JP2009044963A - カタラーゼ複合体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成しており、該多量体は、高密度に集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されていて、前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されており、該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得ることを特徴とするサブユニット蛋白質複合体、該複合体を機能性成分として含みサブユニット蛋白質の活性を安定に有する機能性部材。
【効果】カタラーゼ等のサブユニット蛋白質の活性を安定に保持した新規サブユニット蛋白質−シリカ系メソ多孔体複合体、及びその機能性部材としての用途を提供することができる。
【選択図】図3
Description
(1)シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、1)前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、2)該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、3)前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されている、4)該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得る、ことを特徴とするサブユニット蛋白質複合体。
(2)前記サブユニット蛋白質が、カタラーゼである、前記(1)に記載の複合体。
(3)前記シリカ系メソ多孔体が、1)ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体である、2)細孔のサイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が2〜50nmである、3)細孔容積が0.1〜1.5mLである、4)比表面積が200〜1500m2である、5)表面にシラノール基(−SiOH基)を有する、前記(1)に記載の複合体。
(4)シリカ系メソ多孔体において、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±40%の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が60%以上である、及び/又は1nm以上のd値に相当する回折角度に1本以上のピークを有するX線回折パターンを示す、前記(1)に記載の複合体。
(5)前記シリカ系メソ多孔体に吸着させるカタラーゼの重量が、シリカメソ多孔体100重量部当たり、0.5〜50重量部である、前記(1)に記載の複合体。
(6)前記シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径が、3〜6nmである、前記(1)に記載の複合体。
(7)前記シリカ系メソ多孔体のpKaが、5〜14である、前記(1)に記載の複合体。
(8)前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に、酸化触媒が更に担持されている、前記(1)に記載の複合体。
(9)1サブユニットあたり蛍光色素により22%まで修飾されている、前記(1)に記載の複合体。
(10)前記(1)から(9)のいずれか1項に記載のサブユニット蛋白質複合体を機能性成分として含むことを特徴とするサブユニット蛋白質の活性を安定に有する機能性部材。
(11)カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、カタラーゼに吸着する酸素、一酸化炭素、又は一酸化窒素を濃縮する作用を有する、前記(10)に記載の機能性部材。
(12)カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、有機溶媒中での触媒能を有する、前記(10)に記載の機能性部材。
本発明は、シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、(1)前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、(2)該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、(3)前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されている、(4)該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得る、ことを特徴とするものである。
(1)カタラーゼを安定に、且つ大きな吸着量で吸着させたカタラーゼ複合体を提供することができる。
(2)カタラーゼ複合体と同様に、他のサブユニット蛋白質を同様の手法で複合化することができる。
(3)サブユニット蛋白質を安定に保持して、その活性を安定、且つ高活性で発揮させることが可能なサブユニット蛋白質の高度利用技術を提供することができる。
(4)サブユニット蛋白質の活性を維持して安定、且つ有効に発揮することが可能な新規機能性部材を提供することができる。
(5)蛋白質を蛍光標識し、その蛋白質をメソポーラスシリカの細孔に導入することで初めて細孔内での蛋白質の状態を観察することが可能となった。
(1)合成例1
水ガラス1号271.59gを水828.41gと混合後、80℃に加熱した。別途、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド80gを70℃の水1リットルに添加、溶解後、トリイソピルベンゼン70ml(60g)を更に添加し、ホモミキサーで30分攪拌した。この乳化液を水ガラス溶液に瞬時に添加して、更に5分攪拌した。
乾燥水ガラス(SiO2/Na2O=2.00)を700℃で6時間、空気中で焼成し、ジケイ酸ソーダ(δ−Na2Si2O5)に結晶化させた。この結晶50gを500mLの水に分散させ、3時間攪拌した。その後、濾過して固形分を回収してカネマイトを得た。こうして得られたカネマイト50gを0.1Mのヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド水溶液1000mLに分散させ、70℃で3時間攪拌しながら加熱した。加熱初期の分散液のpHは12.3であった。その後、70℃で加熱、攪拌しながら2Nの塩酸を添加して、分散液のpHを8.5に下げた。
シリカ系メソ多孔体(複合体1と2)に対するカタラーゼの吸着量を測定した。吸着量の測定は、上記遠心分離で得られた上澄みを用いて行った。測定の結果を図3に示す。図3の左の縦軸は、それぞれのシリカ系メソ多孔体100mgに対するカタラーゼの吸着量、横軸は、吸着平衡濃度を示す。AはFSM6.2であり、BはFSM−16である。AのFSM6.2では、蛋白質が吸着していく様子が伺えるが、FSM−16では、蛋白質の吸着量がFSM−6.2に比べて少ないことが分かる。
シリカ系メソ多孔体の細孔分布を窒素吸着等温線から求めた。すなわち、FSM−6.2に対し、カタラーゼを吸着させ(FSM−6.2 100mgに対し、カタラーゼが、20mgの吸着量)、それぞれについて、窒素吸着特性を調べた。図4に、窒素吸着等温線から求めたFSM−6.2複合体1の窒素吸着曲線、及び細孔分布曲線を示す。
縦軸は、窒素の吸着量を示し、横軸に、そのときの相対圧力を示す。A(FSM−6.2)では、P/P0=0.4付近で急激に立ち上がっている。このことは、規則正しい孔が綺麗に開いていること示している。一方、カタラーゼが吸着したFSM−6.2では、非表面積及び細孔容量が減少していることが分かる。このことは、孔の中にカタラーゼが導入されていることを示している。
図4の中に示された図に、窒素吸着等温線から求めた細孔分布曲線を示す。AはFSM−6.2、Bはカタラーゼが吸着したFSM−6.2(FSM−6.2 100mgに対し、カタラーゼが、20mgの吸着量)を示す。Aでは、6nm付近にシャープなピークが見られる。一方、カタラーゼが吸着したFSM−6.2(B)では、カタラーゼが吸着したことによって、細孔容量が減少していることが分かる。
図5aに示すように、カタラーゼ−FSM及びFSMをフィルターに置き、上から1%過酸化水素水を通した。図5bは、通す前と後の過酸化水素の吸収スペクトルを示している。この図より、カタラーゼ−FSMに通した場合、過酸化水素が完全に分解していることが分かる。一方、FSMのみでは、分解が見られなかった。
図6に、1%の過酸化水素を繰り返し通した実験結果を示す。AのFSMは、全く反応しないのに対して、Bのカタラーゼ−FSMは、40回繰り返し使用しても全く活性が落ちないことが分かった。これは、安定にFSMに酵素が固定されていることを示している。
図7に、カタラーゼの立体構造とアミノ酸配列を示す。以下により、カタラーゼのリジン(K)をターゲットにして蛍光色素を導入した。すなわち、カタラーゼ10mg、20mMリン酸バファ470μl、14mM Alexa dye ジメチルスルホキシド溶液30μl(Alexa dye(MW:3.41)420μmol)を4℃1時間遮光攪拌し、ゲルろ過して回収した。
FSM6.2の粉末10mgと、蛍光標識カタラーゼの水溶液(リン酸バッファpH6.9)1mL(カタラーゼのモル濃度:0.1−2mg/ml)とを混合し、25℃で5時間震盪させた。その後、7000rpmで20分間遠心分離を行い、蛍光標識カタラーゼとFSM−6.2との複合体(以下、「複合体3」という。)を得た。
蛍光標識タンパク質をシリカ系メソ多孔内部に導入し、蛍光顕微鏡により観察した。図9に、蛍光標識カタラーゼ−FSMを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。上からメソポーラスシリカに吸着したカタラーゼの吸着量を1w%、10w%、20w%と変化させた時の蛍光顕微鏡の観察図である。吸着量が増えれば増えるほどメソポーラスシリカ内部に蛋白質が入っていく様子が伺える。このことにより蛋白質がメソポーラスシリカの細孔に導入されたことが分かる。
エタノール溶液3mlに天然酵素(カタラーゼ)0.8mg及びカタラーゼ−FSM4mg(タンパク量0.8mg)を加え、最後に30%過酸化水素水100μlを加え反応を開始した。過酸化水素は270nmに吸収があることから、その減少量を酵素活性の指標とした。その結果を図10に示す。
Claims (12)
- シリカ系メソ多孔体の細孔内部にサブユニット蛋白質を備えるサブユニット蛋白質内包複合体であって、(1)前記サブユニット蛋白質は、前記細孔内部で多量体を形成している、(2)該多量体は、高密度集積した蛋白質として、前記シリカ系メソ多孔体の細孔内壁に吸着されている、(3)前記サブユニット蛋白質が蛍光標識されている、(4)該蛍光標識により、メソ多孔体内での蛋白質の状態が観察され得る、ことを特徴とするサブユニット蛋白質複合体。
- 前記サブユニット蛋白質が、カタラーゼである、請求項1に記載の複合体。
- 前記シリカ系メソ多孔体が、(1)ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体である、(2)細孔のサイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が2〜50nmである、(3)細孔容積が0.1〜1.5mLである、(4)比表面積が200〜1500m2である、(5)表面にシラノール基(−SiOH基)を有する、請求項1に記載の複合体。
- シリカ系メソ多孔体において、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±40%の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合が60%以上である、及び/又は1nm以上のd値に相当する回折角度に1本以上のピークを有するX線回折パターンを示す、請求項1に記載の複合体。
- 前記シリカ系メソ多孔体に吸着させるカタラーゼの重量が、シリカメソ多孔体100重量部当たり、0.5〜50重量部である、請求項1に記載の複合体。
- 前記シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径が、3〜6nmである、請求項1に記載の複合体。
- 前記シリカ系メソ多孔体のpKaが、5〜14である、請求項1に記載の複合体。
- 前記シリカ系メソ多孔体の細孔内部に、酸化触媒が更に担持されている、請求項1に記載の複合体。
- 1サブユニットあたり蛍光色素により22%まで修飾されている、請求項1に記載の複合体。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載のサブユニット蛋白質複合体を機能性成分として含むことを特徴とするサブユニット蛋白質の活性を安定に有する機能性部材。
- カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、カタラーゼに吸着する酸素、一酸化炭素、又は一酸化窒素を濃縮する作用を有する、請求項10に記載の機能性部材。
- カタラーゼ複合体を機能性成分として含み、有機溶媒中での触媒能を有する、請求項10に記載の機能性部材。
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