JP2009180584A - 水晶発振子を用いる、麦芽の酵母凝集活性の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明による麦芽の酵母凝集活性の測定方法は、被検麦芽から分離し濃縮された高分子多糖分と、コンカナバリンAを固定化した水晶発振子とを緩衝液中において接触させ、高分子多糖分とコンカナバリンAとの結合により生じる水晶発振子の振動周波数の変化を測定することを含んでなる。
【選択図】なし
Description
本発明は、水晶発振子を用いる、麦芽の酵母凝集活性の測定方法に関する。より詳しくは、本発明は、実際に発酵を行うことなく、ビール、発泡酒、ウイスキーなどの酒類製造に用いる麦芽において、酵母の凝集沈降を引き起こす凝集活性を測定する方法に関する。
麦芽を原料とする酒類を製造する際に、下面発酵酵母といわれる種類の酵母を用いて発酵を行うと、発酵工程終了間際に酵母同士が凝集塊を形成して沈降する現象が観察できる。この酵母凝集塊の沈降によって、酒類製造の次回の発酵に必要な酵母を得ることができる。このような現象のメカニズムは、次のように考えられている。
よって、早凝因子である、ある種の高分子多糖を多く含む麦芽は、酵母凝集活性が強く、早期凝集現象を発生させやすい麦芽であると言える。
被検麦芽から分離し濃縮された高分子多糖分と、コンカナバリンAを固定化した水晶発振子とを緩衝液中において接触させ、高分子多糖分とコンカナバリンAとの結合により生じる水晶発振子の振動周波数の変化を測定することを含んでなる。
被検麦芽を糖化して得られる麦汁に、エタノールを加えて、高分子多糖を含むエタノール沈殿を生じさせて分離し、得られた沈殿物を緩衝液に溶解させた後、これを陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して、高分子多糖分を含む濃縮画分を分取する工程をさらに含んでなる。
得れた振動数の変化から、予め得られている酵母凝集活性の値と振動数の変化との相関関係に基づいて、被検麦芽の酵母凝集活性の値を得ることをさらに含んでなる。
麦芽中の酵母早期凝集性因子の定量方法であって、
本発明による麦芽の酵母凝集活性の測定方法を用い、かつ、
得れた振動数の変化から、予め得られている酵母早期凝集因子の量と振動数の変化との相関関係に基づいて、原料麦芽中の酵母早期凝集因子の量を得ることを含んでなる、方法が提供される。
被検麦芽から分離し濃縮された高分子多糖分と、コンカナバリンAを固定化した水晶発振子とを緩衝液中において接触させ、高分子多糖分とコンカナバリンAとの結合により生じる水晶発振子の振動周波数の変化を測定することを特徴とする。
麦芽高分子抽出物をリン酸緩衝液に溶解し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにに付して、早凝因子を含む、早凝因子が濃縮された画分を分取する。各画分の早凝因子の有無は、別途行った発酵試験で確認するか、あるいは予め行っておいた発酵試験に基づいて分取すべき画分を特定することができる。具体的には、カラムクロマトグラフィーにより得られた各分画物を凍結乾燥し、これらを麦芽以外の成分(糖、アミノ酸、無機塩類など)で調製された合成麦汁にそれぞれ加え、さらに酵母を加えて、温度20℃で48時間発酵させる。発酵後、濁度計を用いて波長800nmにおける吸光度(OD800)を測定し、対照区のOD800から試験区のOD800を差し引いた値DPF(Degree of Premature Flocculation)48を比較し、各画分における酵母凝集活性の強度を求めることができる。この結果に基づいて、早凝因子が多く含まれ、濃縮されている分画を特定することができる。酵母凝集活性が高く、早凝因子を多く含む画分を集め、必要に応じて凍結乾燥させ、所望の高分子多糖分(以下、「麦芽高分子濃縮物」ということがある)を得ることができる。
なお合成麦汁の調製方法は特許文献1の記載にしたがって行うことができる。
またここで使用される陰イオン交換カラムクロマトグラフィーとしては、GEヘルスケア バイオサイエンス社製 Mono−Qカラム、または、Q Sepharoseカラムを用いることができる。
被検麦芽を糖化して得られる麦汁に、エタノールを加えて、高分子多糖を含むエタノール沈殿を生じさせて分離し、得られた沈殿物を緩衝液に溶解させた後、これを陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して、高分子多糖分を含む濃縮画分を分取する工程をさらに含んでなる。
水晶発振子へのコンカナバリンAの固定化の具体例を示すと、コンカナバリンAを0.5〜1.0mg/Lの濃度となるよう水に懸濁し、50μLを水晶発振子センサーチップ表面に滴下して約30分間放置する。その後、蒸留水で固定化しなかったコンカナバリンAを洗い流し、コンカナバリンAが固定化した水晶発振子を得ることができる。
前記したようにコンカナバリンAを固定化した水晶発振子センサーを、リン酸緩衝液(例えば、0.1%Tween20、1mg/mLマンノースを含む10mMリン酸緩衝液)に浸す。このとき、リン酸緩衝液は、酸性側に調整することが望ましく、好ましくはそのpH値は5.0付近である。この緩衝液中に、所定の濃度(マンノース相当量、蒸留水)に調整した高分子多糖分(麦芽高分子濃縮物)を所定量(例えば、5μL)添加して、コンカナバリンAと高分子多糖分に含まれる早凝因子とを結合反応させる。このとき、反応温度は特に制限はないが、例えば室温(例えば25℃程度)で行うことができる。一方、水晶発振子センサーを接続した分子間相互作用測定装置(例えば、株式会社イニシアム製AFFINIX Q4)を用いて、高分子多糖分(特に早凝因子)とコンカナバリンAとの結合により生じる水晶発振子の振動周波数の変化(減少)を測定する。測定の開示時および測定時間は、結合反応の開始時点からの反応の進行状況や周波数の減衰状態を考慮して適宜選択して設定することができ、例えば、高分子多糖分添加後60秒間の周波数変化測定する。なお本発明では、添加後60秒間の周波数変化を、もともとの麦芽が特徴的にもつConAとの結合活性と仮定して実験を行っている。
得れた振動数の変化から、予め得られている酵母凝集活性の値と振動数の変化との相関関係に基づいて、被検麦芽の酵母凝集活性の値を得ることをさらに含んでなる。
すなわち、予め既知の濃度の早凝因子を含む麦芽を用意し、これを用いて、酵母凝集活性の値と振動数の変化との相関関係(例えば検量線)を求めておく。未知の被検麦芽の測定を行った場合には得られた振動数の変化結果から、被検麦芽における酵母凝集活性の値を算出することができる。従来、麦芽の酵母凝集活性の測定法は、酵母凝集活性の有無や、その強弱を判別することはできたが、数値化までするには十分ではなかった。本発明によれば、被検麦芽の酵母凝集活性の値を得ることができるので、より精度が高く緻密な測定および判別が可能となる。これは、麦芽製造や、アルコール飲料製品の製造や、そこにおける工程管理等の面から極めて有効であると言える。
麦芽中の酵母早期凝集性因子の定量方法であって、
本発明による麦芽の酵母凝集活性の測定方法を用い、かつ、
得れた振動数の変化から、予め得られている酵母早期凝集因子の量と振動数の変化との相関関係に基づいて、原料麦芽中の酵母早期凝集因子の量を得ることをさらに含んでなる、方法が提供される。
1) 麦芽からの麦汁の調製
従来から麦芽の評価に幅広く用いられているコングレス麦汁(European Brewery Convention,Analytica-EBC(4th ed.),Method 4.4,p.E59,Braurei-und Getrauke-Rundschau,CH-8047)を調製した。
麦汁に対して約2倍量のエタノールを加え、析出した高分子成分を沈殿物(麦芽高分子抽出物)として分離回収した。この方法はエタノール沈殿と呼ばれる方法である。高分子酸性多糖である早凝因子はこの方法によって、沈殿物として分離することが出来る。
麦芽以外の成分(糖、アミノ酸、無機塩類など)で調製された合成麦汁に、麦汁から分離回収した高分子成分、酵母を加え温度20℃で48時間発酵させた後の濁度によって評価した。この場合、濁度計を用いて波長800nmにおける吸光度(OD800)を測定し、対照区のOD800から試験区のOD800を差し引いた値DPF(Degree of Premature Flocculation)48を比較した。合成麦汁の調製方法は特許文献1の記載にしたがった。
前記2)で得られた麦芽高分子抽出物を、リン酸緩衝液に溶解し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって酵母凝集活性を含む画分を分取した。酵母凝集活性の有無は、分画物を凍結乾燥し、これを加えた発酵試験を行い、発酵の進行状況を上記3)の方法と同様に判定した。酵母凝集活性を含む画分を集めて凍結乾燥した。
ConAを0.5から1.0mg/Lの濃度に懸濁し、50μLを水晶発振子センサーチップ表面に滴下して30分間放置した。その後、蒸留水で固定化しなかったConAを洗い流した。
ConA固定化水晶発振子センサーを分子間相互作用測定装置に装着し、センサー部分を0.1%Tween20、1mg/mLマンノースを含む10mMリン酸緩衝液に浸した。この中に先に所定の濃度(マンノース相当量、蒸留水)に調製した麦芽高分子濃縮物5μLを添加して結合反応を開始した。分子間相互作用測定装置で周波数変化(減少)を測定した。
被検サンプルとして、さまざまな由来の麦芽試料9点を用意した。
まず、糖化ビーカーに水320mLを入れ、水温を45℃に保った。ここにディスクミルを用いて粉砕した粉砕麦芽(被検サンプル)50gを加えて、均一になるように良く攪拌した。次に粉砕麦芽からの早凝因子の抽出処理を行った。抽出の温度プログラムの設定は、45℃、30分保持→1℃/分で昇温→70℃、2時間保持であった。抽出処理後、これをよく攪拌し、濾紙(東洋濾紙No.2)を用いて濾過し、この濾液を200mLのメスシリンダーを用いて正確に200mLを分取した。
これらにビール酵母0.70gをそれぞれ添加した後に、直径27mmの発酵管(100mL容)に入れて20℃で発酵させ、48時間後、液面から5cmのところから2mLずつ分取して、そのOD800をそれぞれについて測定した。対照区の値から試験区の値を差し引いて、酵母凝集の度合を示すDPF(Degree of Premature Flocculation)48を求めた。DPF48は2連の試験の平均値とした。
結果から、麦芽サンプル番号「No.1」、「No.3」の麦芽が持つ酵母凝集活性は弱く、「No.2」、「No.8」、および「No.9」の麦芽が持つ酵母凝集活性は著しく強いことが判明した。
実際の酒類製造に用いた結果、酵母凝集活性が強いことが判明している麦芽を用意した。
まず、糖化ビーカーに水320mLを入れ、水温を45℃に保った。ここにディスクミルを用いて粉砕した粉砕麦芽(被検サンプル)50gを加えて、均一になるように良く攪拌した。次に粉砕麦芽からの早凝因子の抽出処理を行った。抽出の温度プログラムの設定は、45℃、30分保持→1℃/分で昇温→70℃、2時間保持であった。抽出処理後、これをよく攪拌し、濾紙(東洋濾紙No.2)を用いて濾過し、この濾液を200mLのメスシリンダーを用いて正確に200mLを分取した。
結果から、ここでの実施例2における条件を用いることによって、「Fr.4」または「Fr.5」に酵母凝集活性が濃縮されることが明らかになった。以下においては、「Fr.4」または「Fr.5」を、高分子多糖分(麦芽高分子濃縮物)として用いた。
実施例1の発酵試験の結果、酵母凝集活性が強いこと(DPF48値:1.364(サンプル番号2))、および、弱いこと(DPF48値:0.202(サンプル番号1))が判明している麦芽試料2種類を実施例1のサンプルの中から選択した。(なお図−2では、「凝集強」、「凝集弱」と表示している)。
これら選択した2つの麦芽試料から、実施例2に従って、10mg/mL(マンノース相当量、蒸留水)とした高分子多糖分(麦芽高分子濃縮物)を調製した。
市販の水晶発振子センサー(イニシャム社製セラミックセンサーチップ 27MHz)の金電極部分に、ピランハ溶液(過酸化水素:濃硫酸=1:3混合液)、または1%SDS溶液を滴下し表面を洗浄した後、十分量の蒸留水で洗い流し、表面に残った水分を紙に吸い取って除去した。次に、金電極部分に0.5から1.0mg/mL蒸留水の濃度に調製したConA(和光純薬株式会社より入手、カタログ番号594−02833)懸濁液50μLを滴下し、これが乾ききらないように湿度を維持できる箱(例えば湿らせた濾紙を入れたシャーレなど)の中で30分間静置した後、金電極部分に残っているConA懸濁液を十分量の蒸留水で洗い流した。これにより、ConA固定化水晶発振子センサーを得た。
測定結果は、図2に示される通りであった。
一方、リン酸緩衝液のpHを5.0に調製した場合には、麦芽高分子濃縮物を添加した直後から急激に振動周波数が減少すること、振動周波数の減少は、酵母凝集活性が強い麦芽から得られた高分子濃縮物の方が、酵母凝集活性が弱い麦芽から得られた高分子濃縮物よりも大きいことが観察された。
ConA固定化水晶発振子センサーを装着した分子間相互作用測定装置(イニシャム社製AFFINIX Q4)を用い、また、実施例1の発酵試験の結果から様々な酵母凝集強度を持つことが判明している麦芽試料9点を用いて、麦芽試料から分離した麦芽高分子濃縮物のConAへの結合の結果生じる振動周波数変化を測定した。
実験の手順は実施例3に従った。
振動周波数変化の測定は、麦芽高分子濃縮物1点につき3ないし4回の測定を行い、その平均値を用いた。発酵試験による酵母凝集活性強度(DPF)と麦芽高分子濃縮物添加1分後の振動周波数変化の相関を求めた。
Claims (7)
- 麦芽の酵母凝集活性の測定方法であって、
被検麦芽から分離し濃縮された高分子多糖分と、コンカナバリンAを固定化した水晶発振子とを緩衝液中において接触させ、高分子多糖分とコンカナバリンAとの結合により生じる水晶発振子の振動周波数の変化を測定することを含んでなる、方法。 - 被検麦芽から、濃縮された高分子多糖分を得る工程として、
被検麦芽を糖化して得られる麦汁に、エタノールを加えて、高分子多糖を含むエタノール沈殿を生じさせて分離し、得られた沈殿物を緩衝液に溶解させた後、これを陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して、高分子多糖分を含む濃縮画分を分取する工程をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 高分子多糖分と、コンカナバリンAを固定化した水晶発振子とを、酸性緩衝液中において接触させる、請求項1または2に記載の方法。
- 得れた振動数の変化から、予め得られている酵母凝集活性の値と振動数の変化との相関関係に基づいて、被検麦芽の酵母凝集活性の値を得ることをさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 麦芽中の酵母早期凝集性因子の定量方法であって、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法を用い、かつ、
得れた振動数の変化から、予め得られている酵母早期凝集因子の量と振動数の変化との相関関係に基づいて、原料麦芽中の酵母早期凝集因子の量を得ることを含んでなる、方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法を用いて、麦芽原料、製造途中の麦芽、または製造麦芽の酵母凝集活性を判定することにより、麦芽製造工程を管理することを特徴とする、麦芽の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法を用いて、麦芽中の酵母凝集活性を測定することにより、用いる麦芽原料の選択および調整を行うことを特徴とする、発酵アルコール飲料の製造方法。
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