JP2009153517A - 色素上皮誘導因子:pedf遺伝子の特性評価、ゲノム構成および配列 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ニューロンを含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し;および、該集団のニューロン細胞生存を促進することからなるニューロン細胞生存の促進法。グリア細胞を含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し;および、該集団のグリア細胞増殖を阻害することからなるグリア細胞増殖阻害法。
【選択図】なし
Description
本出願は1992年9月24日に出願された特許出願第07/952,796号の一部継続出願である1994年6月7日に出願された特許出願第08/258,963号の一部継続出願である。
本発明は神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止性タンパク質に関する。特に、本発明は色素上皮誘導因子(PEDF)として知られているタンパク質の生物学的特性およびそのタンパク質の組換え形に関している。本発明はまたrPEDFと称されるPEDFの端を切り取ったものにも関している。PEDFおよびrPEDFおよび機能的に等価なタンパク質に加え、本発明はrPEDFおよびその断片をコードしている核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞およびそのようなタンパク質を産生するためのこれらの宿主細胞の使用にも関している。
色素上皮誘導因子(または色素上皮分化因子として知られている)は、培養ヒト網膜芽腫細胞の神経突起成長を誘導できる細胞外神経栄養性作因として培養ヒト胎児網膜色素上皮細胞の馴化培地で同定された(Tombran−Tink et al.(1989)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,30(8),1700−1707)。PEDF源、即ち網膜色素上皮(RPE)は網膜神経の正常な分化および機能に決定的なものであろう。増殖因子を含む種々の分子がRPE細胞により合成および分泌される。RPEは網膜神経に先だって分化して隣接して存在し、およびそれが血液−網膜障壁の一部として機能しているため(Fine et al.(1979)The Retina.Ocular Histology:A Text and Atlas,New York,Harper & Row,61−70)、RPEは目の血管性、炎症性、消耗性(degenerative)および異栄養性(dystrophic)疾患に関係していると考えられる(Elner et al.(1990)Am.J.Pathol.,136,745−750)。増殖因子に加え、栄養および代謝物もまたRPEおよび網膜間で交換されている。例えば、RPEはよく知られた増殖因子PDGF、FGF、TGF−α、およびTGF−βを網膜に供給している(Campochiaro et
al.(1988)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,29,305−311;Plouet(1988)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,29,106−114;Fassio et al.(1988)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,29,242−250;Connor et al.(1988)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,29,307−313)。RPEにより供給されたこれらおよび他の未知の因子が網膜の構成、分化および正常な機能発揮に影響していることは非常にありそうなことである。
本発明によって、以下が提供される。
(項目1) ニューロンを含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し;および
該集団のニューロン細胞生存を促進することからなるニューロン細胞生存の促進法。
(項目2) グリア細胞を含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し;および
該集団のグリア細胞増殖を阻害することからなるグリア細胞増殖阻害法。
(項目3) ニューロン細胞が組織細胞培養にある項目第1項に記載の方法。
(項目4) 以下の工程をさらに含む項目第1項に記載の方法:
細胞培養を設定し;および
該細胞培養を有効量のPEDFで処理する。
(項目5) 処理される細胞が患者内へ移植される組織の構成要素を含む項目第1項に記載の方法。
(項目6) 細胞が胎児脳細胞である項目第6項に記載の方法。
(項目7) グリア細胞が腫瘍増殖の一部である項目第2項に記載の方法。
(項目8) 阻害されるグリア細胞増殖がグリオシスである項目第2項に記載の方法。
(項目9) 精製された色素上皮誘導因子またはその抗原性断片に対して作製された精製抗体または該抗体の抗原−結合断片。
(項目10) 前記抗体がポリクローナルである項目第9項に記載の単離抗体または抗体断片。
(項目11) 前記抗体がモノクローナルである項目第9項に記載の抗体または抗体断片。
(項目12) 前記抗体が検出可能な標識で標識されている項目第9項に記載の抗体または抗体断片。
(項目13) 細胞または細胞集団を有効量の項目第9項に記載の抗体または該抗体の抗原結合断片で処理し;および
色素上皮誘導因子生物学的活性を阻害することからなる色素上皮誘導因子の阻害法。
(項目14) 以下の工程を含んでなる、体液、細胞または組織試料中の色素上皮誘導因子レベルの決定法:
A.該試料と項目第9項に記載の精製抗体または抗原結合断片を該抗体または抗原結合断片と該試料中に存在する色素上皮誘導因子間で免疫複合体が形成される条件下で接触させ;
B.免疫複合体から過剰の抗体または抗原結合断片を分離し;および
C.免疫複合体のレベルを決定して色素上皮誘導因子レベルを決定する。
本発明は新規で、重要でありようやく解明された特性を持つタンパク質に関する。色素上皮誘導因子(PEDF)は神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止特性を持つタンパク質である。本発明はさらに、PEDF遺伝子をコードしているDNA配列、PEDF遺伝子および生物学的活性を持つPEDFのタンパク質断片をコードしているPEDF遺伝子の断片を含むゲノムDNAに関する。
PEDFはRPE細胞によって特に高く発現されるが、ほとんどの組織、細胞型、腫瘍などでノーザンおよびウェスタンブロット分析により検出可能である。例えば、硝子体液および眼房液に容易に検出される。PEDFの細胞内局在化という重要な問題も追求されている。PEDFの大部分は分泌されるようであるが、培養サルRPE細胞の探査にPEDF抗体を用いたところ、核ならびに細胞質の非常に特異的な細胞骨格構造にPEDFが付随することが観察された。重要なことは、このことが試験された細胞の年齢および特定の細胞周期状態で変化することである。例えば、付着の最初の段階で基層と相互作用する霊長類RPE細胞の偽足の先端に本タンパク質は濃縮されるようである。その後、この染色は消失し、特異的細胞骨格構造および核に付随して本タンパク質が出現する。従って、PEDFは核および細胞質の両方で重要な細胞内の役割を果たしているようである。
本発明は分裂中の未分化Y−79細胞では発現し、および対応する静止状態の分化細胞ではわずかな発現または無発現であることを示している(Tombran−Tink、et al.,(1994)Genomics,19:266−272)。Pignolo
et al.(1993)J.Biol.Chem.,268:2949−295、はWI−38線維芽細胞中のPEDFの合成は若い細胞の細胞周期のG0段階に限定されることを示している。さらに、年をとった老化細胞においては、PEDF メッセンジャーRNAは存在しない。
PEDFポリペプチドを分節に区切って研究することは構造−機能の研究では基本的なことである。この目的ために、PEDFコード配列の断片を含む発現ベクターがPEDFポリペプチドの異なった領域の合成および単離のために優れた断片源を提供する。ヒト胎児PEDF配列の発現は大腸菌発現ベクターおよびヒト胎児PEDF cDNAにより達成された。組換え体PEDF生成物(rPEDF)は生物学的に活性な神経栄養性因子であり、湿潤大腸菌グラム当たり1.3mgのオーダーの収量で得られることが示された。端が切断されたペプチドはまた適当な分子生物学的構築物を大腸菌で発現させても作製できる。これらの生成物を用い、PEDF一次構造上の2つの独特な領域が1)タンパク質のN−末端近くのアミノ酸残基44−121内に位置し、分子に神経栄養性活性を与える”活性部位”、および2)セルピンの露出ループと相同的であるC−末端近くの領域(即ち、”古典的”セルピン活性部位)が区別できた。これらの結果は、1)神経突起成長にはPEDFの全部の天然コンホメーションは必要とされない、および2)セリンプロテアーゼの阻害ではPEDFの生物学的活性は説明できないことが示唆される。タンパク質配列を覆う一連の端が切断されたrPEDF構築物が得られ、N−末端近くの特異的神経栄養性”活性部位”の正確な位置を決めることができた。
精製された組換え体ヒトPEDFは、PEDF媒介神経栄養性活性を特異的に阻害するポリクローナル抗体(”抗−rPEDF”)の開発に使用された。さらに、抗−rPEDFは完全にIPM誘導神経栄養性活性を阻害した。
Y−79およびWeri腫瘍細胞系において天然PEDFおよびrPEDFが神経栄養性であることを示すことに加え、本発明はPEDFが初代培養の正常ニューロンに効果を示すかどうかを決定した。この目的のため、生後8日のラットから調製された正常小脳顆粒細胞(CGC)の培養物を用いて研究が実施された。rPEDFで処理された細胞はより神経的形態的外観を示すことにより処置には応答しなかった。しかしながら、PEDFは顆粒細胞生存に大きな効果を示した。これらの細胞は腫瘍性または形質転換細胞ではないので、これらは培養で限られた寿命しかなく、培養培地に依存して約21日で死んでゆく。しかしながら、PEDF処理培養物は非処理培養物と比較して無血清培地中、培養10日後に10倍の細胞を含んでいた(図4)。これらの結果は;1)直接的顕微鏡観察および細胞計数、および2)生きている細胞数を決定するMTS(テトラゾリウム/ホルマザン)アッセイにより決定された(実施例11参照)。従って、PEDFはCNSニューロン生存に劇的な効果を示し、近年明らかにされつつある”神経細胞栄養性”タンパク質の数少ないリストに加えられるべきである。
ニューロンおよびグリアを用いる組織培養実験で一般的に悩まされる2つの問題は、ニューロンは急速に死にがちであり、グリアは培養皿を乗り越えがちであることである。PEDFまたはそのペプチドは両方の点を助けることができる。従って、PEDFの商業的使用の一つは、CNS細胞が培養される場合の一般的な培養培地添加物としてであろう。
ニューロンの移植はある種の病理を治療すると考えられている。例えば、パーキンソン疾患において、特定の胎児脳細胞の患者への移植は疾患に付随する問題を軽減または治療できるであろう。しかしながら、一つの大きな問題は移植された細胞の生存を延ばすこと、およびそれらを分化したまま維持すること(例えば、適当な物質を分泌するように)であろう。細胞をPEDFで前処理すると、これらの両方の面での助けになる。同様に、移植前にニューロンまたは大グリア細胞をPEDFでトランスフェクトすると、移植部位で長期間のPEDF源であることができる。
CNS(脳および網膜)に対する多くの神経消耗性疾患およびその他の障害はニューロンの死亡およびグリアの過密(グリオシス)により代表される。PEDFはこれらの状態において、一次ニューロンの寿命および機能発揮を延長するため、およびグリアの進出をくい止めるために有効に使用できる。例えば、PEDFはCNS障害に応答した小グリア活性化を阻害し、ならびにニューロンの命を延長/助命するのに有効で有り得る。
CNSを攻撃する癌の主要な型のほとんどにグリア要素が含まれており、PEDFは他の形の療法と組み合わせて使用できるグリア静止因子である。例えば、手術に加えて、PEDFは疾患の拡散または再発を有効に阻害できる。
本発明はヒトPEDF遺伝子およびそのプロモーターの構成の決定およびその進化的相関および種々のヒト胎児および成人組織での発現に関している。
この実施例は、PEDFのトリプシン加水分解と生じる断片のアミノ酸配列決定について記載している。
この実施例は実施例1のペプチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドの構築、PEDF
cDNAの単離におけるオリゴヌクレオチドの使用、およびPEDFcDNAの配列決定について記載している。
ミニプレップ プロトコールに従って分離した。精製プラスミドは EcoRI と HindIII(BRL)で消化した。これらの制限部位は挿入物の5’と3’末端にリンカーを連結反応させてライブラリー構築している間に加えられたもので、従ってEcoRI−HindIII消化により単離されたプラスミドに存在する挿入物が切り出される。これらのフラグメントは挿入物の大きさを決定するため0.7%アガロースゲルで電気泳動した。最大の挿入物を持つプラスミド(即ち、πFS17)が地図作製のため、およびクローンの同一性を確認するため、続いてSequenase 2.0 シークエンシング キット(United States Biochemical Corp.、Cleveland、OH)を用いての配列決定のために選択された。配列分析はMacVectorソフトウェアーパッケージ(International Biotecnologies、Inc.)およびGenBank Sequence Data Bank(Intellingenetics、Montain View、CA)を利用して行った。
この実施例は組換え体PEDF生産のための発現ベクターの構築について記載している。
この実施例は完全長PEDF cDNAを含んだ発現ベクターの構築について記載している。
この実施例は組換えにより生成されるPEDFを大量に生成する方法について記載している。
この実施例は精製組換え体PEDFの分化因子としての使用について記載している。
分子量3000の組換え体PEDFと共に、より小さな組換え体が合成され、神経栄養性活性を持つかどうか決定された。より小さなペプチドは完全長構築物よりも、高い溶解性、よりよい膜透過性、より低い抗原性、製造の容易さなど様々な利点を与える。
(ヒトPEDF遺伝子のコローニングおよび配列決定)
材料−制限酵素、SuperScriptTM RTおよびカナマイシンはGIBCO−BRL(Gaithersburg,MD)から購入された。DynabeadsTMオリゴ dT(25)はDynal Inc.(Lake Success,NY)から購入された。RetrothermTM RTはEpicentre Technologies(Madison,WI)から得られた。RNAsinTMはPromega(Madison,WI)から購入された。TaqポリメラーゼはPerkin−Elmer(Norwalk,CT)またはStratagene(La Jolla,CA)から購入された。サブクローニングに使用するプラスミドベクターpBlueScriptはStratagene(La Jolla,CA)から購入された。神経網膜および網膜色素上皮からの全RNAは文献に記載されているように(Chomczynki and Sacchi,1987)、National Disease Research
Interchange(NDRI,Philadelphia,PA)から得られたヒト組織から精製された。標識および配列決定に使用された[32P]α−dATPおよび[32P]γ−ATP(3000 Ci/mmol)はAmersham(Arlington Hts,IL)から購入された。Superbroth(バクトートリプトン
12g/L、酵母抽出物 24g/L、K2HPO412.5g/L、HK2PO43.8g/Lおよびグリセロール5mL/L)、変性溶液(0.2N NaOH、1.5M
NaCl)、中和溶液(1Mトリス−Cl pH7.0、1.5M NaCl)、20X SSC(3.0M NaCl、0.3mMクエン酸ナトリウム)、10X TBE(1Mトリス−ホウ酸、2mM EDTA、pH8.3)および50X TAE(2Mトリス−酢酸、50mM EDTA、pH 8.0)はQuality Biologicals(Gaithersburg,MD)から購入された。20X SSPE(3M NaCl、0.2M NaH2PO、20mM EDTA pH7.4)はDigene Diagnostics,Inc.(Silver Spring,MD)から購入された。アンピシリンはSigma Chemical Co.(St.Louis,MO)から購入され、水に溶解し、フィルター滅菌された。
2X PCR混合物は1.6μモル/mLのGeneAmpTM dNTPs(各々400M)、2X GeneAmpTM PCR緩衝液および50U/mLのTaqポリメラーゼを含むように調製された。これらの試薬はPerkin−Elmer(Norwalk,CT)から購入された。一般に、鋳型およびオリゴヌクレオチド(各々のオリゴの100ng)は25μLの容量で混合され、25μLの2X混合物、続いて50μLの鉱油が加えられた。鋳型は、最初の変性が95℃で2分間、30秒のアニーリング(プライマーに依存して55から65℃の間)、および伸長が72℃にて増幅された生成物に依存して1−5分であった。
以前に記載されているように(Rodrigues and Chader 1992)cDNAがDynabeads上で合成された。Dynabeads(0.5mg)を100μLの10mMトリス−Cl pH7.0、1mM EDTA、1M KClで洗浄した。全RNA水溶液30μL(30μg、約1μL)を30μLの上記緩衝液および平衡化Dynabeads(0.5mg)と混合し、55℃で2分間加熱した。ポリ+A
RNAを室温で15分間ビーズにアニール化し、ビーズをMPC−E磁気セパレーター(Dynal Inc.)へ結合させることにより過剰のRNAを除去した。アニール化されたポリ+A mRNAを持つビーズは次に2.5μLの緩衝液A(200mMトリス−Cl pH8.3、1.0M KCl)、2.5μLの緩衝液B(30mM MgCl2、15mM MnCl)、20μLの10mMdNTP(各々2.5mM)1μLのRNAsin、2μLのSuperScript RT、5μLのRetrotherm RT(1単位/μL)および16μLのH2Oに懸濁し、最終容量を50μLとする。反応混合物は40℃で10分、続いて65℃で1時間インキュベートした。ビーズを再びMPC−E磁気セパレーターへ結合させ、過剰のRT反応混合物を除去した。ビーズは次に100μLの0.2N NaOHで1回、10X SSPEで1回および1X TEで2回洗浄した。cDNA含有ビーズは最終容量で100μLの1X TEに懸濁した。
Clontechから購入された5’−AmpliFINDER RACEキットに基づく改良法を用いて5’−RACEが実施された(Rodriguesら、1994)。最初に、cDNAが上記のように(Rodrigues and Chader 1992)DynabeadsTM オリゴ dT(25)上で合成された。AmpliFINDERアンカープライマーが5’プライム末端のPCR増幅のためPEDF特異的プライマー#2744と組み合わせて使用された。増幅は上記のように行われ、2μLのアンカー結合ヒト網膜色素上皮−Dynabeads cDNAが鋳型として使用された。増幅は30サイクル行われた。
オリゴヌクレオチドプライマーはAplied Biosystems Inc.(Foster City,CA)DNA合成機モデル392により合成された。オリゴヌクレオチドは脱保護され、さらに精製することなく使用された。
ヒトゲノムコスミドライブラリー(Clontech)を150mg/mLアンピシリン、20mg/mMカナマイシンを含むLBプレートにプレート当たり10,000コロニーの密度で播種された。コロニーを拾い上げるのにニトロセルロースフィルターが使用され、フィルターはSambrookら(1989)に記載されているように処理されハイブリダイズされた。ライブラリーはT7/T3プライマーを用いてPEDF cDNAクローンから得られた[32P]標識PCR生成物(Steeleら、1993)で探査した。この結果、p10Aコスミドが単離された。λDASHTMIIライブラリー(Stratagene)が上記のPEDF cDNAクローンのインサートを用いてLark Sequencing Technologies Inc.(Houston,TX)によりスクリーンされた。この結果、7kb NotI−Not断片(JT6A)が単離された。全PEDF遺伝子および隣接する領域を含むP−1クローン(p147)は、オリゴ1590/1591を用いてGenome Systems(St.Louis,MO)により単離された。
PEDF cDNAの内部コード領域から設計された4組のプライマー、603:604;605:606;2238:354および2213:2744が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)実験のプライマーとして使用するために上記のように合成された。プライマー配列は以下の様である:603:5’−ACA AGC TGG CAG CGG CTG TC−3’(配列ID番号:13)、604:5’−CAG AGG TGC CAC AAA GCT GG−3’(配列ID番号:14);605:5’−CCA GCT TTG TGG CAC CTC TG−3’(配列ID番号:15)、606:5’−CAT CAT GGG GAC CCT CAC GG−3’(配列ID番号:16),2213:5’−AGG ATG CAG GCC CTG GTG CT−3’(配列ID番号:17)、2744:5’−CCT CCT CCA CCA GCG CCC CT−3’(配列ID番号:18);2238:5’−ATG ATG TCG GAC CCT AAG GCT GTT−3’(配列ID番号:19),354:5’−TGG GGA CAG TGA GGA CCG CC−3’(配列ID番号:20)。プライマー603:604および605:606で生じたPCR生成物の増幅、サブクローニングおよび配列決定はヒトゲノムDNAを鋳型として用いてLark Sequencing Technologies Inc.により実施された。603:604からの生成物は約2kb(jt8A)であり、エクソン3からエクソン5へ伸びている。605:606からの生成物は約3.3kb(jt 9)であり、エクソン5からエクソン6へ伸びている。プライマーの組2213−2744はP1クローンp147からの約2.5Kb生成物(jtl5;JT115とも称される)の増幅に用いられた。この生成物はサブクローニングおよび配列決定のためLark Sequencing Technologies Inc.に送られた。2238:354プライマーはイントロンEをまたぐエクソン6からエクソン7の増幅に使用された。この生成物はサブクローン化されなかったが、我々により直接および完全に配列決定された。
P−1クローン(pl47)、このクローンのサブクローンおよびこのクローンのPCR生成物が配列決定された。ほとんどの配列決定は標準配列決定技術を用いてLark Sequencing Technologies Inc.により実施された。すべての重要な領域(例えば、イントロン−エクソン境界)およびクローン間の連結は我々の実験室で配列決定された。PCR生成物からのDNAはPromega Corp.(Madison,WI)から購入されたWizardTM PCR Preps DNA精製キットを使用して配列決定のために精製された。P−1クローンおよびプラスミドサブクローンはQiagen Inc.(Chatsworth,CA)Midiプラスミド精製キットを使用して精製された。精製PCR生成物およびプラスミドはPRISMTM DyeDeoxy Terminator Cycleシークエンシングキット(Applied Biosystems a Division of Perkin−Elmer Corp.,Foster City,CA)を用い、使用説明書に従って配列決定された。典型的には、配列決定反応当たり0.5ピコモルの鋳型および3ピコモルのプライマーが使用された。配列決定反応生成物はSelect−D G−50カラム(5プライム−3プライム;Boulder,CO)を用いて精製され、乾燥された。次に各々の試料を5μLのホルムアミド、1μLの50mM EDTAに溶解し、モデル370A
Automated Fluorescent Sequencer(ABI,Foster City,CA)中で加熱し、分析した。すべてのスプライス−部位連接(ジャンクション)、イントロンFおよびクローンを横切った連接が配列決定された。
種々の種からのDNAのEcoRI消化ゲノム(8μg)ブロットはBIOS Laboratories,New Haven,CTから購入された。ブロットは標準技術(Sambrook et al.,1989)を使用し、PEDF cDNAで探査された。
5’RACEは上記のようにアンカーオリゴをDynabeads上で前もって合成されたヒト網膜色素上皮cDNAへ結合させることにより実施された。5’末端はアンカープライマー(AmpliFinderのキット)およびPEDF−特異的プライマー2744を用いて増幅された。増幅は30サイクル行われた。一つの主要なバンドが約230bpに観察された。PCR生成物はpGEM−T(Promega Corp.,Madison,WI)にクローン化され、配列決定された。これらのクローンの内最も長いものはPEDFの5’末端から20bp伸びていることが観察された。
PEDF遺伝子はプライマー1590および1591(1590:5’−GGA CGC TGG ATT AGA AGG CAG CAA A−3’(配列ID番号:23);および1591:5’−CCA CAC CCA GCC TAG TCC C−3’(配列ID番号:24))を用い、Genome Systems(St.Louis,MO)によりP−1クローン(pl47)に単離された。このクローンが全PEDFを含んでいるかどうかを決定するため、pl47およびヒトゲノムDNAの両方がBamHI、EcoHI、HindIIIおよびPstIで消化され、続いてパルスフィールド装
置中、アガロースゲル電気泳動により分離された。アガロースゲルはブロットされ、PEDF cDNAクローン(Steeleら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1526−1530)で探査した。P−1クローンとゲノムDNA間のバンドパターンの比較は全PEDF遺伝子がこのクローンに含まれていることを示している。さらに、この結果はPEDFには一つの遺伝子のみが存在することも示している。
遺伝子のスケール地図が図1に示されている。PEDF遺伝子はその全部が配列決定された(配列ID番号:43)。クローンjt1、jt14、jt6Aおよび関連するPCR生成物(jt15、jt8Aおよびjt9)(図1)はLark Sequencing Technologies Inc.により配列決定された。遺伝子の残りの部分はp147クローンを鋳型として用いて遺伝子の異なった部分を増幅することにより配列決定された。すべてのエクソン、イントロン−エクソン連接(ジャンクション)および全イントロンFはP−1クローンp147より発生するPCR生成物から上記のように我々の実験室で両方の方向で配列決定された。エクソン1から下流のNotI部位はそれをまたいで増幅し、生成物を配列決定することにより確認された。遺伝子は約16Kbにわたり、8つのエクソンを持っている。すべてのイントロン−エクソン連接はAG/GT規則に従っている。イントロン−エクソン連接および隣接する配列は表1に示されている。
(PEDFプロモーターの分析)
PEDFを制御しているであろう可能な転写要素についてのいくらかの理解、PEDF発現についてのさらなる実験のための手引きを得るためにPEDF5’隣接領域(図3)の理論的分析を実施した。PEDF遺伝子の5’隣接領域には古典的TATAAA信号またはTATA−ボックスが欠けている。しかしながら、重要な転写因子により認識されるいくつかの興味ある特色および要素が含まれている。−164から−591および−822から−1050に2つのAlu反復要素が存在する。Alu領域の外側に、共通のATGCAAAT(Parslow et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:2650−2654;Falkner et al.(1984)Nature 310:71−74;Sturm et al.(1988)Genes & Devel.2:1582−1599;Faisst and Meyer(1992)Nuc.Acids Res.20:3−26)から1塩基異なった転写因子の偏在するオクタマーファミリー(Oct)のための2つの可能な部位が−29(ATCCAAAT)および−113(GTGCAAAT)に存在する。興味を引くもう一つの要素が−62に位置している。この要素、GTAAAGTTAACはHNF−1(肝細胞核因子)に結合している共通GTAATNATTAACに似ている(Frain,M.,et al.(1989)Cell 59:145−147)。これは多くの有力な肝臓遺伝子をトランス活性化するホームドメイン含有転写因子であるが(Kuo et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9838−9842)、内胚葉性分化への関連が示唆されている(Baumhueter et al.(1990)Genes Dev.4:371−379)。−202の配列TCAGGTGATGCACCTGCはAP−1により認識されレチノイン酸によりトランス活性化されるであろう人工的パリンドローム配列(TREp)TCAGGTCATGACCTGA(Umescono et al.(1988)Nature 336:262−265;Linney(1992)Curr.Topics in Dev.Biol.27:309−350)に非常に類似している。−22の配列TGAGTGCAおよび−207のTGATGCA(TREp内)はAP−1共通配列TGACTCA(Schule,et al.(1990)Cell 61:497−504)に類似している。TREp内に含まれる−204の配列AGGTGATGCACCTもまたその共通配列がAGGTCATGACCTである発生的に制御されたRAP(レチノイン酸受容体)モチーフ(Faisst and Meyer(1992)Nuc.Acids Res.20:3−26)に類似している。PEA3要素(ポリオーマウイルスエンハンサー活性化因子3)AGGAAG/A(Martin et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5839−5843;Faisst and Meyer(1992)Nuc.Acids Res.20:3−26)が縦列に−122および−129続いて再び−141に存在している。PEA3は転写因子ETSファミリーのメンバーであり(Macleod et al.(1992)TIBS 17:251−256)、その活性は非核癌遺伝子により制御されているようである(Wasylyk et al.(1989)EMBO J.8:3371−3378)。最も興味深い要素の1つは−654に配列GTGGTTATGと共に位置する。この要素は転写因子のC/EBP(CAATエンハンサー結合タンパク質)ファミリーにより認識される共通配列GTGGT/AT/AT/AG内にある(Faisst and Meyer(1992)Nuc.Acids Res.20:3−26)。この因子は成人表現型へ導く最終分化に関与するようである(Vellanoweth et al.(1994)Laboratory Investigation 70:784−799)。3つの可能なCACCCボックスが存在し、1つは−845に、および2つは逆の配向で−826および−905に存在する。これらはすべてAlu反復内にある。可能なSpl部位(CCCGGC)がAlu反復前の−153にあり、共通Spl部位GGCGGGがAlu反復の内側−1030に存在する。
(培養細胞におけるPEDF mRNAの発現)
(遺伝子発現分析)
レーン当たり2μgのポリ−(A)RNAを用い多ヒト組織mRNAノーザンブロット(Clonetech)が放射活性化標識667bpPCR増幅生成物(Tombran−Tink et al.,1994 Genomics,19:266−272)でハイブリダイズされた。ブロットはQuickHyb急速ハイブリダイゼーション溶液(Stratagene,La Jolla,CA)中、68℃で15分前もってハイブリダイズし、5x106cpm DNA/mlを含む同一の溶液中、68℃で1時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズされたブロットは2回100mlの2XSSC、0.1%SDSにて室温で15分間、さらに1回200mlの0.1XSSC、0.1%SDSにて68℃で30分間洗浄した。ブロットはKodax XAR−5フィルムおよびDupont補力スクリーンを用いて、−70℃で2時間オートラジオグラフィーを行った。
PEDFメッセンジャーRNAの発現が培養ヒト胎児RPE細胞以外のヒト組織で起こっているかどうかを決定するために、試験された各々の組織に対し等量のポリ−(A)RNA含んでいる多組織ヒト成人および胎児RNAブロットを分析した。結果は表4に示されている。PEDFプローブは分析された16の成人組織の14で種々の強度のハイブリダイゼーションの単一の1.5kb転写体を同定した。成人腎臓または末梢血白血球では信号が検出されなかった。成人脳、膵臓、脾臓および胸腺で弱い信号が観察できた。PEDFメッセンジャーRNAに対する多量のハイブリダイゼーションがヒト成人肝臓、骨格筋、精巣および卵巣で観察された。驚くべきことに、全脳RNAでは非常に弱い信号しか観察されなかった。試験された胎児組織では、非常に強いPEDF信号が肝臓組織で観察され、興味深いことには成人腎臓試料ではPEDFハイブリダイゼーションがなかったのに比較して胎児腎臓では有意に強度で信号が観察された。
(種々の系統発生的関連種におけるPEDFの比較分析)
(進化的保存分析)
多数の哺乳類および霊長類種を含む種々の種のリンパ球からのゲノムDNA(BIOS
laboratories,New Haven CT)の8μgをEcoRIで消化し、1%アガロースゲルで分離した。ゲルはトランスブロットされ、消化されたDNAを含む膜はノーザン分析と同一の方法および条件を用いてハイブリダイズした。
若干の系統発生的に関連する種間のPEDFの進化的保存が試験された。結果は図5に示されている。これらの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いると、鳥類、哺乳類および霊長類で約23kbの大きなEcoRI制限断片が観察された。おそらく使用されたヒトPEDFプローブとの低い相同性のためであろうが、より下等な種ではハイブリダイゼーションは観察されなかった(図5A)。ニワトリおよびマウスのEcoRI断片はヒトのものより幾分小さい。試験されたいくつかの哺乳類種において興味ある制限パターンが現れた(図5B)。6kbから2kbの間の大きさの範囲にいくつかのより小さな制限断片が観察された。試験されたすべての霊長類種で9kbから23kbの間の大きさの範囲により大きな断片が観察され、それは約9kbに追加の強くハイブリダイズする多形断片を持っている。
(培養における小脳顆粒細胞に対する色素上皮誘導因子の神経細胞栄養性効果細胞培養)
小脳顆粒細胞(CGC)はNovelliら(1988,Brain Res.,451:205−212)により記載されているように生後5または8日のSprague−Dawleyラット子供から調製された。簡単に記すと、髄膜を含まない組織を124mM NaCl、1mM NaH2PO4、1.2mM MgSO4、3mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、27μMフェノールレッドおよび25mM HEPES(pH7.4)を含む緩衝液中で切り刻み、550xgで3分遠心分離した。10−20匹の動物からの組織ペレットを再懸濁し、250μg/mlトリプシンを含む同一の緩衝液30ml中でトリプシン分解し(15分、37℃);26μg/mlのDNaseI、166μg/mlの大豆トリプシン阻害剤および0.5mMの追加のMgSO4を含む緩衝液をさらに15ml加えて上記のように組織を再び遠心分離した。ペレットを80μg/mlのDNase、0.52mg/mlのトリプシン阻害剤および1.6mMの追加のMgSO4を補給した1mlの緩衝液に再懸濁し、パスツールピペットで60回砕いた。0.1mMのCaCl2および1.3mMの追加のMgSO4を含む緩衝液2mlで懸濁液を希釈し、非分散物は5分間放置して沈澱させた。上清を別のチューブに移し、細胞は軽く遠心分離し、血清含有培地(25mM KCl、2mMグルタミン、100μg/mlゲンタマイシン、および10%熱不活性化ウシ胎児血清を含むイーグル基本培地)または化学的に決められた培地(5μg/mlインシュリン、30nMセレン、100μg/mlトランスフェリン、1000nMプトレシン、20nMプロジェステロン、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、および2mMグルタミンを含むDMEM:F12(1:1))(Bottenstein,1985 CellCulture in the Neuroscience,J.E.Bottenstein and G.Sato,eds.New York Plenum Publishing Corp.p.3−43)に再懸濁して回収した。細胞をポリ−L−リシン被覆96ウェルプレート(MTSアッセイおよび神経フィラメントELISAアッセイのため)または8ウェルチャンバースライド(免疫細胞化学およびBrdU標識のため)に2.5x105細胞/mlで加え、5%CO2を含む空気からなる雰囲気下、37℃で増殖させた。培養1日後、血清補給培地中の細胞にのみシトシンアラビノシド(Ara−C)を加えた(最終濃度50μM)。
96ウェルプレート中の小脳顆粒細胞をMTS(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、内部塩)およびPMS(フェナジンメトスルフェート)(最終濃度;333μg/ml MTSおよび25μM PMS)(Promega Corp.)と4時間CO2インキュベーター内でインキュベートした。PMS存在下、MTSは代謝的に活性な細胞に観察されるデヒドロゲナーゼ酵素により水可溶性ホルマザンに変換される(Coryet al.(1991)Cancer Comm,3:207−212)。ホルマザン生成物の量は分光学的に490nmで決定した。
インビトロでの日数(DIV)で7日後、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液(PBS)で3回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで10分間、続いて−20℃にて95%エタノール/5%酢酸で10分間固定した。NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)に対する一次抗体、GABA、カルビンジン、またはグリア原線維性酸性タンパク質(GFAP)とのインキュベーションを室温で60分実施した。2%正常ヤギ血清および0.2%BSA存在下、抗体を1:1000−1:5000で加えた。抗体はABCシステム(Vector Laboratories)およびジアミノベンジジンを用いて可視化した。各々の実験で2−3のウェルから少なくとも20視野を計数した。対照培養中のNSE陽性細胞と比較した他の抗体により染色された細胞の数の比を決定するために視野当たりの細胞の平均数を計算した。
BrdU標識は以下の変更を行ったGaoら(1991 Neuron,6:705−715)の方法により実施された。細胞は8ウェルチャンバースライドに入れ直ちにrPEDFを加えた。24時間後、BrdU(1:100;Amersham細胞増殖キット)を培養培地に24時間加え、その後細胞を2%パラホルムアルデヒドで固定し(10分)、95%エタノール/5%酢酸で処理し(10分)、抗BrdUモノクローナル抗体とインキュベートした(1:20、2時間)。培養物は次に西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス第二抗体と60分インキュベートした。ジアミノベンジジンーペルオキシダーゼ後、細胞はGel Mountにマウントされた。顕微鏡で標識された細胞のパーセント数を計数することにより、分裂指数が決定された。各々の値に対し、3000細胞の無作為試料が計数された。
わずかな変更を加えたDohertyら(1984 J.Neurochem.,42:1116−1122)の方法に従って神経フィラメントELISAが実施された。96ウェルマイクロタイタープレートで増殖させた培養物は4%パラホルムアルデヒドを含むPBSにより、4℃で2時間固定した。固定された細胞は15分0.1%トリトンX−100を含むPBSで処理して透過性を上げ、続いて非特異的結合を防ぐために60分10%ヤギ血清を含むPBSとインキュベーションを行った。培養物は次にモノクローナル抗−神経フィラメント抗体と4℃にて一夜インキュベートした(RMO 1:100で;小脳顆粒細胞の培養において神経芽のみを染色する)。10%ヤギ血清を含むPBSで2回洗浄後、細胞を第二抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス 1:1000で)と1時間インキュベートした。PBSおよび水で連続的に洗浄した後、培養物は0.2%O−フェニレンジアミンおよび0.02%H2O2を含む50mMクエン酸緩衝液(pH5.0)と30分インキュベートした。等量の4.5M H2SO4を添加することにより反応を停止させた。マイクロタイターリーダーを用い、490nmで反応生成物の一部の光学密度(O.D.)を読みとることにより生成物形成を定量した。
al.(1978)Science,199:313−315);小脳顆粒細胞を除いたすべての小脳ニューロンで合成されるGABAに対するポリクローナル抗体(Gruol and Crimi(1988)Dev.Brain Res.,41:135−146);ニューロン−特異性タンパク質であるカルビンジンおよびGFAP(アストログリアにのみ存在する中間フィラメントタンパク質)に対する抗体。結果は表2に要約されている。PEDFはSCM(30%増加)およびCDM(60%増加)の両方でNSE陽性細胞の数を有意に増加させた。GABA陽性ニューロンおよびPurkinje細胞(カルビンジン陽性)の数のわずかな(統計的には有意ではない)増加があった。従って、PEDFは顆粒ニューロンに対してのみ神経栄養性である。さらに、PEDFは培養液中に存在するGFAP陽性アストログリア(astrocytes)の数を有意に減少させた(SCMで30%の減少およびCDMで40%の減少)。このPEDFの”グリア静止性”は実施例14でさらに論議される。
(rPEDFペプチド、BPおよびBXの神経細胞栄養性特性)
PEDFの”神経細胞栄養性”活性について前の節で記載されたことは真実であり、強力な神経栄養性活性を示す組換え体PEDF(rPEDF)を比較的多量に製造することが可能である。適当な組換え体分子生物学的技術を用いて、より小さなPEDF分子の断片もまた製造でき、それらは神経栄養性かまたは神経細胞栄養性活性が試験される。図14はCGC生存率に対するPEDFのこれらの端が切断された形のうちの2つの効果を示している。BXおよびBPは各々PEDF分子のアミノ末端部分からの24および28kDa断片である。両断片は1xまたは10x濃度でニューロン生存因子として作用し、有意にCGCの寿命を延長させる。この実験において、ペプチドは実験の初めに一度に与えられ、細胞数は7日後に決定された。完全PEDF分子とともに、分子のN−末端に近いより小さな組換え体ペプチドも”神経細胞栄養性”であると結論付けられる。
(PEDFのグリア細胞静止特性)
ラット小脳顆粒細胞の初代培養中にニューロンとともに少数のグリアの異なった型が存在する。グリアはCNS中におけるニューロンのための”支持”要素であり、建築的骨格、およびニューロンが依存する代謝的支持系を形成する。グリアはまた、脳の腫瘍はほとんどグリアにより形成されおよびグリオシスがいくつかの神経消耗性疾患で問題であるので、臨床的にも重要である。我々の系において、細胞の培養混合集団をニューロンに特異的な抗体およびグリアの異なった型に特異的な他の抗体で免疫細胞化学的に染色した時に、グリアに対するPEDFの効果について気がついた。この目的のため、ニューロンの存在を示すために標準マーカーニューロン特異性エノラーゼ(NSE)およびその他、大グリア(astroglia)の存在を示すためにグリア原線維性酸性タンパク質(GFAP)および小グリア(microglia)染色のためにOX−42を使用した。この実験において(表2)、我々はニューロンがPEDF処理によりより長く生きることを知っていたのでNSE染色で予期される増加を観察したが、GFAP染色での予期されない減少を観察した。このことはPEDF処理培養物において大グリア細胞をより少なくする可能性を示している。
(天然ウシPEDFの特性付け)
特異的抗体によって成人IPMにPEDFの存在が示されたので、天然PEDFの精製源としてウシIPM洗液を使用した。RPEおよび網膜細胞はPEDF mRNAを発現するが、これらの細胞抽出液では抗−BHはウェスタン移行物上のPEDFバンドを検出できず、このことはPEDFがIPM内に迅速に放出されることを示唆している。ウシIPMに存在するPEDFは全可溶性タンパク質の1%未満であると現在見積もられている(即ち、約2−5ng/ウシの眼)。生理学的温度では、IPM中のPEDFタンパク質
は長い期間安定に残っており、SDSに抵抗する非還元複合体は形成しない。従って、その安定な性質のため、培養実験およびインビボでの移植におけるその潜在的有効性は非常に高い。
(色素上皮誘導因子:高度に特異的なポリクローナル抗体による特性決定)
PEDFに対するポリクローナル抗体を開発するために、大腸菌で産生された精製組換え体ヒトPEDFを使用した。抗−rPEDFはおとなのウシの眼からのIPM洗液のウェスタン移行物上の一つのポリペプチドを特異的に認識した(図19)。ヒト組換え体PEDFに対するポリクローナル抗血清は特異的にrPEDFを認識する。ヒトrPEDFのウェスタン移行物およびスロットブロットはrPEDFに対するウサギポリクローナル抗血清、Ab−rPEDFで処理された。4−クロロ−1−ナフトールでの免疫染色の写真が示されている。パネルA、rPEDFの0.5μgのウェスタン移行物が抗血清の希釈の増加をアッセイするために使用された。rPEDFタンパク質は移行前にSDS−12.5%PAGEで分離された。希釈率は各々のレーンの上に示されている。希釈抗血清は免疫検出に使用する前に5μg/mlでrPEDFと前もってインキュベートされ、1:10,000+rPEDFと示されている。左の数字はビオチニル化SDS−PAGE標品の分子量を示している。パネルB、1%BSA/PBS中rPEDFの量を増量し、マニホールドでニトロセルロース膜へ供給した。膜は抗血清抗−rPEDFおよび1:10,000希釈されたウサギ前免疫血清で処理された。右に示されている数字は膜へブロットされたrPEDFの量を表している。各々のペーパーに使用された血清は図の上に示されている。
(色素上皮誘導因子:神経栄養性活性を持つセルピン)
ヒト胎児PEDF cDNAから誘導されるアミノ酸配列は、セリンプロテアーゼ阻害剤(セルピン)ファミリーとその一次構造の同一性を共有し(約30%)、セルピンの構造的完全さに必須な残基の90%を保存している。しかしながら、組換え体PEDFはセリンプロテアーゼであるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼまたはカテプシンGを阻害しない。PEDFの天然の標的はまだ解明されていない。PEDFに対して作製した抗体によるウェスタンブロットの免疫検出および蛋白分解性基質としてカゼインを含むゲルのザイモグラフィーにより、網膜色素上皮および網膜間の空間である、光受容体間マトリックス(IPM)からのタンパク質を分析した。結果は、ウシIPMは安定でグリコ
シル化されたPEDFポリペプチド(50,000Mr)を目当たり2−5μg含んでいることを示している。トリプシン、サブチリシン、キモトリプシンおよびエラスターゼによるウシPEDFの制限蛋白分解は46,000Mrのポリペプチドを産生し、蛋白分解性切断に感受性を持つヒンジ領域を持つ球状構造が示唆される。一方、カゼインSDS−PAGEザイモグラフィーはIPM中のプロテアーゼ活性が低いことを明らかにし、それは約80,000±5,000の2倍移動した。カゼイン分解性活性は1μg/mlのアプロチニンおよび10mM PMSFをゲル混合物に加えると100%阻害されたが、E64またはEDTAには影響を受けなかった。重要なことは、IPMタンパク質は、約80,000Mrのセリンプロテアーゼであるプラスミノーゲンに対する抗体と反応しなかったことである。rPEDFタンパク質が1μg/mlで加えられた場合、これらのカゼイン分解性活性ならびに未知の起源のその他のセリンプロテアーゼ活性の信号は約50%弱められた。これらの結果は新規セリンプロテアーゼおよびセルピンPEDFのための天然の細胞外部位としてのIPMを示唆しており、両方とも全タンパク質の≦1%で存在している。
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