ES2288300T3 - Factor derivado del epitelio pigmentario: caracterizacion, organizacion genomica y secuencia del gen de pedf. - Google Patents

Abstract

ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LA PROTEINA NEUROTROFICA CONOCIDA COMO FACTOR DERIVADO DE EPTITELIO CON PIGMENTO (PEDF), UNA VERSION CORTADA DE PEDF, CONSIDERADA COMO RPEDF, Y PROTEINAS EQUIVALENTES, VECTORES QUE INCLUYEN DICHOS ACIDOS NUCLEICOS, CELULAS DEL RECEPTOR EN LAS QUE SE HAN INTRODUCIDO DICHOS VECTORES, METODOS RECOMBINANTES PARA PRODUCIR PEDF, RPEDF, Y PROTEINAS EQUIVALENTES, LA PROTEINA RPEDF Y PROTEINAS EQUIVALENTES DE RPEDF Y PEDF-BP, -BX Y BA, Y LA PROTEINA PEDF PRODUCIDA POR METODOS RECOMBINANTES. SE DESCRIBEN EFECTOS Y METODOS DE ESTAS VARIANTES SOBRE: 1) LA DIFERENCIACION NEURONAL (EFECTO NEUROTROFICO), 2) LA SUPERVIVENCIA NEURONAL (EFECTO NEURONOTROFICO), Y 3) LA INHIBICION GLIAL (EFECTO GLIASTATICO).

Description

Factor derivado del epitelio pigmentario: caracterización, organización genómica y secuencia del gen de PEDF.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a una proteína neurotrófica, neuronotrófica y gliastática. Más específicamente, esta invención se refiere a las propiedades biológicas de una proteína conocida como factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y a formas recombinantes de la proteína. Esta invención también se refiere a una versión truncada de PEDF que se denomina PEDFr. Además de PEDF y PEDFr y proteínas funcionalmente equivalentes, esta invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican para PEDFr, y fragmentos del mismo, a vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, a células huésped en las que se han introducido tales vectores, y al uso de estas células huésped para producir tales proteínas.

Antecedentes de la invención

El factor derivado del epitelio pigmentario, conocido de otra forma como factor de diferenciación del epitelio pigmentario, se identificó en el medio condicionado de células epiteliales pigmentarias de la retina humana fetal en cultivo como un agente neurotrófico extracelular que podía inducir el sobrecrecimientos de neuritas en células de retinoblastoma humanas en cultivo (Tombran-Tink et al. (1989) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 30 (8), 1700-1707). La fuente de PEDF, concretamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR), puede ser crucial para el desarrollo y función normales de la retina neural. Las células del EPR sintetizan y secretan una variedad de moléculas, incluyendo factores de crecimiento. Dado que el EPR se desarrolla antes que, y se encuentra adyacente a, la retina neural, y que funciona por parte de la barrera hematorretiniana (Fine et al. (1979) The Retina, Ocular Histology: A Text and Atlas, New York, Harper & Row, 61-70), se ha implicado al EPR en enfermedades vasculares, inflamatorias, degenerativas y distróficas del ojo (Elner et al. (1990) Am. J. Pathol., 136, 745-750). Además de factores de crecimiento, también se intercambian nutrientes y metabolitos entre el EPR y la retina. Por ejemplo, el EPR suministra a la retina los factores de crecimiento bien conocidos PDGF, FGF, TGF-\alpha, y TGF-\beta (Campochiaro et al. (1988) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29,305-311; Plouet (1988) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29, 106-114; Fassio et al. (1988) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29, 242-250; Connor et al. (1988) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29, 307-313). Es muy probable que estos y otros factores desconocidos suministrados por el EPR influyan sobre la organización, diferenciación y funcionamiento normales de la retina. El documento WO 93/24529 re refiere entre otros al tratamiento neurotrófico de nervios lesionados, en particular, el tratamiento con PEDNF da como resultado la promoción del sobrecrecimiento de neuritas y la regeneración del nervio.

Con el fin de estudiar y determinar los efectos de los supuestos factores de diferenciación secretados por el EPR, se han sometido las células cultivadas a extractos retinales y medio condicionado obtenido a partir de cultivos de células del EPR fetal humano. Por ejemplo, la patente estadounidense número 4.996.159 (Glaser) describe un inhibidor de la neovascularización recuperado a partir de células del EPR que es de un peso molecular de aproximadamente 57.000 +/- 3.000. De manera similar, las patentes estadounidenses 1.700.691 (Stuart), 4.477.435 (Courtois et al.), y 4.670.257 (Guedon nacida Saglier et al.) describen extractos retinales y el uso de estos extractos para la regeneración celular y el tratamiento de enfermedad ocular. Además, las patentes estadounidenses números 4.770.877 (Jacobson) y 4.534.967(Jacobson et al.) describen inhibidores de la purificación celular purificados de la parte posterior del humor vítreo bovino.

Sólo recientemente se ha aislado PEDF a partir del EPR humano como una proteína de 50 kDa (Tombran-Tink et al. (1989) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29, 414; Tombran-Tink et al. (1989) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 30, 1700-1707; Tombran-Tink et al. (1991) Exp. Eye Res., 53, 411-414). Específicamente, se ha demostrado que PEDF induce la diferenciación de células del retinoblastoma Y79 humanas, que son un homólogo neoplásico de retinoblastos normales (Chader (1987) Cell Different., 20, 209-216). Los cambios diferenciadores inducidos por PEDF incluyen la extensión de una malla compleja de neuritas, y la expresión de marcadores neuronales tales como la enolasa específica de neuronas y proteínas de los neurofilamentos. Esto es por lo que se cree que la síntesis y secreción de la proteína PEDF por el EPR influye sobre el desarrollo y diferenciación de la retina neural. Además, el PEDF sólo se expresa sumamente en células de la retina humana no diferenciadas, como células del retinoblastoma Y79, pero está o bien ausente o bien regulado por disminución en sus homólogos diferenciados. Recientemente, se ha notificado que el ARNm de PEDF se expresa en abundancia en fibroblastos W1 de feto humano quiescentes y no se expresa en sus homólogos senescentes (Pignolo et al., 1993).

Un estudio adicional de PEDF y exploración de su posible uso terapéutico en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, vasculares, degenerativas y distróficas de la retina y del sistema nervioso central (SNC) necesita la obtención de grandes cantidades de PEDF. Desafortunadamente, la baja abundancia de PEDF en el ojo humano fetal y además, la disponibilidad poco común de su tejido fuente, especialmente debido a las restricciones en el uso de tejido fetal en aplicaciones terapéuticas y de investigación, hacen en el mejor de los casos que el estudio adicional de PEDF sea difícil. Por tanto, se mantiene una necesidad de grandes cantidades de PEDF y proteínas equivalentes. Por consiguiente, la obtención de ácidos nucleicos que codifican para PEDF y proteínas equivalentes, y la capacidad de producir PEDF y proteínas equivalentes en grandes cantidades tendría un impacto significativo sobre el estudio adicional de PEDF, su estructura, actividad bioquímica y función celular, así como el descubrimiento y diseño de usos terapéuticos para PEDF.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro para prolongar la supervivencia de células neuronales que comprende:

tratar una población celular que comprende neuronas con el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica.

Las células neuronales están en un cultivo de células tisulares o comprenden un componente de tejido que se trasplanta en un sujeto. Las células pueden ser células de cerebro fetal, neuronas en cultivo primario, o neuronas fotorreceptoras.

En una realización específica el método de la invención comprende:

a) introducir un ácido nucleico que codifica para PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica en una célula huésped; y

b) expresar dicho ácido nucleico y proporcionar de ese modo dicho PEDF o fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica.

La célula huésped puede ser una célula neuronal, una célula de la astroglía, una neurona fotorreceptora o una célula del epitelio pigmentario de la retina.

La invención se refiere también al uso de PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica, una molécula de ácido nucleico que codifica para PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica y/o un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica para la preparación de una composición farmacéutica para prolongar la supervivencia de las células neuronales.

La molécula de ácido nucleico usada en la presente invención es una molécula de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico seleccionado de:

(a) una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID No: 1; y

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 2 ó 3.

Es un objeto de la presente invención proporcionar ácidos nucleicos que codifican para PEDF y fragmentos funcionales del mismo, vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, células huésped en las que se han introducido tales vectores, y un método recombinante para producir PEDF y proteínas equivalentes. Es otro objeto de la presente invención obtener las secuencias de ADN genómico que codifican para PEDF, identificar las uniones intrón-exón, la ubicación cromosómica en el genoma humano, y proporcionar las regiones reguladoras del gen que flanquean la secuencia genómica. La presente invención se refiere a tal ADN genómico de PEDF.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar características estructurales de PEDF y sus semejanzas con la familia de serpina de inhibidores de la serina proteasa, tanto estructural como funcional.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar PEDF y proteínas equivalentes producidas según tal método recombinante, en el que el PEDF y las proteínas equivalentes así producidas están libres de los riesgos asociados con el aislamiento de PEDF a partir de organismos fuente que se producen de manera natural.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar ácidos nucleicos para una versión truncada de PEDF, denominada PEDFr, y proteínas equivalentes, vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, células huésped en las que se han introducido tales vectores, y un método recombinante para producir PEDFr y proteínas equivalentes. Es también un objeto de la presente invención proporcionar PEDFr y proteínas equivalentes producidas según tal método recombinante.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar una proteína PEDF que tiene actividad neuronotrófica. Se observa la actividad neuronotrófica en la supervivencia prolongada de las células neuronales. Es otro objeto de la invención proporcionar métodos para tratar células neuronales de modo que promuevan/aumenten la supervivencia neuronal
que comprenden tratar tales poblaciones celulares con una cantidad eficaz de PEDF o un fragmento activo del mismo.

También se describen en el presente documento anticuerpos que reconocen específicamente a PEDF, anticuerpos o bien monoclonales o bien policlonales, preparados frente a la proteína nativa, la proteína recombinante o un fragmento inmunorreactivo de la misma. También se describen en el presente documento métodos para detectar PEDF mediante inmunoensayos usando tal preparación de anticuerpos para determinar el envejecimiento y/u otras enfermedades degenerativas. También se describe un método para usar anticuerpos frente a PEDF para inhibir específicamente la actividad de PEDF.

Estos y otros objetos y ventajas de la presente invención, así como características inventivas adicionales, serán evidentes a partir de la descripción de la invención proporcionada en el presente documento.

Descripciones de las figuras

Figura 1: Estructura del gen de PEDF humano: mapa de restricción y organización del gen de PEDF humano. Los exones 1-8 se indican mediante cuadrados negros y se numeran como 1-8. Los intrones y el ADN flanqueante se representan mediante líneas horizontales y se marcan como A-G. Las posiciones de varios clones genómicos se muestran por encima y por debajo del gen representado. Los sitios de reconocimiento para la endonucleasa de restricción NotI ("N"), BamHI ("B") y EcoRI ("E") se indican mediante flechas verticales.

Figura 2: Análisis de tipo Southern de ADN genómico humano (A) y P147 (B) restringidos con endonucleasa Bam HI, EcoRI, HindIII y PstI. Se analizaron con sonda las membranas de Southern de perfiles de geles electroforéticos de campo pulsado con ADNc de PEDF marcado radiactivamente. El patrón de hibridación del ADN de P147 es coherente con el ADN genómico humano total. Se indican marcadores de tamaño.

Figura 3: Región flanqueante en 5' del gen de PEDF. Se muestran el primer exón (letras mayúsculas) y los primeros 1050 pb de la región flanqueante en 5'. Se subrayan dos secuencias Alu repetitivas. Se subrayan y marcan posibles sitios de unión para HNF-1, PEA3, Octomer (Oct), c/EBP. Se muestran los supuestos sitios de AP-1 en negrita, y TREp/
RAR están doblemente subrayados. La secuencia subrayada (discontinua) en el exón 1 se determinó mediante

\hbox{5'RACE.}

Figura 4: Análisis por transferencia de tipo Northern del ARNm de PEDF: análisis de la expresión génica del transcrito de PEDF humano en varios tejidos fetales y adultos humanos. Los tejidos de los cuales se obtuvo el ARN se muestran por encima de los carriles correspondientes. Las membranas contienen 2 \mug de ARN poli(A) para cada muestra y se analizaron con sonda con ADNc marcado radiactivamente para detectar PEDF humano. Se observa un transcrito único de 1,5 kb tanto en tejidos adultos como fetales con la intensidad de hibridación mayor en el hígado, testículos, músculo esquelético y ovarios mientras que la señal para el cerebro, páncreas y timo era significativamente más débil que la de los otros tejidos. No se detectó señal significativa para el riñón y bazo adultos. Se observó una diferencia significativa en los niveles de ARNm de PEDF entre el riñón adulto y el fetal.

Figura 5: Parentesco evolutivo del gen de PEDF humano: cada carril representa un total de 8 \mug de ADN genómico para cada especie digeridos con Eco RI. Se muestra el análisis por transferencia de tipo Southern con una sonda de PEDF. Se muestran las señales de hibridación para pollo (A), mamíferos (B) y primates (C). Se observa un gran fragmento de aproximadamente 23 kb en todos los primates y muchas especies de mamíferos. Además, se observan varios polimorfismos en las diferentes especies de mamíferos examinadas.

Figura 6A y 6B: Relación entre la densidad celular en placas y la densidad óptica medida mediante ensayo de MTS. Se añadieron diferentes concentraciones de células granulares del cerebelo en el día 8 tras el nacimiento a placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio que contenía suero (6A), o medio definido químicamente (6B). Se midió la densidad óptica en los días in vitro (DIV) 1, 4 ó 7. Cuadrado, DIV 1, círculo negro, DIV 4; círculo en blanco, DIV7. Se representan los datos como una función de la densidad celular (n = 6).

Figura 7: Transcurso de tiempo para la estimulación por PEDF de la supervivencia celular en medio definido químicamente. Se cultivaron células granulares del cerebelo en el día 8 tras el nacimiento en placas de 96 pocillos. Se añadió PEDF a DIV 0 y se midió entonces la densidad óptica en DIV 1, 4, 7 ó 10. Barra negra, control; barra con rayas ascendentes hacia la izquierda, tratado con PEDF (50 ng/ml); barra con rayas ascendentes hacia la derecha, tratado con PEDF (500 ng/ml). Los datos se expresan como densidad óptica/pocillo (medias \pm EEM, n = 6). Se realizó el análisis estadístico mediante la prueba Scheefe de comparaciones múltiples a posteriori de ANOVA bilateral. **P<0,0001 frente al control.

Figura 8: Curva de dosis-respuesta para PEDF en medio definido químicamente. Se añadieron diferentes concentraciones de PEDF en DIV 0 y se realizó un ensayo de MTS en DIV 7. Los datos se expresan como razón con respecto al control (media \pm EEM, n = 6). Se realizó el análisis estadístico mediante una prueba de la F Scheffe de comparaciones múltiples a posteriori de ANOVA unilateral. **P<0,0001 frente al control.

Figura 9: Ensayo de MTS de células granulares del cerebelo en el día 5 tras el nacimiento a DIV 1 y DIV 2. Se cultivaron células granulares del cerebelo en el día 5 tras el nacimiento en placas de 96 pocillos usando medio que contenía suero sin Ara-C (A), o medio definido químicamente sin F12 (B). Se realizó el ensayo de MTS en DIV 1 y DIV 2. Barra en negro, control; barra de rayas, tratado con PEDF (500 ng/ml). Los datos se expresan como densidad óptica/pocillo (medias \pm EEM, n = 6). Se realizó el análisis estadístico mediante una prueba de la F Scheffe de comparaciones múltiples a posteriori de ANOVA bilateral. **P<0,0005 frente al control.

Figura 10: Incorporación de BrdU en células granulares del cerebelo en el día 5 tras el nacimiento. Se cultivaron células granulares del cerebelo en el día 5 tras el nacimiento en una placa de 96 pocillos usando medio que contenía suero (SCM) sin Ara-C, o medio definido químicamente (CDM) sin F12. Se añadió PEDF en DIV 0, se añadió BrdU en DIV 1 y las células se fijaron en DIV 2. Barra en negro, control; barra de rayas, tratado con PEDF (500 ng/ml). El número de ácidos nucleicos marcados se expresa como un porcentaje de la población celular total (media \pm EEM). Para cada valor, se contaron al menos 3000 células.

Figura 11: Relación entre la densidad celular y el contenido en neurofilamentos medido mediante ELISA. Se añaden diferentes concentraciones de células granulares del cerebelo en el día 8 tras el nacimiento a placas de 96 pocillos y se cultivan. Se midió la densidad óptica en DIV 7. Los datos se representan como una función de la densidad celular.

Figura 12: Ensayo de ELISA de neurofilamentos en células granulares del cerebelo en el día 8 tras el nacimiento. Se cultivaron las células en una placa de 96 pocillos con o sin PEDF usando medio que contenía suero (SCM) o medio definido químicamente (CDM). Tras fijar las células en DIV 7, se llevó a cabo el ELISA de neurofilamentos y se expresan los datos como una razón con respecto al control (media \pm EEM, n = de 6 a 10). Barra en negro, control; barra de rayas, tratado con PEDF (500 ng/ml). Se realizó el análisis estadístico mediante una prueba de la F Scheffe de comparaciones múltiples a posteriori de ANOVA bilateral. **P<0,05 frente al control.

Figura 13: Resumen de los efectos neuronotróficos de PEDF durante 10 días de cultivo.

Figura 14: Efectos de péptidos BP y BX truncados sobre la viabilidad de CGC.

Figura 15: Efecto de PEDF sobre la astroglía del cerebelo.

Figura 16: Efecto de PEDF sobre la microglía del cerebelo.

Figura 17: Purificación de proteína inmunorreactiva con PEDF a partir de IPM (matriz interfotorreceptora) bovina. Los lavados de IPM bovina se sometieron a A) cromatografía de exclusión molecular TSK-3000 seguido por B) cromatografía Mono-S. Los insertos de inmunotransferencia de tipo Western demuestran las fracciones que contienen PEDF.

Figura 18: Desglicosilación enzimática de PEDF tal como se demuestra mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se proporciona el tratamiento con PEDF en la parte superior de cada carril. Los números indican las posiciones de patrones en peso molecular.

Figura 19: El anticuerpo frente a PEDFr reconoce específicamente PEDF nativo con un título alto. A) Inmunotransferencia de tipo Western que demuestra la eficacia del anticuerpo hasta una dilución de al menos 1:50.000 y que la adición de PEDFr en exceso bloquea completamente la visualización de la banda. B) El análisis por transferencia en ranura muestra la capacidad para detectar \leq 1 ng de proteína PEDF bovina nativa.

Figura 20: Efecto negativo del anticuerpo frente a PEDF sobre la extensión de neuritas en células Y-79. Fila superior: cultivos control de albúmina sérica bovina (BSA). Fila central: efecto del anticuerpo sobre la inducción de neuritas mediante la proteína PEDF bovina nativa. Fila inferior: efecto del anticuerpo sobre la inducción de neuritas mediante la matriz interfotorreceptora (IPM).

Figura 21: Análisis por microscopía de fase del sobrecrecimiento de neuritas en presencia o ausencia de PEDF.

Figura 22: Análisis por microscopía de fase del sobrecrecimiento de neuritas en presencia de PEDF recombinante y PEDF aislado, nativo.

Figura 23: Diagrama esquemático de las deleciones C-terminales de PEDFr.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una proteína que tiene propiedades novedosas, importantes y no obvias. El factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) es una proteína que tiene características neurotróficas, neuronotróficas y gliastáticas. La presente invención se refiere además a las secuencias de ADN que codifican para el gen de PEDF, al ADN genómico que contiene el gen de PEDF y a fragmentos del gen de PEDF que codifican para fragmentos de proteína de PEDF que tienen actividad biológica.

Actividad "neurotrófica" se define en el presente documento como la capacidad para inducir diferenciación de una población de células neuronales. Por ejemplo, la capacidad de PEDF para inducir la diferenciación en células de retinoblastoma en cultivo se considera actividad neurotrófica.

Actividad "neuronotrófica" se define en el presente documento como la capacidad para aumentar la supervivencia de poblaciones de células neuronales. Por ejemplo, la capacidad de PEDF para actuar como un factor de supervivencia neuronal sobre células neuronales es actividad neuronotrófica.

Actividad "gliastática" se define en el presente documento como la capacidad para inhibir el crecimiento y proliferación de células de la glía. Por ejemplo, la capacidad de PEDF para impedir el crecimiento y/o proliferación de células de la glía es actividad gliastática.

Basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína aclarada en la presente invención, se ha encontrado que PEDF tiene una homología de secuencia extensa con la familia del gen de la serpina, cuyos miembros son inhibidores de la serina proteasa. Muchos miembros de esta familia tienen un dominio estrictamente conservado en el extremo carboxilo-terminal que sirve como el sitio reactivo de la proteína. Por tanto, se cree que estas proteínas derivan de un gen ancestral común. Sin embargo, la regulación del desarrollo difiere en gran medida entre los miembros de la familia del gen de la serpina y muchos se han desviado de la actividad inhibidora de proteasas clásica (Bock (1990) Plenum Press, New York Bock, S.C., Protein Eng. 4, 107-108; Stein et al. (1989) Biochem. J. 262, 103-107). Aunque el PEDF comparte homología de secuencia con las serpinas, el análisis de la secuencia de ADNc indica que carece del dominio conservado y por tanto no puede funcionar como inhibidor de proteasas clásico.

La secuenciación genómica y el análisis de PEDF ha proporcionado secuencias de intrones y exones así como aproximadamente 4 kb de secuencia en sentido 5'. La presente invención demuestra la ubicación del gen para PEDF en 17p13.1 usando tanto hibridación in situ como análisis de paneles híbridos de células somáticas (Tombran-Tink, et al., (1994) Genomics, 19:266-272). Esta es muy próxima al gen supresor de tumores p53 así como a la ubicación cromosómica de varios cánceres hereditarios no relacionados con mutaciones en el producto del gen p53. Por tanto, PEDF se convierte en un gen candidato principal para estos cánceres.

La secuencia genómica de PEDF de longitud completa se representa por SEQ ID NO: 43. El gen de PEDF abarca aproximadamente 16 Kb y contiene 8 exones que tienen todos sitios de corte y empalme consenso convencionales. La región flanqueante en 5' del gen de PEDF contiene dos elementos repetitivos Alu que cubren aproximadamente dos tercios de los primeros 1050 pb de la supuesta secuencia promotora. También hay varios motivos de secuencia que pueden reconocerse por miembros de varias familias de factores de transcripción. La presencia de dos posibles sitios de unión para la familia octamérica ubicua de factores de transcripción, puede explicar la presencia de PEDF en la mayor parte de los tejidos sometidos a prueba. Sin embargo, la presencia de otros elementos más específicos, sugiere que PEDF está bajo control preciso y apoya trabajos previos que incluyen sus efectos sobre diversos procesos tales como diferenciación neuronal y senescencia de fibroblastos.

La secuencia genómica de PEDF o fragmentos de la misma son útiles como sondas para detectar el gen en una célula. Además, tal sonda es útil en un kit para la identificación de un tipo celular que lleva el gen. Pueden detectarse mutaciones, deleciones u otras alteraciones en la organización del gen mediante el uso de una sonda de ADN derivada de la secuencia genómica de PEDF.

Distribución en el tejido

Aunque el PEDF se expresa de manera particularmente alta por células del EPR, puede detectarse en la mayor parte de tejidos, tipos celulares, tumores, etc. mediante análisis por transferencia de tipo Northern e inmunotransferencia de tipo Western. Se detecta fácilmente, por ejemplo en los humores vítreo y acuoso. También se ha abordado la importante cuestión de la ubicación subcelular de PEDF. Aunque la mayor parte del PEDF parece secretarse, se ha usado un anticuerpo frente a PEDF para analizar con sonda células del EPR de mono cultivadas y se encontró que el PEDF está asociado con el núcleo así como con estructuras del citoesqueleto muy específicas en el citoplasma. De manera importante, esto varía con la edad de las células y el estado del ciclo celular específico examinado. Por ejemplo, la proteína parece concentrarse en las puntas de los seudópodos de células del EPR de primate que interactúan con el sustrato durante las fases iniciales de unión. Más tarde, esta tinción desaparece y existe aparición de la proteína en asociación con estructuras específicas del citoesqueleto y del núcleo. Por tanto, parece que el PEDF desempeña un importante papel intracelular tanto en el núcleo como en el citoplasma.

Implicación en el ciclo celular

La presente invención indica que existe expresión en células Y-79 no diferenciadas, que se dividen y existe poca o ninguna expresión en sus homólogos diferenciados, quiescentes (Tombran-Tink, et al. (1994) Genomics, 19:266-272). Pignolo et al. (1993) J. Biol. Chem., 268:2949-295) han demostrado que la síntesis de PEDF en células de fibroblastos WI-38 está restringida a la fase G_{0} del ciclo celular en células jóvenes. Además, en células senescentes ancianas, está ausente el ARN mensajero de PEDF.

Producción de PEDF recombinante

La segmentación del polipéptido PEDF es básica para estudios sobre la estructura-función. Para este fin, los vectores de expresión que contienen fragmentos de secuencias que codifican para PEDF proporcionan una fuente excelente para sintetiza y aislar diferentes regiones del polipéptido PEDF. Se logró la expresión de secuencias de PEDF de feto humano con vectores de expresión de E. coli y el ADNc de PEDF de feto humano. Se ha mostrado que el producto de PEDF recombinante (PEDFr) es un factor neurotrófico biológicamente activo y se obtiene en rendimientos del orden de 1,3 mg/g de células de E. coli húmedas. También pueden prepararse péptidos truncados a partir de constructos biológicos moleculares apropiados y expresarse en E. coli. Usando estos productos se ha demostrado que pueden distinguirse dos regiones distintas en la estructura primaria de PEDF: 1) un "sitio activo" que confiere actividad neurotrófica a la molécula que está ubicado en los residuos de aminoácidos 44-121 cerca del extremo N-terminal de la proteína y 2) una región cercana al extremo C-terminal con homología con respecto a un bucle expuesto de la serpina, es decir, el sitio activo de la serpina "clásico". Estos resultados sugieren 1) que no se requiere la conformación nativa global de PEDF para el sobrecrecimiento de neuritas y 2) que la inhibición de las serina proteasas no puede justificar la actividad biológica de PEDF. Ahora se dispone de una serie de constructos de PEDFr truncados que extienden la secuencia
de la proteína y pueden ubicar con exactitud el "sitio activo" neurotrófico específico cerca del extremo N-terminal.

Caracterización con un anticuerpo policlonal altamente específico

Se usó PEDF humano recombinante purificado para desarrollar un anticuerpo policlonal ("anti-PEDFr") que bloquea específicamente la actividad neurotrófica mediada por PEDF. Además, el anticuerpo anti-PEDFr bloque completamente la actividad neurotrófica inducida por IPM.

Propiedades neurotróficas de PEDF

Además de demostrar que el PEDF nativo y PEDFr son neurotróficos en los sistemas de células tumorales Y-79 y Weri, la presente invención determinó si PEDF tenía un efecto sobre neuronas normales en cultivos primarios. Para este fin, se realizaron estudios usando cultivos de células granulares del cerebelo (CGC) normales preparadas a partir de la rata 8 días tras el nacimiento. Las células tratadas con PEDFr no respondieron al tratamiento mostrando un aspecto morfológico más neuronal. Sin embargo, el PEDF tuvo un gran efecto sobre la supervivencia de las células granulares. Dado que estas células no son células tumorales o transformadas, tienen una vida finita en cultivo, muriendo en aproximadamente 21 días dependiendo del medio de cultivo. Sin embargo, el cultivo tratado con PEDF contenía hasta 10 veces más células tras 10 días de cultivo en medio libre de suero en comparación con el cultivo no tratado (figura 4). Estos resultados se determinaron; 1) mediante observación microscópica directa y recuento celular y 2) mediante el uso de un ensayo de MTS (tetrazolio/formazán) que determina el número de células vivas (véase el ejemplo 11). Por tanto, el PEDF tiene un efecto espectacular sobre la supervivencia de neuronas del SNC y debe añadirse a la corta lista de proteínas "neuronotróficas" que surgen recientemente.

En investigación general mediante cultivo de tejidos

Dos problemas que afectan generalmente a cualquier experimento de cultivo de tejidos usando neuronas y glía son que las neuronas tienden a morir rápidamente y que la glía tiende a invadir la placa de cultivo. El PEDF o sus péptidos pueden ayudar en ambos aspectos. Por tanto, un uso comercial de PEDF podría ser como un aditivo de medio de cultivo general cuando van a cultivarse células del SNC.

En estudios de trasplante en el SNC

Se cree que el trasplante de neuronas puede curar ciertas patologías. Por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson, el trasplante de células de cerebro fetal específicas en pacientes podría aliviar o curar los problemas asociados con la enfermedad. Sin embargo, uno de los problemas principales con el que enfrentarse sería prolongar la vida de las células trasplantadas y mantenerlas diferenciadas, por ejemplo secretando las sustancias apropiadas, etc. El tratamiento previo de las células con PEDF podría ayudar en ambas de estas áreas. De manera similar, la transfección o bien de neuronas o bien de astroglía con el gen de PEDF antes de la implantación puede ser una fuente a largo plazo de PEDF en el sitio del trasplante.

Existe mucha actividad para intentar trasplantar la retina neural y células fotorreceptoras para ayudar a curar la ceguera. Los intentos hasta la fecha no han sido fructíferos debido tanto a la no diferenciación como a la muerte de los injertos. De nuevo, el PEDF puede ayudar en ambos aspectos. Específicamente, las neuronas fotorreceptoras que van a trasplantarse pueden tratarse previamente con PEDF o transfectarse el gen dentro de las células antes de la cirugía. Alternativamente, puede transfectarse PEDF a altos niveles en células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) adyacentes en las que puede servir como una fuente superior a la normal de la proteína. Varios investigadores han mostrado ahora que las células del EPR cultivadas sobreviven muy bien tras su trasplante en el espacio interfotorreceptor de animales de prueba. Por tanto, es factible la transfección de células del EPR humanas in vitro con el gen de PEDF y luego el uso de las mismas en el trasplante retinal.

En enfermedades neurodegenerativas

Muchas enfermedades neurodegenerativas y otras lesiones del SNC (cerebro y retina) se tipifican mediante la muerte de neuronas y la sobrepoblación de glía (gliosis). Puede usarse PEDF eficazmente en estos estados para prolongar la vida y funcionamiento de las neuronas primarias y para evitar el avance de la glía. El PEDF puede ser eficaz, por ejemplo, en el bloqueo de la activación microglial en respuesta a una lesión del SNC así como en la prolongación/moderación de las vidas de las neuronas.

En la retina, puede predecirse que el PEDF inhibe a las células de la glía de Muller. Dado que las células de la glía de Muller son similares a la astroglía, el PEDF sería eficaz de manera similar en el bloqueo de la gliosis en estados tales como desprendimiento de retina, diabetes, retinitis pigmentosa, etc. así como en la moderación de las vidas de las neuronas retinales.

En cánceres gliales

La mayor parte de las formas principales de cáncer que atacan al SNC implican elementos de la glía, el PEDF es un factor gliastático que puede usarse en combinación con otras formas de tratamiento. Por ejemplo, junto con la cirugía, el PEDF puede inhibir eficazmente la propagación o recurrencia de la enfermedad.

Análisis genético

La presente invención se refiere a la determinación de la organización del gen de PEDF humano y su promotor y al análisis de su parentesco evolutivo y a la expresión en una variedad de tejidos fetales y adultos humanos.

La presente invención proporciona, entre otras cosas, un ácido nucleico que codifica para PEDF. En particular, se proporciona una secuencia de ADNc tal como se expone en SEQ ID NO: 1. Esta secuencia de ADNc codifica para PEDF, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. Se mapean secuencias genómicas adicionales en la figura 1 y se proporcionan en SEQ ID NO: 43. Se proporcionan fragmentos adicionales de la secuencia genómica de PEDF en SEQ ID NO: 9 hasta SEQ ID NO: 12. Se identifica la ubicación de las uniones intrón-exón en la tabla 1 y en SEQ ID NO: 25 hasta SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 43.

El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), que pueden derivar de cualquier fuente, pueden ser de cadena sencilla o doble, y pueden contener opcionalmente nucleótidos sintéticos, no naturales o alterados que pueden incorporarse en los polímeros de ADN o ARN. El ácido nucleico de la presente invención es preferiblemente un segmento de ADN.

La presente invención proporciona además versiones truncadas de PEDF. La más larga de éstas se denomina PEDFr, y comprende la secuencia de aminoácidos Met-Asn-Arg-Ile fusionada a Asp^{44}...Pro^{418} de PEDF, cuyo extremo amino-terminal se ha delecionado. La proteína PEDFr comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La presente invención proporciona también un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de PEDFr, es decir, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

El experto en la técnica apreciará que más de un ácido nucleico puede codificar para cualquier proteína dada debido a la degeneración del código genético y que se permiten excepciones al apareamiento de bases clásico en la tercera posición del codón, tal como se proporciona por las denominadas "normas de Wobble". Por consiguiente, se pretende que la presente invención abarque todos los ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, así como proteínas equivalentes. La frase "ácidos nucleicos equivalentes" pretende abarcar todos estos ácidos nucleicos.

El experto en la técnica también apreciará que pueden alterarse secuencias de aminoácidos sin afectar adversamente a la función de una proteína particular. De hecho, algunas alteraciones en la secuencia de aminoácidos pueden dar como resultado una proteína con características mejoradas. La determinación de qué aminoácidos pueden alterarse sin afectar adversamente a la función de una proteína es bien conocido por los expertos en la técnica. Además, las proteínas que incluyen más o menos aminoácidos pueden dar como resultado proteínas que son funcionalmente equivalentes. Por consiguiente, se pretende que la presente invención abarque todas las secuencias de aminoácidos que den como resultado proteína PEDF o fragmentos de proteína funcionales de la misma.

Algunos ejemplos de posibles ácidos nucleicos equivalentes y proteínas equivalentes incluyen ácidos nucleicos con sustituciones, adiciones o deleciones que dirigen la síntesis de la proteína PEDFr y fragmentos de proteína equivalentes de la misma; ácidos nucleicos con secuencias reguladoras diferentes que dirigen la producción de proteínas PEDFr; variantes de PEDFr que presentan diferentes aminoácidos y/o un número de aminoácidos diferente de cuatro fusionados al extremo amino-terminal de la proteína; y PEDF y PEDFr y fragmentos de proteína funcionales de las mismas con sustituciones, adiciones, deleciones, modificaciones y/o modificaciones tras la traducción de aminoácidos, tales como glicosilaciones, que no afectan adversamente a la actividad. Dado que se ha correlacionado la actividad neurotrópica con una parte particular de la proteína PEDF, los fragmentos que contienen estos residuos están claramente dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una proteína equivalente, un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o proteínas variantes modificadas de manera conservativa, y ácidos nucleicos variantes de los mismos modificados de manera conservativa.

En particular, la presente invención proporciona el vector \piFS17, que comprende el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, y el vector pEV-BH, que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Se apreciará por los expertos en la técnica que los insertos de ADNc descritos pueden presentarse en vectores alternativos. Por ejemplo, los insertos pueden estar en vectores de naturaleza diferente, tales como fagos, cápsidas virales, plásmidos, cósmidos, fagémidos, YAC, o incluso unidos al exterior de un fago o cápsida viral. Los vectores pueden diferir en el intervalo de huésped, estabilidad, replicación y mantenimiento. Además, los vectores pueden diferir en los tipos de control ejercido sobre los insertos clonados. Por ejemplo, los vectores pueden colocar insertos clonados bajo el control de un promotor, potenciador, o sitio de unión a ribosomas diferentes, o incluso colocarlos como parte de un transposón o elemento genético móvil.

La presente invención también proporciona una célula huésped dentro de la cual se ha introducido un vector, que comprende un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una proteína equivalente, un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una proteína equivalente, o un ácido nucleico equivalente de la misma. En particular, la célula huésped puede tener el vector \piFS17, que comprende el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o el vector pEV-BH, que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Los vectores de la presente invención pueden introducirse dentro de cualquier célula huésped adecuada, ya sea eucariota o procariota. Estas células huésped pueden diferir en sus condiciones de crecimiento preferidas, sus requisitos nutritivos, y su sensibilidad frente a los agentes ambientales. Puede emplearse cualquier medio apropiado para introducir los vectores en las células huésped. En el caso de células procariotas, la introducción del vector puede lograrse, por ejemplo, mediante electroporación, transformación, transducción, conjugación o movilización. Para células eucariotas, los vectores pueden introducirse mediante el uso de, por ejemplo, electroporación, transfección, infección, microproyectiles recubiertos con ADN, o fusión de protoplastos.

La forma del ácido nucleico introducido puede variar con el método usado para introducir el vector en una célula huésped. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser circular cerrado, mellado o linealizado, dependiendo de si el vector debe mantenerse como un elemento de replicación autónoma, integrado como un provirus o un profago, o transfectarse de manera transitoria, infectarse de manera transitoria como con un virus o fago de replicación incapacitada, o introducirse establemente mediante acontecimientos de recombinación por entrecruzamiento único o doble.

La presente invención también proporciona un método para producir PEDF, PEDFr y proteínas equivalentes, comprendiendo el método expresar la proteína en una célula huésped. Por ejemplo, una célula huésped en la cual se ha introducido un vector que comprende un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una proteína equivalente, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende los aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una proteína equivalente, o un ácido nucleico equivalente de la misma, puede cultivarse en condiciones adecuadas para producir la proteína deseada. En particular, una célula huésped en la que se ha introducido el vector \piFS17, que comprende el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, o el vector pEV-BH, que comprende un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, puede cultivarse en condiciones adecuadas para producir las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.

La presente invención también proporciona PEDF producido de manera recombinante, y fragmentos de proteína funcionales de la misma que se han producido según el presente método inventivo mencionado anteriormente de cultivar una célula huésped apropiada para producir la proteína deseada. La producción de una proteína tal como PEDF mediante medios recombinantes permite la obtención de grandes cantidades de la proteína en un estado sumamente purificado, libre de cualquier agente que provoque enfermedades que pueda acompañar a la proteína aislada o purificada a partir de un organismo fuente que se produce de manera natural, y evita la necesidad de usar, por ejemplo, tejido fetal como fuente de tal proteína.

Puede suministrarse PEDF recombinante y fragmentos de proteína funcionales de la misma como principios activos a células mediante una diversidad de medios, incluyendo, por ejemplo, la introducción de ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, que codifican para la proteína y por consiguiente pueden transcribirse y/o traducirse dentro de la célula huésped, la adición de proteína exógena, y otros medios adecuados de administración tal como se conocen por los expertos en la técnica. En cualquier forma en que se suministre, el principio activo puede usarse o bien solo o bien en combinación con otros principios activos, usando composiciones y formulaciones farmacéuticas del principio activo que son apropiadas para el método de administración. Los excipientes farmacéuticamente aceptables, es decir, vehículos, adyuvantes, o diluyentes, se conocen bien por los expertos en la técnica, y están disponibles fácilmente. La elección del excipiente se determinará en parte por el compuesto particular, así como por el método particular usado para administrar el compuesto. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas que pueden prepararse en el contexto de la presente invención. Sin embargo, se prefieren los excipientes farmacéuticamente aceptables que no alteran las actividades neurotróficas, neuronotróficas y gliastáticas de la proteína recombinante.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar adicionalmente la presente invención y no deben interpretarse como limitativos de su alcance de ningún modo.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la digestión con tripsina de PEDF y la secuenciación de aminoácidos de los fragmentos resultantes.

Se purificó PEDF a partir del medio de un cultivo primario de células del EPR de feto humano mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Entonces, se redujo y se alquiló la PEDF purificada mediante HPLC. Después de eso, se secó y volvió a disolverse en 50 \mul de tampón CRA (urea 8 M, carbonato de amonio 0,4 M, pH 8,0) y se añadieron 5 \mul de ditiotreitol 45 mM (DTT) (Calbiochem, San Diego, CA). Tras calentar a 50ºC durante 15 minutos, se enfrió la disolución, y se añadieron 5 \mul de ácido yodoacético 100 mM (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Tras 15 minutos, se diluyó la disolución hasta una concentración de urea 2 M y se sometió a digestión con tripsina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) durante 22 horas a 37ºC usando una razón de enzima:sustrato de 1:25 (p/p). Se separaron los péptidos trípticos mediante HPLC de fase inversa, de calibre estrecho en un equipo de HPLC de Hewlett-Packard 1090, equipado con un detector de matriz de diodos 1040, usando una columna C18 Vydac de 2,1 mm X 150 mm. Se usó un gradiente de B al 5% a 0 minutos, B al 33% a 63 minutos, B al 60% a 95 minutos, y B al 80% a 105 minutos, con una velocidad de flujo de 150 \mul/minuto. En este gradiente, el tampón A era ácido trifluoroacético al 0,06%/H_{2}O, y el tampón B era ácido trifluoroacético al 0,055%/acetonitrilo. Se obtuvieron los datos cromatográficos a 210 y 277 nm, y los espectros de UV desde 209 hasta 321 nm, de cada pico. Se aplicaron las muestras para el análisis de la secuencia amino-terminal a un filtro de fibra de vidrio preciclado con polibreno y se sometieron a una degradación Edman automatizada (Harvard Microchemical Facility, Boston, MA) en un secuenciador de proteínas en fase gaseosa modelo 477A de ABI (programa NORMAL 1). Las fracciones de aminoácido feniltiohidantoína resultantes se identificaron manualmente usando un equipo de HPLC modelo 120A de ABI en línea y un integrador Shimadzu CR4A.

La digestión con tripsina de PEDF purificada y el análisis de aminoácidos de los fragmentos resultantes produjo secuencias peptídicas no solapantes, incluyendo las secuencias JT-3 (SEQ ID NO: 6):

100

y JT-8 (SEQ ID NO: 7):

101

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la construcción de oligonucleótidos, basándose en las secuencias peptídicas del ejemplo 1, el uso de los oligonucleótidos en el aislamiento de ADNc de PEDF, y la secuenciación de ADNc de PEDF.

Basándose en las secuencias peptídicas JT-3 y JT-8 del ejemplo 1 y los datos de uso del codón, se construyeron los oligonucleótidos oFS5665 (SEQ ID NO: 4): 5'-AGYAAYTTYTAYGAYCTSTA-3' y oFS5667 (SEQ ID NO: 5): 5'-CTYTCYTCRTCSAGRTARAA-3' en un sintetizador de ADN/ARN ABI 392 y se usaron como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se amplificó una vez una biblioteca de ADNc de Charon BS de ojo fetal humano (obtenida del Dr. A. Swaroop del Kellog Eye Institute) (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) y se exploró mediante PCR (Friedman et al., Screening of \lambdagt11 Libraries, en: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, NY (1990), págs. 253-260) usando un termociclador Techne y reactivos convencionales (GeneAMP, Perkin-Elmer Cetus), excepto que se usó MgSO_{4} a 3 mM. Se aisló un fragmento de amplificación de PCR de aproximadamente 350 pb en un gel 3:1 NuSieve al 3% (FMC Biochemicals, Rockland, ME) usando papel de DEAE-celulosa NA-45 (Schleicher and Scheull) (Sambrook et al., citado anteriormente). Se marcó el fragmento con \alpha^{32}P-dCTP (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) mediante cebado aleatorio (kit Random Priming, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), y se usó para seleccionar 200.000 unidades formadoras de placa (UFP) de la biblioteca de ojo fetal humano.

Se aislaron ocho clones positivos (Sambrook et al., citado anteriormente), y se purificó el ADN de los clones positivos según los protocolos de preparación de Qiagen Maxi (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Se cortaron los insertos de los clones positivos con Not I (BRL, Gaithersburg, MD), se circularizaron con ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA), se transformaron en células competentes Epicurian Sure de Escherichia coli (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), y se sembraron en placas de caldo Luria (LB) que contenían ampicilina y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactósido (X-gal).

Se seleccionaron colonias blancas basándose en que tales colonias deben tener un inserto, y se aisló ADN de plásmido a partir de cultivos de colonias únicas mediante el protocolo de minipreparación de plásmidos de Qiagen. Se digirieron los plásmidos purificados con EcoRI y Hind III (BRL). Se añadieron estos sitios de restricción durante la construcción de la biblioteca mediante la ligación de ligadores a los extremos 5' y 3' del inserto, por tanto la digestión con EcoR I - Hind III escinde el inserto presente en plásmidos aislados. Se sometieron a electroforesis estos fragmentos en un gel de agarosa al 0,7% para determinar el tamaño del inserto. Se seleccionó el plásmido que presentaba el mayor inserto, concretamente \piFS17, para su mapeo y posterior secuenciación usando el kit de secuenciación Sequenase 2.0 (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) para confirmar la identidad del clon. Se realizó el análisis de secuencia usando el paquete de software MacVector (International Biotechnologies, Inc.) y el banco de datos de secuencia GenBank® (Intelligenetics, Mountain View, CA).

El análisis de la secuencia de \piFS17 reveló una secuencia de bases que comprende SEQ ID NO: 1, con un marco de lectura abierto (ORF) largo que codifica para los 418 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, un codón de inicio ATG típico y una señal de poliadenilación (no mostrada en SEQ ID NO: 1). La secuencia codificante del clon se alinea exactamente con todas las secuencias peptídicas de PEDF determinadas previamente. La secuencia de aminoácidos deducida también contiene un tramo de aminoácidos hidrófobos que podrían servir como péptido señal. Una comparación de la secuencia codificante y la secuencia peptídica con el banco de datos GenBank® indica que PEDF es una proteína única que tiene homología significativa con la familia del gen de la serpina (inhibidor de la serina proteasa), que incluye [\alpha]-1-antitripsina humana. Aunque algunos de los miembros de esta familia génica muestran actividad neurotrófica (Monard et al. (1983) Prog. Brain Res., 58, 359-364; Monard (1988) TINS, 11, 541-544), PEDF carece de homología con la secuencia consenso propuesta para el dominio reactivo de la serpina.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión para la producción de PEDF recombinante.

Se construyó un vector de expresión usando el plásmido \piFS17, que contiene el ADNc de longitud completa para PEDF humano tal como se describió en el ejemplo 2. Se colocó la secuencia que codifica para PEDF bajo el control de un promotor P_{L} del bacteriófago lambda presente en el plásmido pEV-vrf2 (Crowl et al., Gene, 38, 31-38 (1985)) para obtener el vector pEV-BH. Esto se logró obteniendo un fragmento BamH I-Hind III de \piFS17 que comprendía una parte de la región que codifica para PEDF (concretamente, los nucleótidos 245 a 1490 de SEQ ID NO: 1), digiriendo el plásmido pEV-vrf2 con EcoR I-Hind III, haciendo ambos fragmentos romos mediante una reacción de relleno en los extremos BamH I y EcoR I con ADN polimerasa I (fragmento Klenow), y ligando los fragmentos de extremos romos/extremos compatibles resultantes entre sí. El vector pEV-BH resultante coloca una distancia de 8 nucleótidos entre la secuencia Shine-Dalgarno (SD) y la región que codifica para PEDF. El constructo especifica Met-Asn- Arg-Lle-Asp^{44}- - -Pro^{418} de modo que se codifica para una proteína de 379 aminoácidos, conocida como PEDFr, tal como se indica en SEQ ID NO: 3. Los aminoácidos en el extremo amino-terminal de la proteína PEDFr no se producen en PEDF nativo y resultan de la fusión de ácidos nucleicos durante la construcción de pEV-BH.

Para verificar la producción de la proteína PEDF recombinante mediante pEV-BH, se propagó el plásmido en la cepa RRI de E. coli (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), que lleva el plásmido pRK248cIts compatible de bajo número de copias que contiene un gen para codificar para un represor \lambdacIAt2 sensible a la temperatura (Bernard et al. (1979) Methods in Enzymology, 68, 482-492). Se realizó la inducción de la proteína tal como se describe en Becerra et al. (1991) Biochem., 30, 11707-11719, con las siguientes modificaciones. Se hicieron crecer células bacterianas que contenían pEV-BH en medio LB que contenía ampicilina 50 \mug/ml a 32ºC hasta la fase logarítmica temprana, de modo que DO_{600 \ nm} = 0,2. Se aumentó rápidamente la temperatura del cultivo hasta 42ºC incubando el matraz en un baño de agua a 65ºC, y se hicieron crecer las bacterias posteriormente a 42ºC durante 2-3 horas en un incubador de flujo de aire a 340 rpm. Se tomaron alícuotas para las lecturas de absorbancia a 600 nm.

Las proteínas nacientes, sintetizadas tras la inducción de la proteína, se marcaron radiactivamente. Después de que la temperatura del cultivo hubiera alcanzado 42ºC, se añadieron 150 \muCi de L-[^{35}S]metionina (1040 Ci/mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) por ml de cultivo, y continuó la incubación a 42ºC durante 10 minutos y 30 minutos. Se recogieron las células por centrifugación y se lavaron con tampón TEN (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, y NaCl 100 mM). Se resolvieron los péptidos marcados con ^{35}S a partir de extractos bacterianos totales y se analizaron en PAGE al 12% - SDS seguido por fluorografía. Se detectó una banda correspondiente a un polipéptido de 42.820 de M_{r} a los 10 y 30 minutos tras la inducción. El tamaño obtenido para la proteína recombinante expresada por pEV-BH correspondía al tamaño esperado para la secuencia codificante subclonada en pEV-BH. De una manera similar, pueden sintetizarse y purificarse fragmentos más pequeños (BP = 28.000 de M_{r}; BX = 24.000 de M_{r}; BA = 9.000 de M_{r}). El péptido BP incluye los aminoácidos 44 hasta 269 de PEDF, el péptido BX incluye los aminoácidos 44 hasta 277 de PEDF, y el péptido BA incluye los aminoácidos 44 hasta 121 de PEDF.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la construcción de vectores de expresión que contienen ADNc de PEDF de longitud completa.

De una manera similar a la descrita en el ejemplo 3 para la construcción de pEV-BH, se colocó el ORF de PEDF del plásmido \piFS17 bajo el control del promotor P_{L} del bacteriófago lambda presente en los plásmidos pRC23 y pEV-vrf1 (Crowl et al. Gene, 38, 31-38 (1985)). Esto se logró obteniendo el fragmento SfaN I-Hind III de \piFS17 que comprende una parte del ADNc de PEDF (concretamente, los nucleótidos 107 a 1490 de SEQ ID NO: 1), digiriendo los plásmidos con EcoR I-Hind III, haciendo los fragmentos romos mediante una reacción de relleno en los extremos SfaN I y EcoR I con ADN polimerasa I (fragmento Klenow), y ligando los fragmentos de extremos romos/extremos compatibles resultantes entre sí. Los vectores pRC-SH y pEV-SH resultantes colocan una distancia de 14 y 8 nucleótidos, respectivamente, entre la secuencia SD y la región que codifica para PEDF. El constructo pRC-SH abarca el ORF de PEDF de longitud completa, y especifica una proteína PEDF de 418 aminoácidos, con su extremo amino-terminal que se produce de manera natural, tal como se expone en SEQ ID NO: 2. El constructo pEV-SH abarca el ORF de PEDF de longitud completa, y especifica una proteína de fusión amino-terminal de PEDF de 425 aminoácidos, precediendo Met-Asn-Glu-Leu-Gly-Pro-Arg (SEQ ID NO: 8) a la secuencia de PEDF de SEQ ID NO: 2. Estos aminoácidos adicionales en el extremo amino-terminal no se producen en PEDF nativo, y los codones en pEV-SH que especifican estos aminoácidos adicionales resultan de la fusión de ácidos nucleicos durante la construcción de pEV-SH.

Para verificar la producción de las proteínas recombinantes especificadas por los dos vectores, se introdujeron los vectores en la cepa RRI de E. coli [pRK248cIts], y se realizó la inducción de la proteína y se controló mediante marcaje metabólico con ^{35}S-metionina durante la inducción de una manera similar a la expuesta en el ejemplo 3. La expresión inducida de las proteínas especificadas por pRC-SH y pEV-SH tuvo un efecto negativo sobre el crecimiento de células bacterianas. En comparación con cultivos bacterianos que contenían los plásmidos originales, los cultivos que contenían pRC-SH y pEV-SH crecieron y se dividieron más lentamente. Este efecto negativo sobre el crecimiento bacteriano se correlacionaba con la distancia entre el codón de inicio y el SD, lo que sugiere que una distancia de ese tipo más corta da como resultado una traducción más eficaz de la proteína recombinante. No se detectó un polipéptido candidato de 46.000 de M_{r} en los medios o lisados celulares de los cultivos bacterianos que contenían pRC-SH y pEV-SH. Sin embargo, se observó una proteína de 35.000 de M_{r} en extractos de cultivos que contenían pRC-SH y pEV-SH, pero no en extractos de cultivos que contenían plásmidos originales. Esto puede indicar que el extremo amino-terminal de PEDF es sensible a proteasas y que el PEDF de longitud completa recombinante se metaboliza en este huésped particular. Alternativamente, el no poder observar las proteínas PEDF recombinantes de tamaño anticipado puede reflejar un artefacto experimental que podría superarse mediante el uso de vectores de expresión, huéspedes, promotores inducibles, sitios de subclonación, métodos de aislamiento o detección de proteína recombinantes, o medios de inducción de la proteína alternativos.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe un método para producir grandes cantidades de PEDF producido de manera recombinante.

Se resuspendió un total de 1 g de células E. coli que contenían PEDFr en 50 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, sacarosa al 20%, y EDTA 1 mM. Se mantuvieron las células en hielo durante 10 minutos, se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 x g, y se resuspendieron en 50 ml de agua helada durante 10 minutos. Se separaron las paredes celulares externas lisadas de los esferoplastos mediante centrifugación a 8000 x g.

Se resuspendieron los esferoplastos sedimentados en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 5 mM, pepstatina 1 \mug/ml y aprotinina 20 \mug/ml. Se sonicó con sonda la suspensión con un sonicador (Ultrasonics, Inc., modelo W-225) para lisar las membranas celulares. Se realizaron tres estallidos a pulsos de 30 segundos con una pausa de 30 segundos mientras la muestra se sumergía en un baño de agua con hielo. Se añadieron ARNasa TI (1300 unidades, BRL) y ADNasa I (500 \mug, BRL) a la suspensión de células sonicadas, y se incubó la suspensión a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se diluyó esta suspensión mediante la adición de 40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 5 mM, pepstatina 1 \mug/ml y aprotinina 20 \mug/ml, y se sedimentaron los cuerpos de inclusión en bruto mediante centrifugación a 13.000 x g durante 30 minutos. Se resuspendió el material particulado que consistía en cuerpos de inclusión en 40 ml de PBS que contenía sacarosa al 25%, EDTA 5 mM y Triton X-100 al 1%, se incubó en hielo durante 10 minutos y se centrifugó a 24.000 x g durante 10 minutos. La etapa de lavado se repitió tres veces. Finalmente, se resuspendieron los cuerpos de inclusión en 10 ml de tampón de desnaturalización que contenía Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, guanidina-Cl 5 M, y EDTA 5 mM. La suspensión se sonicó con sonda brevemente durante 5 segundos en un baño de agua con hielo. Se incubó la suspensión resultante en hielo durante una hora adicional. Tras la centrifugación a 12.000 x g durante 30 minutos, se añadió el sobrenadante a 100 ml de tampón de renaturalizacion que contenía Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, glicerol al 20%, DTT 1 mM, pepstatina 1 \mug/ml, y aprotinina 20 \mug/ml, y se agitó suavemente a 4ºC durante la noche para renaturalizar la proteína. Se separaron las fracciones soluble e insoluble mediante centrifugación a 13.500 x g durante 30 minutos.

Se purificó adicionalmente la fracción soluble concentrándola hasta 1 ml usando un microconcentrador Centricon 30 (Amicon Div., W.R. Grace & Co., Beverly, MA), y dializándola frente a tampón A (fosfato de sodio 50 mM, DTT 1 mM, glicerol al 20%, EDTA 1 mM, pepstatina 1 \mug/ml, y benzamidina 1 mM) a 4ºC durante 3 horas. Se centrifugó el extracto dializado a 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf (modelo 5415C) durante diez minutos. Se colocó en capas la fracción de sobrenadante sobre una columna de flujo rápido de S-Sepharose (Pharmacia, New Market, NJ) (1 ml de volumen de lecho) equilibrada previamente con tampón A. Se lavó la columna con dos volúmenes de columna de tampón A. Finalmente, se eluyó PEDFr recombinante con un gradiente escalonado de NaCl 50 100, 150, 200, 300, 400, 500, y 1000 mM en tampón A. Se recogieron fracciones de 1 ml mediante flujo de gravedad, y se dializaron frente al tampón A. La fracción 300, que contenía PEDFr recombinante, se almacenó a -20ºC. La recuperación en la fracción 300 fue de 50 \mug por gramo de células empaquetadas, lo que representa el 25% de la proteína total.

La mayoría del PEDFr se recuperó de la fracción insoluble disolviendo la fracción en 10 ml de guanidinio-Cl en tampón B (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, DTT 1 mM, EDTA 2 mM). Se centrifugó la disolución a 10.000 x g durante 5 minutos. Se colocó en capas el sobrenadante sobre una columna de Superose-12 (Pharmacia, New Market, NJ) unida en serie a una segunda columna de Superose-12 (cada columna de 2,6 cm x 95 cm) equilibradas previamente con tampón que contenía guanidinio-Cl 4 M en tampón B. La velocidad de flujo fue de 3 ml/min. Se agruparon las fracciones que contenían PEDFr recombinante de la columna de Superose-12 y se dializaron frente a tampón C (urea 4 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,5, benzamidina 1 mM, pepstatina 1 \mug/ml, EDTA 4 mM). Se hizo pasar la fracción dializada a través de un filtro de 0,22 \mum (Miller-GV, Millipore Corp., Bedford, MA). Se colocó en capas la disolución filtrada sobre una columna mono-S (Pharmacia, New Market, NJ) (1 cm x 10 cm, d x h) equilibrada previamente con tampón C. Se lavó la columna con tampón C, y se eluyó el PEDFr recombinante con un gradiente de NaCl 0 mM - 50 mM en tampón C a 0,5 ml/min. Se recogieron fracciones de dos ml, y se agruparon las fracciones pico de PEDFr recombinante. La recuperación en las fracciones agrupadas fue de 0,5 mg de PEDF recombinante por gramo de células empaquetadas.

Ejemplo comparativo 6

Este ejemplo describe el uso de PEDF recombinante purificado como un agente de diferenciación.

Se hicieron crecer células Y79 (ATCC, HTB18) en medio esencial mínimo de Eagle con sales de Earl (MEM) complementado con suero bovino fetal al 15% y antibióticos (penicilina 10.000 u/ml y estreptomicina 10 mg/ml) a 37ºC en un incubador humidificado bajo CO_{2} al 5%. Se propagaron las células durante dos pasajes tras recibirlas de la ATCC y después se congelaron en el mismo medio que contenía DMSO al 10%. Se usaron unas pocas de las alícuotas congeladas para cada experimento de diferenciación. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

Tras la descongelación, se mantuvieron las células, sin pasajes adicionales, en el medio que contenía suero hasta que estaba disponible el número de células apropiado. Se recogieron las células por centrifugación y se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en PBS y se contaron. En ese punto, se sembraron en placas 2,5 x 10^{5} células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (Nunc, Inc., Roskilde, Dinamarca) con 2 ml de medio libre de suero (MEM, complementado con piruvato de sodio 1 mM, HEPES 10 mM, 1X aminoácidos no esenciales, L-glutamina 1 mM, mezcla ITS al 0,1% (insulina 5 \mug/ml, transferrina 5 \mug/ml, selenio 5 ng/ml, Collaborative Research, Bedford, MA) y antibióticos tal como se describió anteriormente.

Se añadieron efectores de diferenciación y tampones control a las 12-16 horas después de sembrar en placas y se incubaron los cultivos y se dejaron en reposo durante 7 días. Al octavo día, se transfirieron las células a placas de seis pocillos recubiertas con poli-D-lisina (Collaborative Research, Bedford, MA) y se sustituyó el medio viejo por 2 ml de medio libre de suero nuevo, tras la unión de las células al sustrato. Se mantuvieron los cultivos en estas condiciones durante hasta 11 días. Se examinaron diariamente los cultivos posteriormente a la unión para detectar pruebas morfológicas de diferenciación así como para la cuantificación del sobrecrecimiento de neuritas usando un microscopio de contraste de fases Olympus CK2.

En comparación con las células no tratadas, sólo los cultivos de Y79 que se expusieron a PEDFr recombinante mostraron cualquier prueba significativa de diferenciación neuronal. Pudo detectarse algo de sobrecrecimiento de neuritas (inferior al 5%) en cultivos control tratados con el mismo tampón usado para solubilizar PEDFr, y no se encontraron pruebas de diferenciación en cultivos procesados de la misma manera sin la adición de PEDF o tampón (figura 22A, "control"). La microscopía de contraste de fases de los cultivos tratados con PEDFr mostró que entre el 50-65% de los agregados celulares tenían extensiones de neuritas en el día 3 posterior a la unión sobre la poli-D-lisina (figura 22B, "PEDF"). Estas extensiones de neuritas a los 3 días aparecían como proyecciones cortas a partir de células con forma de pera en los bordes de los agregados celulares. El número de agregados que se diferenciaban, el número de células que se diferenciaban por agregado y la longitud de los procesos similares a neuritas aumentó con el tiempo posterior a la unión. En el día 5 posterior a la unión, aproximadamente el 75-85% de los agregados mostraba signos de diferenciación extendiéndose neuritas desde la mayor parte de sus células periféricas. Los cultivos tratados con PEDFr alcanzaron el máximo grado de diferenciación en el día 7 posterior a la unión, cuando el 85-95% de las células se agregan. En ese momento, se observaban dos tipos de procesos neuronales, es decir, neuritas únicas 2-3 veces más largas que las observadas en el día 3 que se extendían desde células periféricas de agregados aislados, y procesos mucho más largos y finos que formaban una red de ramificaciones entre agregados celulares vecinos. Con incubación prolongada, es decir, más allá de 10 días posteriores a la unión, hubo un marcado descenso en la proporción de las conexiones en red, y no más crecimiento de las neuritas únicas, aunque la viabilidad de los agregados celulares no se afectó gravemente, y se mantuvo a aproximadamente el 75-80% en diferentes experimentos. No se observaron diferencias entre PEDF nativo purificado y PEDF recombinante (PEDFr) tal como se observa en la
figura 23.

Los clones de ADNc de PEDF y PEDFr no solo proporcionan medios para producir grandes cantidades de las proteínas PEDF y PEDFr, sino que sirven también como fuentes para sondas que pueden usarse para estudiar la expresión y regulación del gen de PEDF. Además, estas secuencias pueden usarse en la técnica antisentido de detención de la traducción para inhibir la traducción de PEDF endógeno.

Las proteínas PEDF y PEDFr producidas de manera recombinante y proteínas equivalentes pueden usarse como agentes neurotróficos potentes in vitro e in vivo. Pueden determinarse actividades bioquímicas adicionales de estas proteínas como agentes neurotrópicos mediante pruebas in vitro convencionales, que permitirán el desarrollo de otros usos terapéuticos para estas proteínas en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, vasculares, degenerativas y distróficas de la retina. Dado que estas proteínas son potentes agentes neurotróficos de este tipo, puede preverse que estas proteínas podrían modificarse para lograr utilidad terapéutica en el tratamiento de tejidos diferentes de la retina, que también responden a factores neurotróficos. Estas proteínas incluso pueden encontrar más utilidad genérica como factores de "diferenciación" para tejidos no neurales y ciertos tipos de cáncer.

Ejemplo comparativo 7

Junto con el PEDF recombinante de 3.000 de peso molecular, se han sintetizado constructos recombinantes más pequeños para determinar si tienen actividad neurotrófica. Los péptidos más pequeños podrían ofrecer una variedad de ventajas sobre los constructos de longitud completa tales como mayor solubilidad, mejor penetración en la membrana, menos antigenicidad, mayor facilidad de preparación, etc.

La figura 23 muestra sólo tres de los constructos que se han sometido a prueba. BP, BX y BA son de aproximadamente 28.000, 24.000 y 9.000 de peso molecular respectivamente y representan mutantes de deleción C-terminales. Todos estos muestras actividad neurotrófica similar a la descrita en las figuras 21 y 22. El descubrimiento novedoso en el presente documento es que incluso el péptido de 9.000 de peso molecular (sólo aproximadamente el 20% del peso molecular completo de la proteína nativa) muestra actividad neurotrófica sorprendente. Además, el péptido neurotrófico activo representa secuencias en el extremo N-terminal en lugar del extremo C-terminal que se sabe que contiene el sitio activo de la serpina. Por tanto, que el sitio activo esté en el extremo N-terminal y que pueda lograrse actividad con una molécula tan pequeña son descubrimientos sorprendentes que no podían haberse predicho basándose en cualquier descubrimiento previo.

TABLA 1 Organización de exones e intrones del gen de PEDF humano

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Tabla 1

Los exones están en la caja superior y las secuencias de los intrones en la caja inferior. El donador GT en 5' y el aceptor AG en 3' están subrayados. Se dan los tamaños de los intrones y los exones en pb y kb respectivamente.

Ejemplo 8 Clonación y secuenciación del gen de PEDF humano

Materiales - Las enzimas de restricción, SuperScript® RT y Kanamicina se adquirieron de GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD). Se adquirieron oligo dT_{(25)} Dynabeads® de Dynal Inc. (Lake Success, NY). Se obtuvo Retrotherm^{TM} RT de Epicentre Technologies (Madison, WI). Se adquirió RNAsin® de Promega (Madison, WI). Se adquirió Taq polimerasa de Perkin-Elmer (Norwalk, CT), o Stratagene (La Jolla, CA). Se adquirió el vector de plásmido pBlue-Script® usado para la subclonación de Stratagene (La Jolla, CA). Se purificó ARN total de la retina neural y del epitelio pigmentario de la retina a partir de tejido humano obtenido del National Disease Research Interchange (NDRI, Filadelfia, PA) tal como se describió previamente (Chomczynki y Sacchi, 1987). Se adquirieron [^{32}P]\alpha-dATP y [^{32}P]\gamma-ATP (3000 Ci/mmol) usados para el marcaje y la secuenciación (respectivamente) de Amersham (Arlington Hts, IL). Se adquirieron Superbroth (bacto-Triptona 12 g/l, extracto de levaduras 24 g/l, K_{2}HPO_{4} 12,5 g/l, HK_{2}PO_{4} 3,8 g/l y glicerol 5 ml/l), disolución desnaturalizante (NaOH 0,2 N, NaCl 1,5 M), disolución neutralizante (Tris-Cl 1 M pH 7,0, NaCl 1,5 M), 20X SSC (NaCl 3,0 M, citrato de sodio 0,3 mM), 10X TBE (Tris-borato 1 M, EDTA 2 mM, pH 8,3) y 50X TAE (Tris-acetato 2 M, EDTA 50 mM, pH 8,0) de Quality Biologicals (Gaithersburg, MD). Se adquirió 20X SSPE (NaCl 3 M, NaH_{2}PO_{4} 0,2 M, EDTA 20 mM pH 7,4) de Digene Diagnostics, Inc. (Silver Spring, MD). Se adquirió ampicilina de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) disuelta en agua y esterilizada por filtración.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se preparó una mezcla de 2X PCR que contenía 1,6 \mumoles/ml de dNTP GeneAmp® (400 \muM cada uno), tampón de PCR 2X GeneAmp® y Taq polimerasa 50 U/ml. Se adquirieron estos reactivos de Perkin-Elmer (Norwalk, CT). En general, el molde y los oligonucleótidos (100 ng de cada oligo) se mezclaron en un volumen de 25 \mul y se añadieron entonces 25 \mul de la mezcla 2X seguido por 50 \mul de aceite mineral. Se desnaturalizó inicialmente el molde durante 2 min a 95ºC, hibridación de 30 segundos (temperatura entre 55 y 65ºC dependiendo de los cebadores) y una extensión a 72ºC durante 1-5 min dependiendo de la longitud del producto amplificado.

Síntesis de ADNc sobre oligo (dT)_{25} Dynabeads®. Se sintetizó el ADNc sobre Dynabeads tal como se describió previamente (Rodríguez y Chader 1992). Se lavaron las Dynabeads (0,5 mg) con 100 \muL de Tris-Cl 10 mM pH 7,0, EDTA 1 mM, KCl 1 M. Los 30 \mul de ARN total, (30 \mug; \sim1 \mul), se mezclaron en agua con 30 \mul del tampón anterior y se calentaron entonces las Dynabeads equilibradas (0,5 mg) hasta 55ºC durante 2 minutos. Se dejó que hibridara el ARN poli+ A con las perlas durante 15 minutos a temperatura ambiente y se eliminó el ARN en exceso uniendo las perlas durante 15 minutos a temperatura ambiente y se eliminó el ARN en exceso uniendo las perlas al separador magnético MPC-E (Dynal Inc.). Se suspendieron entonces las perlas con el ARNm poli+ A en 2,5 \mul de tampón A (Tris-Cl 200 mM pH 8,3, KCl 1,0 M), 2,5 \mul de tampón B (MgCl_{2} 30 mM, MnCl 15 mM), 20 \mul de dNTP 10 mM (2,5 mM cada uno), 1 \mul de ARNsin, 2 \mul de SuperScript RT, 5 \mul de Retrotherm RT (1 unidad/\muI) y 16 \mul de H_{2}O para preparar un volumen final de 50 \mul. Se incubó la mezcla de reacción a 40ºC durante 10 min, después a 65ºC durante 1 hora. Se unieron de nuevo las perlas al separador magnético MPC-E y se elimino la mezcla de reacción RT en exceso. Se lavaron entonces las perlas una vez con 100 \mul de NaOH 0,2N, una vez con 10X SSPE, y dos veces con 1X TE. Se suspendieron las perlas que contenían ADNc en un volumen final de 100 \mul de 1X TE.

Amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) en 5'

Se realizó la RACE-5' usando un método modificado basado en el kit 5'-AmpliFINDER RACE adquirido de Clontech (Rodríguez et al. 1994). En primer lugar, se sintetizó ADNc sobre oligo dT_{(25)} Dynabeads® tal como se describió anteriormente (Rodríguez y Chader, 1992). Se ligó el cebador de anclaje AmpliFINDER (Clontech) a las puntas de los extremos 3' del ADNc del epitelio pigmentario retinal inmovilizado sobre Dynabead usando las mismas condiciones que para el ADNc soluble descritas en el kit 5'-AmpliFINDER RACE. Se usó el cebador de anclaje Ampli-FINDER en combinación con un cebador específico de PEDF nº 2744 para amplificar por PCR el extremo 5' del cebador. Se realizó la amplificación tal como se describió anteriormente con 2 \mul de ADNc de anclaje-epitelio pigmentario retinal humano ligado-Dynabeads usados como molde. Se realizó la amplificación durante 30
ciclos.

Secuencia de oligonucleótidos. Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos en un sintetizador de ADN modelo 392 de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Se desprotegieron los oligonucleótidos y se usaron sin purificación adicional.

Exploración de bibliotecas genómicas. Se sembró en placas la biblioteca de cósmidos genómica (Clontech) sobre placas de LB que contenían ampicilina 150 mg/ml, kanamicina 20 mg/ml a una densidad de 10.000 colonias por placa. Se usaron filtros de nitrocelulosa para recoger las colonias y se trataron y se hibridaron los filtros tal como se describe en Sambrook et al., (1989). Se analizó con sonda la biblioteca con producto de PCR marcado con [^{32}P] obtenido de la amplificación de un clon de ADNc de PEDF (Steele et al. 1993) usando cebadores T7/T3. Esto dio como resultado el aislamiento del cósmido p10A. Se exploró una biblioteca \lambdaDASH^{TM}II (Stratagene) por Lark Sequencing Technologies Inc. (Houston, TX) usando el inserto del clon de ADNc de PEDF mencionado anteriormente. Esto dio como resultado el aislamiento del fragmento NotI-Not de 7 Kb (JT6A). Se aisló un clon de P-1, p147, que contenía el gen de PEDF entero y regiones flanqueantes usando los oligos 1590/1591 por Genome Systems (St. Louis, MO).

Clonación de productos de PCR: Se sintetizaron cuatro conjuntos de cebadores, 603:604; 605:606; 2238:354 y 2213:2744 diseñados a partir de las regiones codificantes internas del ADNc de PEDF secuenciado tal como se describió anteriormente para su uso como cebadores en experimentos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de cebadores son como siguen: 603: 5'-ACA AGC TGG CAG CGG CTG TC-3' (SEQ ID NO: 13), 604: 5'-CAG AGG TGC CAC AAA GCT GG-3' (SEQ ID NO: 14); 605: 5'-CCA GCT TTG TGG CACCTC TG-3' (SEQ ID NO: 15), 606: 5'-CAT CAT GGG GAC CCT CAC GG-3' (SEQ ID NO: 16), 2213: 5'-AGG ATG CAGGCC CTG GTG CT-3' (SEQ ID NO: 17), 2744: 5'CCT CCT CCA CCA GCG CCC CT-3' (SEQ ID NO: 18); 2238: 5'-ATGATG TCG GAC CCT AAG GCT GTT-3' (SEQ ID NO: 19), 354: 5'-TGG GGA CAG TGA GGA CCG CC-3' (SEQ ID NO: 20). Las amplificaciones, subclonación y secuenciación de los productos de PCR generados con los cebadores 603:604 y 605:606 fueron realizadas por Lark Sequencing Technologies Inc. usando ADN genómico humano como molde. El producto generado a partir de 603:604 es de \sim2 kb (jt8A) y se expande desde el exón 3 hasta el exón 5. El producto generado usando 605:606 es de \sim3,3 kb (jt 9) y se expande desde el exón 5 hasta el exón 6. Se usó el conjunto de cebadores 2213-2744 para amplificar un producto de \sim2,5 kb (jt15; también denominado en lo sucesivo JT115) a partir del clon de P1 p147. Se envió entonces este producto a Lark Sequencing Technologies Inc. para realizar la subclonación y secuenciación. Se usaron los cebadores 2238:354 para amplificar desde el exón 6 hasta el exón 7 a lo largo del intrón E. Este producto no se subclonó pero lo secuenciaron directa y completamente los inventores.

Secuenciación del ADN. Se secuenciaron el clon P-1 (p147), subclones de este clon y productos de PCR a partir de este clon. La mayoría de la secuenciación fue realizada por Lark Sequencing Technologies Inc. usando técnicas de secuenciación convencionales. Todas las zonas importantes (por ejemplo, los límites intrón-exón), y las uniones entre los clones se secuenciaron en el laboratorio de los inventores. Se preparó ADN de los productos de PCR para la secuenciación usando el kit de purificación de ADN Wizard^{TM} PCR Preps DNA adquirido de Promega Corp. (Madison, WI). Se purificaron el clon P-1 y los subclones del plásmido usando el kit de purificación de plásmidos Midi de Qiagen Inc. (Chatsworth, CA). Se secuenciaron los plásmidos y productos de PCR purificados usando el kit de secuenciación por ciclo terminador PRISM^{TM} DyeDeoxy (Applied Biosystems, una división de Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. Normalmente, se usaron 0,5 pmoles de molde y 3 pmoles de cebador por reacción de secuenciación. Se purificaron los productos de la reacción de secuenciación usando columnas Select-D G-50 (5 Prime-3 Prime; Boulder, CO) y se secaron. Se disolvió entonces cada muestra en 5 \mul de formamida, 1 \mul de EDTA 50 mM, se calentó y se ubicó en un secuenciador fluorescente automatizado modelo 370A (ABI, Foster City, CA). Se secuenciaron todas las uniones de los sitios de corte y empalme, el intrón F y las uniones a lo largo de los clones.

Transferencia de tipo Southern. Se adquirió una transferencia de ADN genómica digerida con EcoRI (8 \mug) de una variedad de especies de BIOS Laboratories, New Haven, CT. Se analizó con sonda la transferencia con el ADNc de PEDF usando técnicas convencionales (Sambrook et al., 1989).

5' RACE de PEDF. Se realizó la 5' RACE tal como se describió anteriormente ligando el oligo de anclaje a ADNc del epitelio pigmentario de la retina humana sintetizado previamente sobre Dynabeads. Se amplificó el extremo 5' usando el cebador de anclaje (kit de AmpliFinder) y el cebador 2744 específico de PEDF. Se realizó la amplificación durante 30 ciclos. Se observó una banda principal a \sim 230 pb. Se clonaron los productos de PCR en pGEM-T (Promega Corp., Madison, WI) y se secuenciaron. Se encontró que el más largo de estos clones prolongaba el extremo 5' de PEDF en 20 pb.

Aislamiento del gen de PEDF. Se aisló el gen de PEDF en un clon de P-1 (p147) por Genome Systems (St. Louis, MO) usando los cebadores 1590 y 1591 (1590: 5'-GGA CGC TGG ATT AGA AGG CAG CAA A-3' (SEQ ID NO: 23); y 1591: 5'-CCA CAC CCA GCC TAG TCC C-3' (SEQ ID NO: 24)). Con el fin de determinar si este clon contenía el gen de PEDF entero, se digirieron tanto ADN genómico humano como p147 con BamHI, EcoHI, HindIII y PSTI y se separaron entonces mediante electroforesis en gel de agarosa en un aparato de campo de pulsos. Se transfirió el gel de agarosa y se analizó con sonda con el clon de ADNc de PEDF (Steele et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1526-1530). La comparación del patrón de bandas entre el clon de P-1 y el ADN genómico indica que el gen de PEDF entero está contenido en este clon. Además, este resultado es también indicativo de que existe sólo un gen para PEDF.

Secuencia del gen de PEDF. Se muestra en la figura 1 un mapa a escala del gen. Se secuenció el gen de PEDF en su totalidad (SEQ ID NO: 43). Se secuenciaron los clones jt1, jt14, jt6A y productos de PCR relacionados (jt15, jt8A y jt9) (figura 1) por Lark Sequencing Technologies Inc. Se secuenció el resto del gen amplificando diferentes partes del gen usando el clon p147 como molde. Se secuenciaron todos los exones, uniones intrón-exón y el intrón F entero en ambas direcciones en el laboratorio de los inventores tal como se describió anteriormente a partir de productos de PCR generados a partir del clon P-1, p147. También se confirmó el sitio Not I en sentido 3' del exón 1 amplificándolo a lo largo de él y secuenciando el producto. El gen se expande aproximadamente 16 Kb con 8 exones. Todas las uniones intrón-exón obedecen la norma AG/GTT. Se muestran en la tabla 1 las uniones intrón-exón y las secuencias flanqueantes.

jt1: Un clon de cósmido de 7,1 kb aislado a partir de la biblioteca de cósmidos genómica humana (Clontech) que contiene el exón 7, el exón 8 y la región flanqueante en 3' del gen de PEDF. El extremo 5' de este clon, una zona de aproximadamente 2,1 Kb, no es parte de PEDF. Esto estaba provocado aparentemente por una redisposición del cósmido. Se secuenció completamente este clon por Lark Sequencing Technologies Inc.

jt6A: Este es un fragmento de Not I de 7,2 Kb aislado por Lark Sequencing Technologies Inc. a partir de una biblioteca genómica humana \lambdaDASHII (Statagene). Este clon contenía >6 Kb de la región flanqueante en 5', el exón 1 y 424 pb del intrón A del gen de PEDF. Este clon se secuenció completamente por Lark Sequencing Technologies Inc.

jt8A: Se generó este producto JT8A de PCR clonado a partir de ADN genómico usando los cebadores 603:604. Estos clones se expanden desde el exón 3 hasta el exón 5 incluyendo el exón 4 y los intrones C y D. Se amplificó, se clonó y se secuenció completamente por Lark Sequencing Technologies Inc.

jt9: Se generó este producto JT8A de PCR clonado a partir de ADN genómico usando los cebadores 605:606. Contiene el intrón E entero y partes del exón 5 y el exón 6. Se amplificó, se clonó y se secuenció completamente por Lark Sequencing Technologies Inc.

jt15: Se obtuvo este clon a partir de un producto de PCR amplificado usando el par de cebadores 2213:2744 de p147. El clon se expande desde el exón 2 hasta el exón 3 a lo largo del intrón B. Se envió el producto de PCR a Lark Sequencing Technologies Inc. para la subclonación y secuenciación.

Clon de P1 p147: Este clon fue aislado por Genome Systems Inc. usando los oligonucleótidos 1590:1591. Se usó este clon para obtener la secuencia del intrón F (2238:354) y el subclón jt14. También se usó para confirmar los límites intrón-exón obtenidos inicialmente a partir de los clones mencionados anteriormente. Se amplificaron todos los límites de los exones e intrones (usando p147 como molde) usando oligos específicos de intrón y se secuenciaron los productos. Se confirmaron todas las secuencias de uniones de corte y empalme así como los tamaños de los intrones y exones.

jt14: Éste es un subclón de p147 que contiene la mayor parte del intrón A, el exón 2 y una parte del intrón B. Los inventores aislaron este clon y lo enviaron a Lark Sequencing Technologies Inc. para la secuenciación.

Por tanto, a partir del análisis de secuencia de todos los clones mencionados anteriormente y productos de PCR, se determinaron la estructura y tamaño de los exones e intrones del gen de PEDF humano. Los sitios del donador de corte y empalme en 5' y del aceptor de corte y empalme en 3' en todas las uniones se ajustan al consenso GT/AG.

Ejemplo 9 Análisis del promotor de PEDF

Con el fin de obtener un algún entendimiento con respecto a los posibles elementos transcripcionales que pueden regular PEDF y una guía para futuros experimentos sobre la expresión de PEDF, los inventores realizaron un análisis teórico de la región flanqueante en 5' de PEDF (figura 3). La región flanqueante en 5' del gen de PEDF carece de la señal TATAAA clásica o caja TATA. Sin embargo, contiene varios elementos y características interesantes reconocidos por importantes factores de transcripción. Existen dos elementos repetitivos Alu desde -164 hasta -591, y desde -822 hasta -1050. Fuera de las regiones Alu, existen dos posibles sitios para la familia octamérica ubicua de factores de transcripción (Oct) a -29 (ATCCAAAT) y de nuevo a -113 (GTGCAAAT) que se desvían por una base del consenso ATGCAAAT (Parslow et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:2650-2654; Falkner et al. (1984) Nature 310:71-74; Sturm et al. (1988) Genes & Devel. 2:1582-1599; Faisst y Meyer (1992) Nuc. Acids Res. 20:3-26). Otro elemento de posible interés se ubica a -62. Este elemento, GTAAAGTTAAC, que se asemeja al consenso de unión a HNF-1 (factor nuclear de hepatocitos) GTAATNATTAAC (Frain, M., et al. (1989) Cell 59:145-147). Este es un factor de transcripción que contiene homeodominios que transactiva muchos genes predominantemente hepáticos (Kuo et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9838-9842) pero se ha implicado también en diferenciación endodérmica (Baumhueter et al. (1990) Genes Dev. 4:371-379). La secuencia TCAGGTGATGCACCTGC a -202 es muy similar a la secuencia palindrómica artificial (TREp) TCAGGTCATGACCTGA que es reconocida por AP-1 y posiblemente transactivada por ácido retinoico (Umescono et al. (1988) Nature 336:262-265; Linney (1992) Curr. Topics in Dev. Biol. 27:309-350). Las secuencias TGAGTGCA a -22 y TGATGCA a -207 (dentro del TREp), son similares a la secuencia consenso de AP-1 TGACTCA (Schüle, et al. (1990) Cell 61:497-504). La secuencia AGGTGATGCACCT a -204 contenida dentro del TREp es también similar al motivo RAR (receptor de ácido retinoico) regulado por el desarrollo cuyo consenso es AGGTCATGACCT (Faisst y Meyer (1992) Nuc. Acids Res. 20:3-26). El elemento PEA3 (activador 3 potenciador del poliomavirus) AGGAAG/A (Martin et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5839-5843; Faisst y Meyer (1992) Nuc. Acids Res. 20:3-26) está presente en serie a -122 y -129, después de nuevo a -141. PEA3 es un miembro de la familia ETS de factores de transcripción (Macleod et al. (1992) TIBS 17:251-256) y su actividad parece estar regulada por oncogenes no nucleares (Wasylyk et al. (1989) EMBO J. 8:3371-3378). Uno de los elementos más interesantes se ubica a -654 con la secuencia GTGGTTATG. Este elemento está dentro de la secuencia consenso GTGGT/AT/AT/AG reconocida por la familia C/EBP (proteína de unión al potenciador CAAT) de factores de factores de transcripción (Faisst y Meyer (1992) Nuc. Acids Res. 20:3-26). Este factor parece estar implicado en la diferenciación terminal que conduce a un fenotipo adulto (Vellanoweth et al. (1994) Laboratory Investigation 70:784-799). Están presentes tres posibles cajas CACCC una a -845 y dos en la orientación inversa a -826 y -905. Éstas están todas dentro de la repetición Alu. Está presente un posible sitio Sp1 (CCCGGC) a -153 antes de la repetición Alu y está presente un sitio Sp1 consenso GGCGGG -1030 dentro de la repetición Alu.

Ejemplo 10 Expresión de ARNm de PEDF en células en cultivo Análisis de la expresión génica

Se hibridaron múltiples transferencias de tipo Nothern de ARNm de tejidos humanos (Clonetech) con 2 \mug de ARN poli-(A) por carril con un producto de PEDF amplificado por PCR de 667 pb marcado radiactivamente (Tombran-Tink et al., 1994 Genomics, 19:266-272). Se hibridaron previamente las transferencias durante 15 min a 68ºC en disolución de hibridación rápida QuickHyb (Stratagene, La Jolla, CA) y se hibridaron durante 1 hora a 68ºC en la misma disolución que contenía 5 x 10^{6} cpm de ADN/ml. Se lavaron las transferencias hibridadas dos veces con 100 ml de 2X SSC, SDS al 0,1% durante 15 min a temperatura ambiente y una vez con 200 ml de 0,1X SSC, SDS al 0,1% durante 30 min a 68ºC. Se sometieron a autorradiografía las transferencias a -70ºC durante 2 horas usando película Kodax XAR-5 y pantallas intensificadoras DuPont.

Expresión génica

Con el fin de determinar si se produce expresión del ARN mensajero de PEDF en tejido humanos diferentes que en células del EPR fetales humanas en cultivo, los inventores analizaron múltiples transferencias de ARN adulto y fetal humano de tejidos que contenían cantidades iguales de ARN poli-(A) para cada tejido examinado. Se muestran los resultados en la Figura 4. La sonda de PEDF identificó un transcrito de 1,5 kb de cebador único de intensidad de hibridación variable en 14 de los 16 tejidos adultos analizados. No se detecta señal ni en el riñón adulto ni en leucocitos de la sangre periférica. Sólo puede observarse una señal débil en el cerebro, páncreas, bazo y timo adultos. La mayor cantidad de hibridación para el ARN mensajero de PEDF se observa en el hígado, músculo esquelético, testículos y ovarios adultos humanos. De manera sorprendente, sólo se observa una señal muy débil en el ARN de cerebro total. En los tejidos fetales examinados, se observa una señal de PEDF muy fuerte en el tejido hepático, y de manera interesante una señal de intensidad significativa en el riñón fetal comparada con la no hibridación de PEDF en muestras de riñón adulto.

Al contrario que el transcrito de 1,5 kb único observado en los tejidos adultos, un transcrito menor adicional de menos de 500 pb se marca variablemente y con intensidad inferior en el corazón, pulmón y riñón fetales. Esto puede deberse a la degradación parcial del mensajero o a un fenómeno de corte y empalme alternativo. PEDF se expresa también sólo en células del EPR de mono de pasaje temprano (1º - 5º pasaje) y no en células de pasaje tardío (10º pasaje). Estos datos demuestran la relevancia de PEDF con respecto a la senescencia.

Ejemplo 11 Análisis comparativo de PEDF en una variedad de especies relacionadas filogenéticamente Análisis de conservación evolutiva

Se digirieron 8 \mug de ADN genómico de linfocitos de una variedad de especies incluyendo varias especies de mamíferos y primates (BIOS laboratories, New Haven CT.) con Eco-R1 y se separaron en geles de agarosa al 1%. Se transfirieron los geles y se hibridaron las membranas que contenían el ADN digerido usando el mismo procedimiento y condiciones que para el análisis de tipo Northern.

Conservación evolutiva

Se examinó la conservación evolutiva de PEDF entre varias especies relacionadas filogenéticamente. Se representan los resultados en la figura 5. Usando estas condiciones de hibridación de alta rigurosidad, se observa un gran fragmento de restricción de EcoRI de aproximadamente 23 kb en aves, mamíferos y primates. No se observaron señales de hibridación en especies inferiores (figura 5A) debido posiblemente a la débil homología de la sonda de PEDF humano usada. El fragmento de EcoRI tanto para el pollo como para el ratón es algo más pequeño que el de seres humanos. Surge un patrón de restricción interesantes en varias de las especies de mamíferos examinadas (figura 5B). Se observan varios fragmentos de restricción más pequeños que oscilan en tamaño entre 6 kb y 2 kb. Los fragmentos más grandes oscilan en tamaño entre 9 kB y 23 kB y se observan en todas las especies de primates examinadas que tienen un fragmento polimórfico adicional que se hibrida fuertemente a aproximadamente 9 kb.

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Ejemplo 12 Efectos neuronotróficos del factor derivado del epitelio pigmentario sobre células granulares del cerebelo en cultivo Cultivo celular

Se prepararon células granulares del cerebelo (CGC) a partir de crías de rata Sprague-Dawley de 5 u 8 días de edad tal como se describe por Novelli et al. (1988, Brain Res., 451:205-212). En resumen, se picó tejido libre de meninges en un tampón que contenía NaCl 124 mM, NaH_{2}PO_{4} 1 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, albúmina sérica bovina 3 mg/ml (BSA), rojo fenol 27 \muM y HEPES 25 mM (pH 7,4), y se centrifugó a 550 xg durante 3 min. Se resuspendió el sedimento de tejido de 10-20 animales y se tripsinizó (15 min, 37ºC) en 30 ml del mismo tampón que contenía tripsina 250 \mug/ml; se añadieron 15 ml adicionales de tampón que contenía ADNasa I 26 \mug/ml, inhibidor de la tripsina de soja 166 \mug/ml, y MgSO_{4} 0,5 mM adicional y se centrifugó de nuevo el tejido tal como se describió anteriormente. Se resuspendió el sedimento en 1 ml de tampón complementado con ADNasa 80 \mug/ml, 0,52 mg/ml de inhibidor de la tripsina, y MgSO_{4} 1,6 mM adicional, y se trituró 60 veces con una pipeta Pasteur. Se diluyó la suspensión con 2 ml de tampón que contenía CaCl_{2} 0,1 M y MgSO_{4} 1,3 mM adicional, y se dejó que se asentara el material no disociado durante 5 min. Se transfirió el sobrenadante a otro tubo, se recuperaron las células por centrifugación breve y se resuspendieron en medio que contenía suero (medio basal de Eagle con KCl 25 mM, glutamina 2 mM, gentamicina 100 \mug/ml, y suero de ternero fetal inactivado por calor al 10%) o medio definido químicamente (DMEM:F 12 (1:1) con insulina 5 \mug/ml, selenio 30 nM, trasferrina 100 \mug/ml, putrescina 1000 nM, progesterona 20 nM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 \mug/ml y glutamina 2 mM) (Bottenstein, 1985 Cell Culture in the Neurosciences, J.E. Bottenstein y G. Sato, eds. New York Plenum Publishing Corp. págs. 3-43). Se sembraron en placas las células en placas de 96 pocillos recubiertas de poli-L-lisina (para ensayos de MTS y ensayos de ELISA de los neurofilamentos) o portaobjetos de cámara de 8 pocillos (para inmunocitoquímica y marcaje con BrdU) a 2,5 x 10^{5} células/cm^{2} crecidas a 37ºC en una atmósfera que consistía en un 5% de CO_{2} en aire. Tras 1 día en cultivo, se añadió arabinosida de citosina (Ara-C) sólo a las células en medio complementado con suero (concentración final de 50 \muM).

Ensayo de MTS

Se incubaron células granulares del cerebelo en placas de 96 pocillos en un incubador de CO_{2} durante 4 horas con MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna) y PMS (metosulfato de fenazina) (concentración final; MTS 333 \mug/ml y PMS 25 \muM) (Promega Corp.). En presencia de PMS, MTS se convierte en un formazán soluble en agua mediante una enzima deshidrogenasa encontrada en células metabólicamente activas (Cory et al. (1991) Cancer Comm, 3:207-212). Se determinó la cantidad de producto de formazán mediante espectrofotometría a 490 nm.

Inmunocitoquímica

Tras 7 días in vitro (DIV), se lavaron las células tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de calcio y magnesio y se fijaron con paraformaldehído al 2% durante 10 min, seguido por 10 min a -20ºC en etanol al 95%/ácido acético al 5%. Se llevó a cabo la incubación con anticuerpos primarios frente a NSE (enolasa específica de nueronas), GABA, calbindina, o proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) durante 60 min a TA. Se aplicaron los anticuerpos a 1:1000-1:5000 en presencia de suero de cabra normal al 2% y BSA al 0,2%. Se visualizaron los anticuerpos usando el sistema ABC (Vectos Laboratories) y diaminobencidina. Se contaron al menos 20 campos a partir de 2-3 pocillos para cada experimento. Se calculó entonces el número promedio de células por campo para determinar la razón para el número de células teñidas mediante los otros anticuerpos en relación con las células positivas a NSE en cultivos control.

Marcaje con bromodesoxiuridina (BrdU)

Se realizó el marcaje con BrdU mediante el método de Gao et al. (1991 Neuron, 6: 705-715) con la siguiente modificación. Se sembraron en placas las células en portaobjetos de cámara de 8 pocillos y se añadió PEDFr inmediatamente. Tras 24 horas, se añadió BrdU (1:100; kit de proliferación celular de Amersham) al medio de cultivo durante 24 horas, después de lo cual se fijaron las células en paraformaldehído al 2% (10 min), se trataron con etanol al 95%/ácido acético al 5% (10 min), y se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU (1:20 durante 2 horas). Se incubaron entonces los cultivos con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 60 min. Tras la diaminobencidina-peroxidasa, se montaron las células en Gel Mount. Se determinó el índice mitótico contando el porcentaje de células marcadas con un microscopio. Para cada valor, se contó una muestra aleatoria de 3000 células.

Ensayo de ELISA de los neurofilamentos

Se realizó el ELISA de los neurofilamentos según el método de Doherty et al. (1984 J. Neurochem., 42:1116-1122) con una ligera modificación. Se fijaron los cultivos crecidos en placas de microtitulación de 96 pocillos con paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC durante 2 horas. Se permeabilizaron las células fijadas mediante el tratamiento durante 15 min con Triton X-100 al 0,1% en PBS, seguido por la incubación durante 60 min con PBS que contenía suero de cabra al 10% para bloquear la unión inespecífica. Se incubaron entonces los cultivos con un anticuerpo monoclonal anti-neurofilamento durante la noche a 4ºC (RMO-42 a 1:100; que tiñe sólo las neuritas en los cultivos de células granulares del cerebelo). Después de lavar dos veces con PBS que contenía suero de cabra al 10%, se incubaron las células con anticuerpo secundario (de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante a 1:1000) durante 1 hora. Tras el lavado secuencial con PBS y agua, se incubaron los cultivos con O-fenilendiamina al 0,2% y H_{2}O_{2} al 0,02% en tampón citrato 50 mM (pH 5,0) durante 30 min. Se paró la reacción añadiendo un volumen igual de H_{2}SO_{4} 4,5 M. Se cuantificó la formación de producto leyendo la densidad óptica (D.O.) de una alícuota del producto de reacción a 490 nm usando un lector de microplacas.

Con el fin de validar el ensayo de MTS como una medición de células vivas, y para determinar el intervalo del número de células en el que los resultados serían lineales, se llevaron a cabo los experimentos mostrados en la figura 6. En medio que contenía suero (SCM) (figura 6A), la densidad óptica (D.O.) era proporcional al número de células sembradas en placas en un intervalo desde 1-9 x 10^{5} células/cm^{2}. Por el contrario, para células crecidas en medio definido químicamente (CDM) (figura 6b), el intervalo lineal cubría 1-5 x 10^{5} células/cm^{2}. Para todos los experimentos posteriores, se sembraron en placas las células a 2,5 x 10^{5} células/cm^{2}, en la mitad del intervalo lineal para cualquier tipo de medio de cultivo.

La figura 7 muestra que PEDF provocó un aumento significativo en el número de células por DIV4 con una gran diferencia a DIV7 y 10. Sin embargo, los aumentos de 2-3 veces fueron el resultado de grandes descensos en los números de células en los cultivos control. La curva de dosis-respuesta en medio definido químicamente (figura 8), mostró que existe un efecto estadísticamente significativo a 20 ng/ml. El aumento de la concentración de PEDF por encima de 50 ng/ml no produjo aumentos adicionales en CDM.

Con el fin de determinar si el aumento en la D.O. (ensayo de MTS) en respuesta a PEDF reflejaba un aumento en células supervivientes o un aumento en la proliferación, se realizó un estudio de marcaje con BrdU usando cultivos de animales en el día 5 posterior al nacimiento (un momento en el que las células granulares del cerebelo se están dividiendo todavía en el animal). La figura 9 muestra el efecto de PEDF sobre cultivos de CGC P5 a DIV1 y 2. Usando el ensayo de MTS, PEDF no tuvo efecto a DIV1 pero provocó un pequeño aumento en la D.O. a DIV2 en o bien el medio que contenía suero o bien el medio definido químicamente. Por tanto, se añadió BrdU en el día 1 y se fijaron las células en el día 2. El índice de marcaje con BrdU fue del 5% en SCM y del 3% en CDM, en condiciones de control, y PEDF no aumentó el índice de marcaje con BrdU en cualquier medio de cultivo (figura 10). La carencia de estimulación del índice de marcaje con BrdU mediante PEDF implica que el aumento de la supervivencia en lugar del aumento
de la división celular es responsable del aumento de D.O. medido por el ensayo de MTS tras la exposición a PEDF.

Se usó inmunocitoquímica para identificar las células presentes en cultivos antes y después del tratamiento con PEDF. Se tiñeron cultivos P8 crecidos durante 7 días con y sin PEDF (500 ng/ml) con cuatro anticuerpos diferentes: un anticuerpo policlonal de conejo frente a una enolasa específica de neurona (NSE), que reconoce todas las neuronas del cerebelo (Schmechel et al. (1978) Science, 199:313-315); un anticuerpo policlonal frente a GABA, que se sintetiza en todas las neuronas del cerebelo excepto las células granulares del cerebelo (Gruol y Crimi (1988) Dev. Brain Res., 41:135-146); un anticuerpo frente a la calbindina, que es una proteína específica de neurona y GFAP, una proteína de los filamentos intermedios presente sólo en astrocitos. Se resumen los resultados en la tabla 2. PEDF aumentó significativamente el número de células positivas para NSE tanto en SCM (aumento del 30%) como en CDM (aumento del 60%). Hubo un pequeño aumento, no estadísticamente significativo, en el número de células de Purkinje (positivas para calbindina) y neuronas positivas para GABA. Por tanto, PEDF es neurotrófico sólo para las neuronas granulares. Además, PEDF disminuyó significativamente el número de astrocitos positivos para GFAP presentes en los cultivos (descenso del 30% en SCM y descenso del 40% en CDM). Esta propiedad "gliastática" de PEDF se trata adicionalmente en el ejemplo 14.

TABLA 2 La inmuhocitoquímica demuestra que PEDF aumentó el número de células positivas para NSE (neuronas) pero disminuyó las células positivas para GFAP (glía)

104

Se cultivaron células granulares del cerebelo en el día 8 posterior al nacimiento en portaobjetos de cámara de 8 pocillos. Se añadió PEDF (500 ng/ml) a DIV0, se fijaron las células en DIV7, y se llevó a cabo la inmunocitoquímica usando anticuerpos frente a NSE, GABA, calbindina y GFAP. Se contaron al menos 20 campos de 2-3 pocillos para cada experimento. Se expresan los datos como tantos por ciento de control de células positivas para NSE. Cada valor experimental representa el número medio de células \pm EEM.

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*P<0,005 comparado con el control entre sí usando una prueba no apareada.

Con el fin de investigar los efectos de PEDF sobre el sobrecrecimiento de neuritas, se usó un ensayo de ELISA de los neurofilamentos. La inmunocitoquímica había mostrado que el anticuerpo monoclonal RMO-42, teñía sólo las neuritas de células granulares del cerebelo en cultivo, de modo que se usó este anticuerpo en los procedimientos como una medición directa sólo de los neurofilamentos presentes y no del cuerpo celular (figura 11). PEDF aumentó ligeramente el contenido en neurofilamentos, tanto en SCM como CDM, pero el aumento fue directamente proporcional al aumento en el número de células (figura 12).

La figura 13 resume los datos de este ejemplo. A los 10 días en cultivo, la mayoría de las CGC no tratadas murieron (control) pero el 60% o más de las células tratadas con PEDF se mantenían viables. Por tanto, PEDF es un potente factor de supervivencia, para neuronas del cerebro.

Ejemplo 13 Propiedades neuronotróficas de los péptidos PEDFr, BP y BX

Se describe en las secciones previas sobre la actividad "neuronotrófica" de PEDF el hecho de que pueden producirse cantidades relativamente grandes de una PEDF recombinante (PEDFr) que muestra una potente actividad neurotrófica. Usando tecnología de biología molecular recombinante apropiada, pueden producirse también fragmentos más pequeños de la molécula de PEDF que pueden someterse a prueba para detectar actividad o bien neurotrófica o neuronotrófica. La figura 14 muestra los efectos de dos de estas formas truncadas de PEDF sobre la viabilidad de CGC. BX y BP son fragmentos de 24 y 28 kDa de la parte amino terminal de la molécula de PEDF, respectivamente. Ambos fragmentos, a concentraciones de 1x o 10x, actúan como factores de supervivencia de neuronas, promoviendo de manera significativa la vida de las CGC. En este experimento, se administró el péptido una vez al comienzo del experimento y se determinó el número de células 7 días después. Se concluye que, junto con la molécula de PEDF completa,
los péptidos recombinantes más pequeños cercanos al extremo N-terminal de la molécula son "neuronotróficos".

Ejemplo comparativo 14

Propiedades gliastáticas de PEDF

Junto con las neuronas en los cultivos primarios de células granulares del cerebelo de rata, existe un pequeño número de tipos diferentes de glía. La glía son elementos de "apoyo" en el SNC para las neuronas, que forman la red arquitectónica y el sistema de apoyo metabólico de los que dependen las neuronas. La glía es también de importancia clínica ya que los tumores del cerebro están formados en su mayor parte por la glía y la gliosis es un problema en varias enfermedades neurodegenerativas. En este sistema, los inventores se dieron cuenta por primera vez de un efecto de PEDF sobre la glía cuando se tiñó inmunocitoquímicamente la población mixta en cultivo de células con anticuerpos específicos para neuronas y otros anticuerpos específicos para diferentes tipos de glía. Para este fin, se usaron los marcadores convencionales enolasa específica de neurona (NSE) y otros para demostrar la presencia de neuronas, proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) para demostrar la presencia de astroglía y OX-42 para teñir la microglía. En este experimento (tabla 2), se encontró el aumento esperado en la tinción de NSE con el tratamiento con PEDF ya que se pensó entonces que las neuronas vivían más tiempo pero se encontró un descenso inesperado en la tinción de GFAP. Esto indicó la posibilidad de menos astrocitos en los cultivos tratados con PEDF.

Debido a la morfología característica de la astroglía y microglía en las placas de cultivo y a su tinción selectiva para GFAP u OX-42, es posible contar individualmente su número en el microscopio en diferentes condiciones experimentales. Se ha realizado esto ahora tal como se resume en las figuras 15 y 16. La figura 15 muestra los efectos de PEDF sobre los números de astroglía en cultivos obtenidos del cerebro de ratas a las 2 semanas (2 s) o 12 semanas (12 s) en cultivos. Los tiempos proporcionados son a las 48 horas, 96 horas o 7 días tras el tratamiento con PEDF. Claramente, en todas las condiciones sometidas a prueba, el tratamiento con PEDF dio como resultado un descenso drástico en el número de la astroglía. La figura 16 muestra un análisis en paralelo de la microglía en los mismos cultivos. La administración de PEDF durante 48 horas o 7 días dio como resultado números inferiores de las células ya se hubiesen cultivado durante 2 semanas (2 s) o 12 semanas (12 s). Por tanto, PEDF disminuyó sustancialmente los elementos de la glía durante un periodo de tiempo muy largo mientras actuaba como un factor de supervivencia para las neuronas.

Ejemplo comparativo 15

Caracterización de PEDF bovino nativo

Ya que el anticuerpo específico indicaba la presencia de PEDF en la IPM adulta, se usaron lavados de IPM bovina como una fuente para la purificación de PEDF nativo. Aunque el EPR y las células retinales expresan ARNm de PEDF, el anti-BH no puedo detectar bandas de PEDF en inmunotransferencias de tipo Western en estos extractos celulares, lo que sugiere una liberación de PEDF rápida dentro de la IPM. Los inventores estiman que PEDF está presente en la IPM bovina a menos del 1% de la proteína soluble total (es decir, aproximadamente 2-5 ng/ojo bovino). A temperaturas fisiológicas, la proteína PEDF en la IPM se mantiene estable durante periodos de tiempo prolongados y no forma complejos no reducidos resistentes a SDS. Por tanto, su utilidad potencial en experimentos de cultivo y trasplante in vivo está potenciada en gran medida debido a su naturaleza estable.

Se logra la purificación hasta homogeneidad aparente mediante un procedimiento de dos etapas sencillo (figura 17). Se fraccionaron los componentes de la IPM mediante cromatografía en columna de exclusión molecular (TSK-3000). Se agruparon las fracciones inmunoreactivas de PEDF, se aplicaron a una columna de intercambio catiónico (Mono-S) y se eluyó la inmunorreactividad con un gradiente lineal de NaCl. Se detalla el protocolo de purificación en Materiales y métodos. Los perfiles de elución de cada cromatografía se muestran en: panel A, cromatografía en columna de exclusión molecular TSK-3000, y panel B, cromatografía en columna mono-S. La absorbancia a 280 nm está representada por \underline{\hskip1cm}, y la concentración de NaCl por - - -, se siguió la inmunoreactividad de PEDF con antisuero Ac-PEDFr. Los insertos corresponden a análisis por inmunotransferencia de tipo Western de las fracciones indicadas. Se realizó la inmunorreacción con una dilución 1:10.000 de Ac-PEDFr y se tiñó con 4-cloro-1-naftol. Los patrones de tamaño molecular para la cromatografía TSK-3000 fueron: BSA, albúmina sérica bovina (66.000); y CA, anhidrasa carbónica bovina (29.000).

Comenzando con un lavado de los componentes solubles de la IPM, la primera etapa implica la eliminación de la proteína más abundante, IRBP, mediante cromatografía de exclusión molecular. PEDF se eluye como un polipéptido monomérico de aproximadamente 50 kDa de tamaño. Ya que se ha determinado que el punto isoeléctrico del PEDF es 7,2-7,8, se ha usado cromatografía en columna de S-sepharose a pH 6,0 en la segunda etapa del procedimiento para purificar y concentrar simultáneamente la proteína. La proteína purificada se recupera a aproximadamente 2 \mug de proteína por ojo bovino adulto con una recuperación de aproximadamente el 40%. PEDF nativo se comporta como una glicoproteína monomérica con un peso molecular aparente de 49.500 \pm 1.000 en SDS-PAGE.

La proteína purificada es sensible a la glicosidasa F, revelando oligosacáridos unidos en N que suman hasta 3.000 de masa molecular relativa de la proteína nativa (figura 18). Para eliminar los oligosacáridos unidos a asparragina, se trató la proteína PEDF purificada con endoglicosidasa H y N-glicosidasa F. Se realizaron reacciones enzimáticas tal como se describió en Materiales y métodos con un total de 200 ng de proteína PEDF en presencia o ausencia de \beta-mercaptoetanol. Se aplicaron las mezclas de reacciones a gel de poliacrilamida al 12,5%-SDS. Se muestran fotografías de inmunotransferencias de tipo Western de reacciones de endoglicosidasa H (panel izquierdo) y N-glicosidasa F (panel derecho). Se trataron las inmunotransferencias con antisuero Ac-PEDFr diluido 1:10.000. La adición en cada reacción se indica en la parte superior. Los números en el lado derecho de cada fotografía indican la migración de los patrones de SDS-PAGE biotinilados: albúmina sérica bovina (66.200), ovoalbúmina (45.000) y anhidrasa carbónica bovina (31.000). Los inventores han mostrado que PEDF bovino purificado promueve el sobrecrecimiento de neuritas en células Y-79 y células de retinoblastoma de Weri, y que esta actividad se bloquea por anti-PEDFr (véase a continuación).

La presente invención proporciona las herramientas para determinar el efecto de PEDF auténtico sobre la expresión de marcadores neuronales y gliales en los cultivos de CGC y células tumorales Y-79 incluyendo proteínas NSE, GFAP, neurofilamentos (NF-2000).

Ejemplo comparativo 16

Factor derivado del epitelio pigmentario: Caracterización usando un anticuerpo policlonal sumamente específico

Los inventores usaron PEDF humano recombinante purificado producido en E. coli para desarrollas anticuerpos policlonales frente a PEDF. Los anti-PEDFr reconocían específicamente un polipéptido en la inmunotransferencia de tipo Western del lavado de la IPM de ojos bovinos adultos (figura 19). El antisuero policlonal frente a PEDF recombinante humano reconoce específicamente a PEDFr. Se trataron la inmunotransferencia de tipo Western y la inmunotransferencia de ranuras de PEDFr humano con antisuero policlonal de conejo frente a PEDFr, Ac-PEDFr. Se muestran fotografías de inmunotinciones con 4-cloro-naftol. En el panel A, se usaron inmunotransferencias de tipo Western de 0,5 \mug de PEDFr para someter a ensayo diluciones en aumento de antisuero. Se resolvió la proteína PEDFr mediante SDS-PAGE al 12,5% antes de la inmunotransferencia. Se indican las diluciones en la parte superior de cada carril. Se preincubó el antisuero diluido con PEDFr a 5 \mug/ml antes de usarlo para la inmunodetección y se indica como 1:10.000 + PEDFr. Los números a la izquierda indican el peso molecular de patrones de SDS-PAGE biotinilados. En el panel B, se aplicaron cantidades en aumento de PEDFr en BSA al 1%/PBS a una membrana de nitrocelulosa con un colector. Se trataron las membranas con antisuero anti-PEDFr y suero preinmunitario de conejo diluido 1:10.000. Los números a la derecha indican las cantidades de proteína PEDFr inmunotransferida sobre la membrana. Los sueros usados en cada papel se indican en la parte superior de la figura.

Anti-BH reconoce específicamente PEDF humano en inmunotransferencias de tipo Western a diluciones tan bajas como 1:50.000; de manera importante, no reconoce a la \alpha_{1}-antitripsina del suero. El anticuerpo reconoce una banda principal en inmunotransferencias de tipo Western de medio condicionado de células del EPR de monos jóvenes así como de la IPM de ojos bovinos adultos. Anti-PEDFr bloqueó la actividad neurotrófica que promueve la IPM (figura 20). Se lavaron células Y-79 de retinoblastoma humano que crecían exponencialmente dos veces con PBS, y se sembraron en placas (2,5 x 10^{5}) células por ml) en MEM libre de suero complementado con insulina, transferrina y selenio (mezcla ITS, Collaborative Research Products). Se añadieron entonces los efectores a los cultivos. Tras 7 días a 37ºC en CO_{2} al 5%, se unieron las células a placas recubiertas con poli-D-lisina con medio nuevo libre de suero. Se controló el estado de diferenciación de los cultivos a intervalos diferentes tras la unión. Se muestra la morfología característica de los cultivos en el día 9 posterior a la unión. La adición de los efectores fue tal como se indica en cada panel a las siguientes concentraciones finales: BSA 125 \mug/ml, IPM al 1%, y PEDF bovino purificado 100 ng/ml. Con el fin de bloquear la actividad inductora del sobrecrecimiento de neuritas, se preincubó cada efector con un exceso de antisuero anti-PEDFr (1 \mul) en BSA al 1%/PBS a 4ºC durante al menos 6 horas. Todas las fotografías se muestran a una magnificación de x50.

El anti-PEDFr también bloqueó la actividad de sobrecrecimiento de neuritas promovida por el PEDF purificado. Los datos indican que PEDF es el único factor neurotrófico en la IPM. Estos resultados también sugieren que el anti-PEDFr será útil para analizar con sonda el sitio activo neurotrófico de PEDF así como el papel fisiológico de PEDF en la IPM y otros tejidos (por ejemplo, cerebro) también. Además, estos resultados indican que PEDF es un componente genuino de la IPM y es probablemente el único componente neurotrófico en la matriz extracelular. Además, la proteína está presente en una amplia gama de tejidos y espacios extracelulares. El anticuerpo bloqueante es útil en estudios que analizan con sonda las funciones fisiológicas de PEDF.

Ejemplo comparativo 17

Factor derivado del epitelio pigmentario: Una serpina con actividad neurotrófica

La secuencia de aminoácidos derivada de un ADNc de PEDF humano fetal comparte identidad de su estructura primaria (\sim30%) con la familia de inhibidores de la serina proteasa (serpina), conservando el 90% de los residuos esenciales para la integridad estructural de las serpinas. Sin embargo, PEDF recombinante no inhibe las serinas proteasas, tripsina, quimotripsina, elastasa o catepsina G. No se ha identificado todavía una diana natural para PEDF. Los inventores han analizado proteínas de la matriz interfotorreceptor (IPM), el espacio entre el epitelio pigmentario de la retina y la retina, mediante inmunodetección en inmunotransferencias de tipo Western con anticuerpos preparados frente a PEDF y mediante zimografía en geles que contienen caseína como sustrato proteolítico. Los resultados muestran que IPM bovina contiene un polipéptido PEDF glicosilado, estable (masa molecular relativa de 50.000) a aproximadamente 2-5 \mug por ojo. La proteolisis limitada de PEDF bovino produjo un polipéptido de masa molecular relativa de 46.000 con tripsina, subtilisina, quimotripsina y elastasa, sugiriendo una estructura globular con una región de bisagra propensa a escisión proteolítica. Por otra parte, la zimografía de SDS-PAGE caseína reveló una baja actividad de proteasas en la IPM que migró como un doble de aproximadamente 80.000 \pm 5.000 de masa molecular relativa. Se inhibieron las actividades caseinolíticas al 100% con aprotinina 1 \mug/ml y PMSF 10 mM añadidos a la mezcla del gel, pero no se afectaron por E64 o EDTA. De manera importante, la proteína IPM no reaccionó con anticuerpo frente a plasminógeno, una serina proteasa de aproximadamente 80.000 de masa molecular relativa. Cuando se añadió la proteína PEDFr a 1 \mug/ml, la señal para estas actividades caseinolíticas, así como otras actividad de serina proteasa de origen desconocido, disminuyó en aproximadamente el 50%. Los resultados sugieren que IPM es un sitio extracelular natural para una serina proteasa novedosa y la serpina PEDF, ambas presentes a \leq1% de la proteína total.

La presente invención describe las características estructurales generales de PEDF y comienzo del entendimiento de como éstas se relacionan con la función de la proteína. PEDF posee las características estructurales y las características terciarias generales atribuidas previamente a las serpinas pero no su actividad antiproteasa. PEDF es una proteína neurotrófica y parece ser el único componente de la IPM que promueve el sobrecrecimiento de neuritas en células de retinoblastoma. Sin embargo, el centro reactivo para la inhibición de las serinas proteasas encontrado cerca del extremo carboxilo terminal de las serpinas clásicas no es necesario para la actividad biológica neurotrófica de PEDF. Específicamente, una cadena polipeptídica que contiene un dominio de la parte amino terminal de la molécula (BA) es suficiente para la actividad neurotrófica y de supervivencia neuronal. La presente invención permite además la determinación de si las neuronas CGC mueren normalmente por apoptosis y si PEDF es un inhibidor de la apoptosis. En otras palabras, la presente invención permite determinar mediante qué mecanismo PEDF "salva" neuronas e "inhibe" el crecimiento o proliferación de la glía.

La presente invención es útil en la determinación del "sitio activo" neurotrófico específico. Además, el uso de péptidos truncados de PEDFr permite a los inventores definir los elementos necesarios para determinar la actividad neuronotrófica y quizá gliastática de PEDF. La presente invención proporciona además las herramientas necesarias para estudiar las interacciones de PEDF que desencadenan la señal para la diferenciación del retinoblastoma. Los experimentos recientes demuestran que ^{125}I-BH se une a células de retinoblastoma de modo competitivo sólo cuando se añaden en un medio que se ha "condicionado" previamente mediante células de retinoblastoma. Esto sugiere que podrían requerirse para la unión uno o más cofactores producidos por las células. La presente invención proporciona además las herramientas necesarias para identificas y caracterizar un supuesto receptor de la superficie celular para PEDF o para un complejo de PEDF de los sistemas de prueba de CGC y retinoblastoma de los inventores.

Las proteínas mutadas recombinantes, los productos proteolíticos y los péptidos sintéticos se han vuelto decisivos para el mapeo de dominios de sitios funcionales de las proteínas. Además, las proteínas recombinantes de la presente invención permiten el mapeo de "sitios activos" neurotróficos y neuronotróficos en la molécula de PEDF y la determinación del mecanismo de transducción celular mediante el cual esta proteína interesante ejerce sus drásticos efectos biológicos.

Aunque esta invención se ha descrito con un énfasis en realizaciones preferidas, será obvio para los expertos en la técnica que pueden realizarse variaciones en los ácidos nucleicos preferidos que codifican para, y las secuencias de aminoácidos de PEDF, PEDFr y proteínas equivalentes (BP, BX, BA), en los vectores que utilizan cualquier ácido nucleico de ese tipo, en los métodos recombinantes para producir tales proteínas y en los métodos para usar tales proteínas, y que se pretende que la invención pueda ponerse en práctica de otra manera diferente a la descrita específicamente en el presente documento.

\global\parskip0.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTES: Chader, Gerald J.; Becerra, Sofia Patricia; Schwartz, Joan P.; Taniwaki, Takayuki

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FACTOR DERIVADO DEL EPITELIO PIGMENTARIO: CARACTERIZACIÓN GENÓMICA, ORGANIZACIÓN Y SECUENCIA DEL GEN DE PEDF

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Morgan & Finnegan, L.L.P.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 345 Park Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

STATE: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 10154

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WORDPERFECT 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: POR ASIGNAR

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUN-1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/367.841

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-DIC-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/257.963

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 07/952.796

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 24-SEP-1992

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: DOROTHY R. AUTH

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36434

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 20264126PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE COMUNICACIONES TELEFÓNICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (212) 758-4800

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (212) 751-6849

\vskip0.800000\baselineskip

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1512 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Región que codifica para PEDF

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 418 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 117..1373

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "producto" = "factor derivado del epitelio pigmentario" gen = codón de inicio de "PEDF" = 1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Secuencia de aminoácidos de PEDF

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 379 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Met 1...Ile 4 es una fusión N-terminal a Asp 44...Pro 418 de SEQ ID NO:2; Met 1...Glu 43 de SEQ ID NO:2 se deleciona"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGYAAYTTYT AYGAYCTSTA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTYTCYTCRT CSAGRTARAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Asp Glu Glu Arg}

\sac{Thr Val Arg Val Pro Met Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

500

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asn Glu Leu Gly Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4421 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Ser humano

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: JT1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Fragmento Bam HI de 7,1 kb derivado del ADN genómico de la placenta humana; también denominado JT101

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

7

8

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7210 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Ser humano

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: \lambdaDASH II

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: JT6A

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Fragmento Not 1-Not de 7,0 kb; derivado del ADN genómico de la placenta humana, también denominado JT106

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

12

13

14

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1988 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Ser humano

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: JT8A

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Producto de PCR de 2 kb usando cebadores, SEQ ID: 13 y 14; también denominado JT108

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3267 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: JT109

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Producto de PCR de 3,3 kb usando cebadores, SEQ ID No: 15 y 16

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 603

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAAGCTGGC AGCGGCTGTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótidos

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 604

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAGGTGCC ACAAAGCTGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 ares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótidos

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 605

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGCTTTGT GGCACCATCTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida.

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 606

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCATGGGG ACCCTCACGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 2213

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGATGCAGG CCCTGGTGCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 2744

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCCTCCAC CAGCGCCCCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 2238

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGATGTCGG ACCCTAAGGC TGTT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 354

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGGACAGT GAGGACCGCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: JT10 - UP01

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGTGCAAA TGTGTGCGCC TTAG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: JT10 - DP01

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGCTGCT TTACCTGTGG ATAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 1590

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACGCTGGA TTAGAAGGCA GCAAA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 1591

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: cebador en una reacción en cadena de la polimerasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACACCCAG CCTAGTCCC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATCCACAGG TAAAGTAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGAGGAGG TCAGTAGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCGCTGGG TGAGTGCT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 4

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAGAAGAG TGAGTCGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 5

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTCAAGGG TGAGCGCG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGCAAGG TCTGTGGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAGATGAG TATGTCTG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 5' del EXÓN 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio donador de corte y empalme en 5' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTATCCCTA ACTTCTGT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 Pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACGCTGG

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTTGCAGG CCCCAGGA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGCCAGG GCTCCCCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 4

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTGGCAGG AGCGGACG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 5

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTTCTCAGA GCTGCGCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTTTCCAGG GCAGTGGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTCTCAGA TTGCCCAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de corte y empalme en 3' del INTRÓN 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El sitio aceptor de corte y empalme en 3' se ubica entre los nucleótidos 9 y 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCTACAGA GCTGCAAT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 737 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Promotor de PEDF

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El EXÓN comienza en 614 y termina en 728 del gen de PEDF

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 88 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Promotor de PEDF

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: El EXÓN del gen de PEDF comienza en 9

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22481 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: Doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: P1-147

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: secuencia genómica de longitud completa para PEDF más las secuencias flanqueantes.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

Claims (13)

1. Método in vitro para prolongar la supervivencia de las células neuronales que comprende:

tratar una población celular que comprende neuronas con el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica.

2. Método según la reivindicación 1, en el que las células neuronales están en un cultivo de células tisulares.

3. Método según la reivindicación 1, en el que las células neuronales comprenden un componente de tejido que puede trasplantarse en un sujeto.

4. Método según la reivindicación 1, en el que las células son células de cerebro fetal.

5. Método según la reivindicación 1, en el que las células son neuronas en cultivo primario.

6. Método según la reivindicación 1, en el que las células son neuronas fotorreceptoras.

7. Método según la reivindicación 1, que comprende:

a)

establecer un cultivo celular; y

b)

tratar dicho cultivo celular con PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica.

8. Método según la reivindicación 1 ó 7, en el que dicho tratamiento comprende:

a)

introducir un ácido nucleico que codifica para PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica en una célula huésped; y

b)

expresar dicho ácido nucleico y proporcionar de ese modo dicho PEDF o fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicha célula huésped es una célula neuronal, una célula de la astroglía, una neurona fotorreceptora o una célula del epitelio pigmentario de la retina.

10. Método según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico seleccionado de:

(a)

una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID No: 1; y

(b)

una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 2 ó 3.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la molécula de ácido nucleico es parte de un vector.

12. Uso de PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica, una molécula de ácido nucleico que codifica para PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica y/o un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para PEDF o un fragmento activo del mismo que tiene actividad neuronotrófica para la preparación de una composición farmacéutica para prolongar la supervivencia de las células neuronales.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico seleccionado de:

(a)

una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID No: 1; y

(b)

una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 2 ó 3.