JP2011028063A

JP2011028063A - 多光子顕微鏡および走査装置

Info

Publication number: JP2011028063A
Application number: JP2009174869A
Authority: JP
Inventors: Naoshi Aikawa; 直志相川
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2011-02-10
Anticipated expiration: 2029-07-28
Also published as: JP5311134B2

Abstract

【課題】多光子顕微鏡において、より簡単に複数の波長の極短パルス光を使用する。
【解決手段】小型レーザ２１ａ乃至２１ｃは、それぞれ異なる波長に固定された極短パルス光を射出する。走査部２５は、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃから射出される極短パルス光を標本２上で走査する。プリチャーパ２２ａ乃至２２ｃは、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃと走査部２５との間において、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃに対してそれぞれ１つずつ設けられ、それぞれ、対応する小型レーザ２１ａ乃至２１ｃから射出される極短パルス光の波長に応じて予め調整されている量の負分散を極短パルス光の群速度に発生させることにより、極短パルス光のパルス幅を調整する。本発明は、例えば、多光子顕微鏡に適用できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、多光子顕微鏡および走査装置に関し、特に、複数の波長の極短パルス光を使用可能な多光子顕微鏡および走査装置に関する。

従来、多光子励起を利用した走査型のレーザ顕微鏡である多光子顕微鏡が知られている。多光子顕微鏡では、非常に時間幅の短い（例えば、100フェムト秒の）パルス状のレーザ光である極短パルス光の射出が可能な極短パルスレーザ光源が用いられる。

また、多光子顕微鏡の中には、波長が可変の極短パルスレーザ光源を備え、複数の波長の極短パルス光を使用できるものもある（例えば、特許文献１参照）。

特開２００２−１０７６３５号公報

ところで、波長が可変の極短パルスレーザ光源では、極短パルス光の波長を変更すると、内部の光学部材が動き、極短パルス光の射出角度が変化する。また、極短パルス光の波長を変更すると、多光子顕微鏡の光学部材の波長分散により発生する極短パルス光のパルス幅の広がり（いわゆるチャープ）の量が変化する。従って、極短パルス光の群速度に負分散を発生させることにより極短パルス光のパルス幅を調整するプリチャーパの負分散量も変更する必要がある。そして、負分散量を変更すると、プリチャーパからの極短パルス光の射出角度が変化する。そのため、極短パルス光の波長を変更する度に、極短パルス光の向きを調整するために、ミラー部材の向きなどを調整する必要があった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、多光子顕微鏡において、より簡単に複数の波長の極短パルス光を使用できるようにするためのものである。

本発明の第１の側面の多光子顕微鏡は、極短パルス光を用いた多光子励起を利用する多光子顕微鏡であって、それぞれ異なる波長に固定された前記極短パルス光を射出する複数の光源と、複数の前記光源から射出される複数の前記極短パルス光を標本上で走査する走査手段と、複数の前記光源と前記走査手段との間において複数の前記光源に対してそれぞれ設けられ、対応する前記光源から射出される前記極短パルス光の波長に応じて予め調整されている量の負分散を前記極短パルス光の群速度に発生させることにより、前記極短パルス光のパルス幅を調整する複数の第１の調整手段とを備える。

本発明の第１の側面においては、それぞれ異なる波長に固定された極短パルス光が射出され、複数の前記極短パルス光が標本上で走査され、前記極短パルス光の波長に応じて予め調整されている量の負分散が前記極短パルス光の群速度に発生し、前記極短パルス光のパルス幅が調整される。

本発明の第２の側面の走査装置は、極短パルス光を用いた多光子励起を利用する顕微鏡に前記極短パルス光を導入し、前記極短パルス光を標本上で走査する走査装置であって、それぞれ異なる波長に固定された前記極短パルス光を射出する複数の光源と、複数の前記光源から射出される複数の前記極短パルス光を前記標本上で走査する走査手段と、複数の前記光源と前記走査手段との間において複数の前記光源に対してそれぞれ設けられ、対応する前記光源から射出される前記極短パルス光の波長に応じて予め調整されている量の負分散を前記極短パルス光の群速度に発生させることにより、前記極短パルス光のパルス幅を調整する複数の調整手段とを備える。

本発明の第２の側面においては、それぞれ異なる波長に固定された極短パルス光が射出され、複数の前記極短パルス光が標本上で走査され、前記極短パルス光の波長に応じて予め調整されている量の負分散が前記極短パルス光の群速度に発生し、前記極短パルス光のパルス幅が調整される。

本発明の第１の側面または第２の側面によれば、多光子顕微鏡において、より簡単に複数の波長の極短パルス光を使用することができる。

本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態を示すブロック図である。プリチャーパの構成の例を示す図である。プリチャーパの構成の他の例を示す図である。

以下、図を参照して、本発明の実施の形態について説明する。

図１は、本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態を示すブロック図である。図１の走査型顕微鏡１は、走査装置１１と顕微鏡本体１２とにより構成される。

走査装置１１内には、３つの小型レーザ２１ａ乃至２１ｃが固定されて内蔵されている。小型レーザ２１ａ乃至２１ｃは、例えば、多層膜ミラーにより構成される負分散ミラー、レーザ結晶、過飽和吸収ミラー（SESAM）、SESAMと組み合わせたイットリビウム（Yb）ベースの固体レーザなどにより構成され、ソリトンモードロッキング（ソリトン型モード同期）技術を用いて、共振器長が数cmと短くても、モードロッキング状態を安定して維持することが可能な極短パルスレーザ光源（例えば、特開２００９−８８１３６号公報などを参照）により構成される。この極短パルスレーザ光源は、極短パルス光の波長が固定されているため、波長を変更するための可動部を設ける必要がないので、極短パルス光の射出角度が安定していて、さらに上述した技術的特徴により、従来の波長が可変の極短パルスレーザ光源と比較して非常に小さくすることができる。

そして、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃは、それぞれ固定された異なる波長の極短パルス光（以下、極短パルス光Ａ乃至Ｃと称する）を射出する。具体的には、極短パルス光Ａ乃至Ｃの波長は、標本２の染色に用いる蛍光試薬の特性に対応した値が採用され、例えば、極短パルス光Ａの波長としてGFP（Green Fluorescent Protein）用に950nmが採用され、極短パルス光Ｂの波長としてFITC（Fluorescein Isothiocyanate）用に800nmが採用され、極短パルス光Ｃの波長としてDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）用に700nmが採用される。

また、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃは、個別にオン／オフを制御することができ、極短パルス光Ａ乃至Ｃの中から任意のものを選択して使用することが可能である。

なお、以下、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃを個々に区別する必要がない場合、単に、小型レーザ２１と称する。

小型レーザ２１ａから射出された極短パルス光Ａは、プリチャーパ２２ａを通過し、ミラー２３ａによりダイクロイックミラー２３ｂの方向に反射され、ダイクロイックミラー２３ｂを透過し、ダイクロイックミラー２３ｃにより、プリチャーパ２２ｄの方向に反射され、プリチャーパ２２ｄを通過する。また、小型レーザ２１ｂから射出された極短パルス光Ｂは、プリチャーパ２２ｂを通過し、ダイクロイックミラー２３ｂによりダイクロイックミラー２３ｃの方向に反射され、ダイクロイックミラー２３ｃによりプリチャーパ２２ｄの方向に反射され、プリチャーパ２２ｄを通過する。さらに、小型レーザ２１ｃから射出された極短パルス光Ｃは、プリチャーパ２２ｃを通過し、ダイクロイックミラー２３ｃを透過し、プリチャーパ２２ｄを通過する。

プリチャーパ２２ａ乃至２２ｄは、極短パルス光Ａ乃至Ｃの群速度に負分散を発生させることにより、極短パルス光Ａ乃至Ｃのパルス幅を調整する。すなわち、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｄは、走査型顕微鏡１の光学系により発生する極短パルス光Ａ乃至Ｃのチャープを補正し、各々のパルス幅を所望の大きさに維持する。

ところで、走査型顕微鏡１の光学系により発生するチャープ量は、極短パルス光の波長により異なり、一般的に、波長が短いほど大きくなり、波長が長いほど小さくなる。従って、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｄの負分散量は、極短パルス光Ａ乃至Ｃのパルス幅をそれぞれ所望の大きさに維持するために、極短パルス光Ａ乃至Ｃの各波長に対して予め最適化されている。

具体的には、プリチャーパ２２ｄは、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃに対して１つ設けられており、極短パルス光Ａ乃至Ｃの群速度におおまかな負分散を発生させる。一方、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｃは、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃに対してそれぞれ１つずつ設けられており、それぞれ対応する小型レーザ２１から射出される極短パルス光の波長に応じて予め負分散量が調整されている。すなわち、プリチャーパ２２ａは極短パルス光Ａに対して負分散量が最適化されており、プリチャーパ２２ｂは極短パルス光Ｂに対して負分散量が最適化されており、プリチャーパ２２ｃは極短パルス光Ｃに対して負分散量が最適化されている。従って、極短パルス光Ａ乃至Ｃは、プリチャーパ２２ｄによりおおまかなチャープ量の補正が行われ、さらにプリチャーパ２２ａ乃至２２ｃにより、各々の波長に正確に対応したチャープ量の補正が行われる。

なお、以下、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｄを個々に区別する必要がない場合、単に、プリチャーパ２２と称する。

ここで、図２および図３を参照して、プリチャーパ２２として用いることが可能なプリチャーパの構成の例について説明する。

図２のプリチャーパ１０１は、負分散ミラー１１１ａおよび負分散ミラー１１１ｂの２枚のミラーにより極短パルス光の群速度に負分散を発生させ、チャープの補正を行うプリチャーパである。具体的には、小型レーザ１０２から射出され、プリチャーパ１０１に入射した極短パルス光は、負分散ミラー１１１ａおよび負分散ミラー１１１ｂにより反射され、反射される毎に負分散が群速度に対して与えられる。そして、極短パルス光は、負分散ミラー１１１ａと負分散ミラー１１１ｂの間を所定の回数だけ往来してから、外部に射出される。従って、プリチャーパ１０１は、負分散ミラー１１１ａおよび負分散ミラー１１１ｂにより極短パルス光が反射される回数を調整することにより、極短パルス光のチャープを補正するための負分散量を調整することができる。

図３のプリチャーパ１５１は、負分散ファイバ１６２により極短パルス光の群速度に負分散を発生させ、チャープの補正を行うプリチャーパである。具体的には、小型レーザ１５２から射出され、プリチャーパ１５１に入射した極短パルス光は、カプラ１６１ａを介して、負分散ファイバ１６２に導入される。小型レーザ１５２から射出される極短パルス光の射出角度は安定しているので、負分散ファイバ１６２に導入される極短パルス光の光量も安定している。そして、極短パルス光は、負分散ファイバ１６２を通過することにより、その距離に応じた負分散が群速度に対して与えられ、カプラ１６１ｂを介して外部に射出される。従って、プリチャーパ１５１は、負分散ファイバ１６２の距離を調整することにより、極短パルス光のチャープを補正するための負分散量を調整することができる。なお、負分散ファイバを用いたプリチャーパの詳細については、例えば、特開２００４−２４６１１１号公報などに開示されている。

なお、プリチャーパ２２は、上述した構成に限定されるものではなく、任意の構成のものを使用することが可能である。例えば、プリチャーパ１０１およびプリチャーパ１５１以外にも、プリズム、回折格子、音響光学式位相制御フィルタなどを用いたプリチャーパを、プリチャーパ２２として採用することが可能である。

なお、極短パルス光Ａ乃至Ｃの波長はそれぞれ固定されており、各プリチャーパ２２の負分散量は、極短パルス光Ａ乃至Ｃの各波長に対して予め最適化されている。従って、各プリチャーパ２２は、負分散量を調整するための可動部を設ける必要がなく、その構成に関わらず小型化することが可能である。

また、プリチャーパ２２ｄにより、極短パルス光Ａ乃至Ｃのチャープ量の大部分をおおまかに補正し、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｃにより、極短パルス光Ａ乃至Ｃの波長の違いにより生じるチャープ量の差に応じた補正を行うことにより、プリチャーパ２２ｄを設けずに、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｃのみにより極短パルス光Ａ乃至Ｃのチャープを個別に補正する場合と比較して、プリチャーパ全体の大きさを小型化することができる。

図１の説明に戻り、プリチャーパ２２ｄを通過した極短パルス光Ａ乃至Ｃは、ダイクロイックミラー２４により、例えば、ガルバノスキャナにより構成される走査部２５の方向に反射され、走査部２５に入射する。そして、極短パルス光Ａ乃至Ｃは、走査部２５により偏向され、走査レンズ２６を透過し、走査装置１１から射出され、顕微鏡本体１２に入射する。走査レンズ２６を透過した極短パルス光Ａ乃至Ｃは、一旦結像した後、顕微鏡本体１２の鏡筒レンズ４１によりコリメートされ、ダイクロイックミラー４２を透過し、対物レンズ４３により標本２の観察面において集光される。このとき、走査部２５は、図示せぬコントローラの制御の基に、極短パルス光の走査範囲や走査速度を制御しながら、標本２の観察面において極短パルス光を走査する。

極短パルス光が標本２に照射されると、標本２からは多光子励起による蛍光が発現し、この蛍光は、観察光となって、ダイレクトディテクタ４４またはピンホールディテクタ２７により検出される。

具体的には、ダイレクトディテクタ４４により観察光を検出する場合、標本２からの観察光は、対物レンズ４３によりコリメートされ、ダイクロイックミラー４２により、ダイレクトディテクタ４４の方向に反射され、ダイレクトディテクタ４４に入射する。ダイレクトディテクタ４４は、例えば、バリアフィルタ、PMT（photo multiplier tube：光電子増倍管）などにより構成され、PMTは、バリアフィルタを透過した観察光を受光し、その光量に応じた電圧の検出信号を図示せぬコントローラに供給する。なお、標本２に照射される極短パルス光は、上述したように走査部２５により走査されるので、ダイレクトディテクタ４４は、標本２の観察面にわたる観察光を検出する。そして、図示せぬコントローラは、ダイレクトディテクタ４４からの電気信号に基づいて、標本２の観察画像を生成する。

一方、ピンホールディテクタ２７により観察光を検出する場合、標本２からの観察光は、対物レンズ４３によりコリメートされ、ダイクロイックミラー４２を透過し、鏡筒レンズ４１により一旦集光された後、走査レンズ２６によりコリメートされ、走査部２５に入射する。そして、観察光は、走査部２５によりデスキャンされ、ダイクロイックミラー２４を透過し、ピンホールディテクタ２７に入射する。ピンホールディテクタ２７は、例えば、集光レンズ、ピンホール、PMTなどにより構成され、観察光は、集光レンズにより集光され、対物レンズ４３の焦点位置とほぼ共役な位置に設けられたピンホールを通過し、PMTに入射する。PMTは、受光した観察光の光量に応じた電圧の検出信号を図示せぬコントローラに供給する。なお、標本２に照射される極短パルス光は、上述したように走査部２５により走査されるので、ピンホールディテクタ２７は、標本２の観察面にわたる観察光を検出する。そして、図示せぬコントローラは、ピンホールディテクタ２７からの電気信号に基づいて、標本２の観察画像を生成する。

このように、走査型顕微鏡１は、多光子顕微鏡および共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。

ところで、一般的に、パルス光がガラス媒質中を伝播すると、ガラスによる波長分散によりチャープが発生し、パルス幅が広がる。そのため、極短パルス光のパルス幅を維持するためには、極短パルス光の伝送に光ファイバを用いることはできない。従って、従来の多光子顕微鏡では、極短パルス光の光路を固定し、安定して顕微鏡本体に導入するために、例えば、極短パルスレーザ光源、走査装置、および顕微鏡本体を、光学定盤に固定して使用する必要があった。

そのため、システムが大型化し、システムの移動が容易に行えない上に、設置場所に広い空間が必要とされた。また、極短パルス光の光路が長くなるため、例えば、極短パルス光の導入に用いるミラー部材が温度変化により変形し、光路に僅かなズレが生じても、極短パルス光を顕微鏡本体に正常に導入できなくなり、ユーザが、ミラー部材の向きを調整しなければならない場合があった。

一方、走査型顕微鏡１では、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃおよびプリチャーパ２２ａ乃至２２ｄを小型化でき、小型レーザ２１ａ乃至２１ｃ、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｄ、ミラー２３ａ、ダイクロイックミラー２３ｂ，２３ｃ，２４、走査部２５、走査レンズ２６、および、ピンホールディテクタ２７を走査装置１１に全て内蔵し、１つのユニットとすることが可能である。

従って、システムを小型化でき、システムの移動が容易になり、設置場所の自由度が増す。また、極短パルス光の光路を短くすることができ、極短パルス光の導入に用いるミラー部材（ダイクロイックミラー２４など）が温度変化により変形しても、光路のズレを小さく抑えることができるため、ミラー部材の向きを調整しなくても、極短パルス光を顕微鏡本体１２に安定して導入することが可能になる。

また、各小型レーザ２１から射出される極短パルス光Ａ乃至Ｃの波長は固定されており、波長調整用の可動部を設ける必要がない。同様に、各プリチャーパ２２も、それぞれ極短パルス光Ａ乃至Ｃの波長に合わせて最適化されており、調整不要のため、調整用の可動部を設ける必要がない。従って、従来の多光子顕微鏡のように、極短パルス光の波長を変更する度に、極短パルス光の向きを調整する必要がなく、より簡単に複数の波長の極短パルス光を使用することが可能になる。

ここで、本発明の実施の形態の変形例について説明する。

例えば、上述したように、プリチャーパ２２ｄを設けずに、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｃにより極短パルス光Ａ乃至Ｃのチャープを個別に補正するようにしてもよい。

また、例えば、プリチャーパ２２ａ乃至２２ｃのうち１つを設けずに、極短パルス光Ａ乃至Ｃのうちの１つのチャープをプリチャーパ２２ｄのみにより補正するようにしてもよい。例えば、プリチャーパ２２ｃを設けずに、プリチャーパ２２ｄを極短パルス光Ｃに対して最適化し、極短パルス光Ｃのチャープをプリチャーパ２２ｄのみにより補正するようにしてもよい。なお、この場合、プリチャーパ２２ｄで補正しきれない極短パルス光Ａのチャープをプリチャーパ２２ａにより補正し、プリチャーパ２２ｄで補正しきれない極短パルス光Ｂのチャープをプリチャーパ２２ｂにより補正するようにすればよい。

さらに、小型レーザ２１とプリチャーパ２２の組み合わせの数は、上述した３組に限定されるものではなく、１組、２組、または、４組以上設けるようにすることも可能である。

また、小型レーザ２１からプリチャーパ２２ｄまでを光源装置として、走査装置１１とは別のユニットとして設けるようにしてもよい。さらに、この場合、プリチャーパ２２ｄとして、負分散ファイバ１６２を用いたプリチャーパ１５１を用いると、走査装置に対して、負分散ファイバ１６２の長さの分だけ自由な位置に、光源装置を設置することもできる。

さらに、従来の波長が可変の極短パルスレーザ光源と、極短パルス光の波長に応じて負分散量の調整が可能なプリチャーパを備える多光子顕微鏡に、走査装置１１、または、上述した小型レーザ２１からプリチャーパ２２ｄまでを内蔵する光源装置を組み合わせて使用できるようにしてもよい。これにより、従来の多光子顕微鏡において、一度に使用できる極短パルス光の数を容易に増やすことができ、例えば、複数の極短パルス光を励起光と刺激光とに使い分けることが可能になる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１走査型顕微鏡，２標本，１１走査装置，１２顕微鏡本体，２１ａ乃至２１ｃ小型レーザ，２２ａ乃至２２ｄプリチャーパ，２３ａミラー，２３ｂ，２３ｃ，２４ダイクロイックミラー，２５走査部，２６走査レンズ，２７ピンホールディテクタ，４１鏡筒レンズ，４２ダイクロイックミラー，４３対物レンズ，４４ダイレクトディテクタ，１０１プリチャーパ，１１１ａ，１１１ｂ負分散ミラー，１５１プリチャーパ，１６２負分散ファイバ

Claims

極短パルス光を用いた多光子励起を利用する多光子顕微鏡において、
それぞれ異なる波長に固定された前記極短パルス光を射出する複数の光源と、
複数の前記光源から射出される複数の前記極短パルス光を標本上で走査する走査手段と、
複数の前記光源と前記走査手段との間において複数の前記光源に対してそれぞれ設けられ、対応する前記光源から射出される前記極短パルス光の波長に応じて予め調整されている量の負分散を前記極短パルス光の群速度に発生させることにより、前記極短パルス光のパルス幅を調整する複数の第１の調整手段と
を備える多光子顕微鏡。
複数の前記光源に対して１つ設けられ、複数の前記極短パルス光の群速度に負分散を発生させる第２の調整手段を
さらに備える請求項１に記載の多光子顕微鏡。
複数の前記光源、前記走査手段、および、複数の前記第１の調整手段が１つのユニット内に設けられている
請求項１に記載の多光子顕微鏡。
極短パルス光を用いた多光子励起を利用する顕微鏡に前記極短パルス光を導入し、前記極短パルス光を標本上で走査する走査装置において、
それぞれ異なる波長に固定された前記極短パルス光を射出する複数の光源と、
複数の前記光源から射出される複数の前記極短パルス光を前記標本上で走査する走査手段と、
複数の前記光源と前記走査手段との間において複数の前記光源に対してそれぞれ設けられ、対応する前記光源から射出される前記極短パルス光の波長に応じて予め調整されている量の負分散を前記極短パルス光の群速度に発生させることにより、前記極短パルス光のパルス幅を調整する複数の調整手段と
を備える走査装置。