JP2016541027A - 小型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

小型顕微鏡は、筐体と、支持部材と、筺体内に配置され支持部材によって支持された一次光学支持部材と、支持体と一次光学支持部材との間にある少なくとも一つの防振架台と、照明部と、対物レンズ系と、一次光学支持部材に搭載される試料ステージと、照明光ビームを照明部から試料ステージに導く照明光学系と、試料ステージから戻り光を受光しそれを検出装置に伝送する戻り光学系とを備え、照明光学系および戻り光学系は、一次光学支持部材に搭載される。【選択図】図２

Description

本出願は、小型顕微鏡と、小型顕微鏡および照明用光源モジュールを備えたシステムと、顕微鏡焦点制御システムと、顕微鏡焦点を制御する方法とに関する。

光学顕微鏡および分光法の用例には、数多くの技術および応用例が含まれる。技術例には、微分干渉コントラストと位相コントラストと暗視野とを用いた顕微鏡、吸収顕微鏡、コヒーレント干渉顕微鏡、ラマン分光法を用いた顕微鏡、および、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分光法や、蛍光寿命イメージングや、蛍光偏光や異方性などの蛍光に基づく技術を用いた顕微鏡、マルチカラーと交互レーザー励起を用いた顕微鏡、単一粒子の局在化と構造化照明に基づく超解像度顕微鏡が含まれる。

多くの応用例に対し、顕微鏡システムは、非常に安定していて、振動およびその他の外的影響から保護され、正確な位置合わせと制御が可能であり、非常に弱い信号を検出することができ、しかも、安全に操作できる必要がある。特定の応用例向けの市販システムや特注顕微鏡システムは、高価であり、寸法も重量も大きいので持ち運ぶことができず、その上、相当な設備と、メンテナンスコストと、オペレータ研修およびカスタムソフトウェアと、結果的に相当な総所有コストとを必要とする。

本発明の第一態様によれば、小型顕微鏡を提供することができ、前記小型顕微鏡は、筐体と、支持部材と、前記筺体内に配置され前記支持部材によって支持された一次光学支持部材と、前記支持体と前記一次光学支持部材との間にある少なくとも一つの防振架台と、前記一次光学支持部材に搭載される試料ステージと、前記試料ステージからの戻り光を受光し検出装置に戻り光を伝送する戻り光学系と、を備え、前記戻り光学系は、前記一次光学支持部材に搭載されることを特徴とする。

前記小型顕微鏡は、前記一次光学支持部材に搭載された対物レンズ系を有していてもよい。

前記小型顕微鏡は、さらに、照明部と、前記照明部から前記試料ステージ上の試料に照明光ビームを導く照明光学系とを備え、前記照明光学系は、前記一次光学支持部材に搭載されていてもよい。

少なくとも一部の前記照明光学系および前記戻り光学系は、前記小型顕微鏡の異なる平面に配置されていてもよい。前記異なる平面は、前記一次光学支持部材または二次光学支持部材の不透明部分によって分離されていることが好ましい。

前記検出装置は、前記一次光学支持部材によって支持されていてもよい。

前記照明光学系および前記戻り光学系の少なくとも一部は、前記一次光学支持部材によって支持された二次光学支持部材を備えていてもよい。

前記照明部は、光源に接続された光ファイバを収容する接続部を備えていてもよい。

前記検出装置は、光検出器を備えていてもよい。

前記検出装置は、撮像装置を備えていてもよい。

前記照明部は、出力計を備えていてもよい。

前記照明光学系は、照明光ビームの形状を制御するために、ビーム整形光学系を備えていてもよい。

前記照明光学系は、照明光ビームの形状を制御するために、少なくとも一つの絞りを含んでいてもよい。

前記戻り光学系は、戻り光を少なくとも第一波長帯域と第二波長帯域とに分離するように動作可能であってもよい。

前記小型顕微鏡が撮像装置を備える場合、前記戻り光学系は、第一波長帯域の戻り光を前記撮像装置の第一領域に導き、第二波長帯域の戻り光を前記撮像装置の第二領域に導いてもよい。

前記試料ステージは、可動であってもよい。

前記小型顕微鏡は、さらに、焦点安定化ビームを前記対物レンズ系に導くために焦点安定化ビーム光学系を備えていてもよい。

前記小型顕微鏡システムは、前記対物レンズ系から焦点安定ビームの基準画像を受信し、前記焦点安定化ビームの後続画像を受信し、そして、前記基準画像と後続画像に応じて前記試料ステージを制御するように動作可能な焦点制御部を備えていてもよい。

前記照明光ビームがパルス化されている場合、前記後続画像は、前記照明光ビームのパルスとパルスとの間で取得してもよい。

本発明の第二態様によれば、顕微鏡システムを提供することができ、前記顕微鏡システムは、本発明の第一態様による小型顕微鏡と、照明光源モジュールとを備え、前記小型顕微鏡の前記照明光学系と前記照明光源モジュールは光ファイバによって接続されている。

前記照明光源モジュールは、レーザ光源を備えていてもよい。

前記照明光源モジュールは、第一波長を有する第一照明光ビームを生成する第一レーザ光源、および、第二波長を有する第二照明光ビームを生成する第二レーザ光源と、前記第一照明光ビームおよび前記第二照明光ビームを前記光ファイバに伝送するビーム合成光学系とを備えていてもよい。

前記照明光源モジュールは、焦点安定化ビームレーザ光源と、前記焦点安定性化ビームを前記小型顕微鏡に伝送する焦点安定化ビーム光ファイバを備えていてもよい。

本発明の第三態様によれば、顕微鏡焦点制御システムを提供することができ、前記顕微鏡焦点制御システムは、可動試料ステージと、対物レンズ系と、焦点安定化ビームを前記対物レンズ系に導く焦点安定化ビーム光学系と、撮像装置と、前記撮像装置に光を戻す戻り光学系と、前記対物レンズ系からの前記焦点安定化ビームの基準画像を有する制御系とを備え、前記制御系は、前記焦点安定化ビームの後続画像を受信し、前記基準画像と後続画像に応じて前記試料ステージを制御するように動作可能である。

前記制御系は、後続画像が前記基準画像と一致するように前記試料ステージを制御する動作を行なうことが可能であってもよい。

本発明の第四態様によれば、顕微鏡の焦点を制御する方法を提供することができ、前記方法は、焦点安定化ビームの基準画像を格納することと、顕微鏡の対物レンズ系に焦点安定化ビームを伝送することと、前記焦点安定化ビームの後続画像を受信することと、前記基準画像と後続画像に応じて前記顕微鏡の試料ステージを制御することとを含む。

前記方法は、後続画像が前記基準画像と一致するように前記試料ステージを制御することを含んでいてもよい。

ほんの一例として、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明することにする。
本発明の実施形態である小型顕微鏡の斜視図である。 図１の小型顕微鏡の概略断面図である。 図２の小型顕微鏡の照明部を図示したものである 図１の小型顕微鏡の一次光学支持部材に対して代替となる支援部材の平面図である。 図１の小型顕微鏡で使用する照明光源モジュールの概略図である。 デュアルカラー広視野蛍光顕微鏡用の反射光路の例である。 デュアルカラー広視野蛍光顕微鏡用の反射光路の代替例である。 デュアルカラー広視野蛍光顕微鏡で使用する、図１の小型顕微鏡内のビーム経路の斜視図である。 図４の小型顕微鏡内の別のビーム経路の斜視図である。 図４と図５の小型顕微鏡内の撮像装置で形成された画像の例である。 本発明の実施形態である、別の小型顕微鏡の斜視図である。 図７の小型顕微鏡の一次光学支持部材の斜視図である。 図７の小型顕微鏡の一次光学支持部材の斜視図である。 図７の小型顕微鏡の一次光学支持部材の斜視図である。 図７の小型顕微鏡の一次光学支持部材の斜視図である。 図７の小型顕微鏡の構成の線図である。 図７の小型顕微鏡の構成の線図である。 図７の小型顕微鏡の構成の線図である。 図７の小型顕微鏡の構成の線図である。 図９Ｂ〜９Ｄの光学的構成の斜視図である。 図７の小型顕微鏡の二次光学支持部材の斜視図である。 図８Ａ〜図８Ｄの一次光学支持部材に搭載された図７の小型顕微鏡の二次光学支持部材の斜視図である。 図７の小型顕微鏡の一体型ミラー架台の断面図である。 図７の小型顕微鏡の別の一体型ミラー架台の断面図である。 本発明の実施形態の小型顕微鏡で使用する対物ステージの側面図である。 焦点制御系の動作を説明する図である。 図１３の焦点制御系で使用する複数の基準画像例を示している。 単色の広視野蛍光顕微鏡に対する検出経路の例を示している。 二色の広視野蛍光顕微鏡に対する検出経路の例を示している。 三色の広視野蛍光顕微鏡に対する検出経路の例を示している。 二色共焦点蛍光顕微鏡に対する光経路の一例である。 蛍光偏光顕微鏡に対する光経路の一例である。 明視野干渉散乱顕微鏡の光経路の一例である。 同時二色広視野蛍光顕微鏡に対する光路の一例である。 同時二色暗視野蛍光顕微鏡に対する光路の一例である。

各図面について詳細に亘り具体的に言及する場合、図示した詳細は、一例として挙げたものであって、本発明の好ましい実施形態を分かりやすく説明するためのものに過ぎず、本発明の原理および概念的側面について最も有用な、しかも、容易に理解できる説明であると考えられるものを提供するために提示するということを強調しておきたい。したがって、本発明の基本的な理解のために必要な程度以上に詳細に本発明の構造的詳細を示すことは行なわず、図面とともになされる説明は、本発明のいくつかの形態を実際にどのように具体化することができるのかについて当業者に対して明確にするものである。

本発明の少なくとも一つの実施形態を説明する前に、本発明は、それを適用する際に、以下の説明で記載したり図示したりする、構造および構成要素の配置に関する詳細内容に限定されないということを理解されたい。本発明は、他の実施形態に適用したり、さまざまな形で実践もしくは実施したりすることが可能である。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。

＜第一実施形態＞
本願の実施形態である小型顕微鏡は、一般的に、図１の符号１０で示すものである。顕微鏡１０は、顕微鏡の光経路を完全に覆う筺体１１を有している。筺体１１は、以下で記載するように、試料ステージへアクセスすることができるハッチ部１１ａを備えている。筺体１１の側壁および天井壁は、顕微鏡１０内の構成要素へアクセスすることができるために取り外し可能であることが好ましい。この例では、筐体１１は、横２４センチメートル、縦２１．５センチメートル、高さ１５センチメートルで非常に小型であり、顕微鏡の設置面積はほぼＡ４用紙と同じで、体積は約８リットルである。筐体１１内の未使用スペースをさらに減らせば、ほかに主要な設計変更をせずに、顕微鏡の大きさを２３センチメートルｘ１６センチメートルｘ１５センチメートルまでさらに減らすことができ、構成要素および光経路を適切に設計すればもっと小さくすることもできると想定される。この可搬性により、顕微鏡の向きや設置場所を簡単に変えたり、冷蔵庫とか、例えば、ｐＨ感受性の哺乳動物細胞培養のために二酸化炭素濃度が制御された、特殊な大気の組成の培養器などの制御環境に設置することもできる。

ハッチ１１ａと連動して、照明部を遮断したり、ハッチが開いているときは照明部の動作ができないようにしたりすることができる。エンクロージャ１１が顕微鏡内から光が漏れないようにすることで、本顕微鏡は、クラスＩレーザー製品とすることができ、したがって、どこでも使用することができるので、レーザ制御領域などに限定されないようにすることができる。

顕微鏡１０の断面図を図２に示す。筐体１１内には、符号１２で大まかに示した位置に、支持部材がある。この例では、支持部材１２は、通常はその中間点に架台ホルダー１４を有する複数の支柱１３で構成されている。この例では、支持部材１２は離散構造であるが、支持部材を筐体１１と一体化して設けることもできる。

光学構成要素を支持するために、一次光学支持部材１６が設けられている。一次光学支持部材１６は、例えば、アルミニウムのブロック、チタンのブロック、または炭素繊維から製造したり他の手法で製造される、インバーのブロックのような、寸法が安定していて単一の連続した緻密な材料でできたものであることが好ましい。この例では、一次光学支持部材１６は、ほぼ矩形の板であるが、例えば、筐体１１内の他の構成要素や系を収容するために、必要に応じて他の幾何学形状または不規則な形状を使用することもできる。一次光学支持部材１６は、光学部品用の既存のホルダといっしょに鋳造や機械加工をしたり、一体化して設けたりすることによって、安定性を高め、該部品の位置ずれが発生する可能性を低減することができる。

一次光学支持部材１６は、支柱１３上の架台ホルダー１４に保持された防振架台１５を介して支柱１３に支持されている。この例では、防振架台１５はゲル状ポリマー覆いを備えているが、十分な防振を提供することができれば、任意の適切な架台を使用してもよい。また、筐体１１にはゴム足１７が設けられて支持面と係合し、伝達される振動をさらに低減することができる。所望であれば、他の防振部品を設けてもよいし、実際に筐体１１および／または支持部材１２あるいはその一部は、防振材料を備えてもよい。図２ｂの代替例に示すように、一次光学支持部材１６'は、一次光学支持部材１６'の溝部１６'ａに納められた、ゲルコーティング処理チタン棒１５'に支持されている。ゲルコーティング処理チタン棒１５'の端部１５'ａは、筐体１２'の内面の凹部１８'で支持されたゴム架台１７'に納められている。さらに別の代替例では、一次光学支持部材が、調整空気ピストンのような能動型防振部品によって支持されていてもよい。

この例では、ゲル状ポリマー覆い１５は、ほぼ１０ヘルツの周波数カットオフ能力を有するローパス制振材として機能する。一次光学支持部材１６の長さと幅は、当部材の適度な厚さを維持しながら、小さくなるように選択され、例えば、一次光学支持部材としてアルミニウムを使用する場合、モード周波数を１キロヘルツよりもはるかに高くまで押し上げる。本実施形態におけるカメラは、１００ヘルツの全フレーム読み出し周波数を有する。したがって、これらの特性周波数の大きさが桁違いなので、外部の力がモード周波数を励起して影響が出ることはなく、モード周波数が高いので励起の振幅は小さく、モード周波数における振動は、カメラのデータ取得時間規模に対して取るに足りない。

図２から明らかなように、各構成要素は、一次光学支持部材１６の両側に搭載することができる。一次光学支持部材１６は、最上部の第一側面１６ａと最下部の第二側面１６ｂとを有している。最上部の第一側面１６ａには、対物レンズ系１８と試料ステージ１９とが搭載される。試料ステージ１９は、対物レンズ１８の上方で試料ホルダ２０を支持するように配置され、試料２１を撮像することができるようになっている。試料ステージ１９は、対物レンズ系１８に対して、試料２１をｘ−ｙ平面内で移動させることができる横方向位置決め部１９ａと、試料ホルダ２０を垂直に移動させることができるｚ軸位置決め部１９ｂとを有している。位置決め部１９ａ、１９ｂは、機械的ドリフトおよび反動が少ない、圧電摩擦駆動であることが好ましく、試料の多くの領域を撮像できるように、比較的大きな距離（数センチメートル）にわたりナノメートルの精度で自動的に制御することができる。圧電摩擦駆動は、ナノメートル規模の移動ステップとすることが可能であり、この移動ステップは使用する駆動手段に従って約１〜１００ナノメートルの範囲である。これによって、本顕微鏡は、横方向の位置を操作して試料の異なる領域を対物レンズの視野内に順次移動させて自動的に多数の測定値を取得する、自動操作に適したものとなっている。本顕微鏡を合焦させることに加えて、ｚ軸位置の制御によって、例えば、細胞の端から端まで、異なる平面上で測定値を取得することができる。

照明部は、符号２２で一般的に、そして図２Ａでより詳細に、一次光学支持部材１６の第一側面１６ａ上に搭載されているものとして示してある。照明部２２は、レーザかＬＥＤかランプ、または、複数の光源からなるか、または、この例のように、別の照明源モジュールに接続するための光ファイバの受け口となる接続部を備えてもよい。別の照明源モジュールを使用することによって、本顕微鏡は、異なる光源を提供する、異なる技術や異なる応用例に適合させることができる。図２ａに示すように、光ファイバ接続部２３は、光ファイバ２４の受け口となって保持する。照明光ビーム２５は、円筒形レンズ２６ａ、２６ｂを通過した後に成形されて平行光線となる。可調節絞り２７は、該ビームをさらに成形し、次に広視野レンズ２８が、対物レンズ系１８の後側焦点面に合焦した収束ビームを提供する。ビームスプリッタ２９は、ほぼ１０％以下の光を出力メータ３０へ分光させ、ビーム出力を監視して、ビーム強度の変動に起因する、結果データにおけるノイズを低下させることができるようにする。次に、ミラー３２が、絞り１６ｃを介して照明光ビーム２５を導く。以下に説明するように、いくつかの応用例に対しては、レンズ２８を調整または交換して、平行となったり分光されたりした照射ビーム、または光経路内のどこか別の点に合焦した照明ビームを提供することが望ましい。

一次光学支持部材１６の下側の第二側面１６ｂでは、ミラー３３、３４が、照明光ビーム２５を絞り１６ｄを通して対物レンズ系１８に導き、そこで照明光ビーム２５は、広視野撮像用として、対物レンズ系１８の背面焦点面に合焦して試料２１を均一に照明するか、または、共焦点顕微鏡用として、対物レンズ１８系によりその背面絞りに入る平行光を介して試料２１上に合焦する。照明部２２およびミラー３３、３４は、照明光学系と総称することにする。他の応用例に対しては、他の構成要素が、照明光学系に使用される場合もある。例えば、ミラー３４は、ダイクロイックミラー、ビームスプリッタ、または小型ミラーのいずれかであることもあれば、完全に省略されることもある。ミラー３３は、可動または平行移動可能であって、例えば、全反射顕微鏡用として、照明角度を変更することができてもよい。

試料２１からの戻り光は、おおまかに符号３５で示している。戻り光は、ミラー３４を通過する。ミラー３４がダイクロイックミラーである場合、ダイクロイックミラー３４の特性は、照明光ビーム２５の波長または波長範囲は反射されるが、戻り光は通過するように選択される。ミラー３４を通過後、戻り光は、ミラー３６によって検出装置３７に導かれる。検出装置３７は、適切な検出器またはカメラ（あるいは、必要に応じて複数の検出器またはカメラ）と、必要な応用例に対して適切な光学部品とを備える。この検出装置は、接続部３８を有し、制御システムまたはコンピュータにデータを送信することができる。戻り光を検出装置に導く光学部品と、検出装置内の光学部品とは、戻り光学系と総称することにする。他の応用例に対しては、他の構成要素が、戻り光学系に使用される場合もある。

本例では、構成要素を単一の一次光学支持部材の表面付近に実装し、この一次光学支持部材を防振架台上で支持することによって、該顕微鏡は、外力および温度やその他の周囲条件の変動に対して非常に影響を受けにくくなっている。光経路用として一次光学支持部材の両側を使用すること、および一次光学支持部材の表面に近いビーム高を使用することによって、これらの構成要素を比較的小さな体積内に含めることができる。本実施例では、ビーム高は、一次光学支持体の表面から約１０〜約３０ミリメートルである。対物レンズと試料ホルダーを一次光学支持部材の片側に搭載し、少なくとも一部の照明および反射光学系を反対側に搭載することによって、不要な光学反射が戻りビーム経路に混入するのを低減することができる。光学系は、一次光学支持部材の両側にあるので、すべての構成要素にアクセスできる状態が保たれる。

図２と図２Ａに示した構成は、一般的な構成であり、所望の顕微鏡技術で使用するために適合させることができる。一例として、二色広視野蛍光顕微鏡の構成を、図３Ａ〜６を参照して説明する。図３Ａは照明光源モジュールの図であり、図３Ｂと図３Ｃは代替となる単純戻り光学系であり、図４と図５はそれぞれ顕微鏡１０内のビーム系路の斜視図である。図２および図２Ａと同等の構成要素は、同一の参照番号が付されている。

二色広視野蛍光顕微鏡では、試料２１は、二つの励起波長のうち一つで光を吸収した後、蛍光を発する蛍光分子で標識される。したがって、本実施形態において、照明光ビームは、より正確には励起光ビームとみなすことができる。

図３Ａに見られるように、照明光源モジュールは、一般的に符号４０で示される。照明光源モジュール４０は、第一波長を有する第一照明光ビーム４１ａを生成する第一レーザ光源４１と、第二波長を有する第二照明光ビーム４２ａを生成する第二レーザ光源４２とを備えている。ビーム結合光学系４３は、第一照明光ビーム４１ａと第二照明光ビーム４２ａとを混合させ、その光を光ファイバ２４に結合させる。この例では、第一波長は６４０ナノメートルであり、第二波長は５３２ナノメートルである。照明光ビーム４１ａ、４２ａは、ビームのパルスが重ならないようにパルスのタイミングをとって、交互レーザ励起顕微鏡用にパルス化することもできる。必要に応じて、照明光源モジュール４０は、出力計２７の代わりに、またはそれに加えて、所定の出力計を有していてもよい。また、図３Ａは、以下でより詳細に説明するように、単一モード光ファイバ６１ａに結合される焦点安定化ビーム６０を発生させるためのフォーカス安定ビーム源５９を示している。二色顕微鏡では、両方の照明ビームが同時に照射されることもあり得る。ビーム進路に励起除去フィルタを配置して、主たる照明レーザ波長のみ通過させる。

図３Ｂ〜５の検出装置５は、２Ｄカメラ、この例では、ＣＭＯＳカメラ３７'を備えるが、用途に応じてＣＣＤカメラまたはＥＭＣＣＤカメラを使用することもできる。戻り光経路には光学部材が備えられていて、波長によって戻り光を分離する。図５に示すように、照明光路は、実質的に図２ａで示したものである。

戻り光の光路は図３Ｂと図４に示してある。戻り光は、この応用例ではダイクロイックミラーであるミラー３４を透過し、ミラー３６によって導かれる。そして、該ビームは、分離ダイクロイックミラー３８ａを通過する。分離ダイクロイックミラー３８ａは、戻り光のうち５４５〜６２０ナノメートルの範囲545nmの波長を有する緑色蛍光光を反射する。６５６ナノメートル以上の赤の波長は、通過し、ミラー３８ｂによって反射される。赤の戻り光ビームと緑の戻り光ビームは、ＣＭＯＳカメラ３７'の異なる領域に導かれる。図３Ｂと図４の例では、緑のビームと赤のビームは、別々のミラー３９ｃ、３９ｄによって別々に反射され、集光レンズ３９ｅを介してＣＭＯＳカメラ３７'に入射される。この例における緑のビームと赤のビームは、レンズ３９ｅの中心近くを通過することで収差が少なくて済むように、カメラ３７'の手前で互いに交差する。ミラー３８ａ、３８ｂ、３９ｃ、３９ｄがあるので、ＣＭＯＳカメラ３７'の異なる領域上で画像の位置決めが制御可能になる。ＣＭＯＳカメラ３７ 'によって得られたフレームの例が、図６に符号５０で示してあるが、画像５１はフレームの左側における一方の波長または波長範囲に対応し、画像５２はフレームの右側における他方の波長または波長範囲に対応する。この例において、画像が緑色フルオロフォアから赤色フルオロフォアへの微弱な蛍光共鳴エネルギー移動を示すので、右側の赤の帯域の信号は、明るさが少ない信号を示している。戻り光を異なる波長帯域および異なる検出器の領域に分離することによって、散乱と蛍光など、複数の技術を組み合わせて同時に使用することが可能になる。発光除去フィルタを使えば、照明レーザー波長の光が検出装置に到達するのを遮断することができる。

ミラー３９ｃ、３９ｄとレンズ３９ｅとＣＭＯＳカメラ３７'の代替構成が図３Ｃに示されているが、この場合には、光経路は、図３Ｂに示されている１８０°の反射とは対照的に、図に見られるように概して左から右へ進行する。これらの図は、光経路および一次光学支持部材１６上の構成要素の最も効率的な配置のやり方に応じて、異なる光経路を選択することによって、小型システムを得ることができることを説明するためのものである。

＜第二実施形態＞
今度は、小型顕微鏡の第二実施形態について、図７〜１１Ｂを参照しながら説明する。図７に示すように、符号２００で示される小型顕微鏡は、一次光学支持部材２０２を支持する、実質的に平坦な支持部材２０１を備えている。一次光学支持部材２０２は、防振架台２０３を介し支持部材２０１によって支持されている。また、支持部材２０１は、伝達される振動をさらに低減するために、小型顕微鏡２００が配置される潜在的に不安定な作業面に係合するようにその下面に防振足２０４を有している。

図７に示すように、小型顕微鏡２００は、さらに、支持部材２０１によって支持されているが、物理的に一次光学支持部材２０２とは別個のものであってそれに接続されていない筐体２０５を備えている。筐体２０５は、該顕微鏡の光学系を環境の影響および外光から隔離し、該顕微鏡内の有害な光強度からユーザを保護する働きをする。第一実施形態と同様に、筐体２０５は、必要に応じて試料ステージへアクセスできるように、連動アクセスハッチを備えていてもよい。

今度は、図８Ａ〜８Ｄを参照しながら一次光学支持部材２０２についてより詳細に説明する。これらの図では、一次光学支持体２０２は、支持部材２０１上に配置した状態で示されているが、筐体２０５と以下で説明する二次光学支持部材は省略してある。図１〜６に示してある小型顕微鏡の実施形態とは対照的に、この例では、一次光学支持部材２０２は、多平面構造の光学部品を収容するように設計された複雑な形状であり、比較的単純な平面の一次光学支持部材より小型の構成を組むことができる。一次光学支持部材２０２は、符号２１０で大まかに示したカメラ支持部、および符号２１１で大まかに示した光学支持部という二つの部位を有している。光学支持部２１１は、多くの二次光学支持部材としての光学部品を収納する容積２１２を備えている。容積２１２の上部２１３は、以下でより詳細に説明する対物ステージを収納するように成形されている。一次光学支持部材２０２は、さらに、以下でより詳細に説明するように顕微鏡筒レンズからの光をカメラに導く内蔵ミラー架台を備えている。この例の一次光学支持部材２０２は、互いに堅固に結合された四つの機械加工部品を備えているが、任意の適切な製造手段および組立手段を用いてもよい。一次光学支持部材を単一部品として製造することも可能であるが、複数の部材を使用すれば、モジュール化することができ（異なるカメラを使用してもよいようにすることや、鏡筒レンズとカメラとの間の信号を操作することなど）、部品加工をより簡単にすることができる。

小型顕微鏡２００のレイアウトは、図９Ａ〜９Ｅに一定の縮尺で図示している。図９Ａは、光学装置およびカメラの相対的な配置および寸法を一定の縮尺で示した平面図である。防振架台２０３の位置は参照のために示されており、この例でいうと、総設置面積は、各側で約１８０ミリメートルである。顕微鏡光学系は、光学装置の寸法が１４６ミリメートルｘ９０ ミリメートルであるように配置され、複数層の光学系を極めて接近した状態でお互いの上にまたは隣に積み重ねることによって達成している。

図９Ａ〜９Ｅに示されるように、光学系は、下側平面２２０と上側平面２２１と垂直平面２２２との三つの平面に配置されている。大まかに言えば、照明光学系は下側平面２２０と垂直平面２２２に配置され、受光光学系は上側平面２２１に配置されている。図９Ｂに示されるように、下側平面２２０は、図３Ａにあるものと同様の照明源モジュールのような、適切な光源に由来する複数の光ファイバからの光を受光する受光部２２３を備えている。光ファイバは、符号２２５ａ〜２２５ｆで示している。光ファイバ２２５ｃ〜２２５ｆから受光した光は、一対の筒型レンズ２２６および図２Ａの絞り２７と同様の絞り２２７をそれぞれ通過する。これは、図２Ａの例のように、所望の輪郭を有するビーム、この例ではほぼ矩形のビーム形状を提供するものであって、複雑な光学系を必要とせず、したがって、必要スペースを削減することができる。一連のダイクロイックミラー２２８は、共通パス２２９に沿って混合ビームを反射し、この混合ビームはミラー２３０ａ、２３０ｂに入射し、混合ビームを上方に反射する、垂直平面２２２にある第一上方反射ミラー２３１に導かれる。

複数のフォトダイオード２３２は、ダイクロイックミラー２２８を透過する光を受光し、顕微鏡に到着する各ビームの出力をそれぞれ測定することができるように配置されている。優位点として、追加のビームスプリッタがなくても各ビームの出力を判定することができるので、得られる利用可能出力を最大化することができるとともに他の構成要素の必要性も減らすことができる。

光ファイバ２２５ａ、２２５ｂからの光は、光ファイバ２２５ｃ〜２２５ｆからの光とは別に受光する。受光した光は、集光レンズ２２６ａを通り、ミラー２３３ａ、２３３ｂ、２３３ｃによって、垂直平面２２２にある第二上方反射ミラー２３４に導かれる。ミラー２３３ｂは、ダイクロイックミラーとすることができる。

垂直平面２２２における光学系を、図９Ｄと９Ｅに示している。第一上方反射ミラー２３１から反射された光は、広視野レンズ部２３５が受光する。この光は、広視野レンズ２３５ａによって合焦し、ミラー２３６によりダイクロイックミラー２４０に向けて横方向に導かれ、その後にミラー２３９が収束ビームを対物レンズに反射させ、対物レンズの後側焦点平面に合焦して対物レンズの前側焦点平面から平行光が出て行く。広視野レンズ部２３５は、自動的にまたは手動でレンズ２３５ａの位置を変化させるように制御することができる圧電アクチュエータ２３７を備えている。圧電アクチュエータ２３７は、レンズ２３５ａから対物レンズまでの距離が一定のままであるよう、レンズ２３５ａおよびミラー２３６を平行移動する。この点は、短焦点レンズ２３５ａにとって特に必要であるが、対物レンズまでの距離が一定であることは、はるかに長い焦点距離を有するレンズが使用される、より大きな顕微鏡にとっては重要ではない。圧電アクチュエータがあることによって、レンズ２３５ａは、全反射顕微鏡用の照明を調整することができる。第二上方反射ミラー２３４からの光は、溶融石英窓２３８に当たり、単純にミラー２３９まで、そして対物ステージ３００の中に導かれる。溶融石英窓２３８が関連する波長領域において透過性であり、反射防止コーティングされているので、第一上方反射ミラー２３１から導かれる光は、最小限の損失で済む。溶融石英を使用することによって、ミラー２３１から出て該窓を透過する光によって発生する蛍光を最小限に抑えることができる。

本例では、試料平面内の大きな（例えば、１２０マイクロメートルｘ６０マイクロメートル）面積を照射するのでより多くの出力を必要とする、上方反射ミラー２３１からの収束光に対しては、最小の伝送損失しか発生しないことが要求されるが、小さな（例えば、１マイクロメートルｘ１マイクロメートル）面積を照射するのでより小さい出力しか必要としない、上方反射ミラー２３４からの平行光に対しては、高反射損失が発生しても許容される。他の応用例では、溶融石英窓の代わりにダイクロイックミラーのような他の部品を使用することができる場合がある。

試料と対物レンズ３０１からの戻り光は、その後、ミラー２３９とダイクロイックミラー２４０によって、図９Ｃに大まかに示した受光光学系に導かれる。受光光学部は、領域２４１内に、顕微鏡で使用される技術や機能に応じて除去したり調整したりする複数のモジュール部材を備えている。この例では、モジュール２４１は、図３Ｃに示したものと同様の光学部品を備え、二つの波長範囲からなる、試料からの戻り光を、二つの空間的にずれたビームに分離し、鏡筒レンズ２５０に導く。出力ビームは、一体型架台２１４に保持されたミラー２５１と一体型架台２１５に保持されたミラー２５２によってカメラに導かれる。ずれたビームは、異なる波長または波長範囲に対応する画像５１と５２が画像フレームのニつの別々の部分に作成されて、図６で示した出力画像となる。

この場合もやはり、図９Ｂ〜９Ｅの配置は非常に順応性があり、必要に応じて、入力光ファイバ２２５ａ〜２２５ｆの一部のみしか使用する必要がなく、必要に応じて、戻り光モジュール２４１を交換することができることが明らかであろう。要件としては、モジュール２４１に入りそこから出るビームは、容易に交換できるように無限大に合焦するということだけである。

二次光学支持部材を、図１０Ａと１０Ｂに示してある。第一二次光学支持部材２６１は、光ファイバ２２５ｃ〜２２５ｆを収納する接続部２６１ａを有し、レンズ２２６と、絞り２２７と、ミラー２２８および２３０ａとを備えている。第二二次光学支持部材２６２は、第一および第二上方反射ミラー２３１、２３４を支持している。第三二次光学支持部材２６３も同様に、簡単に言えば、光ファイバ２２５ａ、２２５ｂの受け口となる接続部（図示せず）と、レンズ２３２と、ミラー２３３ａ、２３３ｂ、２３３ｃとを備えている。第四二次光学支持部材２６４は、広視野レンズ２３５ａと、圧電アクチュエータ２３７と、ミラー２３６とを備えた広視野レンズ部２３５を保持している。溶融石英窓２３８は、別の二次光学支持部材によって適所に保持され、ミラー２３９は、一次光学支持部材２０２によって直接保持されている。第五二次光学支持部材２６５は、一つの装置としてまたはサブモジュール群として受光光学系２４１を提供している。図１０Ｂに示すように、これらの各構成要素は、一次光学支持部材２０２の容積２１２内に収容され、ほぼ容積２１２を満たすので、モジュール式で必要に応じて調整可能な、剛性があって精密に位置合わせされた構成となっている。必要であれば、特にそうしない限り二次光学支持モジュールによって占有されていない容積２１２の部分を、固体または中空の充填ブロックで占有して、さらに剛性を高めてもよい。同時に、ビームが伝搬しやすいように多数の絞りを必要とするので、顕微鏡は穴だらけであり、自然に剛性があって、軽量で、中空な構造となっており、自重による変形が起こりにくくなっている。優位点として、異なる平面は、一次光学支持部材または二次光学支持部材の不透明な部分によって分離されている。

一体型ミラー架台２１４は、図１１Ａと１１Ｂでより詳細に示してある。図１１Ａで見るように、一体型ミラー架台２１４は、垂直に延びるスロット２７０を備えている。ビーム絞りは、符号２７１で示し、直角な溝部を備えている。垂直スロット２７０は、その深さがビーム絞り２７１の深さよりも大きく、下部支持ステップ２７２を呈するように成形されている。ミラー２５１は、下部支持ステップ２７２に係合し、ビーム絞り２７１に沿って端から端まで延び、ビーム絞り２７１の上方にあるスロット２７０の上縁２７４と係合するような大きさとする。ミラー２５１とスロット２７０の後壁２７６との間にあるバネ２７５は、ミラーを所定位置に保持している。該バネは、該光学部品を位置合わせする面に対して垂直に一定であって温度に影響を受けない力をかける。同様の構成は、一体型ミラー架台２１５に対しても使用されるが、スロット２７０は、ミラー２５２が位置合わせ面に対して平行ではなく垂直に導入され、バネを圧縮する適切なロック部材によって所定位置に保持される点は異なる。したがって、各一体型ミラー架台２１４、２１５は、機械加工によって恒久的に決まり変更することができず、位置ずれが起こり得ない、ミラー保持面を有している。位置合わせ面を決めることに加え、機械加工によって、ミラーとバネを挿入することができるようなアクセスポートを同時に作成する。ミラーが位置合わせ面と物理的に接触して、光が伝搬する機械加工された絞りを封止するので、粉塵も防ぐことができる。図には一体型ミラー架台２１４、２１５だけが示してあるが、同様の一体型ミラー架台は、必要に応じて一次および二次光学支持部材の各所で使用されている。

＜対物ステージ＞
対物ステージ３００は、より詳細に図１２に示してある。対物ステージ３００は、顕微鏡の対物レンズ３０１を支持している。対物ステージ３００は、例えば、主としてアルミニウム製の移動ステージ３０４が搭載されたインバー基板３０２を備えている。移動ステージ３０４は、インバー試料ホルダ３０５を支持するとともに移動させ、顕微鏡の対物レンズ３０１に対して試料ホルダ３０５の三次元位置の調整ができるようになっている。移動ステージ３０４は、それと同じ材料の板３０３によってインバー基板３０２に接続されている。第一取り付け位置３０６は、それがステージ３０４の前面３０７と位置合わせされるように、アルミニウム板３０３とインバー基板３０２を連結している。その後方にあって、アルミニウム板３０３とインバー基板３０２を連結する第二取り付け位置３０８は、アルミニウム板３０３とインバー基板３０２との間の相対的なスライド移動を可能にしている。このインバー基板は、一次光学支持構造体２０２の凹部２１３に取り付けられて、対物レンズの軸と一直線になった第一固定取り付け位置３０２ａ、およびアルミニウム製の一次光学支持構造２０２とインバー基板３０２との間の相対的なスライド移動を可能にする第ニ取り付け位置（図示せず）を介して、一次光学支持構造体２０２に固定されている。移動ステージ３０４は、おおまかに符号３０９ａ、３０９ｂ、３０９ｃでそれぞれ示した三つの圧電摩擦モータを有している。

対物レンズ３０１は、このように、一次光学支持構造体２０２およびその内部に搭載された光学系に対して固定位置に保持されている。対物ステージ３００の構成によって、移動ステージ３０４の熱膨張、試料ホルダの熱膨張、および対物レンズと移動ステージ３０４を接続する物質の熱膨張を補償することができる。

移動ステージ３０４の熱膨張の補償は、アルミニウム板３０３の固定取り付け位置３０６を、インバー試料ホルダ３０５と接触している、移動ステージ３０４の前面３０７と位置合わせされたアルミニウム製ステージの下に配置することによって実現することができる。したがって、アルミニウム製の移動ステージ３０４が左に膨張した場合、アルミニウム板３０３は右に拡張し、前面３０７に対する膨張量が同じであるため、打ち消し合う。この補償は、ステージ３０４が中心位置から対物レンズに近づいたり遠ざかったりして前面３０７が固定取り付け位置３０６からずれると、相対的な拡張を完全に打ち消し合うことはできなくなる。しかし、この配置によって乖離は最小レベルとなり、この乖離は、ステージ３０４が初期設定の位置にあるゼロから、（中心位置に近い位置よりも使用される可能性が少ない）ステージの移動範囲の両端における小さな最大値まで直線的に増加する。

この配置では、対物レンズ３０１と試料ホルダ３０５上の試料との間の相対運動が打ち消し合うように、対物レンズ３０１と前面３０７との間のインバー部分の熱膨張は、試料ホルダ３０５の熱膨張と大きさが等しいが向きは反対である。固定取り付け位置３０２ａは、対物レンズ３０１が所定の位置に維持されることを保証するが、取り付け位置をスライドさせれば、インバー基板が一次光学支持部材２０２に対して膨張もしくは収縮することができる。

ここで、対物ステージ３００は、インバー製構成要素とアルミニウム製構成要素とを備えているが、必要に応じて該ステージが他の材料から製造された構成要素を備えることができることは明らかであろう。以下の二対の部品は、熱膨張係数が一致している必要があり、第一の対は試料ホルダーと対物レンズ取り付け板で、第二の対は移動ステージと板３０３である。対物ステージは、本明細書に記載した例だけでなく任意の他の適切な顕微鏡で使用することができ、試料ホルダの移動の所望の自由度に対する必要に応じて、一つのアクチュエータまたは任意の数のアクチュエータを備えることができる。

<フォーカス制御＞
フォーカス制御系は、試料ホルダー３０５の位置を制御することによって、対物レンズ３０１の焦点に対する試料の軸方向位置を維持することができる。

これを実現するために、焦点安定化ビームファイバ接続部から焦点安定化ビームが提供される。小型顕微鏡の第一実施形態では、顕微鏡の焦点制御系は、図２、３Ａ、４に示している。焦点安定化ビーム６０は、この場合には単一モード光ファイバ６１ａに接続されて、照明光源モジュール４０の焦点安定化ビームレーザ光源５９からの光を伝送する焦点安定化ビームファイバ接続部６１から供給される。焦点安定化ビーム６０は、レンズ６２によって平行光線となり、ミラー６３およびダイクロイックミラー３４によって対物レンズ系に導かれる。ミラー６３、３４は、光軸２５に対して所定の角度で対物レンズ系１８内に焦点安定化ビーム６０を導く。焦点安定化ビームファイバ接続部６１、レンズ６２、ミラー６３、およびダイクロイックミラー３４は、総称して焦点安定化ビーム光学系と呼ぶことにする。

小型顕微鏡の第二の実施形態では、ファイバ２２５ａ、２２５ｂの一つが、焦点安定化ビームファイバ接続部として使用される場合がある。この場合、上述したように、焦点安定化ビームは、ミラー２３３ａ、２３３ｂ、２３３ｃ、および２３４によって対物レンズ３０１に導かれる。

焦点安定化ビームの波長は、試料が光に影響されないように選択することができる（例えば、試料が蛍光分子を含む場合、オフレゾナンス光など）。焦点安定化ビームは、試料が撮像されていないときだけ動作することが好ましい。対物レンズ系は、光の一部が反射される、カバーガラスと試料媒体との間の境界面に焦点安定化ビームを合焦させる。このビームは、励起レーザと同じ経路で対物レンズに入るが、カバーガラスと試料媒体との間の境界面が対物レンズの前方焦点面にあるときには、ほぼ合焦したスポットが（カメラの）画像面に表示されるように平行化される。このビームは、対物レンズの開口数が高いので、境界面が焦点面から少しでも離れると反射画像が大幅に拡大するように、強く収束する。照射領域から散乱した光は、戻り光学系によって検出装置に戻り、そこで画像を撮ることができる。反射する画像は、対物レンズと境界面との間の距離に依存した大きさ、形状、および位置を有することになる。焦点を制御するために、本システムおよび本方法は、基準画像を後続の画像と比較する。

焦点安定化系を動作させる第一の手法は、焦点ロックモードで行なうことである。試料が最初に正確に位置決めされた後、焦点安定化ビームを対物レンズ系に伝送して、参照画像を保存することができる。試料の位置が対物レンズに対してシフトした場合、その後に撮影した画像では照明領域の外観が変化する。したがって、別の視野に移動した後、後続の画像を撮る。これが基準画像と異なる場合、Ｚ軸位置決め装置を反復動作させる。Ｚ軸位置は、基準画像と後続画像と間の差の計算結果に応じて変えられ、さらに後続の画像を撮る。再び、差分を計算し、さらにＺ軸の位置決め手順を行なう。このようにすれば、この系は、いくつかの手順後に元の焦点に収束することになる。画像間の差は、任意の適切な方法で計算することができる。

焦点安定化系を動作させる第二の手法では、基準画像を格納することは、各々が既知の異なる垂直位置に対応する大量の基準画像を格納することを含むものとする。これを使って、所望のＺ軸位置に試料を移動させたり、試料のＺ軸位置を決定したりすることができる。所望のＺ軸位置に試料を移動させたい場合、そのＺ軸位置に対応する参照画像を読み取り、後続画像が所望の基準画像に収束するまで後続画像を撮影しては少しずつＺ軸位置を移動させるという、上述した処理に似た反復プロセスを実行することができる。別法として、後続画像を撮影しどの基準画像が後続画像と最も一致するかを決定することによって、試料のＺ軸位置を決定することができる。

装置を製造または較正するときに、基準画像や大量の画像を格納することができる。新しい焦点面が必要な場合、または、試料や顕微鏡系が変わることによって基準画像が正しい焦点と合わなくなった場合、取得を開始する前など、顕微鏡の動作中の任意の適切な時点で、追加または置換する基準画像を撮ることができる。後続画像は、後続の操作に対し基準画像としての役割を果たすことができる。

例示的な方法を図１３に符号３２０で記載している。ステップ３２１で示すように、焦点ビームの画像を取得する。ステップ３２２で、最も高い正規化相互相関最大値（ＮＣＣＭ）を有する基準画像を識別する。ＮＣＣＭは、撮った画像と基準画像がお互いにどの程度似ているかの尺度であって、完全な類似性を有する場合はスコアが１となり、全く類似性がない場合はスコアが０となる。このようなアルゴリズムは、反射パターンの形状に敏感であるが、その強度やカメラ上でのその位置には敏感ではない。

矢印３２３で示すように、最も高いＮＣＣＭが０．５未満である場合、ステップ３２４で、任意の基準画像に対して相互相関尺度が０．５を超える画像が見つかるまで、現在のＺ軸位置の範囲を拡げながら試料ステージ３０５を移動させ、繰り返して画像を撮影する。このステップが完了すると、該方法は、ステップ３２６に移行する。最も高いＮＣＣＭが０．５を超えるものの設定位置の基準画像からではない場合、矢印３２５で示すように、代わりにステップ３２２からステップ３２６に直接移行することができる。ステップ３２６で、比較的大きい２００ナノメートルの移動ステップを用いて、相互相関測定値が０．９を超えるか設定位置を通り過ぎるまで、ステージを設定位置に向かって移動させる。ステップ３２６を完了した後か、または、最も高いＮＣＣＭが０．５と０．９９の間にあって設定位置の基準画像のものである場合はステップ３２２の後すぐに、微調整段階３２７で、１００から１０ナノメートルまで移動ステップを減少させながらＮＣＣＭを最大化する。ＮＣＣＭが最大化されると、符号３２８に示すように、手順は完了する。矢印３２９で示すように、取得した画像と基準画像のＮＣＣＭが最初から０．９９よりも大きい場合、自動焦点手順は直ちに終了する。一連の基準画像例が図１４に示されており、中央にある図３４０ａは設定位置を表している。一連の図３４０ｂ〜３４０ｄは、漸進的に低い試料位置からの画像を表している。同様に、基準画像３４０ｅ〜３４０ｇは、位置が高すぎる試料位置から得られた画像である。したがって、図１３に示すように、焦点装置は、焦点ビームの取得画像と最も一致する画像を探し出して、設定位置に向かってＺ軸位置を調整する、つまり、焦点ビームの取得画像が設定位置の基準画像３４０ａに事実上一致するまで、処理を繰り返すことになる。ステップ３２１における、焦点ビームの取得画像が、撮像画像３４０ａ〜３４０ｇのいずれにも十分に類似していない場合、試料位置が撮像画像の範囲外であることを示すので、符号３２３および３２４に示したように、格納されている基準画像のうちの一つに十分に類似している焦点ビーム画像が取得されるまで、この処理は引き続き試料位置を移動させる。

顕微鏡の焦点制御系は、こうして、顕微鏡１０の長時間操作にわたって、安定した試料位置を維持することができる。合焦は、１秒未満しかかからずにナノメートルの精度を実現している。この自動合焦方法は、基準ビームのための追加の光検出器を必要とせず、ビーム品質、出力および出力安定性が非常に低いレーザを使用することができる。本実施例における焦点安定化ビームの出力は、集束レンズなしで光ファイバ６１ａに結合する非効率的な単一モード光ファイバ結合であるために極めて低く、最小の危険性にとどまる。光ファイバ結合レンズが存在しないので、単一モード光ファイバに対してレーザの（再）位置合わせを行なう必要もなくなる。

試料がガラス基板上に固定化された実験では、励起レーザがまだ当たっていない新しい領域に視野を移動させることによって、独立した一連のデータを記録することがしばしば起こり得るし、そうすることがしばしば望ましい。数ミクロン程度のカバーガラスの厚さのばらつきおよび試料ステージの動作不規則性が原因で、新しい視野を得る前には、通常、再合焦手順が必要である。本発明の焦点制御系は、この移動及び再合焦手順を自動的に行なうことができる。例えば、試料を螺旋状に移動して、複数の視野を記録することが考えられる。各視野に励起レーザが当てられる前に、この焦点制御によって、試料は所定の軸方向位置に移動される。焦点安定化ビーム用の光が、顕微鏡の主要光学支持部材にしっかりと取り付けられた光ファイバの端から照射され、焦点安定化ビーム用の平行光線化レンズとビーム誘導ミラーは、調整の自由度がほとんどないので、ビームの角度安定性が向上する。専用のセンサを使用する代わりに、主カメラを使って焦点安定化ビームの像を検出するので、この場合も必要な構成要素の数を減らすことができる。

焦点を制御し、ユーザが所望する平面への移動を可能にする別の方法として、ガラス・試料の媒体境界面を設定位置として設定し、ユーザにはそれを変更できないようにする。その後、焦点制御機構がこの境界面を焦点平面まで移動し、次に、圧電ステージの位置センサ（約１ナノメートルの精度を有する）を使用して、この境界面から離れて所望の位置までナビゲートする。換言すれば、境界面は、移動の起点として使用されて、ユーザが基準画像を記録する必要性をなくするとともに、この境界面を明確に定義された座標系の原平面として規定することができる。

＜代替の光学構成＞
この顕微鏡をどのように他の応用例に対して適合させることができるかの例を、図１５〜１９Ｂに示している。優位点としては、小型顕微鏡２００は、適切な第五二次支援モジュール２６５を提供することによって、これらの構成のいずれにも適応可能である。

図１５Ａ〜１５Ｃは、単色、二色、または三色の広視野蛍光顕微鏡に適応可能な戻り光学系の構成を示している。一般的な装置は、図１５Ａに符号４００で示してあり、ビームは、レンズ４０１によってカメラ４３７上に直接に合焦する。図３Ｂおよび３Ｃの光経路と同等である図１５Ｂでは、ダイクロイックミラー４０２が、戻り光を第一波長帯域および第二波長帯域に分離する。第一波長帯域の光は、ダイクロイックミラー４０２を通過し、ミラー４０３および４０４によって反射され、第一バンドパスフィルタ４０５を通過する。第二波長帯域の光は、ダイクロイックミラー４０２およびミラー４０６によって反射され、バンドパスフィルタ４０７を通過する。得られた二つのビームは、空間的にずれており、カメラ４３７の異なる領域に合焦する。図１５Ｃに示される、さらに変形したものとして、ミラー４０３は追加のダイクロイックミラー４０８で置換されている。第三波長帯域の光は、ダイクロイックミラー４０２、４０８およびロングパスフィルタ４０９を通過し、得られた三つのビームは、カメラ４３７の別々の互いにずれた領域に合焦する。

図１６は、二色蛍光共焦点顕微鏡用としてこの顕微鏡を使用する場合を示しており、例示的な光経路が符号４１０で示されている。この応用例における検出装置は、一対の光検出器４１１ａ、４１１ｂ、具体的には、高い検出感度を提供するアバランシェフォトダイオードを備えている。励起ビーム４１２は、上述したように、ニつの波長帯域の光を含み、平行光線となっている。対物レンズ系は、試料２１上に照明光を合焦させる。戻ってきた蛍光は、ダイクロイックミラー４１３を通過し、ミラー４１４によって検出装置に導かれる。第一波長帯域の光は、ロングパスダイクロイックミラー４１５によって反射され、バンドパスフィルタ４１６を通過し、レンズ４１７によって第一光検出器４１１ａに合焦する。第二波長帯域の光は、ダイクロイックミラー４１５を通過し、ミラー４１８で反射され、ロングパスフィルタ４１９を通過し、レンズ４２０によって第二光検出器４１１ｂに合焦する。

図１７は、蛍光偏光顕微鏡に対する戻り光経路を符号４３０で示している。戻り蛍光４３１は、発光フィルター４３２を通過し、戻り光は、偏光ビームスプリッタ４３３によって異なる偏光成分に分離される。ミラー４３４、４３５、４３６は、異なって偏光されたビームをレンズ４３８を介して導き、異なるビームは、撮像装置４３７'のずれた領域に合焦する。

図１８は、明視野干渉散乱（ｉＳＣＡＴ）顕微鏡に対する構成を符号４４０で示している。照明ビーム４４１はやや収束気味である。照明ビーム４４１は、照明光の一部を対物レンズ系１８に導くビームスプリッタ４４２を通過して、試料２１の所定領域を照明する。ビームストップ４４３は、ビームスプリッタ４４２を直接に通過する分の照明ビーム４４１を吸収する。試料２１から散乱した照明光は、試料スライドの境界面から反射された照明光と干渉する。反射された光は、ビームスプリッタ４４２を介して戻り、ミラー４４４によって反射され、レンズ４４５によって撮像装置４３７に合焦する。

図１９Ａと１９Ｂは、それぞれ符号４５０ａ、４５０ｂで示した、同時暗視野顕微鏡および多色広視野顕微鏡に対する光経路を示している。符号４５０ｂにおいて、小楕円ミラー４５１は、対物レンズの光軸上で対物レンズの後方焦点平面に収束する照明光を反射し、反射された照明光が光軸上を戻りミラー４５１によって再び反射されて検出経路の外に出る。符号４５０ａにおいて、小ミラー４５２は、その背面絞りの端で対物レンズの後方焦点平面に収束する照明光を反射する。照明光は、ガラス・試料の境界面で全内部反射（ＴＩＲ）され、背面絞りの直径方向反対の端に戻り、そこで別の小ミラー４５３によって吸収部材４５４に導かれる。後者の形状は十分に高い開口数の液浸対物レンズを必要とする。

各代替案において、ダイクロイックミラーとフィルターとで構成された系は、戻り光から蛍光と散乱光を分離し、さまざまな波長帯域を撮像装置４３７の異なる領域まで導く。ニ帯域ダイクロイックミラー４５５は、第一波長帯域および第二の波長帯域の蛍光はダイクロイックミラー４５５を通過するが、散乱光は反射されるように選択されている。散乱光は、ミラー４５６で反射され、デュアルレーザー線パスフィルタ４５７およびレンズ４５８を通って、撮像装置４３７の第一領域に合焦する。ロングパスダイクロイックミラー４５９は、蛍光を第一波長帯域および第二波長帯域に分離し、それらはロングパスフィルタ４６０と帯域パスフィルタ４６１とをそれぞれ通過して、撮像装置４３７の第ニ領域と第三領域に合焦する。

顕微鏡焦点制御系は、上述した小型顕微鏡の実施形態だけでなく、他のいずれのタイプの顕微鏡に使用する場合にも適切であることは明らかであろう。適切であれば、この焦点制御系は、顕微鏡の主検出器とは別に、独自の撮像装置を有することもできる。

＜適応性＞
本明細書に記載した小型顕微鏡は、小型で、堅牢で、持ち運ぶことができ、低コストであるフォームファクタに納まりながら、広視野撮像の最も望ましい特徴である、低い試料ドリフト、高い振動安定性、単一分子の検出感度、自動化、および、高スループットを提供することができるという優位点がある。

光経路は、可能な限り最高の検出効率を提供するとともに、できるだけ小型になるように設計されている。単一アレイセンサ上のマルチチャネル撮像に対して、この設計は、画像をカットするスリット絞りの平面に画像を形成する必要がない。これは、通常、画像をアレイセンサ上の矩形領域に合わせるために行われる。対照的に、上述した小型顕微鏡は、検出しようとしている領域のみを照明する成形入射ビームを使用している。非点収差レンズおよび適切な絞りを使用して、入射ビームの幅と長さを定めることができる。他のチャネル分割光学系と比較して、本発明の系では、検出経路にニつのレンズおよび調整可能なスリット絞りを配置する必要がないので、検出効率を増加させ、空間コストと部品コストの両方を節約することができる。

分離した照明光源モジュールを提供することは、それによって本発明の顕微鏡の筺体から構成要素を除くことができるので筺体をより小さくすることができ、レーザやそれを支援する機器からの熱で顕微鏡筐体および筐体内の温度に反応しやすい試料が加熱されるのを防ぐので優位性がある。分離した照明光源モジュールによって適応性を高めることもでき、本発明の顕微鏡の機能を変更するためには、異なる照明光源モジュールを提供し光ファイバリンクを介して接続するだけで済ませることができる。本発明の顕微鏡を複数の照明部に接続することができる複数の接続部を提供することもできるし、並列動作やコスト削減のために、実際に複数の顕微鏡を単一の照明光源モジュールに接続することもできる。レーザ光源は、連続波、または、デュアルレーザー励起やトリプルレーザー励起や、シングルレーザー励起とデュアルレーザー励起を交互に配列するような複雑なパルス配列を含む、パルス源の任意の組合せとして提供してもよい。光ファイバが使用される場合、この光ファイバは、加熱するか、または、伸ばすか圧搾するかして機械的に折り曲げるなど既知の方法で操作することによって、均質な照明光を生成することができる。電源、圧電駆動装置、レーザ駆動装置、信号伝達と入出力のハードウェア、および、光ファイバ圧搾圧電駆動装置などを含む制御用電子回路は、照明光源モジュールの一部として提供してもよい。これは、例えば、特定の実験に対して本発明の顕微鏡を適合させるためには、適切な照明光源モジュールおよび（必要に応じて）補助的光学支援モジュールが小型顕微鏡に接続されていることだけが必要となる。

所望であれば、その代わりとして、または、それに加えて、照明光源モジュール、略して、光源を顕微鏡筺体内に設けることができる。本発明の顕微鏡を所望の機能に適合させるために、任意の適切な検出器または検出器群、および、対応する戻り光学系を設けてもよい。一つの対物レンズ系について上述したが、本発明の顕微鏡は、必要であれば、複数の対物レンズ系を備えることができる。本明細書に記載の顕微鏡は、対物レンズ系を有しているが、いくつかの応用例に対しては、反射型対物レンズ系のような他の集光部材で置き換えてもよい。顕微鏡光学系と対物ステージがモジュールタイプなので、そのような適応が可能である。

優位点として、本発明の顕微鏡は、温度、湿度、圧力、雰囲気の組成、加速度、磁場と電場、および所在地などの測定パラメータを検出し記録するセンサを備えることができる。これらのセンサからの情報をフィードバック系で顕微鏡の筐体の内部または外部にある制御システムと併せて使用することによって、所望の正確な測定条件を実現することができる。例えば、一次光学支持部材に搭載された温度制御装置は、顕微鏡全体（および、筺体内の空気）を所定の温度まで加熱または冷却することができる。適切な温度制御を行なうことによって、本発明の顕微鏡は、特に試料を一定の温度で維持する必要がある培養器の役割を果たすことができる。通常の顕微鏡を用いた場合の既知のアプローチは、対物ヒータを使用して試料を必要な温度で維持することだけである。このようにすると、必然的に顕微鏡ならびに試料の中に温度勾配を引き起こし、顕微鏡のドリフトと試料の対流につながる。これらの問題は、環境全体を必要とされる温度で維持することによって、低減または排除することができる。内部の雰囲気も調整することができる。例えば、ＣＯ２パイプを顕微鏡およびガス流量調整器に接続し環境センサからフィードバックさせるようにすれば、本発明の顕微鏡に哺乳動物細胞の培養器の役割を果たさせることができる。顕微鏡ソフトウェアもセンサ情報を使用することによって、測定値の品質を判断し、必要であれば、無効な測定値を廃棄することができる。記録されたセンサ情報は、測定値の再現性の助けともなる。

本発明の顕微鏡は、照明および検出のオプション、観察対象、および、集結形態の面で、非常に適応性と柔軟性がある。例えば、単一波長連続レーザ、ピコ秒〜秒の時間領域で変調するパルス励起光源、異なる変調方式（電子的オン／オフ変調、チョッパー、音響光学変調器、音響光学波長可変フィルタ、電気光学変調など）で変調した複数の変調レーザを使用する複雑な励起体系といった、さまざまな照明部を使用することができる。（蛍光発光を担う状態が化学反応によって生成される）化学発光化合物の場合など、一部の例では、顕微鏡は、照明部が存在しない状態でも動作することができる。本発明の顕微鏡は、発光化合物を含む溶液、固定化分子が載ったカバースリップ、蛍光分子を含有するフローセル、定着した哺乳動物細胞または組織試料が載ったスライドなど、多様な形態を有する試料を収容するように適合させることができる。本発明の顕微鏡は、個々の分子を検出する感度を有するが、単一または複数のスペクトル放射チャネルの平均強度を観察する高濃度モードで動作することもできる。検出という点では、（集光レーザービームによって照射される回折限界量が、アバランシェフォトダイオード検出器、略してＡＰＤ、のような点検出器に合焦する）共焦点顕微鏡、または、（試料平面の大面積が、ＣＣＤカメラ、ＥＭＣＣＤカメラ、ｓＣＭＯＳカメラのようなニ次元検出器上に撮像される）広視野撮像などの点光源検出用フォーマットを実現することができる。蛍光イメージング機能および蛍光寿命イメージング機能に加えて、放射経路のフィルタおよび適切な配置を慎重に選択することによって、散乱測定が可能になる。レーザ光波長、略して、波長を選択して、（ＵＶレーザによる）蛍光体の光活性化、または、蛍光体全般の化学的および量子的な状態の誘導放出と制御のような、試料の光化学的または（光）物理的な処理を発生させる試料変化、および（集光ＩＲレーザーによる）局所的な温度変化を誘発することができる。複数の光源を使用すれば、いくつかの波長の光を必要な分だけ一つの試料に、または同じ試料の異なる領域に導くことができる。

本発明の顕微鏡システムは、ハードウェア制御、データ収集・格納処理、および、可視化処理が密接に統合された、適切な制御および分析ソフトウェアを伴う自動化に非常に適している。適切なソフトウェアがあれば、ユーザ対話をほとんどまたは全く必要としない、自動データ収集、リアルタイム分析、インテリジェントデータ分析、および、リアルタイムのデータ可視化・レポーティングを行なうことができる。広い範囲の応用例において、単一の視野内で多くの信号を同時に測定することができる。圧電摩擦駆動装置を使用すれば、数千の視野を、データ分析と解釈が並列に行なわれる、完全自動化されたやり方で測定することができるように、試料を数センチメートル単位で平行移動することができる。非常に大きな一連のデータを、非常に短い時間で収集し処理することができる。そのような顕微鏡またはそのような一連の顕微鏡は、したがって、薬学環境で使用するような、高処理能力で大規模並列多次元なスクリーニング応用例に使用することができる。

本発明に至る作業は、第七次欧州研究開発フレームワーク計画（ＦＰ７、２００７年〜２０１３年）下のＥＲＣ助成金契約番号２６１２２７で欧州研究評議会から資金提供を受けている。

上記の説明において、実施形態は、本発明の例または実装である。「一実施形態」、「実施形態」、または「いくつかの実施形態」などのさまざまな表現は、かならずしもすべてが同じ実施形態を指すとは限らない。

本発明のさまざまな特徴が単一の実施形態の文脈で説明されているかもしれないが、これらの特徴は、別々に、または任意の適切な組み合わせで提供されてもかまわない。逆に、本発明は、本明細書では明確性のため別々の実施形態の文脈で記載されているが、単一の実施形態で実装してもよい。

また、本発明は、さまざまな方法で実施または実践することができるし、上記の説明で概説したもの以外の実施形態で実装することもできることを理解すべきである。

本明細書で使用される技術用語および科学用語の意味は、別途定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものである。

Claims (27)

1. 筐体と、
   支持部材と、
   前記筺体内に配置され前記支持部材によって支持された一次光学支持部材と、
   前記支持体と前記一次光学支持部材との間にある少なくとも一つの防振架台と、
   前記一次光学支持部材に搭載される試料ステージと、
   前記試料ステージからの戻り光を受光し検出装置に戻り光を伝送する戻り光学系と、を備え、
   前記戻り光学系は、前記一次光学支持部材に搭載される
   ことを特徴とする小型顕微鏡。
2. 前記一次光学支持部材に搭載された対物レンズ系を有している
   ことを特徴とする、請求項１に記載の小型顕微鏡。
3. 照明部と、
   前記照明部から前記試料ステージ上の試料に照明光ビームを導く照明光学系とを備え、
   前記照明光学系は、前記一次光学支持部材に搭載されている
   ことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の小型顕微鏡。
4. 前記照明光学系および前記戻り光学系の少なくとも一部は、前記小型顕微鏡の異なる平面に配置されている
   ことを特徴とする、請求項３に記載の小型顕微鏡。
5. 前記検出装置は、前記一次光学支持部材によって支持されている
   ことを特徴とする、請求項４に記載の小型顕微鏡。
6. 少なくとも一部の前記照明光学系と前記戻り光学系は、前記一次光学支持部材によって支持された二次光学支持部材を備えている
   ことを特徴とする、請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の小型顕微鏡。
7. 前記照明部は、光源に接続された光ファイバを収容する接続部を備えている
   ことを特徴とする、請求項３乃至請求項６のいずれかに記載の小型顕微鏡。
8. 前記検出装置は、光検出器を備えている
   ことを特徴とする、請求項３乃至請求項７のいずれかに記載の小型顕微鏡。
9. 前記検出装置は、撮像装置を備えている
   ことを特徴とする、請求項３乃至請求項７のいずれかに記載の小型顕微鏡。
10. 前記照明部は、出力計を備えている
    ことを特徴とする、請求項３乃至請求項９のいずれかに記載の小型顕微鏡。
11. 前記照明光学系は、照明光ビームの形状を制御するために、ビーム整形光学系を備えている
    ことを特徴とする、請求項３乃至請求項１０のいずれかに記載の小型顕微鏡。
12. 前記照明光学系は、照明光ビームの形状を制御するために、少なくとも一つの絞りを含んでいる
    ことを特徴とする、請求項１１に記載の小型顕微鏡。
13. 前記戻り光学系は、戻り光を少なくとも第一波長帯域と第二波長帯域とに分離するように動作可能である
    ことを特徴とする、請求項３乃至請求項１２のいずれかに記載の小型顕微鏡。
14. 請求項８に記載の小型顕微鏡であって、
    前記戻り光学系は、第一波長帯域の戻り光を前記撮像装置の第一領域に導き、第二波長帯域の戻り光を前記撮像装置の第二領域に導いる
    ことを特徴とする、請求項１３に記載の小型顕微鏡。
15. 前記試料ステージは、可動である
    ことを特徴とする、請求項１乃至請求項１４のいずれかに記載の小型顕微鏡。
16. さらに、焦点安定化ビームを前記対物レンズ系に導くために焦点安定化ビーム光学系を備えている
    ことを特徴とする、請求項１５に記載の小型顕微鏡。
17. 前記対物レンズ系から焦点安定ビームの基準画像を受信し、前記焦点安定化ビームの後続画像を受信し、そして、前記基準画像と後続画像に応じて前記試料ステージを制御するように動作可能な焦点制御部を備えている
    ことを特徴とする、請求項１６に記載の小型顕微鏡。
18. 前記照明光ビームはパルス化されていて、前記後続画像は前記照明光ビームのパルスとパルスとの間で取得される
    ことを特徴とする、請求項１７に記載の小型顕微鏡。
19. 前記焦点安定化ビームの前記後続画像は、前記前記検出装置から受信する
    ことを特徴とする、請求項１７または請求項１８に記載の小型顕微鏡。
20. 請求項１乃至請求項１９のいずれかに記載の小型顕微鏡と、
    照明光源モジュールとを備え、
    前記小型顕微鏡の前記照明光学系と前記照明光源モジュールは光ファイバによって接続されている
    ことを特徴とする、顕微鏡システム。
21. 前記照明光源モジュールは、レーザ光源を備えている
    ことを特徴とする、請求項２０に記載の顕微鏡システム。
22. 前記照明光源モジュールは、
    第一波長を有する第一照明光ビームを生成する第一レーザ光源と、
    第二波長を有する第二照明光ビームを生成する第二レーザ光源と、
    前記第一照明光ビームおよび前記第二照明光ビームを前記光ファイバに伝送するビーム合成光学系とを備えている
    ことを特徴とする、請求項２１に記載の顕微鏡システム。
23. 請求項１６に記載の小型顕微鏡を備える顕微鏡システムであって、
    前記照明光源モジュールは、
    焦点安定化ビームレーザ光源と、
    前記焦点安定性化ビームを前記小型顕微鏡に伝送する焦点安定化ビーム光ファイバを備えている
    ことを特徴とする、請求項２１または請求項２２に記載の小型顕微鏡システム。
24. 可動試料ステージと、
    対物レンズ系と、
    焦点安定化ビームを前記対物レンズ系に導く焦点安定化ビーム光学系と、
    撮像装置と、
    前記撮像装置に光を戻す戻り光学系と、
    前記対物レンズ系から前記焦点安定化ビームの基準画像を受信し、前記焦点安定化ビームの後続画像を受信し、前記基準画像と後続画像に応じて前記試料ステージを制御するように動作可能である制御系とを備える
    ことを特徴とする、顕微鏡焦点制御システム。
25. 前記制御系は、後続画像が前記基準画像と一致するように前記試料ステージを制御する動作を行なうことが可能である
    ことを特徴とする、請求項２４に記載の顕微鏡焦点制御システム。
26. 焦点安定化ビームの基準画像を格納することと、
    顕微鏡の対物レンズ系に焦点安定化ビームを伝送することと、
    前記焦点安定化ビームの後続画像を受信することと、
    前記基準画像と後続画像に応じて前記顕微鏡の試料ステージを制御することとを含む
    ことを特徴とする、顕微鏡の焦点を制御する方法。
27. 後続画像が前記基準画像と一致するように前記試料ステージを制御することを含む
    ことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。