JP2008225454A - レーザ顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【課題】パルス圧縮器として使用される正分散素子における出力減衰を低減して、多光子励起効率を向上するとともに、正分散素子のサイズを低減して、顕微鏡本体への取り付けや収納を容易にすることができ、取り回しを容易にする。
【解決手段】超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源2と、該レーザ光源2から出射された超短パルスレーザ光を伸長させるパルス伸長器4と、該パルス伸長器4により伸長された超短パルスレーザ光を伝播させる大口径のシングルモードファイバ8と、該シングルモードファイバ8により伝播されてきた超短パルスレーザ光を圧縮するパルス圧縮器11と、該パルス圧縮器11により圧縮された超短パルスレーザ光を標本Aに照射する顕微鏡本体12とを備えるレーザ顕微鏡1を提供する。
【選択図】 図1
【解決手段】超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源2と、該レーザ光源2から出射された超短パルスレーザ光を伸長させるパルス伸長器4と、該パルス伸長器4により伸長された超短パルスレーザ光を伝播させる大口径のシングルモードファイバ8と、該シングルモードファイバ8により伝播されてきた超短パルスレーザ光を圧縮するパルス圧縮器11と、該パルス圧縮器11により圧縮された超短パルスレーザ光を標本Aに照射する顕微鏡本体12とを備えるレーザ顕微鏡1を提供する。
【選択図】 図1
Description
本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。
従来、平均出力数mW〜数百mW、パルス幅数十fs〜数百fsの超短パルスレーザ光を対物レンズを介して標本に照射し、対物レンズの焦点面において多光子励起効果を発生させて多光子蛍光を観察する多光子励起方式のレーザ走査型顕微鏡が知られている。
このようなレーザ走査型顕微鏡においては、取り回しが容易で利便性が高い光ファイバを用いて光源からのレーザ光を導入することが望まれている。
このようなレーザ走査型顕微鏡においては、取り回しが容易で利便性が高い光ファイバを用いて光源からのレーザ光を導入することが望まれている。
ところが、光ファイバにフェムト秒オーダのパルス幅を有する超短パルスレーザ光を導入すると、ファイバ内部の光子密度が高くなることで非線形効果(自己位相変調:スペクトルの広がり)が誘発され、群速度分散と相俟って対物レンズの先端から射出される超短パルスレーザ光のパルス幅が太ってしまい、多光子励起効率が損なわれてしまうという不都合がある。
これを解決する手法として、超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と光ファイバとの間に負分散光学系を配置し、光ファイバと顕微鏡本体との間に正分散素子を配置したレーザ顕微鏡が知られている(例えば、特許文献1および特許文献2参照。)。
このレーザ顕微鏡によれば、負分散光学系により予め超短パルスレーザ光のパルス幅を広げて光ファイバに入射させるので、光ファイバ内における非線形効果の発生を回避することができる。
このレーザ顕微鏡によれば、負分散光学系により予め超短パルスレーザ光のパルス幅を広げて光ファイバに入射させるので、光ファイバ内における非線形効果の発生を回避することができる。
そして、光ファイバの終端付近においては、超短パルスレーザ光のパルス幅の再圧縮が進行するので、それに伴う非線形効果の発生を回避するために、光ファイバの下流側に配置された正分散素子により正分散を付与し、正分散素子出射後のパルス幅を負分散光学系への入射前とほぼ同等にすることとしている。
特許文献1および特許文献2のレーザ顕微鏡においては、光ファイバ内を伝播中に超短パルスレーザ光のパルス幅が伸びるのを防止するために、マルチモードファイバを使用することはできず、シングルモードファイバを使用する必要がある。シングルモードファイバのコア径は、一般に約数μmと小さく、内部における非線形効果の発生を抑えるためには、負分散補償量を相当大きくしてファイバ入射ピーク強度を減少させ、かつ、ファイバ下流側に配置される正分散素子の正分散量を相当大きくする必要がある。
しかしながら、付与すべき正分散量が大き過ぎる場合には、正分散素子の厚さが厚くなり、正分散素子内における内部吸収により出力減衰が顕著になるため、標本内における多光子励起効果の効率が低下するという不都合がある。
また、正分散量が大き過ぎる場合には、正分散素子のサイズが大きくなり、顕微鏡本体への取り付けおよび収納が困難になるという不都合がある。顕微鏡本体の大型化が生ずる場合には、光ファイバを用いて顕微鏡本体の取り回しを向上する効果が薄れることになるという不都合もある。
また、正分散量が大き過ぎる場合には、正分散素子のサイズが大きくなり、顕微鏡本体への取り付けおよび収納が困難になるという不都合がある。顕微鏡本体の大型化が生ずる場合には、光ファイバを用いて顕微鏡本体の取り回しを向上する効果が薄れることになるという不都合もある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、正分散素子における出力減衰を低減して、多光子励起効率を向上するとともに、正分散素子のサイズを低減して、顕微鏡本体への取り付けや収納を容易にすることができ、取り回しを容易にすることができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光を伸長させるパルス伸長器と、該パルス伸長器により伸長された超短パルスレーザ光を伝播させる大口径のシングルモードファイバと、該シングルモードファイバにより伝播されてきた超短パルスレーザ光を圧縮するパルス圧縮器と、該パルス圧縮器により圧縮された超短パルスレーザ光を標本に照射する顕微鏡本体とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。
本発明は、超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光を伸長させるパルス伸長器と、該パルス伸長器により伸長された超短パルスレーザ光を伝播させる大口径のシングルモードファイバと、該シングルモードファイバにより伝播されてきた超短パルスレーザ光を圧縮するパルス圧縮器と、該パルス圧縮器により圧縮された超短パルスレーザ光を標本に照射する顕微鏡本体とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。
大口径のシングルモードファイバを採用することにより、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生を増大させることなく、シングルモードファイバに入射させる超短パルスレーザ光のピーク強度を大きくすることができる。その結果、入射される超短パルスレーザ光のパルス幅を狭くすることができ、パルス伸長器およびパルス圧縮器による補償量を低減することができる。
すなわち、パルス圧縮器を小型化して光量ロスを低減し、標本における多光子励起光率を向上することができる。また、パルス圧縮器のサイズを小さくすることで、顕微鏡本体への取り付けや収納が容易となり、装置全体を小型化できるとともに、取り回しを向上することができる。
上記発明においては、前記シングルモードファイバが、フォトニッククリスタルファイバであり、前記レーザ光源が、近赤外域の超短パルスレーザ光を出射し、かつ、波長変更機能を有することとしてもよい。
このようにすることで、広波長帯域にわたり超短パルスレーザ光をシングルモード伝送することができる。したがって、超短パルスレーザ光の波長を変更しながら多光子蛍光を観察することができる。
このようにすることで、広波長帯域にわたり超短パルスレーザ光をシングルモード伝送することができる。したがって、超短パルスレーザ光の波長を変更しながら多光子蛍光を観察することができる。
また、上記発明においては、前記シングルモードファイバが次式により設定される最小有効コア径以上のコア径を有することとしてもよい。
Dmin=2×√(Aeff/π) (1)
Aeff=2π/λ×n2×Po_max×L/a (2)
Po_max=2×√(ln2/π)×Pave/(Δtin×ν) (3)
Δtin≒Δtout×√{1+7.68×[(GDDf+GDDc)/(Δtout 2)]2} (4)
ここで、Dmin:シングルモードファイバの最小有効コア径、Aeff:実効コア断面積、λ:波長、n2:シングルモードファイバの非線形屈折率、a:定数、L:シングルモードファイバの長さ、Po_max:Δtout以下のパルスを伝送可能な最大ファイバ入射ピーク強度、Pave:ファイバ出射端での平均出力、ν:繰り返し周波数、Δtin:ファイバ入射パルス幅、Δtout:顕微鏡本体内対物レンズ出射パルス幅、GDDf:ファイバの群速度遅延分散、GDDc:パルス圧縮器+顕微鏡本体の群速度遅延分散である。
このようにすることで、標本において目的のパルス幅の超短パルスレーザ光を照射することができ、多光子励起効率の低下を防止することができる。
Dmin=2×√(Aeff/π) (1)
Aeff=2π/λ×n2×Po_max×L/a (2)
Po_max=2×√(ln2/π)×Pave/(Δtin×ν) (3)
Δtin≒Δtout×√{1+7.68×[(GDDf+GDDc)/(Δtout 2)]2} (4)
ここで、Dmin:シングルモードファイバの最小有効コア径、Aeff:実効コア断面積、λ:波長、n2:シングルモードファイバの非線形屈折率、a:定数、L:シングルモードファイバの長さ、Po_max:Δtout以下のパルスを伝送可能な最大ファイバ入射ピーク強度、Pave:ファイバ出射端での平均出力、ν:繰り返し周波数、Δtin:ファイバ入射パルス幅、Δtout:顕微鏡本体内対物レンズ出射パルス幅、GDDf:ファイバの群速度遅延分散、GDDc:パルス圧縮器+顕微鏡本体の群速度遅延分散である。
このようにすることで、標本において目的のパルス幅の超短パルスレーザ光を照射することができ、多光子励起効率の低下を防止することができる。
また、上記発明においては、前記シングルモードファイバが並列に複数備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、シングルモードファイバ1本あたりに割り当てられる超短パルスレーザ光の入射ピーク強度を低減することができ、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生をさらに抑制することができる。
このようにすることで、シングルモードファイバ1本あたりに割り当てられる超短パルスレーザ光の入射ピーク強度を低減することができ、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生をさらに抑制することができる。
また、上記発明においては、前記パルス伸長器が、例えば、グレーティング対で構成される負分散発生光学系からなることとしてもよい。
このようにすることで、簡易に負分散量を調節して、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生を抑制することができる。
このようにすることで、簡易に負分散量を調節して、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生を抑制することができる。
また、上記発明においては、前記顕微鏡本体が標本に対向する対物レンズを備え、前記パルス伸長器が、前記対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小になるように負分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズの種類や超短パルスレーザ光の波長が変更されても、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生を抑制することができる。
このようにすることで、対物レンズの種類や超短パルスレーザ光の波長が変更されても、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生を抑制することができる。
また、上記発明においては、前記顕微鏡本体が、標本から発生する蛍光を検出する光検出器を備え、前記パルス伸長器が、前記光検出器により検出される蛍光強度に応じて負分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、目的の蛍光強度が得られるように負分散量を調節して、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
このようにすることで、目的の蛍光強度が得られるように負分散量を調節して、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
また、上記発明においては、前記レーザ光源と前記シングルモードファイバとの間に、レーザ光源の平均出力を調節する平均出力調整光学系を備え、前記パルス伸長器が、前記対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長および/または前記平均出力に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小になるように負分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、平均出力調整光学系の作動により、レーザ光源の平均出力を調節し、かつ、標本にダメージを与えることなく、超短パルスレーザ光を照射することができる。
このようにすることで、平均出力調整光学系の作動により、レーザ光源の平均出力を調節し、かつ、標本にダメージを与えることなく、超短パルスレーザ光を照射することができる。
また、上記発明においては、前記シングルモードファイバが、無偏波型のシングルモードファイバであり、前記パルス圧縮器が、ZnSe結晶のような等方性の高屈折率正分散材料により構成されていることとしてもよい。
このようにすることで、入手が比較的容易で安価に構成できる。また、パルス圧縮器の通過前後において光軸ずれを抑制することができる。
このようにすることで、入手が比較的容易で安価に構成できる。また、パルス圧縮器の通過前後において光軸ずれを抑制することができる。
また、上記発明においては、前記シングルモードファイバが、偏波保持型のシングルモードファイバであり、前記パルス圧縮器が、ZnSe結晶のような等方性の高屈折率正分散材料、音響光学素子あるいは電気光学素子のような異方性の高屈折率正分散材料またはグレーティング対を含む正分散発生光学系により構成されていることとしてもよい。
このようにすることで、パルス圧縮器の種類が多様になり、例えば、レーザ光特性を調整可能な光学系を使用することができる。
このようにすることで、パルス圧縮器の種類が多様になり、例えば、レーザ光特性を調整可能な光学系を使用することができる。
また、上記発明においては、前記パルス圧縮器が、対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小となるように正分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズの種類や超短パルスレーザ光の波長が変更されても、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生を抑制することができる。
このようにすることで、対物レンズの種類や超短パルスレーザ光の波長が変更されても、シングルモードファイバ内における非線形効果の発生を抑制することができる。
また、上記発明においては、前記顕微鏡本体が、標本から発生する蛍光を検出する光検出器を備え、前記パルス圧縮器が、前記光検出器により検出される蛍光強度に応じて正分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、目的の蛍光強度が得られるように正分散量を調節して、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
このようにすることで、目的の蛍光強度が得られるように正分散量を調節して、鮮明な多光子蛍光画像を取得することができる。
また、上記発明においては、レーザ光源とシングルモードファイバとの間にレーザ光源の平均出力を調節する平均出力調整光学系を備え、前記パルス圧縮器が、前記対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長および/または前記平均出力に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小になるように正分散量を調節することとしてもよい。
このようにすることで、平均出力調整光学系の作動により、レーザ光源の平均出力を調節し、かつ、標本にダメージを与えることなく、超短パルスレーザ光を照射することができる。
このようにすることで、平均出力調整光学系の作動により、レーザ光源の平均出力を調節し、かつ、標本にダメージを与えることなく、超短パルスレーザ光を照射することができる。
本発明によれば、パルス圧縮器として使用される正分散素子における出力減衰を低減して、多光子励起効率を向上することができる。また、本発明によれば正分散素子のサイズを低減して、顕微鏡本体への取り付けや収納を容易にすることができ、取り回しを容易にすることができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡1について、図1および図2を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1は、標本Aにおいて多光子励起効果を発生させる多光子励起型のレーザ顕微鏡1であって、図1に示されるように、超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源2側から順に、該レーザ光源2と、平均出力調整光学系3と、パルス伸長器4と、λ/4板5と、アライメント調整光学系6と、カップリング光学系7と、大口径のシングルモードファイバ8と、コリメート光学系9と、ビーム整形光学系10と、パルス圧縮器11と、顕微鏡本体12とを備えている。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1は、標本Aにおいて多光子励起効果を発生させる多光子励起型のレーザ顕微鏡1であって、図1に示されるように、超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源2側から順に、該レーザ光源2と、平均出力調整光学系3と、パルス伸長器4と、λ/4板5と、アライメント調整光学系6と、カップリング光学系7と、大口径のシングルモードファイバ8と、コリメート光学系9と、ビーム整形光学系10と、パルス圧縮器11と、顕微鏡本体12とを備えている。
レーザ光源2は、例えば、波長帯域700nm〜1000nmで波長変更可能な超短パルスレーザ光を出射するようになっている。
平均出力調整光学系3は、例えば、音響光学素子、電気光学素子、NDフィルタあるいはλ/2板と偏光子との組み合わせにより構成されている。目標となる蛍光強度が得られるようにレーザ光源2から出射される超短パルスレーザ光の平均出力を調整するようになっている。
平均出力調整光学系3は、例えば、音響光学素子、電気光学素子、NDフィルタあるいはλ/2板と偏光子との組み合わせにより構成されている。目標となる蛍光強度が得られるようにレーザ光源2から出射される超短パルスレーザ光の平均出力を調整するようになっている。
パルス伸長器4は、例えば、図1に示す例では、対向する一対のグレーティング4a,4bおよびミラー4cと、これらの駆動機構(図示略)とにより構成されている。レーザ光源2から出射される超短パルスレーザ光の波長、顕微鏡本体12に備えられる対物レンズ13の種類あるいは超短パルスレーザ光の平均出力に応じて、対物レンズ13の先端から出射される超短パルスレーザ光が所定のパルス幅となるように、グレーティング4a,4b対の間隔あるいはミラー4cの位置を矢印の方向に調節し、超短パルスレーザ光に付与する負分散量を調節するようになっている。
λ/4板5は、パルス伸長器4内のグレーティング4a,4bとの組み合わせで、超短パルスレーザ光が、シングルモードファイバ8の端面において反射してレーザ光源2側に戻るのを阻止するようになっている。
アライメント調整光学系6は、パルス伸長器4におけるグレーティング4a,4b対およびミラー4cの移動により発生する光軸のシフトや傾きを補正するようになっている。
アライメント調整光学系6は、パルス伸長器4におけるグレーティング4a,4b対およびミラー4cの移動により発生する光軸のシフトや傾きを補正するようになっている。
カップリング光学系7は、少なくとも1つのレンズを光軸方向に移動させることにより、パルス伸長器4におけるグレーティング4a,4b対およびミラー4cの移動により発生する光路長の変動に応じて、超短パルスレーザ光のシングルモードファイバ8の端面への集光位置が光軸方向にずれないように調節することができるようになっている。
シングルモードファイバ8は、近赤外域対応のフォトニッククリスタルファイバであり、そのコア径は、次式により算出される径寸法以上に設定されている。
Dmin=2×√(Aeff/π) (1)
Aeff=2π/λ×n2×Po_max×L/a (2)
Po_max=2×√(ln2/π)×Pave/(Δtin×ν) (3)
Δtin≒Δtout×√{1+7.68×[(GDDf+GDDc)/(Δtout 2)]2} (4)
Dmin=2×√(Aeff/π) (1)
Aeff=2π/λ×n2×Po_max×L/a (2)
Po_max=2×√(ln2/π)×Pave/(Δtin×ν) (3)
Δtin≒Δtout×√{1+7.68×[(GDDf+GDDc)/(Δtout 2)]2} (4)
ここで、
Dmin:シングルモードファイバ8の最小有効コア径
Aeff:実効コア断面積
λ:波長
n2:シングルモードファイバ8の非線形屈折率
a:定数
L:シングルモードファイバ8の長さ
Po_max:Δtout以下のパルスを伝送可能な最大ファイバ入射ピーク強度
Pave:シングルモードファイバ8の出射端での平均出力
ν:繰り返し周波数
Δtin:シングルモードファイバ8への入射パルス幅
Δtout:対物レンズ13の出射パルス幅
GDDf:シングルモードファイバ8の群速度遅延分散
GDDc:パルス圧縮器11+顕微鏡本体12の群速度遅延分散である。
Dmin:シングルモードファイバ8の最小有効コア径
Aeff:実効コア断面積
λ:波長
n2:シングルモードファイバ8の非線形屈折率
a:定数
L:シングルモードファイバ8の長さ
Po_max:Δtout以下のパルスを伝送可能な最大ファイバ入射ピーク強度
Pave:シングルモードファイバ8の出射端での平均出力
ν:繰り返し周波数
Δtin:シングルモードファイバ8への入射パルス幅
Δtout:対物レンズ13の出射パルス幅
GDDf:シングルモードファイバ8の群速度遅延分散
GDDc:パルス圧縮器11+顕微鏡本体12の群速度遅延分散である。
なお、対物レンズ13の出射パルス幅Δtoutについては、超短パルスレーザ光の使用目的に応じて設定することとする。本実施形態では、例えば、レーザ光源2のパルス幅の1〜3倍程度の範囲で設定する。また、定数aについては、設定された出射パルス幅Δtoutの値をもとに、Po_maxを実験的に設定して求める。具体的には、一般に超短パルスレーザ光のファイバへの入射ピーク強度Poが大きくなるほどファイバ内での非線形効果が顕著になってパルス幅Δtoutが伸びるため、超短パルスレーザ光をファイバに対して入射させる実験系を構築し、ファイバへの入射ピーク強度Poを変化させたときのΔtoutの値を予め測定しておく。目標とするΔtoutが決まれば、実測されたPoとΔtoutのプロットに基づいて、設定されたΔtoutに対応する入射ピーク強度Po_maxを求めることができる。
このようにして求められた入射ピーク強度Po_maxの値から、次式により定数aを求めることができる。
γ=(2π/λ)・(n2/Aeff) (5)
Lnl=1/(γ・Po_max) (6)
a=L/Lnl=L・γ・Po_max (7)
ここで、
γ:非線形定数
Lnl:非線形長である。
上記実験系で使用した光ファイバの仕様に基づいて、シングルモードファイバ8の長さLおよび式(5)により非線形定数γを求めることができる。これらの値と上記実験系で求められたPo_maxの値から、式(6),(7)により定数aを求めることができる。
定数aは、Δtoutが上述の設定値となるための条件であるため、得られた定数aの値に対して式(5)から(7)が成立していれれば、Δtoutは設定した値に保たれる。よって、これらの関係式が成立する範囲で、L,γ,Po_maxは自由に変更できることとなり、例えばAeffを大きくすることにより、Po_maxを大きくすることができる。
シングルモードファイバ8による非線形効果が無視できる条件としては、式(2)および式(7)において最大ファイバ入射ピーク強度Po_maxを小さくする必要がある。しかし、最大ファイバ入射ピーク強度Po_maxを小さくする場合には、式(3)により、シングルモードファイバ8の出射端での平均出力Paveを下げるかシングルモードファイバ8の入射パルス幅Δtinを大きくする必要があり、いずれの場合も伝送可能な出力が低下してしまう。そこで、定数aを設定し目的のパルス幅を得ることについて以下に述べる。定数aの設定は、a≒1であれば非線形現象が誘発され、a>1であれば非線形現象が顕著になり、a≪1であれば非線形現象を無視することができる。上述のように定数aが大きくなればPo_maxも大きくなることから、シングルモードファイバ8内における非線形効果の発生の許容範囲内において定数aを1より大きく設定し、目的のパルス幅を得ることにより、伝送出力を向上させることができる。すなわち、シングルモードファイバ8内における非線形効果の発生をある程度許容することとして、伝送出力を向上することができる。
このようにして求められた入射ピーク強度Po_maxの値から、次式により定数aを求めることができる。
γ=(2π/λ)・(n2/Aeff) (5)
Lnl=1/(γ・Po_max) (6)
a=L/Lnl=L・γ・Po_max (7)
ここで、
γ:非線形定数
Lnl:非線形長である。
上記実験系で使用した光ファイバの仕様に基づいて、シングルモードファイバ8の長さLおよび式(5)により非線形定数γを求めることができる。これらの値と上記実験系で求められたPo_maxの値から、式(6),(7)により定数aを求めることができる。
定数aは、Δtoutが上述の設定値となるための条件であるため、得られた定数aの値に対して式(5)から(7)が成立していれれば、Δtoutは設定した値に保たれる。よって、これらの関係式が成立する範囲で、L,γ,Po_maxは自由に変更できることとなり、例えばAeffを大きくすることにより、Po_maxを大きくすることができる。
シングルモードファイバ8による非線形効果が無視できる条件としては、式(2)および式(7)において最大ファイバ入射ピーク強度Po_maxを小さくする必要がある。しかし、最大ファイバ入射ピーク強度Po_maxを小さくする場合には、式(3)により、シングルモードファイバ8の出射端での平均出力Paveを下げるかシングルモードファイバ8の入射パルス幅Δtinを大きくする必要があり、いずれの場合も伝送可能な出力が低下してしまう。そこで、定数aを設定し目的のパルス幅を得ることについて以下に述べる。定数aの設定は、a≒1であれば非線形現象が誘発され、a>1であれば非線形現象が顕著になり、a≪1であれば非線形現象を無視することができる。上述のように定数aが大きくなればPo_maxも大きくなることから、シングルモードファイバ8内における非線形効果の発生の許容範囲内において定数aを1より大きく設定し、目的のパルス幅を得ることにより、伝送出力を向上させることができる。すなわち、シングルモードファイバ8内における非線形効果の発生をある程度許容することとして、伝送出力を向上することができる。
コリメート光学系9は、少なくとも1つのレンズを光軸方向に移動させることにより、シングルモードファイバ8の出射端から出射される超短パルスレーザ光を略平行光に変換するようになっている。
ビーム整形光学系10は、少なくとも2つのレンズにより構成され、少なくとも1つのレンズを光軸方向に移動させることにより、超短パルスレーザ光のビーム径が対物レンズ13の瞳を満たすように整形するようになっている。
ビーム整形光学系10は、少なくとも2つのレンズにより構成され、少なくとも1つのレンズを光軸方向に移動させることにより、超短パルスレーザ光のビーム径が対物レンズ13の瞳を満たすように整形するようになっている。
パルス圧縮器11は、シングルモードファイバ8を通過した超短パルスレーザ光に所定の正分散補償量を付与することで、パルス伸長器4に入射される時点における超短パルスレーザ光と同等のパルス幅を対物レンズ13出射後に回復するようになっている。
具体的には、パルス圧縮器11は、シングルモードファイバ8が、ランダム偏光型の場合には、等方性の高屈折率正分散材料を使用し、偏波保持型の場合には、その他に、音響光学素子や電気光学素子に代表される異方性の高屈折率正分散材料やグレーティング対等により構成されている。
具体的には、パルス圧縮器11は、シングルモードファイバ8が、ランダム偏光型の場合には、等方性の高屈折率正分散材料を使用し、偏波保持型の場合には、その他に、音響光学素子や電気光学素子に代表される異方性の高屈折率正分散材料やグレーティング対等により構成されている。
顕微鏡本体12は、パルス圧縮器11によりある程度回復されたパルス幅を有する超短パルスレーザ光を2次元的に走査するスキャナ14と、瞳投影レンズ15および結像レンズ16と、結像レンズ16により略平行光にされた超短パルスレーザ光を集光して標本Aに照射する一方、標本Aにおいて発生した多光子蛍光を集光する対物レンズ13と、該対物レンズ13により集光された多光子蛍光を超短パルスレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー17と、該ダイクロイックミラー17により分岐された多光子蛍光を集光する集光レンズ18と、集光された多光子蛍光を検出する光検出器19と、該光検出器19により検出された多光子蛍光に基づいて多光子蛍光画像を構築し表示する表示部20とを備えている。
このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡1の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1によれば、レーザ光源2から出射された超短パルスレーザ光を平均出力調整光学系3に通過させることにより、超短パルスレーザ光の平均出力が調整される。平均出力調整光学系3がない場合においても、パルス伸長器4またはパルス圧縮器11の分散補償量を調節することで、対物レンズ13から出射される超短パルスレーザ光のピーク強度を可変することができ、それによって目的の蛍光強度を得ることも可能である。しかし、その場合には、平均出力が変わらないため、標本Aにダメージ(焼け)が発生する可能性があるので好ましくない。本実施形態によれば、超短パルスレーザ光の平均出力を調整した上で目的の蛍光強度を得ることができ、標本Aの健全性を維持しつつ蛍光観察を行うことができる。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡1によれば、レーザ光源2から出射された超短パルスレーザ光を平均出力調整光学系3に通過させることにより、超短パルスレーザ光の平均出力が調整される。平均出力調整光学系3がない場合においても、パルス伸長器4またはパルス圧縮器11の分散補償量を調節することで、対物レンズ13から出射される超短パルスレーザ光のピーク強度を可変することができ、それによって目的の蛍光強度を得ることも可能である。しかし、その場合には、平均出力が変わらないため、標本Aにダメージ(焼け)が発生する可能性があるので好ましくない。本実施形態によれば、超短パルスレーザ光の平均出力を調整した上で目的の蛍光強度を得ることができ、標本Aの健全性を維持しつつ蛍光観察を行うことができる。
平均出力を調整された超短パルスレーザ光は、パルス伸長器4を通過させられることにより、負の分散補償量を付与され、パルス幅を伸長させられる。そして、アライメント調整光学系6により、その光軸ずれを補正され、カップリング光学系7により、集光位置を調節されて、シングルモードファイバ8の端面に入射される。
本実施形態においては、シングルモードファイバ8が、上記式(1)に示される最小有効コア径以上のコア径を有しているので、シングルモードファイバ8に入射される超短パルスレーザ光のピーク強度を比較的大きくすることができる。そして、ピーク強度を大きくすることで、式(3)に示されるようにパルス幅を狭くすることができ、パルス伸長器4およびパルス圧縮器11により付与する分散補償量を低減することができる。
すなわち、パルス圧縮器11を小型化することができるとともに、該パルス圧縮器11における光量ロスを低減することができ、標本Aの対物レンズ13の焦点面において多光子励起効率を向上することができる。また、シングルモードファイバ8による超短パルスレーザ光の伝送効率も向上することができる。さらに、パルス圧縮器11を小型化することで、顕微鏡本体12への搭載が容易になり、それによる顕微鏡本体12の大型化を回避できる。したがって、取り回しが向上されるというシングルモードファイバ8による伝送のメリットを生かすことができる。
また、本実施形態においては、シングルモードファイバ8として近赤外域対応のフォトニッククリスタルファイバを使用しているので、広波長帯域でシングルモード伝送ができ、波長をスキャンした観察を簡易に行うことができる。
通常市販されているシングルモードファイバや偏波保持型のシングルモードファイバでは、レーザ光源2として使用されているモードロック型フェムト秒チタンサファイヤレーザの発振波長域(700nm〜1000nm)にわたるシングルモード伝送を保持することができない。このため、多光子励起による蛍光観察行う際に、蛍光色素の最適励起波長に応じてシングルモードファイバの種類も変更することが必要となる場合もあり、装置として構成が複雑になるという問題がある。
通常市販されているシングルモードファイバや偏波保持型のシングルモードファイバでは、レーザ光源2として使用されているモードロック型フェムト秒チタンサファイヤレーザの発振波長域(700nm〜1000nm)にわたるシングルモード伝送を保持することができない。このため、多光子励起による蛍光観察行う際に、蛍光色素の最適励起波長に応じてシングルモードファイバの種類も変更することが必要となる場合もあり、装置として構成が複雑になるという問題がある。
この場合において、シングルモードファイバ8としては、偏波保持型のフォトニッククリスタルファイバを使用することも可能だが、コア径が比較的小さいので、コア径の比較的大きなランダム偏光型フォトニッククリスタルファイバを使用することが好ましい。それに伴い、パルス圧縮器11には、結晶軸に対して屈折率依存性のない等方性の高正分散材料(ZnSe等)を使用することが望ましい。
なお、本実施形態においては、近赤外域において連続的に波長を変更することができるレーザ光源2を例示したが、これに代えて、図2に示されるように、異なる単一波長の複数のレーザ光源2a〜2cからの超短パルスレーザ光を合成ミラー2d〜2fにより同一光路に合流させることとしてもよい。
また、パルス伸長器4としては、一対のグレーティング4a,4bを有するものを例示したが、これに代えて、プリズム対を有するものを採用してもよい。
また、λ/4板5を配置して、シングルモードファイバ8の端面において反射した超短パルスレーザ光がレーザ光源2に戻るのを防止したが、これに代えて、アイソレータ、シングルモードファイバ8端面の斜め研磨あるいはシングルモードファイバ8端面の反射防止コーティングを採用してもよい。
また、λ/4板5を配置して、シングルモードファイバ8の端面において反射した超短パルスレーザ光がレーザ光源2に戻るのを防止したが、これに代えて、アイソレータ、シングルモードファイバ8端面の斜め研磨あるいはシングルモードファイバ8端面の反射防止コーティングを採用してもよい。
また、パルス圧縮器11としては、超短パルスレーザ光の波長、対物レンズ13の種類、入射平均出力に応じて、対物レンズ13から出射される超短パルスレーザ光が所定のパルス幅となるように、パルス伸長器4と合わせて結晶長を可変にしてもよい。可変値は、パルス伸長器4のそれと合わせて予め記憶しておくことにすればよい。また、取得される蛍光強度が最大となるようにパルス圧縮器11の分散補償量か結晶長を微調整してもよい。結晶長を調整する手段としては、図3に示されるようなレボルバー式にして結晶長の異なるZnSe結晶(高屈折率正分散材料)11a,11bを切り替えることが挙げられる。図3(a)はシングルパス方式、図3(b)はマルチパス方式である。図中、符号11cはミラーである。また、図3(c)に示されるように、プリスム方式を採用してもよい。
また、本実施形態においては、単一のシングルモードファイバ8を用いて超短パルスレーザ光を伝送することとしたが、これに代えて、図4に示されるように、アライメント調整光学系6から出射された超短パルスレーザ光を複数の光路に分岐して、それぞれの光路に配置したシングルモードファイバ8aにより伝送した後、同一光路に合流することとしてもよい。図中、符号8bはダイクロイックミラー、符号8cはミラー、符号7aはカップリング光学系、符号9aはコリメート光学系である。
また、図5に示されるように、ファイババンドル8Aをほぐして複数のコア8dから出射される超短パルスレーザ光を同一光路に合流することとしてもよい。
また、図5に示されるように、ファイババンドル8Aをほぐして複数のコア8dから出射される超短パルスレーザ光を同一光路に合流することとしてもよい。
このようにすることで、1本のシングルモードファイバ8に割り当てられる超短パルスレーザ光の入射ピーク強度を抑えることができ、シングルモードファイバ8内における非線形効果を抑制できる。したがって、パルス伸長器4およびパルス圧縮器11をさらに小型に構成することができるという利点がある。
A 標本
1 レーザ顕微鏡
2 レーザ光源
3 平均出力調整光学系
4 パルス伸長器
4a,4b グレーティング
8,8A,8a シングルモードファイバ
11 パルス圧縮器
11a,11b ZnSe結晶(高屈折率正分散材料)
12 顕微鏡本体
13 対物レンズ
19 光検出器
1 レーザ顕微鏡
2 レーザ光源
3 平均出力調整光学系
4 パルス伸長器
4a,4b グレーティング
8,8A,8a シングルモードファイバ
11 パルス圧縮器
11a,11b ZnSe結晶(高屈折率正分散材料)
12 顕微鏡本体
13 対物レンズ
19 光検出器
Claims (13)
- 超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源から出射された超短パルスレーザ光を伸長させるパルス伸長器と、
該パルス伸長器により伸長された超短パルスレーザ光を伝播させる大口径のシングルモードファイバと、
該シングルモードファイバにより伝播されてきた超短パルスレーザ光を圧縮するパルス圧縮器と、
該パルス圧縮器により圧縮された超短パルスレーザ光を標本に照射する顕微鏡本体とを備えるレーザ顕微鏡。 - 前記シングルモードファイバが、フォトニッククリスタルファイバであり、
前記レーザ光源が、近赤外域の超短パルスレーザ光を出射し、かつ、波長可変機能を有する請求項1に記載のレーザ顕微鏡。 - 前記シングルモードファイバが、次式により設定される最小有効コア径以上のコア径を有する請求項1に記載のレーザ顕微鏡。
Dmin=2×√(Aeff/π) (1)
Aeff=2π/λ×n2×Po_max×L/a (2)
Po_max=2×√(ln2/π)×Pave/(Δtin×ν) (3)
Δtin≒Δtout×√{1+7.68×[(GDDf+GDDc)/(Δtout 2)]2} (4)
ここで、
Dmin:シングルモードファイバの最小有効コア径
Aeff:実効コア断面積
λ:波長
n2:シングルモードファイバの非線形屈折率
a:定数
L:シングルモードファイバの長さ
Po_max:Δtout以下のパルスを伝送可能な最大ファイバ入射ピーク強度
Pave:ファイバ出射端での平均出力
ν:繰り返し周波数
Δtin:ファイバ入射パルス幅
Δtout:顕微鏡本体内対物レンズ出射パルス幅
GDDf:ファイバの群速度遅延分散
GDDc:パルス圧縮器+顕微鏡本体の群速度遅延分散 - 前記シングルモードファイバが並列に複数備えられている請求項1から請求項3のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
- 前記パルス伸長器が、負分散発生光学系からなる請求項1に記載のレーザ顕微鏡。
- 前記顕微鏡本体が標本に対向する対物レンズを備え、
前記パルス伸長器が、前記対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小になるように負分散量を調節する請求項5に記載のレーザ顕微鏡。 - 前記顕微鏡本体が、標本から発生する蛍光を検出する光検出器を備え、
前記パルス伸長器が、前記光検出器により検出される蛍光強度に応じて負分散量を調節する請求項6に記載のレーザ顕微鏡。 - 前記レーザ光源と前記シングルモードファイバとの間に、レーザ光源の平均出力を調節する平均出力調整光学系を備え、
前記パルス伸長器が、前記対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長および/または前記平均出力に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小になるように負分散量を調節する請求項5に記載のレーザ顕微鏡。 - 前記シングルモードファイバが、無偏波型のシングルモードファイバであり、
前記パルス圧縮器が、ZnSe結晶のような等方性の高屈折率正分散材料により構成されている請求項1に記載のレーザ顕微鏡。 - 前記シングルモードファイバが、偏波保持型のシングルモードファイバであり、
前記パルス圧縮器が、ZnSe結晶のような等方性の高屈折率正分散材料、音響光学素子あるいは電気光学素子のような異方性の高屈折率正分散材料またはグレーティング対を含む正分散発生光学系により構成されている請求項1に記載のレーザ顕微鏡。 - 前記パルス圧縮器が、対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小となるように正分散量を調節する請求項9または請求項10に記載のレーザ顕微鏡。
- 前記顕微鏡本体が、標本から発生する蛍光を検出する光検出器を備え、
前記パルス圧縮器が、前記光検出器により検出される蛍光強度に応じて正分散量を調節する請求項11に記載のレーザ顕微鏡。 - レーザ光源とシングルモードファイバとの間にレーザ光源の平均出力を調節する平均出力調整光学系を備え、
前記パルス圧縮器が、前記対物レンズの種類および/または超短パルスレーザ光の波長および/または前記平均出力に応じて対物レンズ出射後のパルス幅が最小になるように正分散量を調節する請求項9または請求項10に記載のレーザ顕微鏡。
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