente a formação de edema induzida por PAF. Como PAF também é conhecidamente envolvido em processos alérgicos, esses dados reforçam adicionalmente o uso de cariofilenos na administração de estados alérgicos.

EXEMPLO 5

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Edema de ácido araquidônico em orelhas de camundongos [0048] O edema da orelha no teste abaixo foi medido de acordo com Calixto et al. na publicação Prostaglandins, 5: 515-526, 1991, com pequenas modificações.

[004 9] Camundongos machos de 25 g a 35 g, em primeiro grupo, receberam aplicação tópica, na superfície interna das orelhas, de ungüento que compreende uma faixa de 0,025 a 0,2% de alfa-humuleno ou trans-cariofileno. No grupo controle positivo, os animais receberam aplicação tópica de 0,05 mg de fenidona por orelha. Após sessenta minutos, os animais receberam 20μ1 de ácido araquidônico (2 mg/orelha), dissolvido em acetona, na superfície interna da orelha direita. O edema foi medido utilizando micrômetro digital e as reações foram expressas em pm, a diferença entre a espessura da orelha antes e depois da aplicação de ácido araquidônico. As reações dos animais tratados com cariofilenos foram comparadas com as observadas nos animais do grupo controle, tratados com ungüento base.

[0050] Os gráficos da Figura 6 demonstram claramente que, de acordo com a presente invenção, a aplicação tópica de cariofileno como alfa-humuleno ou trans-cariofileno reduziu notadamente a formação de edema, de forma dependente de dosagem.

EXEMPLO 6

Níveis de citocina Pró-Inflamatória IL-1B [0051] O teste utilizado abaixo é descrito por Campos et ai na publicação Br. J. Pharmacol. 135: 11071114, 2002, com pequenas modificações.

[0052] Ratos machos de 160 a 180 g receberam

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15/19 administração oral de 50 mg/kg de alfa-humuleno. Animais tratados com 0,9% (0, 1 ml/10 g) de solução salina foram utilizados como controle. Outro grupo de animais foi tratado com 0,5 mg/kg de dexametasona, por via subcutânea, quatro horas antes do teste, e utilizado como controle positivo. Após sessenta minutos, os animais receberam injeções intraplantares de 100 μΐ de carragenina (300pg/pata) e foram sacrificados após 180 minutos. Animais controle receberam solução salina. O tecido subcutâneo das patas injetadas foi removido e colocado em tampão de fosfato contendo 0,5% de Tween 20, 0,1 mM de cloreto de benzametônio, 10 mM de EDTA, 2 pg/m de aprotinina, 0,1 mM de PMSF (metil sulfonil fluoreto de fenila) e 0,5% de BSA (albumina de soro bovino). Os tecidos foram homogeneizados e centrifugados a 3000 g, por dez minutos, a -4 °C. O sobrenadante foi utilizado no teste. Os niveis de IL-Ιβ foram medidos com kit Elisa, de acordo com as instruções do fabricante (R & D Systems®, Estados Unidos). Os testes foram realizados em duplicata e repetidos por três vezes. As respostas são expressas em pg/mg de tecido.

[0053] A Figura 7 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, a administração de cariofileno, tal como alfa-humuleno, inibiu notadamente a produção de citocina pró-inflamatória IL-Ιβ induzida por carragenina nas patas de ratos.

EXEMPLO 7

Niveis de citocina pró-inf lamatória TNFoí [0054] O teste utilizado abaixo é descrito por

Campos et ai na publicação Br. J. Pharmacol. 135:11071114,2002, com pequenas modificações.

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16/19 [0055] Ratos machos de 160 a 180 g receberam oralmente 50 mg/kg de trans-cariofileno. Animais tratados com 0,9% (0,1 ml/10 g) de solução salina foram utilizados como controle. Outro grupo de animais foi tratado com 0,5mg/kg de dexametasona, por via subcutânea, quatro horas antes do teste, e utilizado como controle positivo. Após sessenta minutos, os animais receberam injeções intraplantares de 100μ1 de carragenina (300 pg/pata) e foram sacrificados após 180 minutos. Os animais controle receberam solução salina. O tecido subcutâneo das patas injetadas foi removido e colocado em tampão de fosfato contendo 0,5% Tween 20, 0, 1 mM de cloreto de benzametônio, 10 mM de EDTA, 2 pg/m de aprotinina, 0,1 mM de PMSF (metil sulfonil fluoreto de fenila) e 0,5% BSA (albumina de soro bovino). Os tecidos foram homogeneizados e centrifugados a 3000 g, por dez minutos, a -4 °C. O sobrenadante foi utilizado no teste. Os níveis de TNFoí foram medidos com kit Elisa, de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems®, Estados Unidos). Os testes foram realizados em duplicata e repetidos por três vezes. As respostas estão expressas em pg/mg de tecido.

[0056] A Figura 8 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, a administração de cariofileno, tal como trans-cariofileno, inibiu notadamente a produção da citocina pró-inflamatória TNFoí induzida por carragenina nas patas de ratos.

EXEMPLO 8

Níveis de PGE2 [0057] O teste utilizado abaixo é descrito por Pinheiro et ai, na publicação lnflamm. Res. 51:603-610,

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2002, com pequenas modificações.

[0058] Ratos machos de 160 a 180 g receberam oralmente 50 mg/kg de trans-cariofileno. Animais tratados com 0,9% (0,1 ml/10 g) de solução salina foram utilizados como controle. Outro grupo de animais foi tratado com 0,5mg/kg de dexametasona, por via subcutânea, quatro horas antes do teste, e utilizado como controle positivo. Após sessenta minutos, os animais receberam injeções intraplantares de 100μ1 de carragenina (300 pg/pata) e foram sacrificados após 180 minutos.

[0059] O exudato das patas foi recolhido por meio de diálise com o auxílio de duas cânulas de polietileno e foi utilizado para a quantificação de PEG2, com kit Elisa, de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems®, Estados Unidos). Os testes foram realizados em duplicata e repetidos por três vezes. As respostas são expressas em pg/mg de tecido.

[0060] A Figura 9 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, a administração de cariofileno, tal como alfa-humuleno ou trans-cariofileno, inibiu notadamente o crescimento dos níveis de PEG2 induzido por carragenina nas patas de ratos.

EXEMPLO 9

Inibição da expressão de enzimas COX-2 E iNOS [0061] A expressão das enzimas COX-2 e iNOS foi determinada por meio de Western Blot de acordo com a metodologia descrita por Medeiros et al, na publicação Circ. Res. 28: 1375-1382, 2004.

[0062] Ratos machos de 160 a 180 g receberam oralmente 50 mg/kg de trans-cariofileno. Animais tratados

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18/19 com 0,9% (0,1 mg/10 g) de solução salina foram utilizados como controle. Outro grupo de animais foi tratado com 0,5 mg/kg de dexametasona, por via subcutânea, quatro horas antes do teste, e utilizado como controle positivo. Após sessenta minutos, os animais receberam injeções intraplantares de ΙΟΟμΙ de carragenina (300 pg/pata) e foram sacrificados após 180 minutos e o tecido da pata subcutâneo foi removido 240 minutos após a injeção de carragenina.

[0063] O tecido recolhido foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e novamente suspenso em tampão de lise hipotônica (10 mM de HEPES ácido N-2hidroxietilpiperazino-N-2-etanossulfônico, 1,5 mM de MgÜ2, 10 mM de KCI, 0,5 mM de PMSF fluoreto de fenilmetilsulfonila, 1,5 pg/mlde inibidor de tripsina, 7 pg/ml de pepstatina A, 5 pg/ml de leupeptina, 0,1 mM de benzamidina, 0,1 mM e 0,5 mM de ditiotreitol) e homogeneizado. O homogeneizado foi dividido em três parcelas de 2 ml, resfriado em gelo por quinze minutos, agitado vigorosamente e novamente resfriado em gelo, na presença de 20μ de 10% detergente não iônico Nonidet P-40 (Roche Diagnostics, Estados Unidos). A fração nuclear foi precipitada por meio de centrifugação (1500 g, cinco minutos) e o sobrenadante que contém o extrato citosólico foi armazenado a -70 °C para os testes Western Blot. A concentração de proteínas foi determinada por meio do método de Bradford (kit da BioRad Laboratories Inc., Milão, Itália). Os extratos foram fervidos com quantidades equivalentes v/v de tampão Laemmly (125 mM de Tris-HCI, 2 mM de EDTA, 4% de dodecil sulfato de sódio, 20% de

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19/19 glycerol, 10% de 2-mercaptoetanol e 0,1% de azul brilhante de Comassie, pH 6,8). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (100 pg/cavidade) e separadas por meio de eletroforese. As membranas foram posteriormente bloqueadas por meio de incubação por uma noite (4 °C) com leite em pó desnatado (10% PBS) e incubadas em seguida com os anticorpos anti-iNOS ou anti-COX-2 por uma hora à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas por três vezes com 10% Triton-X em PBS com a peroxidase de anticorpo conjugada (anti-coelhos). As faixas obtidas desta forma foram quantificadas utilizando kit de quimioluminescência e análise densitométrica unidades relativas) em filmes radiográficos.

[0064] A Figura 10 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, a administração de cariofileno, tal como alfa humuleno ou trans cariofileno, inibiu notadamente a expressão de enzimas COX2 induzidas por carragenina nas patas de ratos.

[0065] A Figura 11 demonstra claramente que, de acordo com a presente invenção, a administração de cariofileno, tal como alfa humuleno, inibiu notadamente a expressão de enzimas iNOS induzidas por carragenina nas patas de ratos.

[0066] Os exemplos e as informações fornecidas no presente referem-se a realizações específicas da presente invenção, que somente é limitada pelo escopo das reivindicações anexas ao presente.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. USO DE ALFA-HUMULENO caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento útil na profilaxia ou tratamento de uma condição inflamatória do corpo animal, em que a condição inflamatória é dor inflamatória ou edema.

2 . USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o corpo animal é um corpo humano. 3. USO, de acordo com uma qualquer das

reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o medicamento é destinado à administração enteral ou parenteral selecionado do grupo que consiste em oral, tópica, transdermal, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, transdérmica, transmucosa, intramuscular, intrapulmonal, vaginal, retal, intraocular, sublingual, infiltração ou inalação.

4. USO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o medicamento é destinado à administração sistêmica ou tópica selecionada do grupo consistindo em administração oral, transdérmica, infiltração ou inalação.

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A cariofilenos, medicamentos inflamações e